Інститут біології тварин УААН

Лучка Іван Васильович

УДК 636.2.087:591.133.1:547.211

Метаногенез у рубці Великої рогатої худоби

і деякі аспекти його регуляції

03.00.04 — біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

ЛьвівЇ2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий керівник Ї доктор біологічних наук, професор

Сологуб Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН,

головний науковий співробітник

лабораторії обміну речовин.

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник,

Стапай Петро Васильович,

Інститут біології тварин УААН,

завідувач лабораторії живлення овець і вовноутворення

доктор сільськогосподарських наук, професор,

Захарів Орест Ярославович,

Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій ім. С. З. Гжицького,

завідувач кафедри мікробіології і вірусології

Захист дисертації відбудеться “10“ червня 2008 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, .

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН (79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38).

Автореферат розісланий “____” ______________ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О. І. Віщур

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Особливості будови травного тракту жуйних, наявність симбіотичної мікрофлори і мікрофауни у передшлунках, і зокрема у рубці, дають можливість цьому виду тварин використовувати важкоперетравні структурні компоненти кормів, насамперед целюлозу, як джерело поживних речовин, але разом з цим ставлять цілу низку питань щодо їх раціональної годівлі (MackieWhite 1990; Gazia2003; Bach et al., 2005; Iason, 2005; Firkins J. et al., 2006). Потрібно зазначити, що мікроорганізми у процесі життєдіяльності крім утворення продуктів, які тварина використовує як пластичний і енергетичний матеріал, продукують гази, що емітуються у навколишнє середовище (Moss, 1993; Johnson, Johnson, 1995; Богданов Г. О. зі співавт., 2000). За добу кількість утворених у рубці газів може сягати 1000 л, з яких на метан припадає 25–40 %. Утворення метану в травному тракті жуйних тварин, і зокрема в рубці, представляє значний інтерес як з економічної, так і з екологічної точки зору. По-перше, на утворення метану в рубці великої рогатої худоби затрачується від 2 до 12 % загальної енергії спожитого корму, що вважається однією з основних втрат у годівлі цих тварин (McAllister Т. А. et al., 1996; Богданов Г. О. зі співавт., 2001). Тому пошуки шляхів зменшення інтенсивності метаногенезу в жуйних є одним із важливих шляхів зменшення собівартості їх продукції. По-друге, метан вважається другим за важливістю після СО2 парниковим газом і його емісія в атмосферу жуйними тваринами, і зокрема великою рогатою худобою, в глобальних масштабах проявляє вагомий вплив на парниковий ефект планети (Crutzen Р. et al., 1986; Okine Е. К. et al., 1989). За даними літератури, домашні жуйні продукують понад 80 млн т метану в рік і за кількістю займають третє місце на Землі після болотистих регіонів, тропіків і рисових полів південно-східної Азії (Crutzen Р. et al., 1986). Разом з цим потрібно мати на увазі, що метаногенні бактерії в екосистемі рубця у жуйних тварин виконують дуже важливу роль як акцептори водню, який є сильним інгібітором деяких груп мікроорганізмів, у тому числі целюлозолітичних бактерій (Russel, Jeraci, 1984). Тому надзвичайно важливо, при розробці шляхів зменшення інтенсивності метаноутворення в рубці, стимулювати альтернативні шляхи зв’язування водню.

Виходячи з вищесказаного, дослідження можливостей регуляції метаноутво-рення шляхом зменшення величини популяції метаногенних бактерій та використання водню в альтернативних шляхах метаболізму є важливим завданням сучасної біохімічної, мікробіологічної і екологічної наук. Цій проблемі були присвячені ряд світових форумів – у Кіото (1997), Новосибірську (2000), Обігіро (2001), Пекіні (2003), Цюриху (2005), Крайстерчі (2007) на яких обговорювались можливості зменшення емісії метану з різних антропогенних джерел, у тому числі і жуйними тваринами.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом теми лабораторії обміну речовин Інституту біології тварин УААН «Дослідити механізми впливу деяких макро- і мікроелементів на метаболізм в організмі жуйних тварин, ріст популяції симбіотичних мікроорганізмів у передшлунках, продуктивність тварини-господаря та внести корективи у мінеральне живлення молодняку великої рогатої худоби» (№ держреєстрації 0101U003434, шифр 01.01) де дисертант вивчав процес утворення метану в рубці великої рогатої худоби.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було оцінити емісію метану великою рогатою худобою в атмосферу різних біогеохімічних провінцій Західного регіону України за різного типу годівлі і з віком та дослідити вплив різних годівельних чинників на процеси метаноутворення і життєдіяльність мікроорганізмів у рубці великої рогатої худоби.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:—

дослідити утворення метану в рубці великої рогатої худоби й емісію в атмосферу в різних біогеохімічних провінціях західної України за різних умов годівлі;—

дослідити динаміку метаногенезу в рубці телят під час постнатального розвитку;—

дослідити вплив структурних і неструктурних вуглеводів, карбонових кислот, спиртів і амінокислот, сірковмісних сполук та мікроелементів, монензину і дріжджів виду Saccharomyces cerevisiae на процес утворення метану, ріст і життєдіяльність мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби; —

дослідити вплив мінеральних добавок на емісію метану телятами та на їх продуктивність.

Об’єкт дослідження — життєдіяльність мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби, залежність утворення метану від впливу різних годівельних факторів.

