НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
КЛІХ ЛАРИСА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 577.12:543.554.2:546.36/42:636.028
ОБМІННІ ПРОЦЕСИ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ ПРИ ОТРУЄННІ ЦЕЗІЄМ І СТРОНЦІЄМ ТА ЗМІНІ КИСЛОТНО-ЛУЖНОГО СТАНУ
03.00.04 – біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України
Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор,
академік НАН України та УААН
Мельничук Дмитро Олексійович,
Національний аграрний університет,
ректор
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Калачнюк Григорій Іванович,
Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Гжицького, директор Науково-дослідного інституту біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин, професор кафедри органічної та неорганічної хімії
доктор біологічних наук, професор
Войціцький Володимир Михайлович,
Київський національний університет
імені Тараса Шевченка,
професор кафедри біохімії
Захист відбудеться ‹‹15›› травня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус № 4, кімн. 28
Автореферат розісланий ‹‹11››квітня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Є.А. Деркач
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Інтенсивність обмінних процесів у клітинах залежить від багатьох факторів і, в тому числі, від екологічної ситуації, в якій перебуває організм. Відомо, що в цих процесах, які відповідають за енергозабезпечення організму, беруть участь системи, до складу яких входять велика кількість ферментів, їх інтермедіати, нікотинамідні і залізопорфіринові комплекси, флавопротеїди, убіхінони, інші структури, що є складними хімічними сполуками, чутливими до будь-яких зовнішніх змін. Саме тому активність функціонування обмінних процесів залежить від хімічного складу внутрішнього середовища, його кислотно-лужного стану, вмісту відповідних субстратів, активаторів, інгібіторів каталізу тощо.
Солі важких металів за своїми властивостями є хімічно активними речовинами. Токсичність їх визначається здатністю впливати на динамічну хімічну рівновагу в системі живих організмів, що зумовлено утворенням міцних зв’язків із хімічними компонентами клітини, головним чином з біологічними молекулами. Проникаючи в організм тварин і людини, вони діють на клітинні мембрани, впливають на структуру та інтенсивність функціонування внутрішньоклітинних органел і біологічних молекул, спричиняють пошкодження мітохондрій – структур, в яких активно протікають окисно-відновні процеси (Мудрий І.В., Короленко Т.К., 2002; Гудков І.М., Вінничук М.М., 2003). Результатом цього є підвищення проникності мітохондріальної мембрани, що призводить до втрати нікотинамідних коферментів, адже тільки окиснена форма нікотин-амідаденіндинуклеотиду може проникати через пошкоджену мембрану, а відновлена залишається фіксованою всередині мітохондрій
(Ленінджер А., 1985). Це змінює співвідношення окиснених та відновлених форм нікотинамідних коферментів і впливає на стан обмінних процесів, гальмуючи реакції енергозабезпечення в організмі отруєних тварин.
Важкі метали цезій і стронцій у великій кількості потрапляють у навколишнє середовище в зв’язку з інтенсивним антропогенним забруд-ненням і, особливо, під час техногенних викидів підприємствами атомної, гірничо-видобувної, металургійної, хімічної, машинобудівної, паливно-енергетичної промисловості і комунального господарства. Накопичення цих металів призводить до розвитку ряду біохімічних змін в організмі, а період їх виведення є досить тривалим (Єршов Ю.О., Плетньова Т.В., 1989; Власик Л.І., 2000).
Дослідження механізмів токсичної дії важких металів на різні сторони обміну речовин та перетворення енергії багато років проводяться на кафедрі біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продук-ції імені акад. М.Ф. Гулого Національного аграрного університету під ке-рів-ництвом академіка Д.О. Мельничука. Вони спрямовані на вивчення порушень метаболізму, що виникають під впливом важких металів, з метою їх корекції і створення на цій основі методів лікування, а також орієнтовані на пошук ефективних способів прискореного виведення їх сполук з організму тварин (Мельничук Д.О., 1989; Мельникова Н.М. та ін., 2005).
У сучасній науковій літературі недостатньо вивчені питання впливу цезію та стронцію на стан обмінних процесів в організмі отруєних тварин. Не досліджено вплив цезієвої і стронцієвої інтоксикації на показники вуглеводного, азотного, мінерального обміну та способи корекції метаболічних порушень шляхом зміни параметрів кислотно-лужного стану організму. Цим зумовлена пріоритетність досліджень стану обмінних процесів в організмі щурів при введенні солей цезію і стронцію та виявлення впливу змін параметрів кислотно-лужного стану на інтенсив-ність їх накопичення, а також на пошук способів прискореного виведення цих металів з організму тварин.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною науково-дослідної роботи кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого Національного аграрного університету: «Вивчити біохімічну характеристику тканин організму тварин, токсикованих важ-кими металами та розробити способи їх елімінації» (номер державної реєстрації 0106U003874) (2006 2010 рр.).
Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідити обмінні процеси в тканинах і органах щурів при отруєнні цезієм і стронцієм та вплив змін параметрів кислотно-лужного стану організму на інтенсивність їх накопичення.
