Міністерство охорони здоров’я України

Національний медичний університет

імені О.О. Богомольця

КОЗАК ЛЮДМИЛА ПЕТРІВНА

УДК 616.61-002.151:616-07

Сучасні аспекти вірусологічної діагностики

геморагічної гарячки з нирковим синдромом

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор Виноград Наталія Олексіївна, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології і епідеміології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дзюблик Ірина Володимирівна, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри вірусології;

доктор медичних наук, доцент Копча Василь Степанович, Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачовського МОЗ України, професор кафедри інфекційних хвороб та епідеміології

Захист відбудеться “21” лютого 2008 р. о 1600 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.01 у Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України за адресою: 03057, м. Київ, проспект Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія № 2.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий “21” січня 2008 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, професор Войцеховський В.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. В усіх країнах світу спостерігається тенденція до зростання частки вірусних захворювань у структурі інфекційної патології людини. У різних регіонах планети з’являються нові небезпечні збудники: віруси Ґуанаріто, Сабіа, Ґендра, Ніпаґ, а також нові високовірулентні штами збудників геморагічної гарячки з нирковим синдромом (ГГНС) і хантавірусного кардіопульмонального синдрому. Змінюються межі ареалів особливо небезпечних вірусних інфекцій – лихоманок Ебола, Західного Нілу, ГГНС тощо (Маркін В.А., Марков В.І., 2002; Виноград Н.О., 2004, 2006).

В останні 20 років ГГНС привертає особливу увагу в усьому світі, оскільки є найпоширенішою в групі геморагічних гарячок із значною часткою тяжких клінічних форм. Епіцентрами ГГНС на планеті продовжують залишатися Китай, Російська Федерація, Корея (Виноград Н.О., 2003; Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А., 2004).

Природні осередки ГГНС в Україні, вивчення якої було розпочато ще у 50-х роках ХХ сторіччя на заході, охоплюють практично всю територію країни (Виноград І.А. і співав., 1999). Спорадичні випадки ГГНС, зареєстровані в державі впродовж останнього десятиріччя, що представлено в офіційних документах МОЗ України, більше свідчать про неспроможність лабораторної верифікації випадків хвороби, ніж про істинний стан проблеми. Рівень розвитку діагностичної бази визначає якість і повноту діагностики, дієвість контролю інфекційних захворювань.

В Україні вірусологічна діагностика ГГНС не налагоджена в лабораторіях лікувально-профілактичної мережі внаслідок недостатнього матеріально-технічного та організаційного забезпечення (Юрченко О.А., Могилевський Л.Я., Бощенко Ю.А., 2005, 2006). На етапі госпітального нагляду не проводиться обстеження хворих з гарячкою на цю патологію із діагнозами, що не виключають ГГНС; не проводиться сероепідеміологічний моніторинг серед населення, яке проживає на ендемічних з ГГНС територіях; не визначені групи ризику щодо захворюваності на ГГНС; систематично не проводиться комплексна оцінка існуючих природних осередків, не виявляються причини їх активації та межі; не вивчаються особливості перебігу епізоотичного процесу і причини його інтенсифікації.

Впровадження нових методів лабораторної діагностики ГГНС у нашій державі вимагає детальної оцінки доцільності використання кожного конкретного із них, а також створення алгоритму діагностики у розрізі існуючих рівнів надання медичної допомоги населенню і протиепідемічної системи України.

Медико-соціальна значущість проблеми ГГНС, відсутність наукових розробок щодо організації вірусологічної діагностики із використанням сучасних методів і стандартів зумовили вибір теми наукових досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках науково-дослідної роботи кафедри епідеміології Львівського національного медичного університету (ЛНМУ) імені Данила Галицького “Вивчити поширення природно-осередкових зооантропонозних інфекцій у західних областях України з метою з’ясування їх епізоото-епідеміологічних особливостей”, № 0103 U002361, а також у розрізі міжнародних програм ВООЗ “Поглиблене дослідження збудників вірусної геморагічної лихоманки / вірусів енцефаліту та інших збудників, що передаються кліщами, на Україні” за № 847705.82000.25GB.E0018, “Когортне дослідження по встановленню рівня поширеності геморагічної лихоманки з нирковим синдромом (ГЛНС)”, CPHS#164 DOD#NAMRU-3.2004.0018, дозвіл МОЗ України від 12.09.03 р. за № 05.02.01.07/22/364.

Мета і завдання дослідження. Мета: на основі застосування комплексу сучасних серологічних і молекулярно-генетичних методів вірусологічної діагностики ГГНС науково обґрунтувати підходи до організації лабораторної ланки моніторингу природних осередків хантавірусних інфекцій як базису для контролю за цими захворюваннями.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об’єкт дослідження – алгоритм вірусологічної діагностики ГГНС; серологічний прошарок до хантавірусів серед хворих і здорових людей, гризунів-резервуарів на ендемічних щодо ГГНС територіях.

Предмет дослідження – хворі на гарячкові стани нез’ясованого генезу і здорові особи; сироватки крові людей і тварин; природні умови територій та соціально-економічні обставини.

Методи дослідження – серологічний: ІФА, імунохроматографічний аналіз (ІХА); молекулярно-генетичний (ПЛР); епідеміологічний: описово-оціночний, аналітичний, картографічний, статистичний прийоми.