Предмет дослідження — метан утворений мікроорганізмами рубця та емітований великою рогатою худобою в навколишнє середовище, показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця.

Методи досліджень — біохімічні (метод газової хроматографії — утворення метану, спектрометричні — активність ферментів, білок, аміак, швидкість росту бактерій), зоотехнічні (маса тіла тварин), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено дослідження емісії метану великою рогатою худобою двох біогеохімічних провінцій західного регіону України, показана зональна і сезонна залежність цього процесу в тварин. У дослідах in vitro вперше представлені конкретні дані про інтенсивність метаноутворення мікроорганізмами рубця у залежності від типу вуглеводів раціону, наявності насичених і ненасичених карбонових кислот, спиртів, амінокислот, сірковмісних сполук і мікроелементів. Показано інгібуючий вплив на метаноутворення деяких амінокислот, сумісного впливу суміші мікроелементів і сульфату амонію. Вивчено вплив коротколанцюгових жирних кислот на утворення метану при становленні рубцевого травлення у молодняку великої рогатої худоби.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані можуть бути використані для оцінки обсягів емісії метану великою рогатою худобою західної України при створенні національного кадастру парникових газів, при розробці заходів зменшення емісії метану великою рогатою худобою в Україні відповідно до підписаного 161 державою світу Кіотського Протоколу (1997 р.). Розроблена на основі досліджень добавка мікроелементів до раціону великої рогатої худоби дає можливість зменшити продукцію метану тваринами на 14 % і підвищити прирости маси тіла на 13 %.

Особистий внесок здобувача. Підбір та опрацювання літератури за темою дисертації, виконання експериментальної частини та статистичну обробку результатів, написання дисертаційної роботи, було зроблено автором самостійно. Аналіз та інтерпретацію одержаних результатів проведено разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень одержані в ході виконання дисертаційної роботи доповідались на: конференції пам. І. В. Шостаковської, Львів, 2002; VIII Українському біохімічному з’їзді, Чернівці, 2002; міжнародній конференції «Науково-практичні аспекти кормовиробництва та ефективного використання кормів», Дубляни, 2003; міжнародній науково-практичній конференції «Сучасний стан і проблеми експериментальної і клінічної біохімії», Тернопіль, 2004; міжнародних конференціях “Greenhouse Gases and Animal Agriculture” (GGAA): Швейцарія, 2005; Нова Зеландія, 2007; ІХ Українському біохімічному з'їзді, Харків, 2006; звітних сесіях Інституту біології тварин УААН, Львів, 2002—2007 роки; конференціях молодих вчених і спеціалістів Інституту біології тварин УААН, Львів, 2002—2007 роки.

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 14 наукових статей у фахових виданнях і 8 тез конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 164 сторінках друкованого тексту. Робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень, їх аналізу та узагальнення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури, що містить 265 джерел. Робота проілюстрована 18 таблицями та 13 рисунками, що складає 20 сторінок.

Основний зміст роботи

Загальна методика досліджень. Дослідження проводились протягом 2002–2005 років у дослідному господарстві «Чишки» Інституту біології тварин УААН та в господарстві Коломийської дослідної станції на клінічно здорових телятах української чорно-рябої молочної породи. Годівлю телят здійснювали згідно рекомендованих норм (ВАСХНІЛ, 1985). Накладання фістул на рубець телят виконано у 20-денному віці. Для біохімічних досліджень вміст рубця брали через 2 години після ранкової годівлі.

Етап 1 (досліди in vivo). Метою цих дослідів було вивчити інтенсивність емісії метану великою рогатою худобою в залежності від зони і типу годівлі. Емісію метану вивчали на телятах 13?15-місячного віку (3 тварини), які належали дослідному господарству «Чишки» Інституту біології тварин УААН (Львівська область) у кінці зими (лютий) і на початку літа (червень) та в господарстві «Прут-генетик» Коломийського району Івано-Франківської області у ці ж самі періоди року, що і у тварин Львівської області. Взяття газів від кожної тварини проводили 6 разів кожного сезону. Раціони тварин у стійловий період складались з кукурудзяного силосу, сінажу (70загальної поживності) і концентрованих кормів (30загальної поживності). До складу комбікорму входили (%): пшениця — 30–54, ячмінь — 35–40, овес — 10–30 та мінеральна добавка. Годівля забезпе-чувала середньодобові прирости маси тіла телят на рівні 800 г. Раціон тварин у пасовищний період складався з зеленої маси бобово-злакових трав (70загальної поживності) і комбікорму (30поживності). За поживною вартістю раціони були адекватними і відповідали прийнятим стандартним нормам.

Етап 2 (досліди in vitro). Дослідження проводились в дослідному господарстві «Чишки» на трьох бичках. Зразки вмісту рубця тварин брали через носоглоточний зонд або через фістулу на 2-, 3-, 6-, 9- і 12-му місяці життя через 2 години після ранкової годівлі, фільтрували і переносили в анаеробних умовах у буферну суміш. Буферна суміш для інкубації містила наступні інгредієнти (грам на 1 літр): рідини рубця — 300, K2HPO4 — 0,45, KH2PO4 — ,45, (NH4)2SO4 — ,9, NaCl — ,9, CaCl2 х2O — ,12, MgSO4 х 2O — ,19, цистеїн хлорид — 0,6. Після змішування, 50 мл цієї суміші вносили в інкубаційні посудини в кількості 120 мл і додавали окремо мурашину, оцтову і пропіонову кислоти (кінцева концентрація — 20 мМ). Як джерело азоту додавали сечовину (30 мМ), як джерело енергії — глюкозу (30 мМ). Контролем слугували зразки, в які не вносилися названі кислоти. Посудини закривали корками, продували СО2 та інкубували протягом 24-х годин при температурі 38 С. Після інкубації брали зразки газу і визначали у них вміст метану на газовому хроматографі марки SRI 8610 B GAS.

