Міністерство Охорони здоров'я України

Національна медична академія післядипломної освіти

імені П.Л.Шупика

Лазаренко Олег Миколайович

УДК: 616.13+616.14]- 083.843

РОЗРОБКА ТА ДОСЛІДЖЕННЯ НОВИХ ТРОМБОРЕЗИСТЕНТНИХ ТА АНТИПРОЛІФЕРАТИВНИХ ПОКРИТТІВ СТЕНТІВ

ДЛЯ ІМПЛАНТАЦІЇ У СУДИНИ МАЛОГО ДІАМЕТРА

(експериментальне дослідження)

14.01.03 - хірургія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 2008

Дисертація є рукописом.

Робота виконана в Національній медичній академії післядипломної освіти імені П. Л. Шупика МОЗ України, Національному інституті хірургії та трансплантології імені О. О. Шалимова АМН України, Національному науковому центрі “Інститут кардіології імені М. Д. Стражеско” АМН України, Інституті металофізики імені В. Г. Курдюмова НАН України, Інституті хімії високомолекулярних сполук НАН України, Інституті фізики напівпровідників імені В. Е. Лашкарьова НАН України, Інституті електрозварювання імені Е. О. Патона НАН України, Фізичному факультеті Національного Університету імені Т. Г. Шевченко, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, University of Brighton (Англія).

Наукові консультанти:

Член-кореспондент НАН і АМН України, доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України, Бобров Володимир Олексійович, завідувач кафедрою кардіології та функціональної діагностики Національної медичної академії післядипломної освіти імені П. Л. Шупика МОЗ України.

Доктор медичних наук, професор Сморжевський Валентин Йосипович, кафедра хірургії та трансплантології Національної медичної академії післядипломної освіти імені П. Л. Шупика МОЗ України, Лауреат Державної премії України.

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор Мішалов Володимир Григорович, завідувач кафедрою госпітальної хірургії з курсом торокальної та судинної хірургії Національного медичного університету імені О. О. Богомольця МОЗ України, Лауреат Державної премії України.

Доктор медичних наук, професор Руденко Анатолій Вікторович, завідувач відділенням хірургії ішемічної хвороби серця Національного інституту серцево-судинної хірургії імені М. М. Амосова, АМН України, Лауреат Державної премії України.

Доктор медичних наук, професор Лісайчук Юрій Сергійович, кафедра хірургічних хвороб Медичного інституту Української асоціації народної медицини МОН України, Лауреат Державної премії України.

Захист дисертації відбудеться 26 травня 2008 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.08 при Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України (04112, м. Київ, вул. Дорогожицькая 9).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України (м. Київ, вул. Дорогожицькая 9).

Автореферат розісланий 26 квітня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізированої вченої ради Д 26.613.08

кандидат медичних наук, доцент Гвоздяк М. М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За даними ВООЗ у світі в 2003 році було проведено близько 3 мільйонів імплантацій стентів пацієнтам з різною патологією серцево-судинної системи. Тільки в США було встановлено близько 1,5 мільйона коронарних стентів з нержавіючої сталі марки 316 L.

Імплантація стентів у судини малого діаметра (СМД) вимагає повторних втручань у 40-60% хворих [Mintz G.S., et al. 1998, Соколов Ю. Н., та співавт. 2002]. Покриття, які наносяться фірмами виробниками стентів, для зниження реакції організму на сторонній матеріал, дуже різноманітні: Jomed – імпрегнація гепарину, BioDiamond – діамантоподібний вуглець (DLC), Sorin Biomedica – вуглецева плівка, InFlow Dynamics, Medinol – золото, Biocompatible – фосфохолін, Biotronik – карбід кремнію.