Наукова новизна отриманих результатів. Оцінено адекватність вибору методів лабораторної діагностики для моніторингу хантавірусних інфекцій з метою впровадження в мережу лікувально-профілактичних установ залежно від рівнів надання медико-профілактичної допомоги населенню. Встановлено високий ступінь активності природних осередків ГГНС у західноукраїнському регіоні, що проявляється значним рівнем ураженості населення Закарпаття і Волині хантавірусами. Виявлено території ризику щодо зазначеної інфекції. Вперше встановлено імунологічну структуру сукупного населення, яке проживає на ендемічних територіях, шляхом проведення сероепідеміологічного моніторингу при когортних дослідженнях. Визначено частку ГГНС у структурі гарячкових станів у людей, зумовлених моно- і мікст-інфікуванням різними видами хантавірусів. Встановлено взаємозв’язок циркуляції збудників ГГНС із різними ландшафтно-географічними зонами. Виявлено інфікованість гризунів-резервуарів вірусами Наntaan і Dоbravа/Веlgrаde. Польова миша (Ароdemus agrаrіus) виявилася, за даними ПЛР, уражена обома видами вірусів, що свідчить про міжвидовий перехід Dоbravа/Веlgrаde, для якого досі вважалася можливим резервуаром лише жовтогорла миша (Ароdеmus flavicollis). Розроблено алгоритм вірусологічної діагностики ГГНС із врахуванням рівнів надання населенню медико-профілактичної допомоги.

Практичне значення отриманих результатів. Обґрунтовано доцільність систематичного спостереження за територіями і групами високого ризику щодо ГГНС. Визначено адекватні методи лабораторних досліджень щодо ГГНС на різних рівнях надання населенню медико-профілактичної допомоги. Впроваджено в роботу органів місцевого самоврядування і мережі лікувально-профілактичних закладів методологію визначення пріоритетних напрямків контролю і профілактики ГГНС залежно від чинників ризику. Обґрунтовано зміну тактики, обсягів і методів лабораторної діагностики сезонних вірусних гарячок із врахуванням особливостей поширення і видів хантавірусів на адміністративних територіях. Розроблено систему прогнозування епідемічної ситуації щодо ГГНС у західноукраїнському регіоні держави.

Отримані результати впроваджені в практику роботи Львівської, Харківської, Закарпатської, Волинської обласних санітарно-епідеміологічних станцій, санітарно-епідеміологічної станції м. Харкова; в навчальний процес кафедр епідеміології ЛНМУ імені Данила Галицького, Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (м. Київ), Харківського національного медичного університету; кафедр інфекційних хвороб з епідеміологією Вищого державного навчального закладу України “Української медичної стоматологічної академії” (м. Полтава), Сумського державного університету.

Особистий внесок здобувача. У дисертації викладені результати теоретичних та експериментальних досліджень, проведених особисто. Здобувач провела, збір та аналіз літератури вітчизняних і зарубіжних авторів, взяла участь у розробці анкет для збору бази даних у хворих з гарячкою та осіб, серед яких проводився серологічний моніторинг поширеності збудників ГГНС. Провела лабораторні обстеження 764 хворих, які поступали в інфекційні відділення Закарпатської, Волинської областей із симптомами, що не виключали ГГНС, і 2000 здорових осіб (парні сироватки, відібрані з інтервалом в один рік) з метою встановлення поширеності збудника ГГНС серед населення, яке проживає на територіях дослідження. У загальному дослідила в ІФА 1438 сироваток крові хворих з гарячковими станами і 3961 – здорового населення, в ІХА – 43 сироватки хворих з гарячкою. У всіх зазначених вище осіб шляхом анкетування на добровільних засадах отримала інформацію для вивчення чинників ризику інфікування вірусами ГГНС, провела підрахунок показників на засадах доказової медицини.

Під час експедиційних виїздів взяла участь у вилові мишовидних гризунів, відборі взірців для лабораторних досліджень і титруванні сироваток крові тварин на наявність антитіл (АТ) до хантавірусів; відборі взірців крові населення, збору бази даних під час когортних досліджень.