Етап 3 (досліди in vitro). Дослідження проведено в дослідному господарстві «Чишки» на трьох телятах 6-місячного віку. Відбір зразків і їх інкубацію проводили, як описано в дослідах на етапі 2. До інкубаційного середовища додавали окремо:—

по 50 мМ/л целюлози, крохмалю, інуліну (в розрахунку на глюкозу чи фруктозу), сахарози, лактози, глюкози, фруктози, лактату, ацетату, пропіонату, а як джерело азоту — сечовину (30 мМ).—

Na2SO3, Na2SO4 (по 100 мМ), CrCl3, Na2CrO4, Na2SeO3, ZnCl2, NiCl2, CoCl2, Na2MoO4, MnCl2, CuSO4, FeSO4 (по 10 мМ), як джерело азоту – сечовину (30 мМ), а енергії – глюкозу (30 мМ);—

(NН4)2SO3, Na2SO4, Na2S, відновленого (GSH) або окисненого (GSSG) глутатіону, цистеїну і метіоніну (по 10 мМ/л), як джерело азоту — сечовину (30 мМ), а енергії — глюкозу (30 мМ);—

мурашиної, оцтової, пропіонової, масляної, щавлевої, бурштинової, фумарової, молочної, яблучної, цитринової, піровиноградної кислот (у вигляді натрієвих солей), або метанолу, етанолу, пропанолу чи бутанолу (по 10 мМ/л);—

фумарату натрію або олеату натрію (по 5 або 10 мМ/л);—

дріжджі виду Saccharomyces cerevisiae (100 мг дріжджової маси) або монензин (1 мкМ), а також обидва інгредієнти в поєднанні в таких же кількостях.

Після інкубації брали зразки рідини і газу для досліджень.

Етап 4 (досліди in vitro). Дослідження проведено в дослідному господарстві «Чишки» на трьох телятах 6-місячного віку. Зразки рубця вмісту брали через 2 години після ранкової годівлі. Фільтровану рідину центрифугували при 750 g протягом 10 хвилин для відділення інфузорій, а опісля знову центрифугували при 10 000 g протягом 15 хвилин для осадження бактерій. Одержані зразки інкубували як описано в дослідах на етапі 2. До інкубаційного середовища як джерело азоту додавали аміак або еквівалентно за кількістю азоту (3,5 мМ) кожну із 20 амінокислот (аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, пролін, серин, треонін, триптофан, тирозин, валін) або суміш цих амінокислот у таких поєднаннях: (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + Ala, Asn, Asp, Lys), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + Arg, Gln, Pro), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + Gly, Ser, Cys), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + Gly), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + Ser), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + Cys), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + ізолейцин), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + треонін), як джерело енергії вносили в інкубаційне середовище глюкозу (в кінцевій концентрації 4 мМ). Ріст бактерій зупиняли шляхом додавання до середовища 1 %-й розчин (в кінцевій концентрації) формаліну і брали зразки рідини і газу для досліджень.

Етап 5 (дослід in vivo). Дослід проведений на трьох групах бичків-аналогів 13-місячного віку по три тварини в кожній у господарстві «Прут-генетик» Коломийського району Івано-Франківської області у кінці зимово-стійлового періоду. Раціон контрольної групи тварин складався з кукурудзяного силосу, сінажу (70загальної поживності) і концкормів (30загальної поживності). У склад концентрованих кормів входили (в %): пшениця — 30–50, ячмінь — 30–40, овес — 10–30. Тваринам 1-ї дослідної групи згодовували такий ж раціон, до якого протягом місяця додавали розроблену в лабораторії обміну речовин добавку мікроелементів, до складу якої входили: Сосі2 х 6H2O, CuSO4 х 5H2O, KI, Na2SeO3, Na2MoO4 х H2O, CrCl3 х 6H2O, NiCl2 х 6H2O, FeSO4 х 7H2O, MnSO4 х 4H2O, ZnSO4 х 7H2O. До раціону тварин 2-ї дослідної групи, крім вказаних мікроелементів додавали також 100 г сульфату амонію в день. Проводили контрольне зважування телят на початку і в кінці досліду.

Основні методи досліджень. Гази емітовані мікроорганізмами рубця брали для аналізу та визначали за методом рекомендованим К. Джонсон і Д. Джонсоном (JohnsonJohnson1995). Проникну для газів капсулу (1,25х4 см), заповняли SF6, визначали швидкість звільнення з капсули газу — шляхом зважування її маси до і після інкубації, яку проводили три рази через три години при 39 єС. Капсулу вводили в рубець через фістулу, або шляхом заковтування. Утворені в рубці тварин гази вловлювали за допомогою дихальної маски і колектора, закріпленого на шиї, який через три години знімали. У вловлених газах визначали вміст метану і фтористої сірки (на хроматографі SRI 8610 B GAS). Одержані величини використовували для визначення емісії метану в атмосферу (л на добу, кг на рік).

