державна установа “

Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського академії медичних наук україни”

Лещенко Жанна Анатоліївна

УДК: 616.379-08.64: 612.015.32: 612.397.14

формування інсулінорезистентності У НАЩАДКІВ щурів

з гестаційним діабетом за урахуванням впливу соціально-емоційного стресу

(експериментальне дослідження)

14.01.14 – ендокринологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Державній установі “Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського Академії медичних наук України”

Науковий керівник доктор медичних наук, професор Полторак Вікторія Віталіївна,

Державна установа “Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського Академії медичних наук України”, відділ експериментальної ендокринології, завідувачка

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Кучмеровська Тамара Муратівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ біохімії коферментів, провідний науковий співробітник

кандидат медичних наук Будрейко Олена Анатоліївна,

Державна установа “Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків Академії медичних наук України”, відділення ендокринології, завідувачка

Захист відбудеться “ 14 ” лютого 2008 р. о 13-00 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.564.01 при Державній установі “Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського Академії медичних наук України” (61002, м. Харків, вул. Артема, 10).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи “Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського Академії медичних наук України” (61002, м. Харків, вул. Артема, 10).

Автореферат розісланий “ 09 ” січня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук Т.М. Тихонова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останні десятиріччя були відзначені значними досягненнями у розумінні природи метаболічного синдрому (МС), його діагностики та лікування. Однак не всі сторони патогенезу цього захворювання достатньо вивчені, й доказом цьому є неухильний ріст захворюваності, висока смертність і частота ускладнень. На сьогодні середня частота МС в популяції становить 20-25(Dunstan D. et al., 2002), а в деяких країнах, таких, як Іспанія та Куба, досягає 27,4та 32відповідно (Martinez L. M et2005; Fernandez-Britto J. E et2005).

Інсулінорезистентність (ІР) є головною патогенетичною ланкою у розвитку МС, його макросудинних ускладнень та у сполученні із порушенням функції панкреатичних бета-клітин визначає маніфестацію як цукрового діабету (ЦД) 2 типу, так і асоційованих з ним ангіопатій (Liese A. et1998). Сучасне уявлення про ІР охоплює не тільки зміни метаболічних реакцій (обмін вуглеводів, жирів та білків) у відповідь на вплив фізіологічних доз гормону, а й зміни мітогенних процесів (ріст та диференціація тканин, синтез ДНК, транскрипція та експресія генів) (Братусь В. та співавт., 2004). Епідеміологічні дослідження засвідчують наявність ІР у 10 % осіб без метаболічних порушень, у 58 % – з артеріальною гіпертензією, у 63% – з гіперурикемією, у 84 % – з гіпертригліцеридемією, у 88 % – з низьким рівнем холестерину ліпопротеїдів високої щільності, у 66 % – з порушеною толерантністю до глюкози, у 84 % – з ЦД 2 типу (Bonora E. et al., 1998). За умов сполучення ЦД 2 типу або порушеної толерантності до глюкози з дисліпідемією, гіперурикемією, гіпертонією, тобто з основними компонентами мета-болічного синдрому, ІР діагностується у 95 % осіб (Бутрова С. та співавт., 2004).

Материнський організм є середовищем, під впливом чинників якого відбувається реалізація генотипу зиготи у фенотип організму. Одними із основних факторів, які здатні впливати на експресію генів плоду, є гормони, що утворюються в жіночому організмі під дією зовнішніх і внутрішніх стимулів. Внутрішньоутробні зміни гормонального балансу, біосинтезу, секреції та метаболізму гормонів в орга-нізмі матері здатні викликати не лише тератогенні, але й мікроструктурні та функціональні порушення у нащадків (Резніков О. та співавт., 2004). Гестаційний діабет (ГД) є патологією, якій притаманний суттєвий гормональний дисбаланс, оскільки його основними патогенетичними ланками вважають зміни секреторної відповіді -клітин підшлункової залози та зниження утилізації глюкози периферич-ними тканинами, що викликають гіперглікемію, гіперліпідемію та компенсаційну гіперінсулінемію, тобто розвиваються метаболічні та гормональні порушення, притаманні початковим стадіям цукрового діабету (Butte N. et al., 2000; Mathieu C. et al., 2005). На сьогодні наявність ГД у матері вважають доведеним довгостроковим ушкоджуючим чинником (Geronooz I. et al., 1999; Hererra. N. et al., 2005), що значно збільшує ризик народження дитини з вродженими вадами розвитку (23 % порівняно до 2 % серед загалу). Приблизно у 30 % дітей, народжених від матерів із гестаційним діабетом, зафіксовано надлишок ваги на 90 % (Dang K. et al., 2000). Вважають, що у цих нащадків збільшується схильність до розвитку глюкозної інтолерантності й ожиріння в дорослому віці, що, в свою чергу, розглядають як сполучну ланку між ІР та подальшим розвитком у них МС і ЦД 2 типу (Touger L. et al., 2005). Наведена вище інформація переважно стосується констатації розвитку у дітей матерів з ГД метаболічних порушень без розкриття конкретних патофізіоло-гічних механізмів їх виникнення. Натепер відсутні дані щодо впливу материнської гестаційної інсулінової недостатності та гіперглікемії на формування чутливості до інсуліну та ліпідного обміну у нащадків на етапах післянатального онтогенезу. Це обумовлює важливість подальшого дослідження деяких ланок розвитку цього метаболічного дисбалансу у нащадків матерів, обтяжених гестаційним діабетом.