Автором систематизована база даних, проведені узагальнення й статистична обробка результатів та їх аналіз із підрахунком показників, що характеризують тенденції, направленість досліджуваних явищ у розрізі адміністративних територій; обґрунтовані висновки. Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Всі розділи дисертації та публікації по темі дисертації написані автором під керівництвом д. мед. н., професора Виноград Н.О.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися й обговорювалися на першій Міжнародній науково-практичній конференції “Специфічна діагностика інфекційних хвороб” (Київ, 2004 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Екологія. Людина. Суспільство” (Київ, 2004 р.); Науково-практичній конференції й пленумі Асоціації інфекціоністів України “Вірусні хвороби, токсоплазмоз, хламідіоз ” (Тернопіль, 2004 р.); XIV з’їзді українського науково-медичного товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів (Полтава, 2004 р.); Науково-практичній конференції “Хіміотерапія і імунопрофілактика інфекційних хвороб” (Тернопіль, 2005 р.); Науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 60-річчю Ужгородського національного університету “Сучасні методи діагностики та лікування хронічних гепатитів, цирозів, гепатогенної виразки, портальних гастропатій та енцефалопатій у клініці внутрішніх та хірургічних хвороб” (Ужгород, 2005 р.); Міжнародній науковій конференції “Актуальні питання боротьби з інфекційними хворобами в гуманній і ветеринарній медицині”, присвяченій 160-річчю з дня народження І.І. Мечникова (Харків, 2005 р.); Міжнародній конференції “Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології та гігієни” (Львів, 2006); IX конгресі СФУЛТ (Полтава - Київ - Чикаго, 2006 р.); VІI з’їзді інфекціоністів України “Інфекційні хвороби – загальномедична проблема” (Миргород, 2006); Нараді-семінарі з актуальних питань епідеміології і профілактики зооантропонозних інфекційних хвороб та режиму безпеки в лабораторіях державної санітарно-епідеміологічної служби МОЗ України (Дніпропетровськ, 2007 р.); Международной научно-практической конференции “Молекулярная диагностика инфекционных болезней” (Минск, 2007 р.); V Міжнародній науково-практичній конференції “Біоресурси і віруси” (Київ, 2007 р.); Нараді-семінарі “Актуальні проблеми профілактики особливо небезпечних інфекцій та біологічної безпеки” (Одеса, 2007 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових робіт, у тому числі 4 статті у наукових фахових виданнях, що входять до переліку, затвердженого ВАК України. Матеріали дисертації представлені на конференціях і з’їздах – 13 тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, 6 розділів, висновків. Робота містить 13 таблиць, 36 рисунків. Список використаних джерел складається із 208 найменувань. Зміст роботи викладено на 160 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Представлено сучасні дані щодо екологічних і медико-соціальних аспектів хантавірусних інфекцій і як уже відомих особливо небезпечних збудників природно-осередкових зооантропонозів, і як “нових” інфекційних агентів, що виникають; і як збудників, що потенційно можуть бути використані з біотерористичною метою. Розглянуто основні особливості хантавірусів: їх поліморфізм і, як наслідок, – поліетіологічність захворювань, що ними спричиняються; поліпатогенність, що обумовлює здатність інфікувати людей; полігостальність і взаємозв’язок інтенсивності циркуляції інфекційних агентів серед тварин і захворюваності людей; різноманітність клінічних проявів, що обумовлює складність клінічної та лабораторної діагностики. Подано сучасні підходи до лабораторної діагностики хантавірусних інфекцій у світі.

Матеріали і методи досліджень. Виконана робота є результатом комплексних клініко-лабораторних досліджень, проведених із застосуванням сучасних серологічних і молекулярно-генетичних методів діагностики ГГНС.

Під час виконання роботи були досліджені сироватки крові 764 хворих інфекційних відділень шести центральних районних лікарень Закарпаття (В.-Березнянський, Хустський, Мукачівський, Ужгородський, Виноградівський, Берегівський райони) і однієї – Волині (Володимир-Волинський район), обласної інфекційної лікарні м. Ужгорода, які відбиралися для лабораторної верифікації діагнозу за принципом синдромального нагляду при особливо небезпечних інфекціях. Сироватки крові пацієнтів, залучених у дослідження, по можливості відбиралися двічі: у період розпалу хвороби і реконвалесценції – у 674 пацієнтів; у 72 госпіталізованих із діагнозами, що не виключали ГГНС, було досліджено сироватки періоду розпалу хвороби, а у 18 – сироватки лише періоду реконвалесценції у зв’язку з пізнім зверненням хворих до лікувальних закладів. Разом досліджено 1438 сироваток крові. Було визначено три основні синдромальні комплекси, при яких хворий міг бути обстежений лабораторно:

- недиференційовані гарячкові захворювання (температура > або = 38 °С) і два чи більше із таких проявів: сильний біль голови, біль в параорбітальній ділянці, фотофобія, сильний біль у м’язах, у суглобах, висип, лейкопенія, протеїнурія, жовтяниця;

- підозра на менінгіт, енцефаліт у пацієнтів, які поступали з гарячкою (температура > або = 38 °С) із одним чи більше із таких проявів: оніміння шиї, набухання тім’ячка у дітей, місцева неврологічна симптоматика, сплутаність свідомості, висип або плями на шкірі, напади, порушення чутливості чи порушення координації рухів;

- підозра на геморагічну гарячку в хворих, які поступали з гарячкою (температура > або = 38 °С) із одним чи більше із таких симптомів: геморагічні прояви (синці, петехії, кровотечі ясен, кишкова, маткова кровотечі), сильний біль голови чи в параорбітальній ділянці, протеїнурія.

Другою умовою для включення у дослідження було отримання інформованої форми згоди від хворого про добровільну участь у ньому. Вивчались соціально-побутові умови проживання, особливості діяльності, поведінкові характеристики осіб, у яких підтверджено або відхилено лабораторно діагноз ГГНС.

У дослідження були включені 2000 жителів сіл, розташованих на територіях природних осередків ГГНС, які, після отримання інформованої форми згоди, залучалися до когортних досліджень двічі з інтервалом в один рік. Для вивчення популяційного імунітету було обстежено 3961 сироватку крові: 2000 – у перший рік, 1961 – через рік (від тих самих осіб). У 39 осіб кров не була повторно відібрана через об’єктивні причини (від’їзд із місця проживання, смерть тощо).

Вилов мишовидних гризунів (70 тварин шести видів) проводився з використанням живоловок, потім їх присипляли з використанням ефіру; відібрані сироватки крові, паренхіматозні органи формували у пули від трьох тварин.