У вмістимому рубця визначали: кількість мікробної маси ваговим методом, концентрацію аміаку (Курилов Н., Радченкова Т., 1970), концентрацію коротко-ланцюгових жирних кислот (Кротова А., Митин Н., 1957), целюлозолітичну активність (Панок С. М., 1970), амілолітичну активність (Benfeld1955), протеолітичну активність (ShickCastellino F., 1978), вміст білків (Lowry et al., 1951).

Результати досліджень опрацьовували статистично за критерієм Стьюдента. У всіх рисунках і таблиці ступінь вірогідності позначено: х, * — p < 0,05;хх, ** — p < 0,01; ххх, *** — p < 0,001.

Результати досліджень

Інтенсивність емісії метану великою рогатою худобою у залежності від типу годівлі тварин і географічної зони. Проведені нами дослідження показали, що інтенсивність емісії метану в атмосферу великою рогатою худобою, значною мірою, залежить від типу годівлі (рис. ).

Рис. . Емісія метану великою рогатою худобою в різних зонах Західного регіону України при стійловому і пасовищному типі утримання

Примітки. х – різниці в показниках у тварин при стійловому і пасовищному утримані; * ? різниці в показниках у тварин Львівської області та Івано-Франківської області

У літній період (пасовищний період утримання), коли тваринам згодовували зелену масу бобово-злакових трав і комбікорм, емісія метану тваринами в навколишнє середовище була нижчою на 11ніж у зимовий період (стійловий період утримання), коли тваринам отримували раціон силосно-сінажного типу з добавкою комбікорму. Такі різниці спостерігали при проведенні дослідів як у Львівській, так і у Івано-Франківській областях. Що стосується досліджень у різних географічних зонах то нами встановлено, що емісія метану тваринами Івано-Франківської області є нижча (р ,05), ніж у тварин Львівської області. Це, мабуть, зумовлено зональними особливостями геобіохімічних зон, різними метеорологічними умовами у період досліду та з активністю бактерій у рубці тварин.

Вікові особливості утворення метану в рубці телят. Встановлено, що інтенсивність метаноутворення мікроорганізмами рубця телят впродовж постнатального періоду розвитку зростає. У 1 –місячних телят цей процес виражений порівняно слабо, основне зростання (приблизно у 10 разів) його швидкості спостерігається у 3-місячних телят (p ,01), а у 6 ?–місячних телят інтенсивність утворення метану збільшується приблизно у 18 разів (p ,01) і досягає межі дорослих тварин. Такі зміни зумовлені тим, що після народження у телят відбувається заселення їх травного тракту, зокрема передшлунків, специфічною мікрофлорою і мікрофауною, налагоджуються зв’язки екосистеми рубця між окремими групами бактерій, інфузорій. Також при переході тваринами на грубі корми має місце кількісний і якісний перерозподіл різних родів та видів рубцевих мікроорганізмів. Встановлено, що при додаванні до інкубаційного середовища оцтової і пропіонової кислот, з віком спостерігається зменшення інтенсивності утворення метану (p ,01), тоді як додавання мурашиної кислоти інтенсифікує цей процес у старших тварин (p ,001).

Вплив вуглеводів та їх метаболітів на метаноутворення і продукцію летких жирних кислот мікроорганізмами рубця великої рогатої худоби. Встановлено, що максимальне зменшення утворення метану (на 29має місце при додаванні до інкубаційного середовища крохмалю (рис. ).

Рис. 2. Вплив вуглеводів та продуктів їх перетворення на продукцію метану мікроорганізмами рубця телят при інкубації іn vitro

1 – контроль, 2 – целюлоза, 3 – крохмаль, 4 – інулін, 5 – сахароза, 6 – лактоза, 7 – глюкоза, 8 – фруктоза, 9 – лактат

Очевидно, що активність амілолітичних ферментів у середовищі є досить високою для деградації як амілази, так і амілопектину (складових компонентів крохмалю) до б-глюкози. Зменшення на 19 спостерігалось при додаванні глюкози, тоді як добавка целюлози підвищувала концентрацію цього газу на 19. Відомо, що при розщепленні целюлози утворюється дисахарид целобіоза, яка складається з 2-х молекул в-глюкози, швидкість деградації останньої, а тим самим і співвідношення продуктів перетворення відрізняється від продуктів, утворених при розщепленні б-глюкози. Фруктоза проявляє подібний до глюкози вплив на утворення метану (зменшує утворення на 19 %) в рубці жуйних тварин. Відомо, що включення фруктози в гліколітичний шлях розщеплення відбувається з участю специфічної фруктокінази з утворенням фруктозо-1-фосфату і далі фосфорилюванням до фруктозо-1,6-дифосфату, тобто коротшим шляхом, ніж розщеплення глюкози. У всякому разі фруктоза, очевидно, катаболізується мікроорганізмами рубця приблизно з такою ж швидкістю як і глюкоза. Потрібно відзначити, що і полімер цього кетоцукру ? інулін також значною мірою (на 19інгібує продукцію метану в рубці жуйних. Що стосується дисахаридів — сахарози і лактози, то виявлено, що інгібуючий вплив їх на метаноутворення у рубці є значно менший. Збільшення концентрації ЛЖК спостерігали при додаванні до середовища інкубації таких субстратів як целюлози, крохмалю, інуліну, глюкози та лактату (p < ,01).

