ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В. Н. КАРАЗіНА

ЛОАЙ ХАЛЕД МОХАММАД ХАССУНЕХ

УДК 577.175.44+577.125

Вікові особливості обміну ліпідів, які беруть участь в процесах сигнальної трансдукції

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор

Бабенко Наталія Олексіївна,

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна МОН України, НДІ біології,

завідувач відділу фізіології онтогенезу

Офіційні опоненти: | доктор медичних наук, професор

Давидов Вадим В'ячеславович,

Харківська медична академія післядипломної освіти Міністерства охорони здоров'я України, професор кафедри клінічної біохімії і судово-медичної токсикології

доктор біологічних наук, професор

Бондаренко Тетяна Петрівна,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків,

завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем

Захист відбудеться 18.06.2008 року о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 3-15.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4.

Автореферат розісланий 16.05.2008 року

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Дзюба В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ліпіди є важливими компонентами біологічних мембран і беруть участь в регуляції фізіологічних функцій клітин: проліферації, диференціації, апоптоза, секреції й транспорту речовин. Численні метаболіти гліцеро- і сфінголіпідів мають велику біологічну активність і залучені в процеси сигнальної трансдукції й формування адекватної стимулу й типу клітини, фізіологічної відповіді (Abdel-Latif A.A., 1986; Nishizuka В., 1992; van Blitterswijk W.J., 2003; Eyster K.M., 2007). Встановлено, що взаємодія агоністів з рецепторами клітинної поверхні супроводжується послідовною активацією фосфоліпаз С (ФЛС) і фосфоліпаз Д (ФЛД), накопиченням діацилгліцеролу ( ДАГ) та його взаємодією з білками-ефекторами, їхньою активацією й/або транслокацією в мембрани. Оскільки білки-ефектори ДАГ, як правило, займають ключове місце в сигнальній трансдукції або метаболічних процесах, то в процесі активації даного сигнального шляху відбувається швидка індукція специфічної клітинної відповіді. В той же час, хронічне накопичення ДАГ в клітинах - характерна риса ряду патологічних процесів: ожиріння, резистентності до дії інсуліну на тканини-цілі, діабету та онкогенезу (Unger R.H., 2002, 2003; Stratford S. et al., 2004). В модельних експериментах встановлено, що тривале культивування клітин в присутності аналогів ДАГ приводить до різкого зниження їх чутливості до дії гормонів, що активують при нормальному фізіологічному стані поліфосфоінозитидний (ПФІ) цикл (Gustavsson L. et al., 1994; Pettitt T.R. et al., 1997).

Раніше проведеними дослідженнями встановлено, що тиреоїдні гормони в умовах ex vivo та in vivo беруть участь в регуляції ПФІ-специфічної ФЛС і фосфатидилхолін (ФХ)-специфічної ФЛД, продукції і вмісту ДАГ в клітинах печінки молодих щурів (Kavok N.S. et al., 2001; Krasilnikova O.A. et al., 2002; Babenko N.A. et al., 2004). В той же час, гепатоцити старих тварин резистентні до короткочасної дії тироксина (Кавок Н.С. та ін., 2001). Залишаються нез'ясованими причини порушення здатності старих клітин печінки швидко і короткочасно накопичувати ДАГ у відповідь на дію гормону.

Відомо, що разом з фосфоліпазами С і Д, активація яких під дією гормонів і ростових чинників приводить до генерації сигнального ДАГ, існують і інші шляхи, серед яких особливе місце займає сфінгомієліновий (СФМ) шлях (Hannun Y.A. et al., 2001; Pettus B.J. et al. 2002). СФМ-синтази - важливі компоненти СФМ-го циклу і активація цих ферментів приводить до регуляції рівня не тільки ДАГ, але й іншого ліпіда, маючого біологічну активність, - цераміда (Luberto З. еt al., 1998; Tafesse F.G. et al., 2005). Церамід бере участь в регуляції найважливіших фізіологічних процесів: диференціаціїи, проліферації і апоптоза клітин (Hannun Y.A. et al., 2001; Pettus B.J. et al. 2002; van Blitterswijk W.J., 2003). Підвищення базального рівня цераміда у клітинах скелетної мускулатури інгібує фосфоінозитид-3-кіназа (ФІ3К)-опосередкований сигналінг інсуліну і є важливою причиною розвитку стану інсулін-резистентності (Unger R.H., 2002, 2003; Stratford S. et al., 2004). В той же час, порушення функції щитоподібної залози і розвиток експериментального гіпертиреозу приводить до активації кислої СФМ-ази, продукції і накопичення цераміда в печінці молодих щурів (Babenko N.A., 2005). У фізіологічних концентраціях тироксин викликає швидку і короткочасну активацію СФМ-синтази і накопичення СФМ в ізольованих плазматичних мембранах клітин печінки статевозрілих тварин.

Збільшення базального рівня цераміда в нейронах гіпокампу і інших структур мозку - характерна риса нейродегенеративних захворювань, що виникають в немолодому віці та у старості (Cutler R. G. et al., 2004; Satoi H. et al., 2005). Індуковане високожировою дієтою і пальмітиновою кислотою посилення синтезу цераміда de novo в кортикальних нейронах і астроглії приводить до посилення амілоідогенеза і гіперфосфорилювання білка tau (Patil S. et al., 2007). Тривале культивування різних клітин у присутності екзогенних церамідів приводить до їх накопичення усередині клітин, пригнічення їх проліферації, індукції експресії маркерів старіння (в-галактозидази та ін.) і формування фенотипа старої клітини (Venable M.E., 1995; Mouton R.E. et al., 2000; Cutler R.G. et al., 2001; Wu D. et al., 2003).