Для досягнення мети роботи необхідно було вирішити такі завдання:
- розробити біологічні моделі введення щурам цезію і стронцію хлоридів;
- визначити особливості розподілу і накопичення цезію та стронцію в тканинах та органах отруєних щурів;
- з’ясувати вплив солей цезію і стронцію на вміст натрію, калію, магнію, кальцію в тканинах та органах отруєних щурів;
- дослідити стан окисно-відновних систем гліколізу й циклу трикарбонових кислот у печінці щурів, отруєних цезію і стронцію хлоридами;
- провести дослідження показників азотного обміну в крові щурів за умов уведення солей стронцію і цезію;
- дослідити показники кислотно-лужного стану крові в щурів за умов уведення їм солей цезію і стронцію;
- дослідити вплив зміни параметрів кислотно-лужного стану крові на вміст цезію і стронцію в органах щурів за умов уведення їх солей.
Об’єкт дослідження – біохімічні механізми регуляції обмінних процесів в організмі щурів за умов уведення тваринам солей цезію і стронцію та вплив змін параметрів кислотно-лужного стану на інтенсивність накопичення цих важких металів.
Предмет дослідження показники вуглеводного, азотного, мінерального обміну і кислотно-лужного стану, кров, печінка, нирки, м’язи та кістки білих лабораторних щурів.
Методи дослідження ферментативні (показники гліколізу та циклу трикарбонових кислот), спектрофотометричні (показники мінерального, азотного, вуглеводного обміну, активність ферментів), потенціометричні (показники кислотно-лужного стану) та статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Показані особливості розподілу та накопичення солей стронцію і цезію в серці, нирках, печінці, м’язах та кістках щурів при внутрішньочеревному їх введенні. Вперше встановлено, що введення щурам цезію і стронцію хлоридів спричиняє зміни рівня основних інтермедіатів, які характеризують стан обмінних процесів. Виявлено зниження інтенсивності окисно-відновних процесів у їх організмі, що зумовлює виникнення явища субкомпенсованого мета-болічного ацидозу. Введення щурам солей вказаних металів призводить до зниження активності лактатдегідрогенази і амінотрансфераз у печінці та крові. Виявлено, що в умовах in vitro стронцій та цезій знижують активність лактатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази і малат-дегідрогенази. Встановлено, що введення щурам цезію і стронцію хлоридів призводить до зниження в крові вмісту аміаку та глутаміну за одночасної активації процесів сечовиноутворення. Поряд з цим, в організмі таких тварин спостерігається порушення мінерального обміну. Показано, що експериментальні зміни параметрів кислотно-лужного стану крові в бік метаболічного ацидозу сприяють прискоренню перерозподілу та зменшенню накопичення цезію й стронцію в організмі піддослідних щурів.
Наукова новизна одержаних результатів дисертаційної роботи підтверджена чотирма патентами на корисні моделі.
Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень поглиблюють сучасні уявлення про механізм негативної дії стронцію та цезію на внутрішньоклітинний метаболізм. Встановлено закономірності перерозподілу і накопичення цих важких металів у внутрішніх органах тварин, а також характер змін показників мінерального, вуглеводного, азотного обміну та параметрів кислотно-лужного стану в організмі щурів. Результати досліджень впроваджені в навчальний процес Дніпропетровського державного аграрного університету, Білоцерківського державного аграрного університету, Київського національного університету імені Тараса Шевченка, використовуються в науковій роботі Інституту екогігієни і токсикології
ім. Л.І. Медведя, Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, Інституту медицини праці Академії медичних наук України.
Отримані результати можуть стати фундаментальним підґрунтям для розробки нових ефективних способів профілактики та лікування продуктивних тварин за умов отруєння солями цезію та стронцію.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором під керівництвом доктора біологічних наук, академіка НАН України та УААН, професора Д.О. Мельничука. Разом із керівником сформульовано завдання роботи, сплановано напрями досліджень та проаналізовано отримані результати.
Відповідно до поставленої мети та завдань дисертаційної роботи автором проведено аналіз даних наукової літератури, виконано експе-риментальні дослідження, статистичну обробку одержаних результатів, написано і оформлено дисертаційну роботу.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень допові-далися на II і III Міжнародних наукових конференціях студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (2006 - 2007 р. р., м. Львів), наукових конференціях професорсько-викладацького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва НАУ (2006 - 2007 р. р., м. Київ), IX Українському біохіміч-ному з’їзді (2006 р., м. Харків), V Державній науково-практичній конфе-ренції «Аграрна наука виробництву» (2006 р., м. Біла Церква),
V Міжна-родному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (2007 р., м. Київ), II Міжнародній конференції молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери» (2007 р., м. Харків).
Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 18 робіт, з них - 6 статей у фахових наукових виданнях, що входять до переліку ВАК України, 12 тез у наукових збірниках конференцій та 4 патенти на корисні моделі.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду наукової літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, 8 додатків та списку використаних джерел, що включає 258 найменувань, з яких 73 латиницею. Робота викладена на 145 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 32 таблицями та 10 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. Дослідження виконували в науковій проблемній лабораторії кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого НАУ, в віварії факультету ветеринарної медицини, Українській лабораторії якості і безпеки продукції АПК, а також у відділі регуляції обміну речовин Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Для цього використали клінічно здорових самців білих лабораторних щурів 3-місячного віку, масою тіла 150 – 200 г, яких утримували в віварії на стандартному раціоні в клітках по 6 голів. Під час експерименту використано 240 тварин.