Вплив сірковмісних сполук на метаногенез і деякі показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби. Нами встановлено, що добавка до інкубаційного середовища як сульфату натрію, так і сульфату амонію знижує (р ,05) утворення метану метаногеними мікроорганізмами. Відомо, що серед мікроорганізмів рубця є сульфатредукуючі бактерії, які очевидно під впливом окисів сірки інтенсифікують свою життєдіяльність, редукуючи останні за рахунок молекулярного водню. Оскільки афінність редуктази сульфатредукуючих бактерій значно більша, ніж редуктаз у метаногенів, то перші мають значну перевагу в конкуренції з останніми за водень. Знижує утворення метану також окиснений глутатіон, правдоподібно зв’язуючи молекули водню посередним шляхом в реакції відновлення, тому що в цьому процесі приймає участь не молекулярний водень, а відновлений нікотинамідний кофермент. Цистеїн також інгібує як відмічалось у попередньому розділі метаногенез. У свою чергу додавання до середовища метіоніну та відновленних форм сірки його суттєво не впливало на утворення метану.

Вплив мінеральних елементів на продукцію метану на ріст і життєдіяльність мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби. При додаванні до середовища сполук 3- і 6- валентного хрому спостерігали зменшення утворення метану на 22 і 20а ріст мікробної маси збільшився на 30і 24в порівнянні з контрольними зразками (рис. ). Що стосується механізмів дії хрому на проліферацію мікробних клітин, то відомо, що цей елемент може активувати реплікацію геному і транскрипцію генів у клітинах. У той же час, кобальт і нікель стимулюють процеси метаногенезу на 21 і 29відповідно. Перший з них стимулює кінцеву реакцію синтезу молекули метану, а другий входить у молекулу специфічного кофактора в синтезі цього газу ? F430. Правдоподібно, вони активують також ріст популяції метаногенів, але тому що кількість цієї групи бактерій є невелика (близько 5то їх приріст значного впливу на загальну масу популяції мікроорганізмів не має. Збільшення утворення метану на 20виявлено також при додаванні молібдену, хоч безпосередня його участь у реакціях утворення метану невідома. Додавання суміші мікроелементів без сульфатів збільшувало ріст популяції мікроорганізмів, у порівнянні з ростом у контрольних зразках (на 44але одночасно зростала також інтенсивність метаногенезу (на 18У той же час, при додаванні до інкубаційного середовища суміші мікроелементів з сульфатом натрію наростання мікробної маси є на 56більше, ніж у досліді з додаванням суміші лише одних мікроелементів, а утворення метану, в порівнянні з контрольними зразками зменшується на 26Очевидно, у цьому випадку під впливом сульфату збільшується популяція сульфатредукуючих бактерій, які здатні відновлювати неорганічний сульфат, використовуючи при цьому водень, який у відсутності сульфату йде на редукцію СО2 до метану.

Рис. 3. Вплив мінеральних елементів на продукцію метану мікроорганізмами рубця телят при інкубації іn vitro

1 – контроль, 2 – Na2SO4, 3 – Na2SO3, 4 – Na2CrO4, 5 – CrCl3, 6 –2, 7 – MnCl2, 8 – Na2SeO3, 9 – ZnCl3, 10 – FeSO4, 11 – NiCl2, 12 – Na2MoO4, 13 – суміш мікроелементів без сульфату, 14 – суміш мікроелементів + сульфат

Рис. . Вплив натрій фумарату і натрій олеату на утворення метану мікроорганізмами рубця телят при інкубації іn vitro

Вплив різних доз фумарової і олеїнової кислот на метаноутворення і деякі показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби. З отриманих результатів (рис. ) видно, що при додаванні як 5 мМ, так і 10 мМ фумарату зменшується інтенсивність продукції метану на 13і 22, відповідно. Це може бути зумовлено конкуренцією за водень між метаногенами, які використовують його для відновлення СО2 до метану, і фумаровою кислотою, яка під впливом флавінзалежної фумаратредуктази інших груп рубцевих бактерій, може відновлюватись до бурштинової кислоти. Що стосується олеату, то на метаногенез він проявляє незначний вплив. Очевидно, при метаногенезі та відновленні ненасиченого зв’язку цієї сполуки використовуються різні форми водню — в першому випадку — молекулярний водень, а в другому — метаболічно активний водень, зв’язаний з нікотинамідними коферментами. Крім того, в інкубованих з 10 мМ фумарату натрію зразках збільшується (р ,05) мікробна маса, в порівнянні з контрольними зразками, а концентрація аміаку при цьому, навпаки, зменшується (р ,05). Це можливо, зумовлено більшим використанням аміаку в анаболічних процесах про що свідчать зміни рівня бактеріального білка, кількість якого в середовищі також зростає при додаванні фумарової кислоти. Збільшення кількості летких жирних кислот (р 0,05) значно під впливом як фумарату так і олеату. Разом з цим хроматографічне розділення останніх показало, що фумарова кислота стимулює утворення пропіонової кислоти (р ,05), тоді як при додаванні олеїнової кислоти збільшується кількість оцтової та масляної кислот (р ,05).