Ураховуючи ці дані і роль сигнальних ліпідів у розвитку залежних від віку патологій людини, вивчення особливостей регуляції метаболізму біологічно активних гліцеро- і сфінголіпідів набуває важливого значення для з'ясування механізмів розвитку порушень і адаптаційних змін сигнальних трансдукції у старості.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі фізіології онтогенезу НДІ біології ХНУ в рамках науково-дослідної роботи «Шляхи подолання резистентності клітин до дії фізіологічних стимулів у тварин різного віку» (№ державної реєстрації: 0106U001577).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - встановлення особливостей вмісту і обміну гліцеро- і сфінголіпідів, що беруть участь в процесах сигнальної трансдукції, у печінці і мозку щурів в умовах фізіологічного старіння, а також роль тироксина і аліментарних чинників у регуляції їх вмісту в клітинах-цілях. Відповідно до цілі були поставлені наступні завдання:

- провести дослідження вікових особливостей вмісту і обміну ДАГ, СФМ, цераміду, глюкозілцераміду (ГЛЦ) і сфінгозіну (СФЗ) в печінці, гіпокампі та корі мозку щурів;

- дослідити вплив тироксину на обмін сигнальних ліпідів у печінці та ізольованих гепатоцитах щурів 3- і 24-місячного віку;

- дослідити вплив пальмітинової кислоти і вітаміну Е на вміст і обмін гліцеро- і сфінголіпідів в печінці щурів різного віку;

- вивчити особливості модулюючої дії аліментарних чинників (пальмітинової кислоти і вітаміну Е) на регуляцію тироксином обміну сигнальних ліпідів в клітинах-цілях щурів 3- і 24-місячного віку.

Об'єкт дослідження - вікові особливості регуляції обміну сигнальних ліпідів тироксином і модуляція відповіді клітин-цілей на дію гормону за допомогою аліментарних чинників.

Предмет дослідження - вміст і обмін ДАГ і сфінголіпідів в печінці, гіпокампі, корі мозку та ізольованих гепатоцитах щурів різного віку.

Методи дослідження - для вивчення впливу тироксина на клітини-цілі використовували методи клітинної біології; розділення ліпідів на класи при вивченні їх вмісту і обміну проводили з використанням методу тонкошарової хроматографії; визначення вмісту ліпідів і білка в пробах проводили спектрофотометрично; при вивченні метаболізму ліпідів застосовували радіоізотопні методи включення 14С-міченіх попередників до складу ендогенних ліпідів; при статистичній обробці отриманих результатів використовували непараметричні (критерії Манна-Уїтні і Крускала-Уоліса) і параметричні методи аналізу (t-критерії Ст’юдента – для порівнянь двох груп, і дисперсійний аналіз, критерії Turkey, Fisher LSD-test - з метою множинних порівнянь).

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлені вікові особливості регулюючої дії тироксина на обмін ДАГ і сфінголіпідів в клітинах-цілях. Тироксин, при короткочасній дії на клітини 3-місячних щурів, активує синтез СФМ, при одночасному зниженні рівня ФХ, ФЕА і цераміда. В той же час, клітини, ізольовані з печінки 24-місячних щурів, - резистентні до короткочасної дії гормону. Збільшення базального рівня церамідів в гепатоцитах 3-місячних щурів за допомогою пальмітинової кислоти різко знижує ефект гормону на обмін вивчених ліпідів. Інкубація клітин у присутності екзогенних церамідів (N-ацетил, D-еритро-сфінгозина і N-пальмітоіл, D-еритро-сфінгозина) пригнічує синтез СФМ і ФХ в гепатоцитах 3-місячних щурів і імітує ефект пальмітинової кислоти на ці процеси. Важливим модулятором обміну ДАГ і сфінголіпідів в печінці щурів різного віку, метаболічного стану і швидкої відповіді клітин на дію тироксина є вітамін Е. Встановлено, що вітамін Е приводить до корекції базального рівня ДАГ і цераміда в печінці старих тварин, і вмісту і обміну цераміда і фосфоліпідів в "зістаренних", за допомогою пальмітинової кислоти, гепатоцитах молодих щурів, і збільшує їх чутливість до дії гормону.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані в роботі дані про зміни вмісту і обміну гліцеро- і сфінголіпідів, що мають біологічну активність, у функціонально різних тканинах тварин різного віку і харчового статусу дозволять розширити уявлення про особливості фізіологічного старіння і модулюючу дію аліментарних чинників на цей процес.

Дані про швидкі ефекти тироксина на обмін сигнальних ліпідів будуть сприяти поглибленню уявлень про механізм дії тиреоїдних гормонів на клітини-цілі.

Встановлені в роботі дані про дію аліментарних чинників на обмін і вміст ДАГ і цераміда, і відповідь клітин-цілей старих тварин і клітин "зістаренних" in vitro на дію тироксина можуть представляти основу для подальшого вивчення механізму направленої дії компонентів їжі на фізіологічні функції тварин різного віку.

Використання даних цього дослідження в дієтології і клініці буде сприяти підвищенню ефективності комплексної терапії захворювань, пов'язаних з порушенням обміну ліпідів і тиреоїдної патології, що виникають в різні вікові періоди.