Отруєння щурів проводили впродовж 14 діб, шляхом щоденного внутрішньочеревного введення цезію та стронцію хлоридів у дозі 1/15 , із розрахунку 0,006 г стронцію хлориду або 0,01 г цезію хлориду на 0,1 кг маси тіла (Філов В.А., 2004). З метою моделювання стану метаболічного ацидозу і алкалозу щурам дослідних груп per os уводили 2 %-ний розчин HCl 4 мг на 0,01 кг маси тіла та NaHCO3 5 мг на 0,01 кг маси тіла (Мельничук Д.О. та ін., 1995).
Піддослідних тварин розділили на 9 груп по 8 особин у кожній. Досліди проводили згідно зі схемою: I інтактні щури (контроль); II щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид; ІІІ щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид з одночасним застосуванням НСl; ІV щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид з одночасним застосуванням розчину NaHCO3; V щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид, після чого впродовж 20 діб вводили розчин НСl; VI щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид; VII щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид з одночасним введенням розчину НСl; VIII щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид з одночасним введенням розчину NaHCO3; IX щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид, після чого впродовж 20 діб розчин НСl.
Для проведення біохімічних досліджень від щурів відбирали зразки печінки, нирок, серця, кісток, м’язів та крові.
Вміст цезію, стронцію, калію, натрію, магнію і кальцію в органах визначали спектрохімічним методом (Бруцке М.Е., 1982), використовуючи режим абсорбції в повітряно-ацетиленовому полум’ї на атомно-абсорбційному спектрофотометрі ААS–30, фірми «Карл Цейс» (Німеччина). Контролем слугували стандартні зразки розчинів металів, виготовлені в Інституті фізичної хімії НАН України (м. Одеса).
Показники кислотно-лужного стану рН, парціальний тиск вуглекислого газу (р СО2) і кисню (р О2), концентрацію бікарбонатів [НСО3-], загальну вуглекислоту (СО2 заг.) та зсув буферних основ (ЗБО) в крові визначали на мікроаналізаторі Blood Gas Analyzer фірми «Rоdelkis» (Угорщина) за методом Зіггард-Андерсена (1964).
Активність ферментів лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), малатдегідрогенази (МДГ, КФ 1.1.1.37), ізоцитратдегідрогенази (ІДГ, КФ 1.1.1.41) визначали в цитозольній фракції печінки та in vitro за рівнем поглинання НАД+ та НАДН (фірма «Merkck» та «Reanal»), на спектрофотометрі СФ-46, при л 340 нм.
Визначення концентрації інтермедіатів гліколізу та ЦТК (ізоцитрату, малату, лактату, пірувату, б-кетоглутарату і оксалоацетату) та глутамату в екстракті печінки проводили з використанням відповідних ферментів ЛДГ (із м’язів свині, «Fluka» (Німеччина)), МДГ (із серця свині, «Sigma» (США)), ІДГ (із печінки великої рогатої худоби, «Sigma» (США)). Оптичну густину дослідної проби вимірювали на спектрофотометрі СФ-46, при
л 340 нм (Комаров Ф.М. та ін., 2002).
Зміну величини співвідношення НАД+/НАДН та НАДФ+/НАДФН у цитозолі та мітохондріях клітин печінки з метою виявлення інтенсивності окисно-відновних процесів в отруєному організмі тварин розраховували за номограмним методом (Мельничук Д.О., 1987).
Рівень аміаку і глутаміну в крові визначали на спектрофотометрі СФ-46, при л 340 нм (Силакова А.І., Корнюшенко Н.П., 1969).
Концентрацію глюкози, сечовини, активність аланінаміно-трансферази (АлАТ, КФ 2.6.1.2) і аспартатамінотрансферази (АсАТ, КФ 2.6.1.1) у крові визначали на біохімічному аналізаторі Microlab-200 фірми «AVL» (Німеччина), з використанням реактивів фірми «Human» (Німеччина).
Експерименти проводили відповідно до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують в наукових цілях.
Результати досліджень обробляли статистично, з використанням комп’ютерної програми MS Excel (Кучеренко М.Є. та ін., 2001).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Результати проведених досліджень свідчать про значне накопичення цезію та стронцію в досліджуваних органах щурів (табл.1).
Таблиця 1
Вміст стронцію і цезію в тканинах та органах отруєних щурів, мг/кг
(М ± m, n = 8)
Органи | Стронцій | Цезій
інтактні
щури | щури, отруєні SrCl2 | інтактні
щури | щури, отруєні CsCl
М’язи | 0,061 ±
0,005 | 0,102 ±
0,015* | 0,011 ±
0,001 | 0,416 ±
0,030*
Печінка | 0,040 ±
0,005 | 0,061 ±
0,003 * | 0,0012 ±
0,0001 | 0,2740 ±
0,0300*
Серце | 0,0045 ±
0,0003 | 0,0090 ±
0,0007 * | 0,0010 ±
0,0001 | 0,0670 ±
0,0040*
Нирки | 0,010 ±
0,001 | 0,017 ±
0,002 * | 0,0046 ±
0,0003 | 0,1350 ±
0,0100*
Кістки | 0,065 ±
0,004 | 0,332 ±
0,035 * | 0,0093 ±
0,0005 | 0,3520 ±
0,0380*
Примітка. Тут і далі * Р < 0,05, результати вірогідні порівняно зі значеннями в групі інтактних тварин.