Психологічний стрес також є однією з поширених причин порушення гомеостазу вагітної жінки й призводить до віддалених негативних наслідків для здоров'я нащадків (Пшеничникова М., 2000; Татарчук Т., 2006). Епідеміологічними дослідженнями підтверджено зв'язок високого рівня стресу під час вагітності із затримкою розвитку плоду, передчасними пологами, народженням дітей з низькою вагою. Доведено, що стрес впливає на скорочення терміну гестації та вагу новонарод-жених незалежно від “класичних” чинників, які ускладнюють перебіг вагітності (акушерська патологія) (Seckl J. et al., 1999). У дітей від матерів з високим рівнем психологічного стресу під час вагітності достовірно частіше діагностуються зниження когнітивних функцій та психічні розлади в дорослому житті, а також патології, які є складовими МС – захворювання серцево-судинної системи та вісцеральне ожиріння (Reicher-Rossler A. et al., 2005). Натепер майже відсутня інформація щодо впливу додаткових чинників на тлі гестаційного діабету у матері на формування ІР у нащадків, як головної патогенетичної ланки у розвитку метаболічного синдрому, ЦД 2 типу та його макросудинних ускладнень. Як чинник, що може додатково впливати на прояви ІР, нашу увагу привернув соціально-емоційний стрес. Відомо, що гострі стресові стани викликають функціональне напруження інсулярного апарату підшлункової залози, безпосередньо впливаючи на секреторну функцію в-клітин (Delaunay F. et al., 1997). Тривале підвищення рівня стрес-гормонів у циркуляторному руслі може спричиняти периферичну ІР з подальшим розвитком гіпертензії, інтолерантності до глюкози, порушень обміну ліпідів та ліпопротеїнів (Barthel A. et al., 2003). У той же час саме жінки, особливо під час вагітності, більш чутливі до емоційного стресування (Agardh E. et al., 2003). Однак вивчення дії емоційного стресу матерів під час вагітності на формування чутливості до інсуліну у їх нащадків знаходиться на початковій стадії.

Таким чином, актуальність проблеми гестаційно-детермінованих порушень глюкозного гомеостазу у нащадків не викликає сумнівів. Дотепер залишаються невизначеними внесок інсулінорезистентності у розвиток вуглеводної інтолерантності у нащадків від матерів з гестаційною гіперглікемією та чинники, що її потенціюють. Виходячи з вищеозначеного, дослідження механізмів формування інсулінорезис-тентності у нащадків матерів з ГД та впливу додаткових чинників на всі складові загальної чутливості до інсуліну є актуальною науковою проблемою, вирішення якої дасть змогу визначити серед загалу вагітних групи ризику щодо можливого розвитку певного типу ендокринопатій у нащадків та розробити принципи патогенетично обґрунтованих рекомендацій для профілактики та корекції виявлених порушень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідних робіт: “Вивчення поширеності, особливос-тей еволюції гестаційних форм цукрового діабету і тиреопатій: розробка нової технології прогнозування і фармакопрофілактики”, № держреєстраціїА010017551 та “Особливості формування ендокринопатій та стан адаптаційних можливостей у нащадків матерів з гестаційним діабетом; розробка заходів реабілітаційної терапії”, № держреєстрації U001599, які виконувались у відповідності до планів роботи Інституту проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є визначення ролі гестаційного діабету матері у формуванні інсулінорезистентності в нащадків за умов впливу соціально-емоційного стресу.

Реалізація поставленої мети здійснена шляхом вирішення наступних завдань.

1. Вивчити вплив гестаційного діабету матері на формування чутливості до інсуліну та ліпідного обміну у нащадків-щурів першого покоління на етапах післянатального онтогенезу.

2. З’ясувати вплив раннього пренатального соціально-емоційного стресування на тлі материнського гестаційного діабету на показники печінкової, м’язової та жирової інсулінорезистентності у нащадків.

3. Дослідити вплив гестаційного діабету матері на чутливість до діабетогенного чинника нейро-ендокринної природи (додаткове стресування) у нащадків за біохімічними показниками резистентності печінкової, м’язової та жирової тканин до інсуліну.

4. Експериментально обґрунтувати можливість фармакологічної корекції розвитку інсулінорезистентності у нащадків матерів із гестаційною гіперглікемією та/або соціально-емоційним стресом.

Об’єкт дослідження – чутливість до інсуліну у щурів популяції Вістар – нащадків першого покоління від матерів із гестаційною гіперглікемією та/або соціально-емоційним стресом.

Предмет дослідження – параметри загальної чутливості до інсуліну, біохімічні кореляти чутливості до інсуліну печінкової, м’язової та жирової тканин у нащадків від матерів із гестаційною гіперглікемією та/або соціально-емоційним стресом, в базальному стані та за умов застосування антиоксидантних вітамінів.

Методи досліджень. Для виконання основних завдань дослідження використано фізіологічні, патофізіологічні, біохімічні, радіоімунологічні, математичні (гомеостатична модель оцінки інсулінорезистентності та кількісний метод визначення індексу чутливості до інсуліну) та статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначено патогенетичну роль інсулінорезистентності в розвитку інтолерантності до глюкози та виявлено сут-тєві статеві розбіжності її формування у нащадків матерів з інсуліновою недостат-ністю в гестаційний період. встановлено вагомий внесок інсулінорезистентності жирової тканини у формування загальної інсулінорезистентності (на тлі нормальної чутливості до дії гормону в міоцитах та гепатоцитах) у нащадків-самиць та розвиток усіх її складових у самців.

Встановлено, що соціально-емоційний стрес на тлі діабетичного стану в період вагітності матері проявляє виразний потенціюючий ефект на розвиток резистентності до інсуліну у нащадків-самців. Вперше показано, що материнський гестаційний діабет індукує підвищення ендогенної продукції глюкози у нащадків-самців, а соціально-емоційний стрес під час вагітності значно її посилює.