Особистий внесок здобувача. Спільно з науковим керівником вибраний об'єкт і предмет дослідження, визначена мета, завдання і тема дисертаційної роботи і проведена інтерпретація отриманих результатів. Автором самостійно проведений аналіз наукової літератури, виконані експериментальні дослідження, проведена статистична обробка отриманих результатів, оформлення і підготовка матеріалів до публікації.

Апробація результатів. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на VII Міжнародному симпозіумі "Біологічні механізми старіння" (2006, Харків); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Експеріментальна та клінічна ендокринологія: фундаментальні та прикладні питання” (П'яті Данилевські читання) (2006, Харків); IX Українському біохімічному з'їзді (2006, Харків); V міжнародній науково-практичній конференції "Валеологія: сучасний стан, напрямки та перспективи розвитку" (2007, Харків).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 8 друкарських робіт, з яких 5 - статті в наукових журналах (4 - у виданнях, рекомендованих ВАК України) і 3 - тези доповідей в збірках матеріалів конференцій. Публікації повністю відображають основний зміст дисертації.

Структура і об'єм дисертації. Дисертація викладена на 113 сторінках друкарського тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису об'єкту, матеріалів і методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, висновку, і списку використаних джерел літератури. Робота проілюстрована 6 таблицями і 24 рисунками. Список літератури містить 209 джерел.

ОСНОВНИЙ ВМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається з чотирьох підрозділів, в яких розглянуті сучасні уявлення про участь ліпідів в сигнальній трансдукції, вікові особливості їх обміну і роль тиреоїдних гормонів в терміновій і довгостроковій регуляції обміну ліпідів, що виконують важливу роль в регуляції фізіологічних функцій в тканинах- і клітинах-цілях.

Матеріали і методи дослідження. Експерименти виконані на 120 щурах-самцях лінії Вістар 3- і 24-місячного віку, які утримувались в стандартних умовах віварію Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Всі дослідження на тваринах проводили з дотриманням Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів і інших наукових цілей (Страсбург, 1985). Об'єктом дослідження були: печінка, ізольовані гепатоцити, гіпокамп і кора мозку щурів.

Дослідний групі щурів вводили вітамін Е перорально в дозі 100 мкг на 100 г маси тіла протягом 7 днів. Контрольні тварини одержували кукурудзяну олію.

Печінку, гіпокамп і кору мозку використовували для отримання гомогенатів. Отримані гомогенати тканин використовували для вивчення вмісту ліпідів і включення мічених 14С попередників ([14С]пальмітинової кислоти, [14С]H3COONa) в ліпіди.

Нативність клітинних мембран гепатоцитів, виділених за допомогою методу Канаєвой І.П і ін. (1975) в модифікації Петренка О.Ю та ін. (1991), оцінювали за допомогою 0,4% розчину трипанового синього. Вихід життєздатних клітин складав 90±5%. Гепатоцити ресуспендували (до концентрації 6·106 клітин в 1 мл) в середовищі Ігла (рН 7,4), що містить 25 мМ HЕРЕS, пеніцилін (61 мг/л), стрептоміцин (100 мг/л), 10% ембріональну сироватку бика і 2 мкКи/мл [14С]пальмітинової кислоти і інкубували при 37°С протягом 90 хв. Після закінчення інкубації гепатоцити двічі відмивали надлишком буфера, що містить 118 мM NaCl, 5 мM KCl, 1 мM KH2PO4, 1 мM MgSO4, 2 мM CaCl2, 0,2% NaHCO3, 0,1% БСА, 61 мг/л пеніцилін, 100 мг/л стрептоміцин, рН 7,5 (середовище А) охолодженим до 4°С. Надалі гепатоцити розводили до концентрації 106 клітин на 1 мл в середовищі А. В окремих випадках ізольовані гепатоцити предінкубували у присутності вітаміну Е (100 мкг/мл) або кукурудзяної олії, або у присутності пальмітинової кислоти (0,75 мМ/л) протягом 90 хв і 6-24 годин при 37°С, відповідно. Ці клітини піддавали подальшій інкубації у присутності 10 нМ L-Т4 або 100 нМ NaOH протягом 0,5 - 60 хв при 37°C. Реакцію зупиняли додаванням охолодженої до 4оС суміші хлороформу з метанолом (1:2, об/об) і проводили екстракцію ліпідів за методом Bligh E.G та Dyer W.J (1959). Ліпіди розділяли на фракції в тонкому шарі силікагеля на комерційних пластинках Sorbfil у висхідному струмі розчинників. ДАГ розділяли в системі розчинників: гексан: диетиловий ефір: СН3СООН (73:25:2, за об'ємом). Для розділення СФМ, ФХ, ФЕА і цераміда використовували 2 системи розчинників: 1 - диетиловий ефір, 2 - хлороформ: метанол: Н2О (40:10:1, за об'ємом). Для ГЛЦ і СФЗ випарований екстракт ліпідів інкубували 60 хв при 37оС в середовищі: хлороформ - метанол (1:1, об/об), що містить NaOH (0,1 М), для гідролізу ацилгліцеринів. Ліпіди знов екстрагували і використовували для розділення на класи в системі розчинників: хлороформ: етилацетат: ізопропіловий спирт: метанол: 0,25% KCl. Плями ДАГ, фосфоліпідів і ГЛЦ проявляли в парах йоду, плями СФЗ - в 3 % розчині нингидрину на бутанолі, після чого ідентифікували, порівнюючи із стандартами. Для визначення метаболізму СФМ в гомогенаті печінки мічений [14С]пальмітиновою кислотою СФМ ресуспендували в 50 мМ ацетатному буфері (рН 5,0), 1 мМ ЕДТА і 0,9% тритон Х-100 або в буфері, що містить 50 мМ трис-НСl (рН 7,35), 1 мМ ЕДТА, 10 мМ МgCl2, 0,9% тритон Х-100. Проби інкубували при 37оС протягом 60 хв. Реакцію зупиняли додаванням охолодженої до 4оС суміші хлороформу з метанолом (1:2, об/об). Ліпіди екстрагували, випаровували у вакуумі і ацилгліцерини піддавали гідролізу. Сфінголіпіди розділяли на фракції, як описано вище. Кількісне визначення вмісту фосфоліпідів і ДАГ в пробах проводили по методу March L.M та Weinstein J.N (1966). Для кількісного визначення вмісту церамідів в тканинах плями ліпідів переносили в пробірки і еліювали сумішшю хлороформу з метанолом (1:1, об/об) з подальшим еліюванням метанолом (Sathishkumar S. et al., 2005). З'єднані елюати випаровували у вакуумі і піддавали гідролізу в 0,5 М НСl в метанолі при 65оС протягом 15 годин. Масу церамідів визначали по кількості вивільнених довголанцюгових основ в ході гідролізу ліпідів по методу Lauter і Trams (1962). Вміст білка в пробах визначали по методу Lowry T.J. та співавт. (1951). При аналізі отриманих результатів використовували критерії Манна-Уїтні і Крускала-Уоліса, t-критерії Ст’юдента і дисперсійний аналіз (ANOVA, критерій Turkey і Fisher LSD-test).