Показано, що в м’язах щурів, отруєних цезієм, його вміст зростає в середньому в 37, у печінці – в 228, у серці – в 67, у нирках – у 29,
у кістках – у 38 разів, а вміст стронцію у тварин, отруєних стронцію хлоридом, підвищується в середньому відповідно в 1,7; 1,5; 2; 1,7 і 5,1 раза.
Особливості перерозподілу цезію в організмі тварин визначаються тим, що він є хімічним аналогом калію і, потрапивши в організм, вступає в конкурентні відносини з останнім за включення в біохімічні процеси. Основна маса калію знаходиться в м’язах, що пояснює накопичення солей цезію в м’язовій тканині (Власик Л.І., 2000).
Відомо, що стронцій є природним аналогом кальцію і конкурує з ним за включення в остеобласти кісткової тканини організму отруєних тварин (Засєкін Д.А., 2004).
Встановлено, що надлишок важких металів змінює макроелементний склад внутрішніх органів піддослідних тварин (табл. 2).
Таблиця 2
Вміст натрію і калію у тканинах та органах щурів, отруєних цезію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи | Натрій | Калій
інтактні | отруєні | інтактні | отруєні
М’язи | 8,37 ± 0,80 | 4,83 ± 0,44* | 41,10 ± 3,62 | 23,63 ± 2,51*
Печінка | 2,69 ± 0,19 | 4,08 ± 0,43 * | 10,60 ± 0,91 | 16,54 ± 0,54 *
Серце | 1,42 ± 0,09 | 1,97 ± 0,16 * | 3,00 ± 0,23 | 4,11 ± 0,15 *
Нирки | 5,55 ± 0,07 | 3,42 ± 0,35 * | 7,46 ± 0,68 | 4,58 ± 0,26 *
Кістки | 21,10 ± 2,62 | 9,21 ± 0,97 * | 31,00 ± 2,42 | 15,54 ± 1,61 *
У м’язах, нирках та кістках щурів, отруєних цезію хлоридом, вміст натрію знижується в середньому відповідно в 1,7; 1,6 та 2,3 раза, а в печінці та серці підвищується в 1,5 та 1,4 раза. Аналогічні зміни спостерігаються і в перерозподілі калію та магнію (табл. 3). Вміст кальцію знижується в кістках у 2,7 раза та збільшується в м’язах, печінці, серці і нирках відповідно у 2,2; 3,6; 1,4 та 1,3 раза.
Таблиця 3
Вміст магнію та кальцію в тканинах та органах щурів, отруєних цезію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи | Магній | Кальцій
інтактні | отруєні | інтактні | отруєні
М’язи | 5,10 ± 0,47 | 1,81 ± 0,14* | 0,31 ± 0,01 | 0,67 ± 0,05*
Печінка | 0,40 ± 0,02 | 0,91 ± 0,07 * | 0,031 ± 0,001 | 0,113 ± 0,008 *
Серце | 0,20 ± 0,02 | 0,30 ± 0,01 * | 0,030 ± 0,002 | 0,042 ± 0,004
Нирки | 0,50 ± 0,04 | 0,39 ± 0,02 * | 0,066 ± 0,007 | 0,084 ± 0,004 *
Кістки | 9,80 ± 0,82 | 4,99 ± 0,34 * | 294,69 ± 16,55 | 108,29 ± 11,27 *
Інший розподіл елементів спостерігається в організмі щурів, отруєних стронцієм: у кістках підвищується вміст натрію, калію та магнію в 1,6 раза і знижується кальцію в 1,7 раза (табл. 4,5).
Таблиця 4
Вміст натрію та калію у тканинах та органах щурів, отруєних стронцію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи | Натрій | Калій
інтактні | отруєні | інтактні | отруєні
М’язи | 8,37 ± 0,80 | 6,43 ± 0,66 | 41,10 ± 3,62 | 32,87 ± 2,61*
Печінка | 2,69 ± 0,19 | 5,53 ± 0,27* | 10,65 ± 0,91 | 11,14 ± 0,86
Серце | 1,42 ± 0,09 | 2,66 ± 0,19 * | 3,00 ± 0,23 | 5,28 ± 0,55 *
Нирки | 5,55 ± 0,17 | 3,92 ± 0,27 * | 7,46 ± 0,68 | 7,77 ± 0,50
Кістки | 21,11 ± 1,62 | 33,66 ± 3,07* | 31,03 ± 3,42 | 50,88 ± 4,71 *
В інших органах вміст цього елементу підвищується: в м’язах – у 2,0 рази, печінці – в 3,5, серці в 1,8, нирках – у 1,5 раза. У м’язах вміст калію та магнію знижується відповідно в 1,3 та 1,7 раза, а натрію не змінюється.
Таблиця 5
Вміст магнію та кальцію у тканинах та органах щурів, отруєних стронцію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи | Магній | Кальцій
інтактні | отруєні | інтактні | отруєні
М’язи | 5,14 ± 0,47 | 3,00 ± 0,29* | 0,31 ± 0,01 | 0,64 ± 0,03*
Печінка | 0,42 ± 0,02 | 1,10 ± 0,05* | 0,031 ± 0,001 | 0,107 ± 0,005 *
Серце | 0,21 ± 0,02 | 0,46 ± 0,03 * | 0,030 ± 0,004 | 0,054 ± 0,004 *
Нирки | 0,59 ± 0,06 | 0,75 ± 0,08 | 0,066 ± 0,007 | 0,100 ± 0,010 *
Кістки | 9,82 ± 0,82 | 15,78 ± 1,54 * | 294,69 ± 16,55 | 170,90 ± 11,98 *
Вміст натрію, магнію та кальцію у серці і печінці підвищується, а калію не змінюється. В нирках вміст натрію знижується в 1,4 раза, а магнію та калію не змінюється. Отже, в результаті проведених досліджень можна стверджувати, що стронцій та цезій спричиняють перерозподіл макроелементів в організмі щурів.