Дослідження мали багатоплановий етапний характер. На першому етапі вивчався стан проблеми ГГНС у світі й в Україні за даними друкованих джерел. Усього було проаналізовано 208 першоджерел. На другому етапі встановлювали інфікованість певних видів тварин-резервуарів хантавірусами, визначали види, що є потенційно небезпечні для людей. Під час виконання третього етапу проводились лабораторні обстеження сироваток крові осіб із симптомами, що не виключали ГГНС, збір у них клінічного і епідеміологічного анамнезу. Четвертий етап – когортні дослідження – дав можливість оцінити інтенсивність циркуляції хантавірусів серед населення, яке проживало на території природних осередків. На п’ятому етапі розроблено і запропоновано найбільш ефективний алгоритм лабораторної діагностики ГГНС, як важливої ланки моніторингу хантавірусних інфекцій, проведено інтерпретацію отриманих результатів і зіставлення їх з відомими даними в Україні та світі, сформульовані висновки.

Серологічні дослідження на ГГНС проводилися у науковій лабораторії кафедри епідеміології ЛНМУ імені Данила Галицького МОЗ України (госпітальний нагляд, епізоотологічний етап) і вірусологічній лабораторії Закарпатської обласної СЕС (когортні дослідження) за стандартними порядками дій, рекомендованими ВООЗ.

На етапі госпітального нагляду у парних сироватках крові хворих в ІФА (“Focus”, США) визначали наявність АТ класів IgM та IgG до родоспецифічного (HTA) антигену (АГ) хантавірусів. Позитивні взірці та ті, що знаходилися у “сірій зоні”, тестувалися на наявність видоспецифічних IgM до АГ вірусів Hantaan (HTN) і Puumala (PUU), а також IgG до вірусу Hantaan. Використані тести для ІХА для визначення IgM до хантавірусів видів Hantaan, Puumala, Dоbravа/Веlgrаde і Seoul, а також вірусів москітних лихоманок – тест-система recomLine Bunyavirus MIKROGEN.

Зворотна транскрипція в ПЛР і секвенування геномів проведені у лабораторії Регіонального центру ВООЗ з інфекцій, що виникають, який розташований у Єгипті на базі NAMRU-3 (Каїр), і результати нам люб’язно надані, за що ми висловлюємо щиру вдячність.

Із метою вивчення соціально-демографічних характеристик обстеженого населення, визначення територій ризику, тенденцій захворюваності проаналізовано 764 епідеміологічні анкети хворих з гарячкою (госпітальний нагляд) і 2000 анкет осіб здорового населення (когортні дослідження). Первинну базу даних систематизували за ознаками, розрахували кількісні і якісні показники. При трактуванні отриманих даних проводилась оцінка їх вірогідності, встановлювалися корелятивні зв’язки між явищами та тенденції. Обробку статистичного матеріалу здійснено на персональному комп’ютері Pentium ІV із використанням стандартного пакета прикладних програм Microsoft Office (Microsoft Excel 2003) і статистичної програми Statistica.

Епізоотологічні аспекти формування і функціонування природних осередків ГГНС на заході України. В результаті проведеного аналізу фауно-флористичних особливостей Волині і Закарпаття встановлено ймовірність існування осередків ГГНС з потенційною небезпекою поширення хантавірусів серед населення регіону, оскільки фоновими представниками ссавців у західних областях України є мишовидні гризуни. Так, жовтогорла миша (Ароdеmus flavicollis), полівка руда (Сlеthrіonomys glareolus) є домінантними видами; польова миша (Ароdemus agrаrіus) – багаточисельним видом; сірий щур (Rattus spp.), полівка звичайна (Місrоtus аrvаlіs) – звичайними видами. Склад гризунів представлений видами, які можуть бути потенційно резервуарами ряду видів хантавірусів. Відповідно на цих територіях імовірно можуть бути поширені хантавіруси видів Dоbravа/Веlgrаde, Наntaan, Рuumala, Vladivostok, Тulа.

Серологічні дослідження крові виловлених гризунів (польова миша, миша жовтогорла, звичайна бурозубка, руда полівка тощо) були проведені в ІФА з АГ до Наntaan і Рuumala і АТ до Наntaan були виявлені у (74,5±6,4) % досліджених польових мишей (Ароdemus agrаrіus) (рис. 1). Результати досліджень сироваток від інших видів гризунів були негативними в ІФА. Наявність вірусу Наntaan шляхом детекції геному в ПЛР була показана в Ароdеmus agrаrіus, але, окрім того, в цьому ж виді було виявлено геноми вірусу Dоbravа/Веlgrаde, що є новим для науки, оскільки досі встановленим резервуаром для цього виду хантавірусу була лише жовтогорла миша (Ароdеmus flavicollis).

Це свідчить про міжвидовий перехід Dоbravа/Веlgrаde від одного виду мишей до іншого, що суттєво змінює епізоото-епідеміологічні характеристики ГГНС.

Роль лабораторних методів дослідження в контролі поширеності хантавірусів серед людей. При проведенні досліджень хворі на ГГНС виявлені в усіх шести районах Закарпаття та Володимир-Волинському районі Волинської області, їх частка в структурі групи осіб із гарячковими захворюваннями становила (24,2±1,6) % (табл.1).

Таблиця 1

Кількість осіб із позитивним результатом дослідження сироваток на хантавіруси

серед хворих з гарячкою в районах обстеження

Район | Всього обстежено хворих (абс.) | Кількість осіб із позитивним результатом

абс. | M±m, (%) | на 100 тис.нас.