РЕЗУЛЬТАТІ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ІХ ОБГОВОРЕННЯ

Вікові особливості вмісту і обміну сигнальних ліпідів в печінці і мозку білих щурів. Проведеними дослідженнями встановлено, що вміст ДАГ і ВЖК істотно вище в печінці і корі головного мозку 24-місячних щурів у порівнянні з 3-місячними тваринами (рис. 1). Відомо, що в клітинах існують численні шляхи генерації ДАГ, серед яких важливе місце займають процеси синтезу. В даній роботі встановлено, що в старості в порівнянні із статевозрілими щурами збільшується синтез ДАГ у присутності [14C]пальмітинової кислоти в печінці і мозку на 50 і 60%, відповідно.

Рис. 1. Вміст ДАГ (Й) і ВЖК (ЙЙ) в печінці (А), гіпокампі (Б) і корі мозку (В) щурів 3- (1) і 24-місячного віку (2). Примітка. * - вірогідно щодо 3-місячного віку, р<0,05.

Встановлено також падіння вмісту і синтезу ФХ і ФЕА в печінці і корі мозку 24-місячних щурів в порівнянні з 3-місячними тваринами. Так, рівень ФХ в печінці 3- і 24-місячних щурів складає 97,4±7,28 і 73,6±8,40 нмоль на 1 мг білка (р<0,05), відповідно. Вміст ФХ в корі мозку 3- і 24-місячних щурів складає 212±11,5 і 194,6±3,02 нмоль на 1 мг білка, відповідно. В той же час, рівень ФЕА в корі падає з 375±7,46 у 3-місячних тварин до 306±6,85 нмоль на 1 мг білка (р<0,05) у 24-місячних щурів.

Вміст знов синтезованого у присутності [14C]пальмітинової кислоти ФХ в печінці і мозку щурів 24-місячного віку в 1,5 - 2 рази нижче, ніж у 3-місячних щурів. Можна вважати, що підвищення синтезу ДАГ на фоні пригнічення його використання в синтезі фосфоліпідів є важливою причиного збільшення його вмісту в печінці і мозку щурів в старості.

Відомо, що збільшення рівня ВЖК в клітинах підсилює синтез цераміда і загальних сфінголіпідів в печінці (Merrill A.H. et al., 1995), жировій тканини і скелетній мускулатурі (Schmitz-Pfeiffer С., 2002). Встановлено збільшення маси цераміда в печінці, гіпокампі і корі головного мозку і кількості СФМ в корі старих 24-місячних щурів в порівнянні з 3-місячними тваринами (рис. 2).

Рис. 2. Вміст цераміда (Й) і СФМ (ЙЙ) в печінці (А), гіпокампі (Б) і корі мозку (В) щурів 3- (1) і 24-місячного віку (2). Примітка. * - вірогідно щодо 3-місячного віку, р<0,05.

В печінці збільшення в старості вмісту цераміда відбувається на фоні збільшення його синтезу de novo більш, ніж в 2 рази, вміст його знов синтезованих метаболитів: ГЛЦ і СФЗ і загального рівня сфінголіпідів. В цілому, загальний вміст знов утворених токсичних ліпідів (цераміда і СФЗ) в печінці старих тварин, в порівнянні з молодими - збільшується з 449±42 до 769±67 імп/хв на 1 мг білка (р<0,05). Відношення ГЛЦ, який має про-проліферативні властивості, до цераміду знижується з 0,60±0,09 в печінці 3-місячних щурів до 0,38±0,07 (р<0,05) в печінці 24-місячних тварин. Збільшення вмісту цераміда в гіпокампі в старості відбувається не за рахунок зміни синтезу ліпіда de novo (оскільки цей процес пригнічується більш, ніж в 2 рази в мозку 24-місячних щурів в порівнянні з 3-місячними), а за рахунок посилення деградації складних сфінголіпідів: ГЛЦ, ФЕЦ, СФМ і інших.