Дослідження впливу важких металів на активність окремих ферментів гліколізу, циклу трикарбонових кислот та азотного обміну показали, що цезій і стронцій у печінці знижують активність ЛДГ (відповідно на 17 та 13 %), НАДФН - залежної ІДГ (відповідно на 26,4 та 37,3 %) (табл. 6).
Таблиця 6
Ферментативна активність у печінці та крові щурів, отруєних цезієм та стронцієм, мкмоль/хв/мг білка (М ± m, n = 8)
Фермент | Група
інтактні щури | щури, отруєні
CsCl | інтактні щури | щури, отруєні SrCl2
Лактатдегідрогеназа
(НАДН-залежна), печінка | 0,430 ±
0,020 | 0,358 ±
0,015* | 0,630 ±
0,010 | 0,550 ±
0,030*
Ізоцитратдегідрогеназа
(НАДФ+-залежна), печінка | 0,015 ±
0,001 | 0,013 ±
0,001 | 0,024 ±
0,003 | 0,025 ±
0,002
Ізоцитратдегідрогеназа
(НАДФН-залежної), печінка | 0,0053 ±
0,0004 | 0,0039 ±
0,0003* | 0,0059 ±
0,0005 | 0,0037 ±
0,0002*
Малатдегідрогеназа
(НАД+-залежна), печінка | 0,030 ±
0,003 | 0,029 ±
0,001 | 0,056 ±
0,002 | 0,052 ±
0,004
Малатдегідрогеназа
(НАДН-залежної), печінка | 0,13 ±
0,01 | 0,12 ±
0,01 | 0,25 ±
0,01 | 0,28 ±
0,03
Аспартатамінотрансфераза
(ммоль/мл), кров | 4,51 ±
0,17 | 3,44 ±
0,30* | 4,51 ±
0,17 | 3,07 ±
0,19*
Аланінамінотрансфераза
(ммоль/мл), кров | 2,51 ±
0,13 | 1,97 ±
0,07* | 2,51 ±
0,13 | 2,05 ±
0,04*
Активність НАДФ-залежної ІДГ та МДГ (як НАД+-залежної, так і НАДН-залежної) не змінюється. Вплив важких металів на активність вищезгаданих ферментів підтверджується і результатами досліджень, проведеними in vitro (табл. 7).
Таблиця 7
Вплив цезію та стронцію на активність ферментів за умов in vitro, мкмоль/хв/мг білка (М ± m, n = 8)
Фермент | Контроль | CsCl
(2мг/мл) | CsCl
(20мг/мл) | SrCl2
(2мг/мл) | SrCl2
(20мг/мл)
Лактатдегідрогеназа
(НАДН -залежна) | 1,33 ±
0,04 | 1,49 ±
0,01* | 0,91 ±
0,01* | 1,59 ±
0,02* | 1,10 ±
0,01*
Ізоцитратдегідрогеназа (НАДФ+-залежна) | 0,110 ±
0,010 | 0,099 ±
0,006 | 0,075 ±
0,004* | 0,085 ±
0,003 | 0,033 ±
0,003*
Ізоцитратдегідрогеназа (НАДФН-залежна) | 0,168 ±
0,010 | 0,114 ±
0,010* | 0,086 ±
0,003* | 0,138 ±
0,010* | 0,054 ±
0,004*
Малатдегідрогеназа (НАД+-залежна) | 0,64 ±
0,02 | 0,13 ±
0,02* | 0,067 ±
0,001* | 0,38 ±
0,03* | 0,23 ±
0,02*
Малатдегідрогеназа (НАДН-залежна) | 14,46 ±
0,61 | 9,83 ±
0,10* | 8,79 ±
0,15* | 9,95 ±
0,14* | 8,22 ±
0,43*
Активність досліджуваних ферментів залежить від концентрації важкого металу. Причому, введення як цезію, так і стронцію до складу інкубаційного середовища в концентрації 20 мг/мл знижує активність ЛДГ відповідно на 31,3 та 17,3 %, ІДГ НАДФ-залежної на 30,6 та 69,4 %, ІДГ НАДФН+-залежної на 48,8 та 67,9 %, МДГ НАД-залежної на 89,5 та 63,4 %, МДГ НАДН+-залежної на 39,2 та 43,1 %.
Активність ЛДГ при введенні цезію та стронцію до складу інкубаційного середовища в концентрації 2 мг/мл має тенденцію до підвищення, а активність інших досліджуваних ферментів знижується.
Виявлений характер змін може бути зумовлений здатністю металів брати участь у процесах комплексоутворення з природними лігандами, що містять тіолові групи, адже, згідно з даними літератури (Володіна Т.Т., Гулий М.Ф., 1984), важкі метали мають здатність входити до складу металоферментних комплексів, що може спричинити активацію або інгібування таких сполук.