Рис. . Вплив дріжджів і монензину на утворення метану мікроорганізмами рубця телят при інкубації іn vitro

Д _дріжджі, М _монензин, Д+М _дріжджі і монензин, Дм _дріжджі мертві і монензин

Вплив монензину і дріжджів виду Saccharomyces cerevisiae на утворення метану і деякі показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби. Йонофори і пробіотики можуть проявляти вплив на життєдіяльність мікроорганізмів рубця жуйних тварин, стимулюючи ріст одних видів і інгібуючи ріст інших. Як видно з рис.  при інкубації фракції бактерій рубця з додаванням до середовища живих клітин дріжджів S. cerevisiae відмічено зростання концентрації мікробіальних білків (р0,05) та зменшення вмісту аміаку (р ,05). Очевидно, ці результати свідчать про збільшення популяції мікроорганізмів, що мабуть пов’язано з стимулюючим впливом ростових факторів дріжджів на проліферацію бактеріальних клітин. На користь цього припущення свідчить також зростання протеолітичної і целюлолітичної активності (р 0,05) в інкубованих зразках при додаванні дріжджових клітин. На утворення метану метаногенами клітини S.проявляють інгібуючий вплив. При додаванні клітин дріжджів до інкубаційної суміші виявлено також зміни в інтенсивності утворення летких жирних кислот. При цьому зростає продукція ацетату (р0,05) і зменшується утворення бутирату (р ,05). Дещо інші зміни виявлені при додаванні до інкубаційного середовища монензину. Як видно, під впливом іонофору різко інгібується метаногенез (на 50та зменшується ріст мікроорганізмів, про що свідчить зменшення кількості бактеріального білка та утворення аміаку (р ,05). Якщо врахувати, що монензин інгібує ріст грампозитивних бактерій, до яких належать найбільш поширені в рубці види метаногенів — Methanobrevibacter ruminantium i Methanosarcina barkeri, то очевидно, при введенні його в середовище відбувається перерозподіл різних груп мікроорганізмів. Можливо, виявлені зміни є результатом, як гальмування росту грампозитивних бактерій, у тому числі і метаногенних, так і стимулювання факторами клітин дріжджів інших процесів у бактеріальній системі рубця. У результаті чого відбувається часткова зміна у використанні звільненого водню не у напрямку відновлення СО2 до метану, а у напрямку утворення оцтової кислоти. Цікаво, що додавання разом з монензином інактивованих кип’ятінням клітин S.значно гальмує ацетогенез, інтенсифікація якого спостерігається при додаванні живої культури дріжджів.

Вплив амінокислот на утворення метану мікроорганізмами рубця великої рогатої худоби. Зменшення продукції метану мікроорганізмами рубця спостерігалось при додаванні до середовища інкубації цистеїну, валіну, ізолейцину і лізину (р ,05), а збільшення — при додаванні треоніну (р ,05). Що стосується механізмів, які лежать в основі згаданого впливу, то активуючий вплив треоніну, на утворення метану правдоподібно, пов’язаний з наявністю цієї амінокислоти в молекулі кофактора ферменту меркаптогептаноїлтреонінфосфатметилредуктази, одного із кінцевих реакцій відновлення СО2 (DiMarco et al., 1990), тоді як інгібування метаногенезу іншими амінокислотами не має прямого пояснення. Очевидно, в даному випадку має місце посередній вплив через продукти перетворення цих сполук. Можливо, що ці амінокислоти впливають специфічно на якісь метаболічні реакції в клітинах мікроорганізмів, стимулюючи чи інгібуючи ріст популяцій окремих груп. При додаванні до середовища глютамінової кислоти, глютаміну, лейцину, триптофану спостерігали збільшення росту бактерій рубця (р ,05). Інкубація суміші цих амінокислот посилює проліферацію клітин на 20 %, а при введенні їх з гліцином цей показник зростає до 63

Вплив добавок мінеральних елементів до раціону бичків на утворення метану в рубці, його емісію в атмосферу та прирости маси тіла тварин. Встановлено, що додавання мінеральних елементів до раціону молодняку великої рогатої худоби на 11збільшувало емісію метану в атмосферу та добові прирости маси тіла на 9 % (таблиця).

Таблиця

Вплив додавання мікроелементів до раціону на емісію метану ВРХ (М±m; n=3)

Групи тварин | Продукція метану, л/добу | Продукція метану, л/кг маси тіла | Продукція метану

кг/рік

контрольна | 312±9 | 1,39±0,04 | 81,0±2,3

1 дослідна _добавка мікроелементів | 348±6* | 1,53±0,03* | 90,5±1,6*

2 дослідна – добавка мікроелементів+(NH4)2SO4 | 272±7* | 1,19±0,03* | 70,7±1,8*

Отже є підстави вважати, що у раціоні дослідних тварин був дефіцит деяких необхідних мікроелементів. У той же час, додавання до раціону тварин разом з мікроелементами сульфату амонію зменшує інтенсивність метаногенезу в рубці на 13, а середньодобові прирости зростають на 14порівняно із контролем. Очевидно, додаткове внесення сульфату амонію стимулювало життєдіяльність сульфатредукуючих бактерій, які для відновлення сірчанокислого аніону сульфатредуктазою використовують водень і конкурують з метаногенними архебактеріями за нього.

ВИСНОВКИ

У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань вивчено емісію метану великої рогатої худоби в двох геохімічних провінціях Західного регіону України за різних умов годівлі. Досліджено інтенсивність метаногенезу мікроорганізмами рубця in vitro під впливом різних вуглеводів, мінеральних елементів, амінокислот, про зміну продукції цього газу в рубці телят з віком.