На користь даного припущення свідчать дані про збільшення активності нейтральної мембранозв’язанної СФМази в гіпокампі і корі мозку 22-місячних щурів в порівнянні з 6-місячними тваринами (Gravelly N.A. et al., 2005).

Вікові особливості регуляції тироксином вмісту і обміну сигнальних ліпідів в клітинах-цілях. Відомо, що порушення функції щитоподібної залози і тиреоїдного статусу тварин різного віку приводить до глибоких змін вмісту і обміну ДАГ і сфінголіпідів в печінці і інших тканинах щурів (Krasilnikova O.A. et al., 2002; Gorska M. et al, 2003; Babenko N.A., 2005). В той же час, відомо, що тиреоїдні гормони можуть мати регулюючу дію на продукцію ДАГ і сфінголіпідів не тільки при їх тривалій дії на тканини-цілі, але і при короткочасній дії на плазматичні мембрани гепатоцитів (Kavok N.S. et al., 2001; Babenko N.A., 2005).

Проведеними дослідженнями встановлено, що L-Т4 викликає швидку зміну обміну ліпідів в інтактних гепатоцитах 3-місячних щурів (табл. 1). Так, L-Т4 знижує в клітинах, заздалегідь інкубованих з [14С]пальмітиновою кислотою, вміст 14С-церамід і відношення: [14С]-церамід/[14С]-СФМ, і збільшує синтез [14С]-СФМ і відношення: [14С]-ДАГ/[14С]-церамід в перші 30 сек дії. Ураховуючи те, що церамід і ДАГ є учасниками процесу синтезу СФМ і їх зміна в стимульованих гормоном клітинах відбувається синхронно, можна припустити, що в даних умовах експерименту відбувається швидка активація СФМ-синтази.

Таблиця 1

Вплив L-Т4 на обмін сфінголіпідів і діацилгліцерина в інтактних гепатоцитах 3-місячних щурів

14С-ліпіди | NaOH (контроль) | L-Т4 (дослід)

СФМ | 10263 ± 967 | 16648 ± 292*

Церамід | 655 ± 96,3 | 342 ± 63,7*

Церамід/СФМ | 0,062 ± 0,002 | 0,021 ± 0,005*

ДАГ/церамід | 1,09 ± 0,26 | 1,86 ± 0,017*

Примітки: 1) дані представлені в (імп / хв) на 2х107 клітин; 2) * - вірогідно щодо контролю, р <0,05.

Встановлено, що при більш тривалій дії L-Т4 на клітини 3-місячних щурів відбувається активація процесу ресинтезу компонентів СФМ-го циклу: цераміда, ФХ і ФЕА (рис. 3 і 4). У той же час, L-Т4 не впливає на обмін вивчених ліпідів в гепатоцитах 24-місячних тварин. Отримані дані свідчать про розвиток стану резистентності клітин старих тварин до швидкої дії L-Т4 .

Рис. 3. Вплив L-Т4 на синтез цераміда і СФМ в гепатоцитах 3-місячних щурів. Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р < 0,05.

Рис. 4. Вплив L-Т4 на синтез ФХ і ФЕА в гепатоцитах 3-місячних щурів.

Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р < 0,05.

Модуляція обміну гліцеро- і сфінголіпідів і відповіді клітин старих щурів на дію тироксина за допомогою вітаміну Е. Хронічне підвищення в клітинах печінки і клітинах інших тканин і органів базального рівня сигнальних ліпідів: ДАГ і цераміда приводить до розвитку їх резистентності до дії гормонів (Gustavsson L. et al, 1994; Venable M. E. et al., 1994; Unger R.H., 2002; Fulop T. et al., 2004). Даними дослідженнями показано, що розвиток резистентності клітин печінки 24-місячних щурів до дії L-Т4 відбувається на фоні підвищеного, в порівнянні з 3-місячними тваринами, вмісту ДАГ і церамідів. Наступна серія експериментів присвячена вивченню ролі аліментарних чинників в зміні обміну гліцеро- і сфінголіпідів в печінці молодих і старих щурів з метою модифікації швидкої відповіді клітин-цілей на дію L-Т4. Як модулятор обміну ДАГ і сфінголіпідів в даній роботі застосовували вітамін Е, оскільки відомо, що альфа-токоферол активує ДАГ-кіназу і інгібує СФМ-азу, і, таким чином, знижує в клітинах вміст ДАГ і цераміда, відповідно (Hatanaka В. et al., 1998; Mishra K.P., 2004; Azzi A.M. et al., 2000).

Даними дослідженнями встановлено, що введення вітаміну Е 24-місячним тваринам, які в нормі характеризуються підвищеним вмістом ДАГ, приводить до різкого зниження даного ліпіда в печінці. Так, вміст ДАГ в печінці контрольних 24-місячних щурів: 33,7±3,15 нмоль/мг білка, в печінці щурів, що одержували вітамін Е: 23,5±3,02 нмоль/мг білка (р < 0,05).