Використання покриттів у клініці не зменшило розвиток рестенозів у просвіті стенту (РуС), які спостерігаються у 15 - 35% хворих, тобто в більше як у одного мільйона пацієнтів за рік [Giri S., et al. 2001]. Найбільш ефективними покриттями для стентів, виявилися покриття з використанням цитостатиків на поверхні імплантів - драг-елютинг стенти (ДЕС). Нове покоління покриттів - це полімери з вбудовними у них цитостатичними агентами природного походження, які здатні блокувати проліферацію гладком’язевих клітин (ГМК) медії судини на стадії G0 та таким чином, знижувати розвиток рестенозу в стенті до 2 - 10% [Hehrlein C., Arab A., Bode C. 2002]. На початок 2006 року біля вже 11 компаній пропонували свої розробки покриттів ДЕС. На Об'єднаному Всесвітньому та Європейському з'їзді Кардіологів 2006 року у мета аналізах з методики лікування ішемічної хвороби серця (ІХС) за допомогою імплантації ДЕС, доповідалося про розвиток відстрочених тромбозів у просвіті імплантованих стентів. Частота смертельних випадків через вірогідний або задокументований тромбоз у стенті складала 20 - 45% [Otsuka Y., et al. 2007, Virmani R., et al. 2004, McFadden E.P., et al. 2004, Farb A., et al. 2003]. У пацієнтів були зафіксовані відстрочені тромбози просвіту коронарних стентів з фатальними наслідками [McFadden E.P., et al. 2004, Eisenberg M.J. 2004]. Причиною цього є дуже повільне вкривання ендотелієм поверхні стенту, міграція стента в просвіті артерії або деградація артеріальної стінки з утворенням аневризм у місці знаходження стенту [Nilsen D.W., et al. 2006, Ripen K. Gupta., et al. 2006]. Останні дослідження засвідчили, що у периферічному руслі судини після імплантації ДЕС відзначається прогресування розвитку атеросклеротичних бляшок, яке пояснюють персистуючим запаленням, яке викликають полімерні покриттям ДЕС [Kotani J., Tsimikas S. 2006, Sabate M. 2006]. До кінця 2006 року, за даними ВОЗ у світі було вже встановлено понад 4 мільйона ДЕС хворим з ІХС.

Зазначимо, що насьогодні внутрісудинні стенти не задовольняють вимогам адаптації до судинної стінки, а їхня поверхня має низьку тромборезистентність [Barragan P. 2006, Colombo A., et al. 2003]. Цей факт змушує лікарів призначати на тривалий строк після проведення імплантації стентів антитромбоцитарні та дезагрегуючі препарати, що може призводитиь до розвитку толерантності пацієнта до цих препаратів, а їхнє скасування або погрішність у прийомі - до розвитку тромбозу в просвіті стенту з фатальними результатами [Urban P., et al. 2007, Daemen J., et al. 2007, Schofer J., et al. 2003].

Актуальність теми випливає з вищевикладених фактів. Проблема полягає у тому, що дотепер не знайдені оптимальні покриття для стентів у судини малого діаметру, які б не викликали відповідної реакції на імплант і запалення в стінці судини. Розглядати взаємодію між тканинами організму та поверхнею стенту необхідно на рівні молекул, а саме на нанорівні, що може дозволити знайти пояснення біосумісності імплантів до певного організму. Подібні дослідження необхідно проводити в співдружності із представниками інших спеціальностей, що дозволить побачити проблему з різних ракурсів при мультидисциплінарному підході. Все це й визначило напрямок, предмет та методи, що використовувались у данній роботі для вирішення зазначеної проблеми.

Зв'язок з науковими програмами й темами.

Автор був керівником Європейських проектів з боку України у програмах:

1. “Development and assessment of novel biocompatible stents for angioplastic surgery” INTAS-Ukraine 95-0038 (1997-2000);

2. “Advanced biocompatible endovascular stents'” GR/R1584/01 UK (2001-2004);

3. “Polymer-coated stent for cardiovascular surgery” INTAS 03-56-173 (2003-2004).

Відповідальним виконавцем біологічного напрямку тематик НАН України:

1.

2.

3.

Насьогодні автор є експертом у складі Української команди, на базі Інституту електрозварювання імені Е. О. Патона НАН України, з розробки покриттів для імплантів у 6ій Європейській Рамковій Програмі “Integrating and strengthening the European Research Area” INCOMAT. “Creating international cooperation teams of excellence in the field of emerging biomaterial surface research” NMP3-CT-2007-032918 за контрактом FP6-032918 на період 2007-2009 роки.

Проведені міждисциплінарні дослідження та застосування ціх результатів на Україні, а також рівень розробок, відповідає розпорядженню Кабінету Міністрів України від 21 березня 2007 року № 102-р “Про схалення Концепції Державної програми розвитку виробництва медичної техніки на 2008-2012 роки”.