1. Емісія метану великою рогатою худобою в Передкарпатській провінції (Івано-Франківська область) є менша (р0,05) ніж тваринами низинної провінції (Львівська область). При пасовищному періоді утримання бичків утворення метану бактеріями рубця є менше (р ,05), у порівнянні з емісією цього газу тваринами за умов стійлового періоду утримання.

2. Інтенсивність метаноутворення мікроорганізмами рубця телят протягом постнатального періоду розвитку змінюється. У 1-місячних телят цей процес є порівняно слабо виражений, а основне зростання його швидкості відмічене до 3-місячного віку тварин. У 6-місячних телят інтенсивність утворення метану досягає рівня, який спостерігається у дорослих тварин.

3. З вуглеводів і продуктів їх перетворення крохмаль найбільше зменшує утворення метану в рубці (30; інгібуючий вплив мають також глюкоза (19, фруктоза (22, інулін (19. Виражену активуючу дію на утворення коротколанцюгових жирних кислот проявляє целюлоза (р ,05).

4. Під впливом хрому, марганцю, цинку зменшується продукція метану мікроорганізмами рубця та інтенсифікується ріст мікроорганізмів (р ,05). Нікель, кобальт і молібден, у той же час посилюють метаногенез (р ,05). Додавання суміші мікроелементів і сульфату зменшує продукцію метану на 27 % і стимулює ріст популяції мікроорганізмів на 56 за умов in vitro.

5. Продукція метану мікроорганізмами рубця інгібується цистеїном (р ,05), а стимулюється треоніном (р ,05). Глутамінова кислота, глутамін, лейцин, триптофан, тирозин, метіонін, фенілаланін і валін активують ріст бактерій рубця in vitro (р ,05), тоді як ізолейцин, треонін і цистеїн його пригнічують (р ,05). Додавання суміші амінокислот, які сприяють росту бактерій, посилює проліферацію клітин лише на 20 %, а при введенні їх з гліцином цей показник зростає до 63 %.

6. Окиснені сполуки сірки — аніон сульфату й окиснений глутатіон зменшують інтенсивність метаноутворення мікроорганізмами рубця, а також активують проліферацію мікробних клітин (р ,05), інтенсифікують продукцію коротколанцюгових жирних кислот зокрема оцтової і пропіонової кислот (р ,05), стимулюють протеолітичні та целюлолітичні процеси у рубці великої рогатої худоби. Сульфід натрію, навпаки, посилює процеси метаногенезу.

7. При вивченні впливу карбонових кислот на утворення метану встановлено, що фумарова кислота зменшує утворення метану тоді як додавання мурашиної, оцтової і пропіонової кислот та метанолу стимулює його утворення (р ,05).

8. При інкубації бактеріальних клітин, виділених із рідини рубця великої рогатої худоби, з монензином інтенсивність метаноутворення зменшується на 42а клітинами S. cerevisiae на 21. Одночасне внесення цих добавок в інкубаційне середовище підвищує їх інгібуючу дію до 60 і посилює утворення мікроорганізмами оцтової кислоти.

9. Додавання до раціону великої рогатої худоби добавки суміші мікроелементів, склад якої розроблено й апробовано у лабораторії обміну речовин Інституту біології тварин УААН збільшує емісію метану в рубці на 11 % та підвищує прирости маси тіла тварин на 9 %. Одночасне введення в раціон тварин разом з мікроелементами сульфату амонію запобігає метаногенному впливу мікроелементів на рубцеві мікроорганізми, зменшує емісію метану в атмосферу на 13 % та підвищує прирости маси тіла тварин до 14 % у порівнянні з тваринами контрольної групи.

Практичні рекомендації

З метою зменшення інтенсивності утворення метану в рубці великої рогатої худоби та підвищення приростів їх маси тіла рекомендуємо вводити в раціон добавку мікроелементів (Fe, Se, Cu, Zn, I, Co, Mn, Mo, Cr, Ni) із сульфатом амонію, в дозах розроблених співробітниками лабораторії обміну речовин Інституту біології тварин УААН.

СПИСОК опублікованих праць за темою дисертації

1. Біохімічні аспекти зменшення метаногенезу в рубці жуйних тварин / Г. О. Богданов, Л. І. Сологуб, В. В. Влізло, В. Г. Янович, І. В. Лучка // Вісник аграрної науки. — . — № . — С. –24. (Дисертант брав участь в аналізі літературних джерел та написанні статті).

2. Інтенсивність метаногенезу в рубці великої рогатої худоби під впливом карбонових кислот / І. В. Лучка, М. Г. Герасимів, Ю. Т. Салига, Р. О. Федяков, Л. І. Сологуб // Науково технічний бюлетень Інституту біології тварин та ДНДКІ вет. преп. та корм. доб. — . — Вип. , № –2. — С. –41. (Дисертант провів дослідження визначення утворення метану, ЛЖК та провів аналіз отриманих результатів брав участьу написанія статті).

3. The emission of methane by steers in different zones of West Ukraine under the different types of feeding / G. Bogdanov, L. Solohub, І. Luchka, M. Herasymiv, R. Fediakov // 2 Internat.Conf. GGAA. — Zurich, 2005. — P. 373–376. (Дисертант брав участь у постановці досліду, провів дослідження визначення утворення метану, провів статистичну обробку і аналіз отриманих результатів та написання статті).