В роботі встановлено, що введення вітаміну Е 24-місячним тваринам знижувало масу цераміда з 0,282±0,029 нмоль/мг білка в печінці контрольних щурів до 0,169±0,032 нмоль/мг білка в печінці дослідних щурів (p<0,05). Відношення цераміда до СФМ (нмоль/нмоль) в печінці щурів контрольної і дослідної груп складало: 0,447±0,010 і 0,169±0,118 (p<0,05), відповідно. Вітамін Е приводив до посилення синтезу ФС, але не змінював його вміст в печінці старих тварин. Введення вітаміну Е не робило впливу на обмін і вміст інших ліпідів в печінці: ФХ, ФЕА, ГЛЦ і СФЗ. Інкубація шматочків печінки з вітаміном Е супроводжувалась істотним зниженням співвідношення цераміди/СФМ. Так, в контролі дане значення складало 0,413±0,080, а в дослідних пробах - 0,223±0,057 нмоль/нмоль (p<0,05). Отримані дані можуть свідчити про те, що вітамін Е в умовах ex vivo та in vitro, змінюючи активність СФМаз, сприяє збільшенню маси СФМ і зниженню вмісту цераміда. На користь даного припущення свідчать отримані в роботі дані про те, що предінкубація шматочків печінки з вітаміном Е пригнічує метаболізм міченого [14С]пальмітиновою кислотою СФМ і продукцію з нього [14С]цераміда при кислих і нейтральних значеннях рН. Так, вміст утвореного [14С]цераміда в контрольних і дослідних пробах ( рН 7,4) складав 208 ± 2,20 і 136 ± 6,20 імп/хв на 1 мг білка (р < 0,05), відповідно. При рН 4,5 ці значення складають: 178 ± 4,24 і 128 ± 3,04 імп/хв на 1 мг білка (р < 0,05), відповідно.

Встановлено, що інкубація шматочків печінки 24-місячних щурів з L-Т4 не приводить до значних змін рівня церамідів, СФМ, ФХ і ФЕА (рис. 5). В той же час, попередня інкубація клітин печінки з вітаміном Е збільшує їх чутливість до

Рис. 5. Вплив вітаміну Е на стимуляцію L-Т4 обміну сфінго- і глицероліпідів в печінці 24-місячних щурів. Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р < 0,05.

короткочасної дії гормону. Так, вміст церамідів, ФХ і ФЕА зменшується, а рівень СФМ збільшується під дією гормону. Відношення між ФХ і СФМ (ФХ/СФМ) в гормон-стимульованих клітинах печінки, предінкубованих з вітаміном Е, майже в 2 рази нижче, ніж в контролі, тоді як відношення церамід/СФМ знижується в L-Т4-стимульованих клітинах.

Інкубація мічених [14C]пальмітиновою кислотою гепатоцитів у присутності L-Т4 не впливала на вміст [14C]ДАГ і [14C]ФХ, який складав 85±10 і 80±12 % від контролю, відповідно. Проте, предінкубація клітин з вітаміном Е істотно впливала на метаболізм [14C]-ліпідів в агоністстимульованих клітинах. L-Т4 приводив до різкого збільшення рівня [14C]ДАГ при одночасному зниженні вмісту [14C]ФХ в клітинах предінкубованих з вітаміном Е. Рівень [14C]ДАГ і [14C]ФХ в стимульованих гепатоцитах складав 190±18 і 58±6 % (р < 0,05) від контролю, відповідно. Дані про зниження рівня цераміда (рис. 5) і ФХ/СФМ на фоні збільшення вмісту ДАГ при сполученій дії L-Т4 і вітаміну Е на клітини старих тварин може свідчити про активацію процесу синтезу СФМ за участю СФМ-синтази.

Вплив пальмітинової кислоти на швидку відповідь клітин печінки молодих щурів на дію тироксина. Для з'ясування механізму вікових порушень відповіді клітини на гормональну дію в даній роботі вивчали дію L-Т4 на ізольовані гепатоцити молодих щурів з експериментально модифікованим рівнем вмісту і обміну сфінголіпідів і ДАГ.

Встановлено, що внутрішньовенне краплинне введення пальмітинової кислоти тваринам або в середовище культивування клітин супроводжується підвищенням маси цераміда і ДАГ в клітинах печінки і скелетних м'язів і знижує їх чутливість до дії фізіологічних стимулів (Chaves E.P. et al., 2001, Solinas G. et al, 2006). В роботі використовували пальмітинову кислоту для моделювання стану обміну сфінго- і глицероліпідів, характерного для гепатоцитів старих тварин. Встановлено, що тривале культивування гепатоцитів 3-місячних щурів у присутності пальмітинової кислоти приводить до, залежного від часу, збільшення базального рівня і синтезу цераміда (рис. 6) і ДАГ (рис. 7).

Рис. 6. Вплив пальмітинової кислоти (16:0) на вміст і синтез цераміда в гепатоцитах 3-місячних щурів. Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р < 0,05.

Рис. 7. Вплив пальмітинової кислоти (16:0) на синтез діацилгліцеролу в гепатоцитах 3-місячних щурів. Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р < 0,05.

Проте, не дивлячись на одночасне підвищення під дією пальмітинової кислоти синтезу цераміда і СФМ, із збільшенням часу дії на клітини підвищується відношення знов синтезованого цераміда до знов синтезованого СФМ: 0,063 ± 0,003 (контроль), 0,050 ± 0,005 (6 годин) і 0,084 ± 0,002 (24 години, р < 0,05). При тривалій дії пальмітинової слоти на гепатоцити 3-місячних щурів (24 години) відбувається зниження вмісту знов синтезованих ФХ в клітинах в 1,4 рази.