Встановлено, що поєднання діабетичного стану матері з раннім пренатальним стресом потенціює підвищену чутливість організму нащадків до додаткового пост-натального стресування короткочасною гіпокінезією. Виявлено статевий диморфізм реакції, а саме підвищену реакцію на вплив ушкоджуючих чинників у самців.

Доведено здатність вітамінів з антиоксидантними властивостями гальмувати розвиток інсулінорезистентності та діабетичної дисліпідемії у нащадків від матерів, які зазнали гестаційної інсулінової недостатності та/або соціально-емоційного стресу в період вагітності, що обґрунтовує перспективність застосування цих вітамінів для запобігання розвитку вищезазначених метаболічних порушень.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати допомогли експериментально обґрунтувати доказове відокремлення груп ризику серед загалу вагітних щодо розвитку метаболічних порушень у їхніх нащадків. Встановлення наслідків дії гестаційної гіперглікемії матері на формування інсулінорезистентності у нащадків та експериментальна апробація реабілітаційної терапії стало підґрунтям для розробки патогенетично обґрунтованих заходів щодо профілактики та корекції зниженої чутливості до інсуліну у нащадків, і в такий спосіб сприятиме зниженню частоти розвитку метаболічного синдрому, цукрового діабету 2 типу та асоційованих із ними судинних ускладнень.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно було одержано увесь фактичний матеріал, викладений у роботі. Аналіз та систематизацію результатів, математичне обчислення функціональних індексів, статистичну обробку даних, обґрунтування наукових положень та висновків, а також написання дисертаційної роботи автор виконав самостійно. Дизайн дисертаційного досліджен-ня розроблено під керівництвом д.мед.н., проф. В. В. Полторак. Моделювання експериментального гестаційного діабету, пренатального соціально-емоційного стресу та короткочасного стресування гіпокінезією відтворено за участю к.б.н. Н.С. Красової. Визначення рівня інсуліну в сироватці крові проведено разом із к.мед.н., с.н.с. О. І. Гладких. Верифікація відтворення моделі соціально-емоційного стресування проведена співробітниками лабораторії патогістології під керівництвом к.мед.н., с.н.с. Л.Ю. Сергієнко.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались та обговорювались на науково-практичній конференції, присвяченій 25-річчю клініки УкрНДІФЕЗ (Харків, 1993), на 33-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Гельсінкі, Фінляндія, 1997), на П’ятому Європейському конгресі ендокринологів (Турин, Італія, 2001), на Першій науково-практичній конференції, присвяченій 95-річчю В.П. Комісаренка (Київ, 2002), на науково-практичній конфе-ренції, присвяченій 180-річчю В.Я. Данилевського (Харків, 2002), на 8-ому Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), на 38-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Будапешт, Угорщина, 2002), на Других Данилевських читаннях (Харків, 2003), на Пленумі асоціації ендокринологів України, присвяченому 25-річчю кафедри ендокринології Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького (Львів, 2003), на Четвертому Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004), на 40-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Мюнхен, Німеччина, 2004), на 8-му Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2004), на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів (Харків, 2005), на науково-практичній конференції “Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005), на науково-практичній конференції з міжнародною участю “Особливості ендокринної патології в різних вікових періодах: проблеми та шляхи вирішення” (Харків, 2005), на VII з’їзді ендокри-нологів України (Київ, 2007), на Шостих Данилевських читаннях (Харків, 2007), на 43-му конгресі Європейської асоціації з вивчення цукрового діабету (Амстердам, Нідерланди, 2007) та інших наукових форумах в Україні і за кордоном.

Публікації. Автором за темою дисертації опубліковано 25 наукових праць (5 статей у наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, з яких 2 одноосібних та решта у співавторстві), та 18 тез доповідей у матеріалах вітчизняних та закордонних з'їздів, конгресів та конференцій. Автор є співавтором патенту України та методичних рекомендацій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 181 сторінці тексту, складається зі вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, заключення, висновків, списку використаних джерел. Матеріал дисертації ілюстровано 24 таблицями та 34 рисунками. Список використаної літератури включає 311 найменувань та складає 30 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на нащадках першого покоління білих щурів популяції Вістар з розплідника Інституту проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України. Репрезентативну вибірку щурів, необхідних для одержання нащадків, було сформовано методом випадкового відбору тварин з генеральної сукупності; розподіл на експериментальні групи проведено рендомним методом (Лакин Г., 1980). Усього досліджено 738 нащадків першого покоління, а саме 364 самці та 378 самиць 45- та 90-добового віку. Тварин утримували в стандартних умовах віварію при природному освітленні та харчовому режимі, рекомендованому для даного виду тварин. Дослідження проводилися відповідно до національних "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах" (Україна, 2001), що узгоджуються з положеннями „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985).

Моделювання порушеної толерантності до глюкози на тлі відносної інсулі-нової недостатності, як основних гормонально-метаболічних проявів гестаційного цукрового діабету, відтворювали шляхом одноразової внутрішньочеревної ін'єкції стрептозотоцину на другу добу вагітності самиці в дозі 45 мг/кг маси тіла (на 0,1цитратному буфері, рН 4,5) (Dцrner G., 1990). З метою підтвердження моделі гестаційного експериментального стрептозотоцинового діабету (ГСД) у вагітних самиць на дев’ятий день гестації визначали глікемію в базальному стані. Для експерименту відбирали нащадків від самиць з помірною базальною гіперглікемією в межах 8–12 ммоль/л.