Аналіз даних наукової літератури (Голіков С.М. та ін., 1986; Дельва Ю.В., Нейко Е.М., 1990) свідчить, що важкі метали є інгібіторами ферментних систем, хоча в мінімальних концентраціях вони є ефективними активаторами перебігу багатьох біохімічних реакцій, а за умов суттєвого надлишку блокують або сповільнюють цей процес.
Зв’язування тіолових груп призводить до зміни структури молекул, в результаті чого ферменти, що їх містять, здатні втрачати свою активність (Діксон М., Уебб Е., 1982; Голіков С.М. та ін., 1986). Вплив металу, очевидно, може відбуватися на різних стадіях: в період синтезу відповідного ферменту, під час його активації, в момент приєднання ферменту до субстрату тощо.
Живий організм має ряд систем, які здатні зв’язувати іони важких металів (Забродський П.Ф., 1998; Засєкін Д.А., 2001), тим самим зменшуючи їх негативну дію на ферментні системи, чим може пояснюватись відмінність в одержаних результатах випробувань активності ферментів in vitro та in vivo. Одним із захисних механізмів організму є синтез металотіонеїнів – білків, що містять тіолові групи, які можуть зв’язувати важкі метали (Барабой В.А., Петрина Л.Г., 2003).
У результаті проведених досліджень встановлено, що стан отруєння важкими металами характеризується певними метаболічними особли-востями, при яких рівень більшості досліджуваних метаболітів відріз-няється від контрольного (табл. 8). У крові щурів, отруєних цезієм і стронцієм концентрація глюкози вища, ніж у інтактних тварин відповідно на 38,8 та 33,0 %. В печінці отруєних щурів підвищується концентрація пірувату на 26 та 38 % і знижується – лактату відповідно на 27,7 та 19,0 %. Виявлені зміни можуть бути зумовлені зниженням інтенсивності гліколітичних процесів у печінці отруєних щурів, що підтверджується зменшенням активності ЛДГ.
Таблиця 8
Вміст інтермедіатів гліколізу та циклу трикарбонових кислот у печінці щурів, отруєних цезієм і стронцієм, мкмоль/г (М ± m, n = 8)
Показник | Група
інтактні
щури | щури, отруєні
CsCl | щури, отруєні SrCl2
Глюкоза | 3,30 ± 0,53 | 5,39 ± 0,31* | 4,92 ± 0,26*
Лактат | 3,58 ± 0,18 | 2,59 ± 0,16* | 2,91 ± 0,18*
Піруват | 0,165 ± 0,011 | 0,225 ± 0,012* | 0,260 ± 0,010*
Ізоцитрат | 0,245 ± 0,018 | 0,219 ± 0,015 | 0,200 ± 0,020
б-Кетоглутарат | 0,135 ± 0,009 | 0,222 ± 0,014* | 0,280 ± 0,020*
Малат | 0,237 ± 0,013 | 0,237 ± 0,008 | 0,270 ± 0,020
Оксалоацетат | 0,100 ± 0,010 | 0,230 ± 0,027* | 0,210 ± 0,020*
Підвищення концентрації глюкози в крові отруєних тварин при збіль-шенні концентрації іонів гідрогену також може вказувати на інтенси-фікацію процесів глюконеогенезу, що узгоджується з даними
Д.О. Мель-ни-чука (1989).
Одержані результати узгоджуються з підвищенням концентрації окремих субстратів ЦТК у печінці щурів, отруєних солями цезію та стронцію, а саме: оксалоацетату відповідно на 56 та 54 %,
б-кетоглутарату на 39 та 53 %, глутамату на 37 та 18 %. Концентрація малату та ізоцитрату в обох дослідних групах залишається без змін.
Багаторівневий контроль клітинного метаболізму, який забезпечує підтримку гомеостазу в змінних умовах зовнішнього середовища, включає, як один із основних факторів, регуляцію окисно-відновного стану в компартментах клітини, що виражається співвідношеннями вільних нікотинамідних коферментів НАД+/НАДН і НАДФ+/НАДФН. Розрахунки цих співвідношень вказують на те, що у тварин, яким вводили цезію і стронцію хлорид, збільшується величина співвідношення НАД+/ НАДН у цитоплазмі клітин відповідно на 45 та 48 % (табл. 9).
Таблиця 9
Співвідношення НАД+/ НАДН та НАДФ+/ НАДФН у мітохондріях і цитоплазмі гепатоцитів щурів, отруєних цезієм і стронцієм (М ± m, n = 8)
Співвідношення
коферментів | Група
інтактні щури | щури, отруєні CsCl | щури, отруєні SrCl2
НАД+/ НАДН
в цитоплазмі | 400 ± 30 | 730 ± 52* | 780 ± 51*
НАД+/ НАДН
в мітохондріях | 11,00 ± 0,98 | 6,20 ± 0,54* | 9,50 ± 0,72*
НАДФ+/НАДФН
в цитоплазмі | 0,033 ± 0,001 | 0,033 ± 0,001 | 0,036 ± 0,002
Величина співвідношень НАДФ+/НАДФН у цитоплазмі клітин печінки щурів інтактної та дослідних груп не змінюється. З іншого боку, величина співвідношення НАД+/НАДН у мітохондріях клітин печінки щурів, яким вводили цезію та стронцію хлориди, зменшується відповідно на 44 та 13 %. Отже, надлишок солей цезію та стронцію в організмі щурів впливає на перебіг реакцій циклу трикарбонових кислот та гліколізу в печінці, змінюючи інтенсивність перебігу окисно-відновних процесів.