В.-Березнянський | 107 | 35 | 32,4±4,5 | 124,1

Хустський | 110 | 28 | 25,5±4,2 | 21,7

Мукачівський | 99 | 20 | 20,2±4,0 | 10,9

Ужгородський | 119 | 29 | 24,5±3,9 | 14,9

Берегівський | 121 | 27 | 22,3±3,8 | 33,3

Виноградівський | 120 | 30 | 25,0±4,0 | 25,4

Вол.-Волинський | 88 | 16 | 18,2±4,1 | 24,4

Всього | 764 | 185 | 24,2±1,6 | не підр.

Найбільша кількість випадків захворювань на ГГНС виявлена серед хворих з гарячкою у В.-Березнянському районі – (32,4±4,5)найнижчий рівень ураженості хантавірусами встановлено у Мукачівському районі Закарпаття і Володимир-Волинському районі. Показано достовірний кореляційний зв’язок (r – ,679, p<0,05) частки виявлених хворих ГГНС та територій з певними клімато-географічними характеристиками. Найвищий ІП (124,1 на 100 тис. населення) виявлений у В.-Березнянському районі, що перевищувало встановлений середній показник для Закарпаття у 3,4 разу.

Третина гарячкових хворих із верифікованим діагнозом „ГГНС” були уражені вірусом Наntaan (30,3±3,4)(9,7±2,2) % – вірусом Рuumala, а (17,8±2,8) % – мали змішане інфікування Наntaan і Рuumala (рис.2).

У (42,2±3,63) % хворих, уражених хантавірусами, не вдалося ідентифікувати вид збудника при титруванні першої сироватки крові, що може свідчити про циркуляцію у цьому регіоні інших видів хантавірусів. Виявлена різниця у територіальному поширенні видів хантавірусів. Близько двох третин сироваток крові з В.-Березнянського і Хустського районів були позитивними до Hantaan і Puumala і лише третина залишилися неідентифікованими до виду. При розтитровці до виду позитивних за родоспецифічним (НTA) АГ не вдалося встановити види хантавірусів, що циркулюють у Берегівському районі, оскільки всі сироватки виявилися негативними до вірусів Hantaan і Puumala (табл. 2). Логічним є припустити циркуляцію на західних теренах держави щонайменше хантавірусів виду Dоbrаvа/Веlgrаde, який виявлений у мишовидних гризунів при польових експедиційних дослідженнях, і, за літературними даними, розповсюджений у Східній і Центральній Європі. Не виключена можливість циркуляції і виду Tula.

За нашими даними більше виявлялося поєднане ураження обома видами – Hantaan і Puumala, аніж моноінфекція. Відомий на сьогодні постулат щодо абсолютно облігатної залежності виду збудника і його резервуару-тварини при формуванні паразитарних систем не дає адекватного пояснення виявленому факту.

Аналіз первинних клінічних діагнозів засвідчив відсутність настороженості медичних працівників щодо ГГНС і неможливість коректної постановки діагнозу лише за синдромальним принципом клінічної діагностики.

Таблиця 2

Розподіл сироваток хворих за IgM до родо- і видоспецифічних АГ у гострий період хвороби

Район | Показники | Всього

позит. за родосп. АГ | У тому числі виявлено АТ

IgM HTA, видосп. неідентифі-ковані | IgM HTA,

IgM HTN | IgM HTA, IgM PUU | IgM HTA,

IgM HTN,

IgM PUU

В.-Березнян-ський | Абс. | 19 | 6 | 2 | 5 | 6

M±m, (%) | 100 | 31,6±10,6 | 10,5±7,0 | 26,3±10,1 | 31,6±10,6

Хустський | Абс. | 14 | 5 | 6 | - | 3

M±m, (%) | 100 | 35,7±12,8 | 42,9±13,2 | - | 21,4±10,9

Мукачівський | Абс. | 4 | 1 | 1 | - | 2

M±m, (%) | 100 | 25,0±21,6 | 25,0±21,6 | - | 50,0±25,0

Ужгородський | Абс. | 16 | 5 | 3 | 1 | 7

M±m, (%) | 100 | 31,3±11,6 | 18,8±9,7 | 6,3±6,0 | 43,8±12,4

Берегівський | Абс. | 7 | 7 | - | - | -

M±m, (%) | 100 | 100 | - | - | -

Виноградів-ський | Абс. | 14 | 12 | 1 | - | 1

M±m, (%) | 100 | 85,7±9,3 | 8,3±7,3 | - | 8,3±7,3

Волод. Волинський | Абс. | 3 | 2 | - | - | 1

M±m, (%) | 100 | 66,7±27,3 | - | - | 33,3±27,2

У досліджених сироватках, відібраних у перші дні хвороби, виявлено різноманітні варіанти поєднання АТ як за класами – IgM і IgG, так і видами хантавірусів, що індукували їх продукцію, дані щодо цього наведені на рисунку 3. Очевидно, що інфікування людини одним видом хантавірусу не формує перехресного імунітету до інших видів, і протективними є видоспецифічні АТ. Доказом чого є виявлені комбінації видо- і родоспецифічних АТ різних класів у сироватках крові хворих на ГГНС.

Визначення динаміки наростання АТ в сироватках крові показало, що вже на 5-й день від появи клінічних симптомів хвороби більше як у половини обстежених хворих із верифікованою ГГНС були виявлені діагностичні титри АТ до хантавірусів, як видно з рисунка 4.