соціально-емоційний стрес (СЕС) першого триместру вагітності (з другої по восьму добу) відтворювали шляхом щоденної зміни груп тварин в оточенні. Кожного разу, впродовж світлової частини доби (6 годин), вагітну самицю поміщали, в іншу клітку із незнайомою їй групою з 25 невагітних статевозрілих тварин, а потім її відсаджували в окрему клітку (Pratt N., 1989).

Для вивчення здатності до адаптації та оцінки чутливості до короткочасного стресування гіпокінезією (СГК) як чинника, що спричиняє функціональне напруження інсулінпродукуючого апарату підшлункової залози та провокує зниження чутливості печінки, м’язів і жирової тканини до гіпоглікемічної дії інсуліну, тварину перед навантажувальними глюкозними тестами або декапітацією поміщали на 1 годину в пенал для знерухомлення (Аршавский И., 1982). Вибір саме цієї моделі стресу було обумовлено необхідністю виявлення початкових стадій порушень глюкозного гомеостазу та чутливості до інсуліну у піддослідних щурів за умов відсутності достовірних змін більшості з досліджуваних показників у контрольних тварин.

Натепер існує гіпотеза, згідно з якою одним із вагомих патогенетичних чинників розвитку ІР є підвищення продукції вільних радикалів, тобто посилення оксидативного стресу, тому на сьогодні актуальним є дослідження впливу антиоксидантів (АО) на розвиток ІР з метою попередження розвитку її дисметаболічних проявів до маніфестного ЦД (Plutzky J., 2002). Антиоксидантну терапію (АОТ) проводили з 21 по 35 добу життя вітамінами Е в дозі 50 мг/кг маси тіла та С в дозі 200 мг/кг маси тіла (Siman1997). Комбінація саме цих вітамінів зумовлена синергічністю їх функціонування в системі антиоксидантного захисту (Балаболкін М. та співавт., 2005).

Оскільки на сьогодні не викликає сумніву участь статевих гормонів у формуванні та регуляції глюкозного гомеостазу і чутливості до інсуліну (Polderman1994), були досліджені метаболічні показники нащадків обох статей та проведено порівняльний аналіз впливу експериментального гестаційного діабету та соціально-емоційного стресу.

У тварин усіх досліджуваних груп вимірювали рівень глюкози крові в базальному стані та під час внутрішньочеревного тесту толерантності до глюкози (ВЧТТГ). Забір крові здійснювали з хвостової вени після попереднього восьми-годинного голодування, а також через 30, 60 та 120 хв після внутрішньочеревного введення глюкози (3 г на кг маси тіла). Рівень глюкози в крові визначали глюко-зооксидазним методом із застосуванням аналізатора глюкози “Ексан-г” (Литва). Глікемічну реакцію при проведенні тесту толерантності до вуглеводів оцінювали за підвищенням рівня глікемії через 30 хв після глюкозного навантаження та інтегральною глікемією, яку розраховували як сумарний показник рівнів глюкози крові в усі часові точки ВЧТТГ.

Для визначення резистентності до інсуліну було застосовано математичну модель оцінки ІР (НОМА – Homeostasis Model Assessment), що базується на викори-станні базальних концентрацій глюкози та інсуліну (Matthews D. et al, 1985). Для кількісного визначення чутливості до інсуліну було використано індекс QUICKI (Quantitative Insulin Sensitivity Check Index) (Katz A. et al., 2000). За даними розробників методу "глюкозного затискача" для визначення чутливості до інсуліну in vivo індекс QUICKI мав найкращу лінійну кореляцію з параметрами "золотого стандарту". Оскільки коефіцієнти HOMA та QUICKI визначають рівень метаболічних порушень у базальному стані, а, як відомо, у розвитку серцево-судинних захворювань суттєвий внесок належить постпрандіальній гіперглікемії (Ceriello A., 2003), доцільним було проведення короткого тесту толерантності до інсуліну (ТТІ), який дозволяє в динаміці оцінити чутливість печінки та периферичних тканин до дії інсуліну, врахо-вуючи гальмування продукції глюкози в печінці та підвищення утилізації глюкози м’язами внаслідок ефекту гормону. Чутливість до інсуліну визначали, розраховуючи відсоток зниження базальної глікемії через 30 хв після підшкірного введення гормону тваринам (1 Од на кг маси тіла) (Akinmokun A. et al., 1992). Інсулінемію оцінювали радіоімунологічно із використанням наборів "рио-ИНС-ПГ-125I" (Республіка Бєларусь).

Для верифікації ІР використовували показники, що характеризують чутливість жирової тканини до дії інсуліну, – рівні тригліцеридів (ТГ) та неестерифікованих жирних кислот (НЕЖК) у сироватці крові. Рівень НЕЖК у сироватці крові піддослідних тварин визначали фотометричним методом W. Duncombe. Рівень НЕЖК у сироватці крові розраховували за калібрувальною кривою; в якості внутрішнього стандарту використовували пальмітинову кислоту. Рівень ТГ в сироватці крові визначали ферментативним методом за допомогою стандартних наборів фірми "Lachema" (Чеська Республіка). Визначення рівня холестерину у експериментальних тварин проводили спектрофотометричним методом за допомогою стандартного набору фірми "Lachema" (Чеська Республіка). Для характеристики чутливості печінки та м’язів експериментальних щурів до дії інсуліну визначали вміст глікогену в печінці та м’язах фотоколориметричним методом. Оцінка ендогенної продукції глюкози проводилась за показником активності глюкозо-6-фосфатази (Г-6-Фаза) у печінці, яку оцінювали за методом М. Свенсона.