Дослідження вмісту продуктів азотного обміну (аміак, сечовина, глутамінова кислота та глутамін), які використовуються для діагностики фізіологічного стану організму за умов отруєння показало, що в крові щурів, яким вводили розчини цезію і стронцію, знижується концентрація глутаміну в середньому відповідно на 15,7 та 23,0 % і аміаку - на 50,2 та 38,6 %, а рівень сечовини і глутамату підвищується на 39,0 і 22,4 % та 37 і 18 % (табл. 10).
Таблиця 10
Вміст продуктів азотного обміну в крові щурів, отруєних цезієм і стронцієм, мкмоль/мл (М ± m, n = 8)
Показник | Група
інтактні
щури | щури, отруєні
CsCl | щури отруєні
SrCl2
Аміак | 19,96 ± 1,65 | 9,95 ± 0,89* | 12,25 ± 0,95*
Глутамін | 18,9 ± 1,68 | 15,93 ± 1,46* | 14,56 ± 1,41*
Сечовина | 11,53 ± 0,97 | 18,91 ± 0,87* | 14,86 ± 0,94*
Глутамінова кислота | 0,679 ± 0,031 | 1,076 ± 0,062* | 0,82 ± 0,04*
Це може вказувати на те, що інтенсивність утилізації амонійного азоту переважає над процесами амонієгенезу, що й зумовлює зменшення концентрації аміаку в крові отруєних тварин порівняно з інтактними. Зазначене припущення підтверджується зниженням активності АсАТ та АлАТ у крові щурів, отруєних цезію хлоридом відповідно на 23,6 та 21,6 %, а стронцію хлоридом – на 31,9 та 18,5 % порівняно з інтактними тваринами.
Отримані результати дозволяють припустити, що іони важких металів зумовлюють зниження активності ферментів та уповільнення процесів переамінування амінокислот. Відомо (Корнілова С.В., 1986; Мацевич Л.Л., Лукаш Л.Л., 2001; Мудрий І.В., Короленко Т.К., 2002), що амінотрансферази, як і інші ферменти, містять у своєму складі певну кількість HS-груп і тому дуже чутливі до дії таких токсикантів.
Результати досліджень параметрів кислотно-лужного стану крові щурів, отруєних стронцію хлоридом, свідчать про те, що токсичні дози цього металу призводять до змін відповідних показників (табл. 11). При цьому величина рН крові зміщується в кислий бік: з 7,35 у інтактних щурів до 7,23 у отруєних. У цих тварин також знижуються рівень р СО2 на 15,2 %, величина [НСО3-] на 18,1 %, вміст СО2 заг. на 30,2 %, значення ЗБО на 37,4 %, рівень р О2 на 36,4 %. Такий характер змін свідчить про виникнення стану метаболічного ацидозу в організмі отруєних тварин.
Таблиця 11
Кислотно-лужний стан крові щурів, отруєних стронцію хлоридом
(М ± m, n = 8)
Показник | Група
інтактні щури | щури, отруєні SrCl2 | щури, отруєні SrCl2 з HCl | щури, отруєні
SrCl2 з NaHCO3
рН | 7,34 ± 0,01 | 7,23 ± 0,01 | 7,12 ± 0,01 | 7,36 ± 0,01
р О2, мм.рт.ст. | 53,41 ± 2,47 | 33,96 ± 2,27* | 28,64 ± 2,54* | 42,25 ± 3,01*
р СО2 , мм.рт.ст. | 32,13 ± 1,87 | 27,25 ± 1,34* | 24,34 ± 1,27* | 41,24 ± 2,49*
СО2, заг., ммоль/л | 21,45 ± 1,67 | 17,28 ± 1,34* | 13,11 ± 1,21* | 28,12 ± 2,72*
[НСО3-], ммоль/л | 20,33 ± 1,58 | 16,65 ± 1,43* | 12,34 ± 0,98* | 27,25 ± 1,01*
ЗБО, ммоль/л | -5,76 ± 0,18 | -9,20 ± 0,41* | -10,90 ± 0,54* | -4,95 ± 0,41*
Ці дані вказують також на те, що отруєні стронцію хлоридом тварини, яким уводили хлоридну кислоту, знаходяться в стані експериментального метаболічного ацидозу. Це супроводжується зниженням величини рН до 7,12, вмісту СО2 заг. на 40,8 %, рівня р СО2 на 24,2 %, величини [НСО3-] на 39,3 %, значення ЗБО на 47,1 % і рівня р О2 на 46,4 %.
В отруєних стронцієм щурів, які додатково отримували натрію гідрокарбонат нормалізуються показники кислотно-лужного стану, за винят-ком підвищення концентрації бікарбонатів на 25,4 % та СО2 заг. на 27,3 %.
Аналогічний характер змін КЛС спостерігається і в щурів, отруєних цезієм (табл. 12). Про це свідчить зміщення показників КЛС в отруєних тварин у напрямі розвитку метаболічного ацидозу. Отруєні цезієм тварини, яким вводили хлоридну кислоту, перебувають у стані метаболічного ацидозу, а ті, що отримували натрію гідрокарбонат у стані компенсованого алкалозу.