Мета дослідження й завдання дослідження.

Розробити нові покриття для стентів з підвищеними тромборезистентними та антипроліферативними властивостями поверхні, які здатні попередити розвиток рестенозов у судинах малого діаметра, обґрунтувати застосування цих імплантатів у клініці для поліпшення якості лікування хворих.

Завдання дослідження.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Об'єкт дослідження.

· Експериментальні тварини (пацюки й кролі) при імплантації їм пластин та стентів із традиційними й новими покриттями.

· Динаміка змін поверхні імплантованих стентів та пластин із традиційними й новими покриттями під час знаходження у організмі експериментальних тварин.

Предмет дослідження.

· Зміна рівня холестерину, С-реактивного білку (CRP) та факторів згортання крові у експериментальних тварин на різних етапах дослідження.

· Морфологічна реакція стінки судини й оточуючих тканин експериментальних тварин (пацюків і кролів) у місці імплантації пластин та стентів.

· Поверхня пластин і стентів до та після імплантації у організм експериментальних тварин.

Експериментальні дані отримані у результаті:

· Імплантації внутрісудинних стентів різних конструкцій із традиційними покриттями та новими неорганічними, синтетичними й аутопокриттями 142 кролям.

· Імплантації металевих пластин із традиційними та новими неорганічними, синтетичними й аутопокриттями 74 пацюкам.

· Системного аналізу показників крові експериментальних тварин на різних етапах дослідження та динаміки їх змін.

· Морфологічного аналізу 1354 гістологічних препаратів, отриманих після видалення імплантів (пластин та стентів) з організму експериментальних тварин;

· Фізико-хімічного вивчення змін стану 23 неорганічних та 8 синтетичних покриттів.

Методи дослідження.

Визначення реакції організму й тканин після контакту з імплантами:

1.

2.

3.

4.

5.

Фізико-хімічні методи:

6.

7.

8.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше на Україні розроблені неорганічні та синтетичні покриття для внутрісудинних стентів, які викликають мінімальну реакцію судинної стінки.

Вперше розроблені біологічні покриття для імплантів, а саме, стентів для судин малого діаметра, які дозволяють виключити реакцію судинної стінки на покриття.

Вперше розроблена інструментальна система із застосуванням фізичних методів вимірів, на основі нанотехнологій, з визначення сумісності певного виду покриття до певного реципієнта.

Розроблено корисні моделі з модифікування поверхні імпланту для надання їм біосумісності з організмом певного реципієнта.

Практичне значення отриманих результатів. Вперше розроблена система тестування фізичними методами на нанорівні покриттів стентів і визначення на них реакції певного реципієнта, з визначенням оптимального покриття для цього реципієнта.

Уперше розроблений спосіб модифікації поверхні стентів для певного реципієнта, що дозволяє виключити, або мінімізувати відповідь тканин судинної стінки на нього.

Знайдено й вивчені дві причини розвитку рестенозу у стенті.

Запропоновано сучасний алгоритм розвитку рестенозу в стенті в залежності від морфології атеросклеротичної бляшки.

Обґрунтовано застосування в клініці стентів з новими неорганічними, синтетичними та аутопокриттями для поліпшення якості лікування хворих та розроблено алгоритм їх застосування в клініці з огляду на стан реципієнта.

Особистий внесок здобувача. Основні дані, що викладені в дисертації, отримані автором особисто, а також у співдружності з фахівцями: архітекторами, фізиками, металофізиками, хіміками синтетиками, фармакологами й морфологами.

Здобувач уперше:

· Висунув гіпотезу однієї з головних причин виникнення рестенозу в стенті при імплантації його у судини малого діаметру, обґрунтував і довів шляхи його розвитку.

· Розробив біологічне покриття стентів для імплантації в судини малого діаметру, що дозволяє виключити реакцію судинної стінки на покриття.

· Розробив спосіб модифікації поверхні стентів з огляду на стан певного реципієнта, що дозволяє виключити, або мінімізувати відповідь тканин на імплант.

· Розробив та застосував систему інструментального тестування покриттів стенту на нанорівні з визначенням реакції певного реципієнта на них.