Статистичний аналіз отриманих даних здійснено за допомогою стандартних пакетів програм Exel та Biostat (Гланц С., 1999). Визначення виду розподілу ознаки у виборці проводили з використанням критерію Шапіро-Уілка, а рівність дисперсій розподілу ознак – за допомогою критерію Левена. Статистичний аналіз ознак, що характеризуються нормальним розподілом та близькими дисперсіями, приводили за допомогою критерію Стьюдента (t). При порівнянні двох груп з розподілом ознаки, відмінним від нормального, використовували непараметричний U-критерій Манна-Уітні (Гублер Е., Генкин А., 1973). Для оцінки лінійного зв’язку між кількісними ознаками застосовували коефіцієнт кореляції Пірсона (r). Розходження вважали статистично значущим при P<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Під час проведення ТТІ у 45-добових нащадків було виявлено вірогідне порушення чутливості до інсуліну: у самців усіх експериментальних груп (“Стрес”, “ГСД” та “ГСД+стрес”) та у самиць, що складали групи “ГСД” та “ГСД+стрес” (рис. 1). Ці порушення знайшли своє відображення у відсутності виразного зниження рівня глікемії у відповідь на введення екзогенного інсуліну на відміну від адекватної реакції на навантаження інсуліном у тварин контрольних груп. Відсоток зниження базальної глікемії через 30 хв після внутрішньочеревного введення гормону становив: у самців у групах “Стрес” – 3,27“ГСД” – 4,41“ГСД+стрес” – 4,39 та 34,09у контролі. У самиць цей показник був на рівні 32,32; 5,75 та 5,10в групах “Стрес”, “ГСД” та “ГСД+стрес”, відповідно (в контролі – 38,48

а) б)

Рис. 1. Динаміка глікемії під час ТТІ (1 Од/кг маси тіла) у самців (а) та самиць (б) щурів-нащадків віком 45 діб, n=5:

*- вірогідність змін порівняно з базальним рівнем, (р0,001).

Дослідження загальної чутливості до інсуліну під час ТТІ у 90-добових нащадків показало збереження виявлених у 45-добових тварин порушень відповіді глюкозного гомеостазу на введення екзогенного інсуліну. Але до вищезазначених груп із підвищеною толерантністю до інсуліну додалась група самиць “Стрес” (зниження рівня глікемії після введення інсуліну – 12,78проти 38,54в контролі), що може свідчити про віддалений термін розвитку ІР та більші адаптаційні можливості інсулінпродукуючого апарату самиць.

На підставі даних ВЧТТГ, ТТІ, базальних рівнів ІРІ, коефіцієнтів ІР-НОМА та QUICKI можна констатувати предіабетичний стан у півторамісячних нащадків від матерів з гестаційною відносною інсуліновою недостатністю (порушення толерантності до глюкози та гіперсекреція інсуліну за відсутності базальної гіперглікемії) (табл.1). Крім того, наявність базальної гіперінсулінемії (P<0,001) на тлі відсутності підвищення рівня глікемії натще свідчить про збереження у цих тварин секреторної функції бета-клітин, достатньої для забезпечення нормоглікемії в умовах інсулінорезистентності та підтверджує провідну патогенетичну роль останньої у розвитку інтолерантності до глюкози. Поєднання діабетичного стану зі стресом у період вагітності матері виказує виразний потенціюючий ефект на розвиток резистентності до інсуліну у нащадків-самців (див. табл. 1).

Таблиця 1

Показники глюкозного гомеостазу та чутливості до інсуліну у нащадків матерів з гестаційним діабетом та/або стресом, (Х±Sx)

Показники | Група, кількість тварин

Контроль,

n=6 | Стрес,

n=7 | ГСД,

n=7 | ГСД+стрес, n=6

Самці

Глікемія натще, ммоль/л | 3,95±0,13 | 4,01±0,16 | 3,94±0,18 | 4,20±0,13

Інтегральна глікемія, ммоль/л | 21,31±0,23 | 26,83±0,86

P10,05 | 30,49±0,60

P10,001 |

35,11±0,48

P10,001

P20,001

ІРІ, пмоль/л | 61,85±2,95 | 109,82±4,68

P10,001 | 145,45±3,58

P10,001 |

172,01±8,10

P10,001

P20,001

Коефіцієнт ІР-НОМА | 1,70±0,09 | 3,06±0,18

P10,001 |

4,11±0,10

P10,001 |

5,24±0,42

P10,001

P20,05

Коефіцієнт QUICKI | 0,275±0,004 | 0,240±0,003

P10,001 | 0,223±0,003

P10,001 |

0,213±0,003

P10,001

P20,05

Самиці

Глікемія натще, ммоль/л | 4,03±0,16 | 4,09±0,10 | 3,99±0,18 | 4,24±0,12

Інтегральна глікемія, ммоль/л | 20,06±0,61 | 20,62±0,63* | 33,01±0,50*

P10,001 | 28,88±0,29*

P10,001

ІРІ, пмоль/л | 53,58±1,67 | 58,40±2,73* |

93,05±3,30*

P10,001 | 96,25±2,85*

P10,001

Коефіцієнт

ІР-НОМА | 1,52±0,11 | 1,66±0,11* | 2,17±0,39*

P10,001 | 2,84±0,29*

P10,001

Коефіцієнт QUICKI | 0,285±0,005 | 0,277±0,005* |

0,248±0,002*

P10,001 | 0,244±0,004*

P10,001

Примітки:

1. р1- вірогідність змін порівняно з групою “контроль”;

2. р2- вірогідність змін порівняно з групою “ГСД”;

3. * - вірогідність змін порівняно з аналогічною групою самців (P0,001).