Отже, при обстеженні гарячкових хворих із нез’ясованими діагнозами серологічні дослідження щодо ГГНС першої сироватки крові доцільно проводити у терміни від 5-го дня. При важких клінічних формах перебігу хвороби у хворих, які перебувають на діалізі, ці терміни можуть бути здовжені до 14-го дня, що відповідає відбору другої сироватки крові при заборі парних взірців, а від’ємний результат титрування першої сироватки і позитивний – другої є вагомим доказом етіології захворювання.

Дослідження парних сироваток виявило у різноманітних поєднаннях родоспецифічні АТ до хантавірусів і видоспецифічні АТ класу IgM до Hantaan і Puumala зі суттєвим зростанням у всіх районах кількості серопозитивних до хантавірусів хворих. Найбільше це мало місце в Мукачівському і Берегівському районах, де позитивних знахідок стало у 4,5 і 3 рази більше, ніж при дослідженні першого взірця крові. В усіх районах переважали хворі, уражені вірусом Hantaan як у вигляді моноінфекції, так і поєднаного інфікування з вірусом Puumala. У Виноградівському районі взагалі не встановлено моноінфекції, викликаної вірусом Puumala, а у В.-Березнянському районі відсоток таких хворих був значним – (30,3±8,0) %, тут була і значна частка хворих з мікст-інфекціями – (18,2±6,7) %.

У цілому кількість позитивних сироваток проти Hantaan була вищою, ніж проти Puumala – (24,3±3,4) % і (14,0±2,8) % відповідно, а прошарок хворих із мікст-інфекціями, викликаними двома вірусами – Hantaan і Puumala, становив (9,6±2,4) % (рис. 5). Отже, можливість зараження людини одночасно або послідовно різними видами хантавірусів залежить від обставин, що визначають таку ймовірність. У певної частини хворих при серологічних обстеженнях другої сироватки було виявлено продукцію обох класів АТ до хантавірусів – IgM і IgG або наявність лише IgG.

При дослідженні парних сироваток на наявність АТ класу IgM виявлено приріст позитивних випадків захворювань людей на ГГНС, що свідчить про нещодавнє інфікування хворих хантавірусами. Випадки виявлення лише у другій сироватці крові IgM, були використані для оцінки тривалості інкубаційного періоду із врахуванням даних епідеміологічного анамнезу. Наявність АТ класу IgM у другій сироватці могло бути і результатом пізнього імунологічного старту при імуносупресії, оскільки частіше спостерігалося при поєднаному інфікуванні двома хантавірусами.

Оскільки майже у четвертої частини обстежених гарячкових хворих при титруванні парних сироваток верифіковано ГГНС, наступним завданням наших досліджень було вивчення поширеності хантавірусів Hantaan і Puumala серед сукупного населення при проведенні когортних досліджень серед жителів чотирьох сіл: Берегівського (с. Варі), Мукачівського (с. Чинадієво), Хустського (с. Вилятино) і В.-Березнянського (с. Кострино) районів Закарпатської області, що були розташовані на різних територіях.

Вибір населених пунктів проводився на підставі епідеміологічної інформації, отриманої при дослідженнях, базованих на результатах попередньо проведеного госпітального нагляду, що свідчила про активність природних осередків ГГНС.

Результати титрування сироваток у перший рік досліджень виявили високий рівень серопозитивності серед обстеженого населення, що суттєво відрізнялися в різних клімато-географічних зонах (рис. 6), і свідчили про високу активність прихованого епідемічного процесу ГГНС.

Розрахований коефіцієнт рангової кореляції Спірмена між часткою осіб, які мали IgG до хантавірусів та територіями дослідження, що знаходяться у різних ландшафтних зонах, виявився оберненим та сильним (r= –1, р<0,05). Тенденція до зниження імунного прошарку до хантавірусів від гірської зони до рівнинної описана за допомогою рівняння показникової функції (рис. 6).

Найвищі показники отримані у гірській зоні – В.-Березнянському районі (с. Кострино) – (29,8±2,0) % позитивних осіб до вірусів Hantaan і Puumala, що перевищували сумарний показник у 2,3 разу (рис. 7). Другою особливістю був високий рівень поєднаного виявлення АТ до обох досліджуваних вірусів, який сягнув (59,7±4,0) % від загальної кількості позитивних знахідок, а співвідношення серопозитивних осіб до вірусів Puumala і Hantaan становило 1:1,5. У той же час, в іншому гірському районі (с. Вилятино) поєднане ураження двома зазначеними вірусами виявлено у 8,1 разу рідше, тоді як АТ до вірусу Hantaan виявлялися в такій же кількості випадків (7,2±1,2)а випадків інфікування вірусом Puumala взагалі не виявлено. На рівнинній території у Берегівському районі (с. Варі), було виявлено лише одну особу з АТ до вірусу Puumala у моноінфекції, тоді як у поєднанні з вірусом Hantaan, як і у В.-Березнянському районі, це мало місце частіше, і в цілому переважало ураження вірусом Hantaan (моноінфекція).

Результати обстеження населення с. Чинадієво (Мукачівський район), що розташоване у перехідній ландшафтній зоні, були подібні до таких у В.-Березнянському районі за структурою і варіантами поєднання АТ до видів хантавірусів.