Наступним етапом роботи було вивчення особливостей відповіді даних клітин на короткочасну дію L-Т4. Так, інкубація "старих" клітин у присутності L-Т4 супроводжується зниженням рівня [14С]-СФМ і відношення [14С]-ДАГ/[14С]-церамід, і збільшенням – [14С]-церамід/[14С]-СФМ (рис. 8). В той же час, гормон не впливає на вміст [14С]-цераміду в клітинах.

Рис. 8. Вплив пальмітинової кислоти (16:0) на регуляцію L-Т4 обміну сфінго- і глицероліпідів в гепатоцитах 3-місячних щурів. Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р < 0,05

Ці дані дозволяють повністю виключити активацію СФМ-синтази в L-Т4-стимульованих гепатоцитах, предінкубованих з пальмітиновою кислотою. Порушення в даних умовах, обміну ФХ, СФМ і ДАГ (учасників СФМ-синтазної

реакції) може впливати на сигналінг тироксина в клітинах.

Так, відомо, що додавання в середовище культивування клітин ФХ активує СФМ-синтазу і синтез СФМ (Radin N.S., 2003). В той же час, збільшення рівня СФМ або ДАГ гальмує СФМ-синтазну реакцію по типу зворотного зв'язку. Можна вважати, що в наших умовах експерименту падіння в гепатоцитах рівня знов синтезованого ФХ на фоні підвищення рівня ДАГ і СФМ важлива причина пригнічення СФМ-синтазної реакції в гормон-стимульованих клітинах, культивованих у присутності пальмітинової кислоти. Не виключено, проте, що збільшення вмісту знов синтезованого цераміда в гепатоцитах, предінкубованих у присутності пальміт инової кислоти, відіграє важливу роль в порушенні регуляції процесу синтезу СФМ.

Так, нашими дослідженнями встановлено, що культивування гепатоцитів, виділених з печінки 3-місячних щурів у присутності екзогенниого синтетичного цераміда, легко проникаючого в клітину - N-ацетил, D-еритро-сфінгозина (С2) або натурального N-пальмітоіл, D-еритро-сфінгозина і [14С]пальмітинової кислоти приводить до зниження вмісту знов синтезованого СФМ і ФХ (табл. 2).

Нашими дослідженнями встановлено, що важливим модулятором обміну сфінго- і глицероліпідів в печінці старих щурів є вітамін Е. Встановлено, що вітамін Е знижує підвищений в старості рівень цераміда і ДАГ, і збільшує чутливість клітин до короткочасної дії L-Т4. Зважаючи на це, в даній роботі з метою корекції обміну сфінго- і гліцероліпідів в гепатоцитах, предінкубованих з пальмітиновою кислотою, використовували вітамін Е.

Таблиця 2

Вплив екзогенних церамідів на вміст [14С]СФМ і [14С]ФХ в ізольованих гепатоцитах 3-місячних щурів

Вплив | 14С - ліпіди

СФМ | ФХ

Контроль | 1921 ± 471 | 4369 ± 357

С2 - N-ацетил, D-еритро-сфінгозин | 988 ± 39,0* | 3425 ± 174*

N-пальмітоіл, D-еритро-сфінгозин | 271 ± 33,4* | 2062 ± 288*

Примітка: 1) дані представлені в (імп / хв) на 2х107 клітин; 2)* - вірогідно щодо контролю, р < 0,05.

Встановлено, що при дії вітаміну Е на "старі" клітини відбуваються істотні зміни, індукованих пальмітиновою кислотою, порушень обміну ліпідів в гепатоцитах 3-місячних щурів (рис. 9). Так, вітамін Е збільшує рівень, що знизився в даних клітинах, знов синтезованих ФХ і ФЕА і знижує - СФМ і цераміда. Проте, в даних умовах вітамін Е не викликає норрисізації обміну ДАГ в клітинах печінки. В той же час, тривале культивування гепатоцитів 24-місячних щурів у присутності вітамін Е супроводжувалось зниженням маси ДАГ (Кулікова В.С., 2005). Отримані дані свідчать про те, що для нормалізації обміну ДАГ в гепатоцитах, культивованих у присутності пальмітинової кислоти, необхідна більш тривала дія вітаміну Е на клітини.

Рис. 9. Вплив вітаміну Е на індуковані пальмітиновою кислотою зміни метаболізму гліцеро- і сфінголіпідів в гепатоцитах 3-місячних щурів. Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р < 0,05.

Отже, даними дослідженнями встановлено, що за допомогою вітаміну Е вдається нормалізувати, порушений пальмітиновою кислотою обмін цераміда і фосфоліпідів в гепатоцитах. В роботі вивчали сполучену дію гормону і вітаміна Е на обмін цераміда, СФМ і ДАГ в молодих гепатоцитах, культивованих у присутності пальмітинової кислоти (рис.10).

Рис. 10. Сполучена дія L-Т4 і вітаміну Е на обмін сфінго- і гліцероліпідів в гепатоцитах, культивованих у присутності пальмітинової кислоти (16:0). Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р < 0,05.

Встановлено, що при короткочасній дії вітаміну Е на гепатоцити, культивовані у присутності пальмітинової кислоти, не відбувається повної реконструкції відповіді клітин на дію гормону. В той же час, рівень [14C]-СФМ і [14C]-ДАГ/[14C]-церамід вище, а [14C]-цераміда і [14C]-церамід/[14C]-СФМ - нижче в гормон-стимульованих клітинах, підданих дії вітаміну Е, ніж в L-Т4-стимульованих гепатоцитах, культуральне середовище яких містило адекватні кількості кукурудзяної олії.