На момент досягнення нащадками статевозрілого віку зберігались виявлені в період пубертату порушення ВЧТТГ і ТТІ, вірогідне підвищення базального рівня ІРІ та коефіцієнта ІР-НОМА, а також зниження коефіцієнта QUICKI у самців усіх трьох експериментальних груп, а до самиць груп “ГСД” та “ГСД+стрес” додалась група, що зазнала впливу лише пренатального стресування.

Як відомо, за умов наявності загальної інсулінорезистентності найбільше клінічне значення має втрата чутливості до інсуліну печінкової, м’язової та жирової тканин. резистентність тканини печінки до інсуліну характеризується зниженням синтезу глікогену, активацією процесів його розпаду до глюкози (глікогеноліз) та синтезу глюкози de novo з амінокислот, лактату, пірувату, гліцерину (глюконеогенез), що й призводить до підвищення надходження глюкози до кровообігу (Leyva F. et al., 1998; Cristopher M. et al., 2006).У ході дослідження впливу материнського гестаційного діабету та раннього пренатального стресування на показники інсулінорезистентності гепатоцитів встановлено зниження в них вмісту глікогену у 45-добових самців усіх груп з гестаційними негараздами (“Стрес” – (25,43±0,88), “ГСД” – (21,61±0,53) та “ГСД+стрес” – (19,14±0,62) мг/гтк проти (32,89±0,72) мг/гтк у контролі, P<0,05). У самців групи, що зазнала поєднання впливу материнської гестаційної гіперглікемії та соціально-емоційного стресу, зниження запасів печінкового глікогену було найбільш виразним (P<0,001). Відмічено прогресування вищезазначених порушень з віком; так, при порівнянні груп статевозрілих самців і статевонезрілих зафіксовано зниження базального вмісту глікогену гепатоцитів на 20,91в групі “ГСД” та на 24,19в групі “ГСД+стрес”. У самиць взагалі не було виявлено жодних змін даного показника відносно контрольної групи.

Зменшення вмісту глікогену за умов інсулінорезистентності печінки може бути наслідком не тільки порушення її глікогенсинтетичної функції, а й суттєвої інтенсифікації глікогенолізу. За відсутності супресивного впливу інсуліну на актив-ність Г-6-Фази, яка контролює ендогенну продукцію глюкози гепатоцитами, спосте-рігається інтенсифікація трансмембранного переходу вільної глюкози незалежно від шляхів утворення Г-6-Ф (Hautonet al., 2001). У 45-добових нащадків-самців активність Г-6-Фази підвищувалась лише у групі “ГСД+стрес”, що свідчить про кумулятивний вплив гестаційних негараздів на активність цього ферменту ((11,81±0,90) проти (5,63±0,38) мкмоль/хв·гтк в контролі, P<0,001). Дані визначення активності Г-6-Фази у дорослих самців засвідчать про збереження посиленої ендогенної продукції глюкози, верифікованої у 45-добових тварин у групі “ГСД+стрес” ((11,18±0,58) проти (5,31±0,16) мкмоль/хв·гтк в контролі, P<0,001) та про її наявність у групі “ГСД”((9,51±0,37) мкмоль/хв·гтк, P<0,001). Особливий інтерес викликає факт статевого диморфізму розвитку ІР печінки у нащадків від матерів з інсуліновою недостатністю в період вагітності. Оскільки у нащадків-самиць не виявлено змін вмісту глікогену та активності Г-6-Фази, то мож-на припустити суттєвий протективний вплив естрогенів на формування резистент-ності гепатоцитів до дії інсуліну. Імовірно, даний ефект естрогенів реалізується через їх здатність пригнічувати експресію генів та активність таких ферментів, як фосфоенолпіруват карбоксикіназа та Г-6-Фаза (Bryzgalova G. et al., 2006).

Про неспроможність міоцитів статевонезрілих самців-нащадків від матерів з комбінованим впливом ГСД та стресу в період вагітності до інсулінопосередкованого накопичення вуглеводних резервів свідчить зниження вмісту м’язового глікогену на тлі базальної гіперінсулінемії (2,31±0,17 проти (3,96±0,27) мг/г тк в контролі, P<0,05).

За результатами дослідження показників ліпідного обміну було встановлено, що материнський гестаційний діабет, як окремо, так і у поєднанні зі стресом, викликає розвиток діабетичної дисліпідемії, верифікованої за підвищенням рівнів НЕЖК та ТГ у сироватці крові нащадків обох статей (P<0,01). У самиць рівень НЕЖК у циркуляторному руслі був вищим за умови ізольованого впливу гестаційної інсулінової недостатності (“ГСД” – (1,34±0,06) та “ГСД+стрес” – (0,93±0,10) проти (0,40±0,02) ммоль/л у контролі, P10,01), а у самців – за умови її комбінації зі стресом (“ГСД” – (1,26±0,06) та “ГСД+стрес” – (1,82±0,11) проти (0,49±0,04) ммоль/л у контролі, P10,01). Виявлено самостійний індукуючий вплив раннього пренатального стресу під час вагітності матері на розвиток ІР жирової тканини у нащадків-самців (P0,01).

Аналіз досліджених метаболічних показників виявив пряму кореляцію між інтенсивністю ендогенної продукції глюкози, визначеною за показником активності Г-6-Фази, та інтенсивністю ліполізу, визначеного за рівнями НЕЖК і ТГ у крові нащадків-самців. Коефіцієнт кореляції Пірсона між активністю Г-6-Фази й рівнем НЕЖК становив r = 0,736 (р<0,05), а з рівнем ТГ – r = 0,562 (р<0,05).