Серед загальної кількості позитивних до хантавірусів осіб переважали люди, які мали АТ до обох видів вірусів, а при моноінфікуванні – Hantaan, отже, віруси виду Hantaan є більш актуальними із хантавірусів у патології людей на заході України (рис. 7). Існує нагальна потреба у поглибленому вивченні епідеміологічних і епізоотичних характеристик цієї проблеми в державі у цілому.

Вивчення рівня продукції АТ до обох вірусів показало, що хантавіруси є високоімуногенними збудниками – титри АТ класу IgG в сироватках крові 29 осіб із 36 позитивних до вірусу Hantaan коливалися у межах 1:400-1:1600. Це, можливо, зумовлено нещодавнім інфікуванням, але не варто виключати і багаторазове поступлення збудника, свого роду бустер-ефекту, що і підтримує продукцію високих титрів АТ.

Ще більш високі показники були щодо вірусу Puumala, де із 24 позитивних осіб у 20 титри АТ сягали 1:400-1:6400. При поєднаному ураженні обома вірусами у 73 осіб із 89 титри АТ були в тих же межах і вище, що свідчить про адитивний ефект при змішаному інфікуванні.

Дані когортних досліджень підтвердили існування у всіх ландшафтних зонах Закарпаття природних осередків ГГНС з найвищим ступенем активності у В.-Березнянському районі. При повторному серологічному обстеженні визначеної когортної групи спостерігався приріст інфікованих осіб серед жителів, які були задіяні у дослідження. Показник ураження людей вірусом Hantaan виріс на (2,1±0,3) %, параметри приросту мікст-інфікування – (1,5±0,3) %, зросла і кількість уражених вірусом Puumala на (1,1±0,2) %. Таким чином, тенденція до зростання кількості уражених хантавірусами серед населення різних ландшафтних зон Закарпаття свідчить про високий рівень активності осередків ГГНС.

Вперше використані ІХА тести виробництва фірми „Mikrogen” (Німеччина), що дають можливість визначити у сироватці чи плазмі крові АТ класів IgM та IgG до видоспецифічних АГ хантавірусів Hantaan, Рuumala, Dоbravа/Веlgrаde, Seoul і вірусів москітних лихоманок. Зіставлення результатів титрування у паралельному дослідженні з використанням ІХА recomLine Bunyavirus MIKROGEN і ІФА ”Focus” 43 сироваток крові сезонних хворих з гарячкою на наявність IgM проти хантавірусів виявило суттєву розбіжність у результатах. Із 8 позитивних в ІФА сироваток до родоспецифічного АГ лише одна була позитивною в ІХА, при цьому хвора була уражена обома видами хантавірусів: Hantaan і Puumala. Чутливість ІХА тест-системи у порівняльних дослідженнях проти ІФА ”Focus” (США) становила 12,5 %. Це не дає можливості рекомендувати використання тестів прискореної діагностики в ІХА в практичній службі як лабораторної ланки, так і лікувальної мережі західного регіону України, а потребують подальшого детального вивчення і дослідження причин розбіжності результатів паралельного титрування.

Дослідження в ПЛР сироваток хворих з гарячкою дозволили виявити геноми хантавірусів Hantaan і Puumala, в тому числі й одночасне ураження людини обома видами. Цей блок досліджень засвідчив, що ПЛР є високоспецифічним тестом для виявлення хантавірусів, її використання відкриває можливості вивчення багатьох проблемних питань патогенезу і епізоото- епідеміологічних закономірностей ГГНС, а впровадження ПЛР є актуальним для України, в тому числі й для діагностики особливо небезпечних інфекцій.

Алгоритм лабораторної діагностики ГГНС. За результатами роботи впроваджені у мережу практичної охорони здоров’я на заході держави ряд стандартних порядків дій, рекомендованих ВООЗ, що оптимізують вірусологічну діагностику ГГНС. Із врахуванням структури надання медико-профілактичної допомоги населенню держави, запропоновані підходи у специфікації груп хворих за синдромальним наглядом для лабораторного обстеження на ГГНС, підходи у формуванні клініко-епідеміологічних даних пацієнтів. Алгоритм вірусологічної діагностики ГГНС включає забір, транспортування, зберігання клінічного матеріалу в залежності від методу дослідження, вибір вірусологічних методів діагностики ГГНС та їх інтерпретацію (рис. ).

Рис. 8. Схема вірусологічного дослідження на хантавіруси хворих із підозрою на ГГНС.

Зазначені підходи дозволяють оптимізувати вірусологічну діагностику ГГНС у комплексі нагляду за поширенням хантавірусних інфекцій у державі.

ВИСНОВКИ

У роботі вирішено актуальне наукове завдання – встановлено оптимальні параметри організації лабораторної ланки моніторингу природних осередків хантавірусних інфекцій в Україні, відповідно до сучасних світових стандартів і досягнень в лабораторній діагностиці особливо небезпечних хвороб, як базису для контролю за цими захворюваннями на території держави. Розроблено та запроваджено алгоритм вірусологічної діагностики ГГНС у розрізі госпітального синдромального нагляду і когортних досліджень, що дозволило визначити сучасний стан проблеми хантавірусних інфекцій в західноукраїнському регіоні.