Отримані дані свідчать про те, що зміни базального рівня церамідів і фосфоліпідів в старих клітинах є важливою, але не єдиною, причиною порушення їх відповіді на дію гормону.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вивчені особливості термінової регуляції тироксином обміну гліцеро- і сфінголіпідів в клітинах-цілях в умовах фізіологічного старіння, виявлений механізм вікових змін гормонального сигналінга і дії аліментарних чинників на цей процес.

1. У старості в порівнянні з молодими тваринами відбувається підвищення рівня ВЖК, ДАГ і церамідів в печінці, гіпокампі і корі мозку і СФМ в корі мозку. Збільшення в печінці вмісту ДАГ і цераміда в старості відбувається за рахунок підвищення їх синтезу з ВЖК de novo і за рахунок зниження їх використання в синтезі ФХ і ГЛЦ, відповідно. В мозку 24-місячних щурів, в порівнянні з 3-місячними тваринами, відбувається зниження синтезу всіх вивчених сфінголіпідів. Збільшення в печінці 24-місячних щурів цераміда супроводжується накопиченням продукту його деградації за участю церамідаз - СФЗ.

2. L-Т4 викликає швидке і короткочасне збільшення вмісту знов синтезованого СФМ, зниження рівня цераміда і збільшення відношення ДАГ до цераміду в гепатоцитах 3-місячних тваринах. Гормон-індуковане зниження вмісту цераміда супроводжується стимуляцією його синтезу de novo. L-Т4 не робить швидкого впливу на обмін вивчених ліпідів в гепатоцитах 24-місячних щурів.

3. Введення в організм 24-місячних щурів додаткових кількостей вітаміну Е або перединкубація ізольованих гепатоцитів або шматочків печінки з вітаміном Е приводить до зниження обміну СФМ, продукції і вмісту цераміда і ДАГ, і сприяє підвищенню чутливості клітин до дії L-Т4. Сполученна дія на клітини вітаміну Е і L-Т4 приводить до швидкого підвищення рівня СФМ і ДАГ, і зниженню - ФХ, ФЕА і цераміда.

4. Культивування гепатоцитів 3-місячних щурів у присутності попередника ДАГ і сфінголіпідів - пальмітинової кислоти - приводить до збільшення їх синтезу і вмісту, зниження рівня знов синтезованих фосфоліпідів (ФХ, ФЕА) в клітинах і зміни їх відповіді на короткочасну дію L-Т4. Передінкубація гепатоцитів 3-місячних щурів з пальмітиновою кислотою приводить до пригнічення індукції під дією гормону синтезу СФМ, рівня ДАГ/церамід, нівелює дію гормону на вміст цераміда і збільшує співвідношення: церамід/СФМ. Екзогенні цераміди (N-ацетил, D-еритро-сфінгозин і N-пальмітоіл, D-еритро-сфінгозин) імітують ефект пальмітинової кислоти на синтез СФМ і ФХ в гепатоцитах 3-місячних щурів.

5. Вітамін Е, при короткочасній дії на клітини, знижує рівень знов синтезованих церамідів і СФМ, і збільшує - ФХ і ФЕА, але не нормалізує вміст ДАГ і ДАГ/церамід в передінкубованих у присутності пальмітинової кислоти гепатоцитах 3-місячних щурів.

6. Нормалізація обміну сфінголіпідів в гепатоцитах, передінкубованих з пальмітиновою кислотою, супроводжується підвищенням їх чутливості до дії L-Т4. Рівень знов синтезованого СФМ і ДАГ/церамід вище, а цераміда і церамід/СФМ - нижче в гормон-стимульованих клітинах, підданих дії вітаміну Е, ніж в L-Т4-стимульованих контрольних гепатоцитах.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Лоай Халед Мохаммад Хассунех., Семенова Я.О., Красільнікова О.А., Бабенко Н.О. Вікові особливості вмісту сигнальних ліпідів у печінці та мозку щурів // Фізіол. журн. – 2006. – Том. 52, № 6. – С. 79-84. (Дисертант провів аналіз вмісту сфінголіпідів, жирних кислот і діацилгліцерину в печінці і мозку щурів різного віку, статистичний аналіз даних).

2. Лоай Халед Мохаммад Хассунех. Влияние -токоферола на индукцию L-тироксином обмена липидов в печени старых крыс // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Серія: Біологія. – 2006. - № 729. - С. 287 – 290.

3. Бабенко Н.А., Лоай Халед Мохаммад Хассунех. Роль сфинго – и глицеролипидов в изменении ответа клеток на действие тироксина в условиях ускоренного старения // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Серія: Біологія. – 2007. - № 788. - С. 121 – 128. (Дисертант провів вивчення впливу пальмітинової кислоти і тироксина на обмін гліцеро- і сфінголіпідів в гепатоцитах щурів, і статистичний аналіз даних).

3. Лоай Халед Мохаммад Хассунех., Бабенко Н.А. Влияние витамина E на обмен фосфолипидов и диацилглицерина в различных тканях старых крыс // Валеологія: сучасний стан, напрямки та перспективи розвитку. – 2007. - Т. 1. – С. 115-119. (Дисертант провів вивчення впливу вітамін Е на обмін фосфоліпідів і діацилгліцеролу в різних тканинах старих щурів статистичний аналіз даних).

5. Бабенко Н.О., Лоай Халед Мохаммад Хассунех., Семенова Я.О. Вікові особливості обміну сфінголіпідів і шляхи їх корекції у старості