Оскільки у нащадків-самиць не було виявлено змін чутливості до інсуліну в печінковій та м’язовій тканинах, але встановлено наявність ІР жирової тканини, то можна припустити провідний внесок порушень саме ліпідного обміну у формування загальної ІР тварин жіночої статі. Надмірні концентрації НЕЖК можуть реалізувати свій патогенетичний вплив шляхом індукції розвитку ІР через порушення на рівні інсулін-стимульованого транспорту глюкози, а саме внаслідок дизрегуляції проведення інсулінового сигналу (Prentki M., 1996). За умов надлишку циркулюючих НЕЖК порушується стимульована інсуліном транслокація глюкозного транспортера-4, підвищуються концентрації діацилгліцеролу, фосфатидної кислоти і ТГ та активність однієї або декількох ізоформ протеїнкінази С. Остання здатна фосфорилювати, і в такий спосіб інактивувати як рецептори інсуліну та інсулін-рецепторний субстрат-1 (ІРС-1), так і глікогенсинтазу (Roduit R. et al., 2004). Гіпертригліцеридемія також може індукувати зниження як експресії інсулінових рецепторів, так і їх інсулінзв’язуючої активності в гормон-чутливих тканинах (Taskinen M., 2003). поєднання підвищених рівнів ТГ та НЕЖК у тварин цих груп є однією з ознак діабетичної дисліпідемії та метаболічного синдрому.

Дослідження чутливості нащадків до додаткового короткочасного гіпокінезійного стресування як діабетогенного чинника, що спричиняє функціональне напруження інсулінпродукуючого апарату підшлункової залози та провокує зниження чутливості печінки, м’язів та жирової тканини до гіпоглікемічної дії інсуліну, дозволило виявити у тварин із груп з помірною гіперглікемією в період ембріогенезу (незалежно від статі й віку) більш значущі, ніж у контролі підвищення базальних рівнів ІРІ й індексу ІР-НОМА та зниження індексу QUICKI (P0,001). Соціально-емоційне стресування у поєднанні з діабетичною вагітністю матері суттєво посилювало ІР у нащадків-самців за умов додаткового СГК. Так, у 45-добових нащадків підвищення індексу ІР-НОМА у відповідь на СГК становило 23,33 % у контролі, 26,36 % в групі “Стрес”, 26,51 % в групі “ГСД” та 40,62 % в групі “ГСД+стрес”. Слід зазначити, що підвищена реактивність самиць від матерів з гестаційним дисбалансом щодо стресування знерухомленням була значущою (P0,001), але менш виразною, ніж у самців. Гіпокінезійне навантаження статевозрілих самців-нащадків не виявило достовірної розбіжності між рівнями ІРІ, індексів ІР-НОМА та QUICKI в групах “ГСД” та “ГСД+стрес”, які спостерігались у період пубертату, що може свідчити про розвиток з часом адаптаційних процесів щодо зниженої чутливості до дії інсуліну. Вищеозначене узгоджується з концепцією пренатального “програмування”, згідно з якою внутрішньоутробні порушення гормонального балансу в організмі матері здатні викликати у нащадків модифікацію рівня експресії генів, що відповідають за формування чутливості та гормональну адаптацію до фізіологічних подразників (Nyirenda M. et al., 2006).

Зниження вмісту глікогену в печінці за умов стресу виникає внаслідок пригнічення адреналіном стимулюючої дії інсуліну на глікогенсинтетичну функцію гепатоцитів (зниження активності глікогенсинтетази) та одночасної інтенсифікації глікогенолізу (підвищення активності Г-6-Фази) (Robert M. et al., 2000). Фізіологічною реакцією організму на стрес є припинення синтезу глікогену та мобілізація його як вуглеводного резерву, що забезпечує надходження енергетичного субстрату для функціонування мозку, серця й м’язів. Додаткове гіпокінезійне стресування нащадків у статевозрілому віці дозволило підтвердити наявність зафіксованого з періоду препубертату дисбалансу між швидкістю глікогеноутво-рення і глікогенолізу у самців від матерів з гестаційною інсуліновою недостатністю (“ГСД” – (16,10±0,34) та “ГСД+стрес” – (13,07±0,55) проти (21,71±0,69) мг/гтк у контролі, P10,001) та вперше виявити його у самиць (“ГСД” – (21,47±0,63) та “ГСД+стрес” – (21,66±0,81) проти (25,83±0,42) мг/гтк у контролі, P10,01). Показано, що короткочасне знерухомлення зменшувало вміст глікогену у печінці всіх груп тварин (P0,001), що співпадає з даними літератури, але, як у самців, так і у самиць достеменно більш чутливими до нього виявились щури груп “ГСД” та “ГСД+стрес” (P0,001).

У межах адекватної реакції на стрес переважна кількість глюкози надходить з печінки до циркуляторного русла у вільному вигляді внаслідок активації глюкокортикоїдами ферменту Г-6-Фази – регулятора термінального етапу глюконеогенезу (Mooy J. et al., 2000). У даному дослідженні доведено підвищену чутливість статевонезрілих самців груп “ГСД” та “ГСД+стрес” (P0,001) і самиць групи “ГСД+стрес” (P0,01) до діабетогенного впливу гіпокінезії, верифіковану за більш значним, ніж в контрольній групі, підвищенням активності Г-6-Фази під впливом короткочасного СГК. Відсутність підвищеної чутливості до діабетогенного впливу гіпокінезії у самиць віком 90 днів з групи “ГСД+стрес”, яку було виявлено раніше, може бути пов’язана з вагомим інгібуючим впливом підвищеного рівня естрогенів на продукцію глюкози печінкою в статевозрілому віці (Borthwick E. et al., 2002; Bonds D. et al., 2006).