1. Серологічні обстеження гризунів виявили високу ураженість польової миші (Ароdemus agrаrіus) вірусом Hantaan – (74,5±6,4) %. За даними ПЛР, Ароdemus agrаrіus були інфіковані як вірусом Hantaan, так і Dоbravа/Веlgrаde, що свідчить про міжвидовий перехід Dоbravа/Веlgrаde, для якого досі встановленим резервуаром була лише жовтогорла миша (Ароdеmus flavicollis).

2. Геморагічна гарячка з нирковим синдромом є актуальним природно-осередковим захворюванням для західноукраїнського регіону – Закарпатської й Волинської областей, про що свідчить висока частка підтверджених випадків ГГНС в ІФА – (24,2±1,6) % серед хворих із гарячковими станами нез’ясованого ґенезу. Показано достовірний кореляційний зв’язок (r= – ,679, p<0,05) частки виявлених хворих ГГНС та територій з певними клімато-географічними характеристиками. Найвищий ІП (124,1 на 100 тис. населення) виявлений у В.-Березнянському районі, що перевищувало встановлений середній показник для Закарпаття у 3,4 разу.

3. Домінуючими видами хантавірусів, що уражають людей у західному регіоні, є віруси Hantaan – (30,3±3,4) % серед хворих з гарячкою і Puumala – (9,7±2,2) %. Вищий відсоток серопозитивних результатів із родоспецифічним антигеном, ніж до ідентифікованих видоспецифічних, свідчить про циркуляцію інших видів хантавірусів, що спричиняють ГГНС у людей в цьому регіоні держави.

4. За результатами серологічних обстежень при когортних дослідженнях встановлено високу ураженість хантавірусами населення всіх ландшафтних зон Закарпаття. Рівні серопозитивності до вірусів Hantaan коливалися від (2,6±0,7) % до (7,2±1,2) % та Puumala – 0 - (4,8±1,0) %. Встановлено зниження імунного прошарку до хантавірусів від гірської зони до рівнинної (r – , р<0,05).

5. Встановлено факти ураження людей як одним видом хантавірусів, так і поєднаного інфікування вірусами Hantaan і Puumala. Серед хворих з гарячковими станами мікст-інфекція була виявлена у (17,8±2,8) %, серед сукупного населення при когортних дослідженнях – (6,4±0,5) %.

6. Розроблено і перевірено в польових умовах алгоритм вірусологічної діагностики ГГНС, що є важливою ланкою моніторингу хантавірусних інфекцій на ендемічних територіях.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті у наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України:

(*– особистий внесок здобувача)

1. Виноград Н.О., Козак Л.П., Буркало Т.В., Грицко Р.Ю. Геморагічна гарячка з нирковим

синдромом // Інфекційні хвороби. – 2004. – № 4. – С. 84-89 (* аналіз епізоотологічних, епідеміологічних, клінічних особливостей ГГНС за даними 22 першоджерел).

2. Виноград Н.О., Козак Л.П., Буркало Т.В. Клініко-патогенетичні особливості геморагічної гарячки з нирковим синдромом // Інфекційні хвороби – 2007. – № 1. – С. 5-9 (* аналіз даних 21 першоджерела щодо клініко-патогенетичних особливостей ГГНС).

3. Козак Л.П. Лабораторна діагностика геморагічної гарячки з нирковим синдромом // AML. – 2006. – Vol. 12, № 3-4. – P. 79-82.

4. Виноград Н.О., Козак Л.П., Буркало Т.В. Соціально-демографічні характеристики хворих на геморагічну гарячку з нирковим синдромом // Зб. наук. праць співробітників НМАПО ім. П.Л. Шупика. – Київ. – 2007. – вип. 16, Книга 4. – С. 591-597 (* серологічні дослідження на ГГНС хворих з гарячкою, створення бази даних, узагальнення результатів).

5. Виноград Н.О., Козак Л.П. Динаміка синтезу антитіл у хворих на геморагічну гарячку з нирковим синдромом // Зб. наук. праць співробітників НМАПО ім. П.Л. Шупика. – Київ. – 2007. – вип. 16, Книга 4. – С. 587-591 (* серологічні дослідження на ГГНС хворих з гарячкою, узагальнення та підрахунок результатів).

Роботи в інших наукових виданнях:

1. Виноград Н.О., Василишин З.П., Козак Л.П. Комплексна діагностика сезонних інфекцій //Специфічна діагностика інфекційних хвороб: Зб. мат. 1-ї Міжнародної науково-практичної конференції. – Київ, 2004. – С. 82-84 (* обґрунтовано принцип комплексності діагностики сезонних гарячкових станів).

2. Виноград Н.О., Буркало Т.В., Козак Л.П. Клінічні аспекти геморагічної гарячки з нирковим синдромом у Закарпатті // Вірусні хвороби, токсоплазмоз, хламідіоз: Зб. мат. науково-практичної конференції і пленуму Асоціації інфекціоністів України. – Тернопіль, 2004. – С. 25-26 (* аналіз епідеміологічних карт пацієнтів, створення комп’ютерної бази даних).

3. Виноград Н.О., Ірхарт К., Імед М., Булос Б., Козак Л.П., Буркало Т.В. Геморагічна гарячка з нирковим синдромом в структурі сезонних гарячкових станів // Тези доповідей XIV з’їзду українського науково-медичного товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів. – Полтава, 2004. – С. 196 (* аналіз показників захворюваності серед різних груп населення, створення комп’ютерної бази даних).

4. Виноград Н.О., Ірхарт К., Імед М., Булос Б., Козак Л.П.,