4. Вплив добавок мінеральних елементів до раціонів бичків на утворення метану в рубці, його емісію в атмосферу і прирости живої маси / Г. О. Богданов, Л. І. Сологуб, І. В. Лучка, Р. О. Федяков, М. Г. Герасимів, О. В. Слипанюк // Біологія тварин. — . — Т. , № . — С. 68–71. (Дисертант брав участь у постановці досліду, провів дослідження визначення утворення метану, аналіз отриманих результатів та написання статті).

5. Лучка І. В., Сологуб Л. І. Вікові особливості утворення метану в рубці телят // Журнал агробіології та екології. — . — Т. , № –2. — С. –142. (Дисертант брав участь у проведені експериментальних досліджень, статистичній обробці й аналізі отриманих результатів та написання статті).

6. Утворення метану в рубці великої рогатої худоби Західньої України за різного типу годівлі / І. В. Лучка, Г. О. Богданов, Р. О. Федяков, Л. І. Сологуб, М. Г. Герасимів, Є. О. Дзень // Науково технічний бюлетень Інституту біології тварин та ДНДКІ вет. преп. та корм. доб. — . — Вип. , № . — С. –80. (Дисертант брав участь у постановці досліду, провів дослідження визначення утворення метану, провів статистичну обробку і аналіз отриманих результатів та написання статті).

7. Вплив карбонових кислот і спиртів на продукцію метану та летких жирних кислот в рубці великої рогатої худоби в дослідах in vitro / І. В. Лучка, Г. О. Богданов, Р. О. Федяков, Л. І. Сологуб, М. Г. Герасимів, Є. О. Дзень // Науково технічний бюлетень Інституту біології тварин та ДНДКІ вет. преп. та корм. доб. — . — Вип. , № . — С. –145. (Дисертант провів дослідження визначення утворення метану, ЛЖК. Брав участь у аналізі отриманих результатів та написання статті).

8. Лучка І. В. Вплив монензину і дріжджів виду Saccharomyces cerevisiae на утворення метану і деякі показники життєдіяльності бактерій в рубці великої рогатої худоби // Науково технічний бюлетень Інституту біології тварин — . — Вип. , № –2. — С. 87–91.

9. Вплив вуглеводів та їх метаболітів на метаноутворення і продукцію летких жирних кислот мікроорганізмами рубця телят в дослідах in vitro / І. В. Лучка, Г. О. Богданов, Л. І. Сологуб, М. Г. Герасимів, Р. О. Федяков // Науково технічний бюлетень Інституту біології тварин.— . — Вип. , № . — С. –56. (Дисертант провів дослідженяі визначення утворення метану, провів статистичну обробку. Брав участь у аналізі отриманих результатів та написання статті).

10. Ріст популяції бактерій рубця великої рогатої худоби і продукція метану в дослідах in vitro при додаванні до середовища різних амінокислот / І. В. Лучка, Г. О. Богданов, Л. І. Сологуб, М. Г. Герасимів // Біологія тварин. — . — Вип. , № –2. — С. –139. (Дисертант брав участь у визначенні інтенсивності росту бактерій, утворенні метану. Брав участь у аналізі отриманих результатів та написання статті).

11. Вплив сірковмісних сполук на метаногенез і деякі показники життєдіяльності мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби / І. В. Лучка, М. Г. Герасимів, Л. І. Сологуб, Р. О. Федяков // Конференція «Науково-практичні аспекти кормовиробництва та ефективного використання кормів». — Дубляни, 2003. — С. –160. (Дисертант провів експериментальні дослідження визначення вмісту білку, аміаку, утвореного метану та целюлозолітичну активність, статистичну обробку. Брав участь у аналізі отриманих результатів та написання статті).

12. Лучка І. В., Герасимів М. Г., Сологуб Л. І. Вплив деяких ненасичених карбонових кислот на ріст і життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят в дослідах in vitro // Науковий вісник ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького. — 2003. — Вип. , Ч. , № . — С. –74. (Дисертант провів експериментальні дослідження визначення кількості утвореного метану та ЛЖК, провів статистичну обробку. Брав участь у аналізі отриманих результатів та написання статті).

13. Some regulatory aspects of methanogenesis in the rumen of cattle / L. I. Solohub, R. Fediakov, M. Herasymiv, A. Voltornisty, I. Luchka // Annales Universitatis Marie Curie-Sklodowsкa. Sectio DDD, Pharmacia. —, 2002. — Vol.15, № . — Р. –297. (Дисертант провів експериментальні дослідження визначення метану, аміаку, мікробної маси та статистичну обробку. Брав участь у аналізі отриманих результатів та написання статті).

14. Вплив структурних і неструктурних вуглеводів на ріст і життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят в умовах in vitro / І. В. Лучка., Р. О. Федяков, М. Г. Герасимів, Л. І. Сологуб // Науково технічний бюлетень Інституту біології тварин — . — Вип.4, № . — С. 95–99. (Дисертант брав участь у проведенні експериментальні досліджень визначенні кількості метану, ЛЖК, аміаку та білка. Провів статистичну обробку. Брав участь у аналізі отриманих результатів та написання статті).

15. Biochemical aspects of mitigation of methane emission in atmosphere by ruminants / G., V. Vlizlo, L. Solohub, V. Yanovich, H. Antoniak, I. Luchka // GGAA Conference. — Christchurch, 2007. — . (Дисертант брав участь у постановці досліду, провів експериментальні дослідження визначення метану і Брав участь у аналізі отриманих результатів та написання тез).

16. The role of some carbohydrates