Адекватне (подібне до контролю) зниження вмісту глікогену в м’язах дорослих нащадків усіх досліджуваних груп у відповідь на додатковий стрес та відсутність кумулятивного ефекту щодо реактивності м’язів на стрес у самців групи “ГСД+стрес”, який було зафіксовано в період пубертату (P0,01), свідчить про підвищення з віком у цих нащадків адаптаційних можливостей систем, що забезпечують баланс між глікогенсинтетичними процесами та глікогенолізом.

Як відомо, стрес різного ґенезу викликає посилену мобілізацію НЕЖК та ТГ з жирового депо. Це обумовлено передусім вивільненням адреналіну та норадреналіну, які у м’язах та печінці стимулюють аденілатциклазу і в такий спосіб підвищують концентрацію цАМФ, що, в свою чергу, стимулює протеїнкіназу в адипоцитах, викликаючи фосфорилювання тригліцеридліпази. Зростання рівня НЕЖК у кровоплині забезпечує наявність енергетичного субстрату для роботи серця й м’язів та збереження глюкози, яка необхідна перш за все для забезпечення енергетичних потреб мозку, нервових тканин та еритроцитів (Herman J., 1993; Kousseff B., 1999). За показниками рівнів НЕЖК та ТГ у кровоплині верифіковано підвищену чутливість ліпідного обміну до додаткового стресування у нащадків обох статей від матерів з гестаційною інсуліновою недостатністю. Комбінація гіперглікемії з соціально-емоційним стресом у період вагітності матері при порівнянні з впливом ізольованого ГСД проявляє потенціюючий ефект щодо посилення резистентності жирової тканини до антиліполітичної дії інсуліну у відповідь на знерухомлення у нащадків-самців ((2,16±0,03) в групі “ГСД” проти (2,80±0,04) ммоль/л у групі “ГСД+стрес”, P0,01, у контролі – (1,41±0,06) ммоль/л) і не підсилює її у самиць ((2,51±0,03) у групі “ГСД” проти (2,31±0,03) ммоль/л у групі “ГСД+стрес”, у контролі – (0,80±0,05) ммоль/л).

Таким чином, отримані результати свідчать про те, що сполучення діабетичного стану з раннім пренатальним стресом потенціює підвищену чутливість організму нащадків до додаткових стресових чинників психогенної природи, причому у самців цей вплив більш виразний, ніж у самиць. Соціально-емоційний стрес на тлі діабетичного стану під час вагітності матері потенціює підвищену чутливість ліпідного обміну до додаткових стресових чинників психогенної природи у самців-нащадків у період статевого дозрівання.

На сьогодні встановлено, що оксидативний стрес є однією із основних патогенетичних ланок інсулінорезистентності, ЦД 2 типу та прискореного атеросклерозу. Підвищений рівень вільних радикалів посилює фосфорилювання IРС-1 за сериновим залишком й призводить до її деструкції через активацію протеїнкінази С, а також знижує експозицію глюкозного транспортера GLUT 4 у клітинах периферичних тканин і в такий спосіб порушує утилізацію глюкози і викликає розвиток інсулінорезистентності. Крім того, вільні радикали гальмують синтез проінсуліну, секрецію інсуліну та підвищують апоптоз панкреатичних бета-клітин, що спричиняє зменшення їх кількості та розвиток інсулінової недостатності. Окиснення ліпопротеїнів за умов оксидативного стресу сприяє зростанню атерогенного потенціалу та розвитку прискореного атеросклерозу (CerielloMotz2004). Оскільки отримані результати прдемонстрували, що гестаційний стрептозотоциновий діабет у матері викликає розвиток ІР, ліпідного дисбалансу та інтолерантності до глюкози у нащадків першого покоління, то за урахуванням доведеної важливої ролі оксидативного стресу в розвитку всіх вищезазначених метаболічних порушень, було патофізіологічно обґрунтованим вивчення ефектів використання АОТ у нащадків від матерів із гестаційними негараздами.

Оцінка впливу АОТ (сполучення природних антиоксидантів – вітамінів Е та С) на інтегральні показники чутливості до інсуліну та глюкозного гомеостазу показало, що застосування терапевтичних доз природних антиоксидантів у препубертатному періоді суттєво послаблює ІР та функціональне напруження інсулінпродукуючого апарату підшлункової залози у 45-денних нащадків, що зазнали впливу материнського ГСД та/або СЕС. Зниження індексу ІР-НОМА за умов АОТ становило 5,9 % в контролі, 49,1 % в групі “Стрес”, 61,9в групі “ГСД” та 51,2 % в групі “ГСД+стрес”, а базального рівня ІРІ – 0,8, 34,9; 56,7 та 45,9 %, відповідно. Але слід зазначити, що лише в групі самців з ізольованим впливом раннього пренатального стресування вітамінотерапія призводила до повної нормалізації вищезазначених показників.

Під час дослідження ефекту застосування АОТ на показники ІР печінки встановлено значне (P10,001) поліпшення глікогеннакопичувальної функції гепатоцитів у самців груп “Стрес”, “ГСД” та “ГСД+стрес” (відсотки підвищення вмісту глікогену склали 24,3; 60,1 та 77,2відповідно). Але, якщо у статевонезрілих самців під дією вітамінотерапії вміст глікогену у печінці піднімався до рівня, визначеного для контрольної групи тварин, то у статевозрілих він залишався зниженим у порівнянні до контролю, але був вірогідно вищим, ніж у відповідних