Здобувач самостійно розробив план досліджень, особисто провів практично усі операції, вивчив і обробив отримані результати за допомогою методів параметричної статистики та аналізу розподілу за Максвелом. Вивчив сучасні інструментальні методи фізико-хімічних досліджень, які й були застосовані при виконанні дисертаційної роботи.

Розробив у співдружності з хіміками синтетиками полімерні покриття для внутрісудинних конструкцій. Розробив разом з архітекторами сучасні принципи комп'ютерного моделювання архітектоніки стентів для судин малого діаметру. Ідеї, гіпотези й розробки співавторів публікацій у роботі не використовувалися. Матеріали кандидатської дисертації здобувача в роботі не використовувалися.

Апробація результатів дослідження. Основні положення та матеріали за темою дисертації викладені на: IV Наукової конференції асоціації серцево-судинних хірургів України (Київ, 1996); I - IX Франкомовних конгресах інтервенційних кардіологів (Франція, Париж, 1997, 1999, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007), на V Конгресі доповідь автора була визнана кращою; XII Всесвітньому конгресі Міжнародного суспільства з штучних органів (Великобританія, Лондон, 1999); I Європейському симпозіумі з судинної біології й медицині (Німеччина, Нюренберг, 1999); Міжнародних симпозіумах “Ендоваскулярна біомеханіка й рестенози” (Франція, Марсель, 2000, 2002, 2006); XI Української конференції з високомолекулярних сполук (Київ, 2000); Заключному засідані Європейської тематичної групи “Матеріали в медицині (MatMed)” (Греція, Родос, 2001); I Російському з'їзді інтервенційних кардіологів (Москва, 2002); З'їзді “Проблеми оптики й науки високотехнологічних матеріалів” (Україна, Київ, 2002); Х Міжнароднії конференції “Геометрія й графіка” (Україна, Київ, 2002); Домбровських хімічних читаннях (Україна, Черкаси, 2003); Конференції “Природні науки на границі сторіч” (Україна, Ніжин, 2004); VII Міжнародному симпозіумі “Біоматеріали й біомеханіка, фундаментальні та клінічні дослідження” (Німеччина, Ессен, 2004); V та VII Національному конгресі кардіологів України (Київ 1997, Дніпропетровськ 2004); Конгресі “Артерії 5” (Франція, Париж, 2005); Конференції з міжнародною участю “Актуальні питання абдомінальної й судинної хірургії. Клінічні проблеми трансплантації органів” (Україна, Київ, 2006).

Публікації по темі дисертації. Матеріали дисертації опубліковані в 63 наукових працях, серед яких 1 монографія, 1 учбово-методичний посібник, 24 статті (5 самостійних), у тому числі 21 у періодичних виданнях, рекомендованих ВАК, 1 збірнику наукових праць, 2 статтях у спеціалізованих журналах, 31 матеріалі міжнародних симпозіумів, з'їздів і спеціалізованих конференцій, 1 методичних рекомендаціях. Новітні розробки захищені 5 патентами України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 315 сторінках друкованного тексту, складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, 7 розділів власних досліджень, заключення й висновків. Текст ілюстрований 142 малюнками, 28 таблицями й 3 діаграмами. Список використаної літератури містить 559 джерел, 54 з яких кирилицею.

Автор висловлює глибоку й щиру вдячність усім співробітникам всіх організацій, що допомогали йому виконати цю працю й без допомоги яких провести заплановані роботи було просто б не можливо.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали й методи дослідження. В основу роботи покладеноі результати міждисциплінарних досліджень.

Розробка технології нанесення неорганічних та синтетичних покриттів на поверхню неіржавіючої сталі (SS). В якості основи для нанесення покриттів була обрана SS марки 316L. Технологічні зразки SS завтовшки 6 мм та діаметром 13 мм, перед плазменним напиленням підгодовувались шляхом піскоструйної обробки електрокорундовим піском фракції 0,3-0,6 мм, що подавався під тиском повітря Рвиб = 3-5 атм. Плазмове напилення оксидних покриттів проводилось в Інституті металофізики імені В.Г.Курдюмова НАНУ, Київ. Напилення керамічних покриттів з нітридів та оксидів Ti, Zr (Ti/TiN/Ti; TiC/Ti; ZrO/Ti) відбувалося на апараті УПУ-ЗД (СРСР) та виконувалось при наступних режимах: Icв= 250-300 A, Uд= 45-50 B, QAr = 40 л/хв, Q N2 = 6 л/хв, V = 30 об/хв, що був заповнений відповідним газам при електричному розряді 2000 вольт. Грануляція напилених порошків - 40-80 мкм. Підшар – термореагируючий порошок ПТНА-01 фракції 50-63 мкм. Вуглецева плівка у вигляді аморфного вуглецю та діамантоподібного вуглецю (DLC), наносилась по за тією ж методою - при електричному розряді у 2000 – 2500 вольт.