Таблиця 12
Кислотно-лужний стан крові щурів, отруєних цезію хлоридом (М ± m, n = 8)
Показник | Група
інтактні
щури | щури, отруєні CsCl | щури, отруєні CsCl з HCl | щури, отруєні CsCl з NaHCO3
рН | 7,34 ± 0,01 | 7,22 ± 0,01 | 7,11 ± 0,03 | 7,37 ± 0,03
р О2, мм.рт.ст. | 53,41 ± 2,47 | 34,45 ± 2,51* | 31,04 ± 1,34* | 39,27 ± 2,10*
р СО2 , мм.рт.ст. | 32,13 ± 1,87 | 26,21 ± 1,49* | 23,98 ± 2,05* | 39,75 ± 1,34*
СО2 заг., ммоль/л | 21,45 ± 1,67 | 16,58 ± 1,34* | 14,21 ± 0,98* | 27,69 ± 2,35*
[НСО3-], ммоль/л | 20,33 ± 1,58 | 15,08 ± 1,44* | 13,14 ± 1,31* | 26,59 ± 1,95*
ЗБО, ммоль/л | -5,76 ± 0,18 | -9,83 ± 0,78* | -11,01 ± 0,99* | -4,98 ± 0,59*
Показано, що зміна параметрів КЛС крові в бік ацидозу сприяє прискореній елімінації кадмію з організму щурів. Це зумовлюється підвищенням ступеня іонізації та розчинності важких металів за вказаних умов (Мельникова Н.М. та ін., 2007).
Нами було досліджено вплив метаболічного ацидозу й алкалозу на інтенсивність накопичення та виведення стронцію і цезію з органів отруєних щурів (табл. 13).
Таблиця 13
Вміст стронцію в органах отруєних щурів за умов зміни показників кислотно-лужного стану крові, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи | Група
інтактні
щури | щури, отруєні SrCl2 | щури, отруєні SrCl2 з HCl | щури, отруєні SrCl2 з NaHCO3
М’язи | 0,061 ± 0,005 | 0,102 ± 0,015* | 0,065 ± 0,002** | 0,091 ± 0,015*
Печінка | 0,040 ± 0,005 | 0,061 ± 0,003 * | 0,042 ± 0,004** | 0,051 ± 0,006*
Серце | 0,0045 ± 0,0003 | 0,0090 ± 0,0007 * | 0,0080 ± 0,0008* | 0,009 ± 0,001*
Нирки | 0,010 ± 0,001 | 0,017 ± 0,002 * | 0,011 ± 0,001** | 0,015 ± 0,001*
Кістки | 0,065 ± 0,004 | 0,332 ± 0,025 * | 0,121 ± 0,012** | 0,330 ± 0,040*
Примітка. ** Р < 0,05, результати вірогідні порівняно зі значеннями для отруєних тварин.
Показано, що отруєння щурів солями цезію та стронцію на фоні введення хлоридної кислоти призводить до зниження накопичення важких металів у м’язах відповідно в 2,1 та 1,6 раза, в печінці в 2,3 та 1,5 раза, в нирках тварин обох дослідних груп в 1,5 раза, в кістках у 1,3 та 2,7 раза. В серці відмічено тенденцію до зниження накопичення досліджуваних металів.
Зменшення накопичення цезію та стронцію в органах піддослідних щурів на фоні виникнення стану метаболічного ацидозу можна пояснити підвищенням ступеня іонізації та рівня розчинності важких металів, що сприяє їх інтенсивнішій екскреції.
Підтвердженням зазначеного є результати досліджень, в яких уведення щурам цезію і стронцію хлориду поєднували з натрію гідрокарбонатом. За таких умов ступінь накопичення важких металів в органах є таким, як і при відсутності NaHCO3. При цьому відмічено подібні значення показників кислотно-лужного стану крові. Це узгоджується з результатами досліджень інтенсивності виведення важких металів з органів отруєних щурів за умов уведення їх у стан експериментального метаболічного ацидозу після отруєння важкими металами. Результати досліджень свідчать про виведення цезію та стронцію з органів отруєних щурів. Проте у тварин, які після отруєння важкими металами були введені в стан метаболічного ацидозу, процес виведення цезію та стронцію відбувається інтенсивніше. Це відмічено на
4 8-му добу дослідження. В цей період спостерігається вірогідна різниця щодо вмісту металів у досліджуваних органах. При цьому найбільш вагомі зміни відзначали у виведенні цезію, де між контрольною і дослідною групами на 20-ту добу різниця перевищувала в м’язах у середньому в 2,8; в нирках – у 5,1; в печінці – у 5,8; в кістках – у 2,8 раза порівняно з отруєними тваринами (табл. 14).
Таблиця 14
Інтенсивність виведення цезію з органів отруєних щурів за умов метаболічного ацидозу, мг/кг (М ± m, n = 8)
Органи | Група тварин | Доба
1 | 2 | 4 | 8 | 14 | 20
М’язи | СsCl | 0,416 ±
0,031 | 0,457 ±
0,030 | 0,525 ±
0,045 | 0,403 ±
0,040 | 0,332 ±
0,031 | 0,311 ±
0,030
СsCl +
ацидоз | 0,416 ±
0,031 | 0,449 ±
0,031 | 0,490 ±
0,040 | 0,279 ±
0,025* | 0,169 ±
0,011* | 0,111 ±
0,010*
Нирки | СsCl