Товщину 22 покриттів визначали за шліфами відповідно до вимірювальної шкали металографічного мікроскопу Versamet (США). Визначення конденсатів на наявність крапельної проводили на косих шліфах (300) на металографічному мікроскопі при 400 кратному збільшенні, а їх захисні властивості - методом анодно-поляризаційного ініціювання дефектів. Метод полягає у збудженні у покриттях механічної напруги за рахунок електрострикційних сил. Завдяки ефекту електрострикції, накладання на покриття електричного поля приводить до виникнення у ньому поля механічної напруги, що супроводжується його катастрофічним руйнуванням. Для створення у покриттях електричного поля високої напруги його піддавати анодній поляризації в середовищі 10 % розчину CaCl2. Найвища якість покриття відповідала випадку коли случаю, коли у всьому інтервалі поляризації струм був рівний нулю (К =1), а при найгіршій якості покриття (К=0) струм поляризації відповідав струму поляризації підкладки без покриття. Рентгенструктурний аналіз покриттів проводили на дифрактометрі ДРОН-3М (СРСР) в монохроматизованному мідному випромінюванні, а аналіз хімічного складу межі розділу покриття/підкладка - методом електронної ОЖЕ-спектроскопії на спектрометрі JAMP-10S (США).

В Інституті хімії високомолекулярних сполук НАНУ, Київ, зразки 8 синтетичних покриттів розчиняли в діметилформаміді і наносили на диски SS марки 316L. Для видалення залишкового розчинника зразки висушували у вакуумі (1-2 гПа) протягом доби. Вказані зразки синтетичних покриттів захищені Патентами України 6С08G18/00, A61L33/00 від 15.02.2001р. та 76351, 7А61L33/00 від 17.07.2006р.

На СЕМ Dimension 3000 NanoScope III (США) у School of Pharmacology and Bimolecular Sciences, University of Brighton (Великобританія), була проведена зйомка поверхонь із збільшенням у 1.000 - 2.000 разів після нанесення відповідних неорганічних покриттів: TiO…/SS, TiC…/SS, ZrO…/SS, DLC та вісьми синтетичних покриттів.

Визначення тромборезистентності досліджуваних покриттів in vitro. Проводилось на дисках з 22 неорганічними та 8 синтетичними покриттями, які оброблялися у суміші Никіфорова. Зразки занурювалися в рідину на 5 хв. Потім висушували на чистому фільтрувальному папері і розташовували в біологічному розчини. В якості біологічних розчинів використовували модельний розчин бичачого фібриногену, з концентрацією 300 мг/л, який був люб’язно надан відділом Структури білку Інституту біохімії НАНУ імені О.А. Палладіна та суцільну кров волонтерів. Забір цілісної крові проводився у 8 волонтерів, чоловіків у віці 41-52 років, які впродовж останніх трьох років отримували терапію препаратами антагоністів Са 2+ та інгібіторів АПФ для лікування основного захворювання. Забір крові волонтерів проводили з v. basilica в пластмасову пробірку, що містіла 3,8 % розчину цитрату натрію в співвідношенні 9:1. Кров відразу перемішували, не струшуючи пробірку. При центрифугуванні (7 хвилин при 1000 об/хв.) отримували збагачену тромбоцитами плазму, плазму центрифугували (15 хвилин при 3000 об/хв.). Дослідження проводилися за допомогою коагулометра KG-4 фірми TECO (Німеччина) з відповідними наборами для визначення фібриногену FIB Kit фірми TECO (Німеччина). Зниження концентрації фібриногену вимірювали у разі модельного розчину після 4 годин експозиції з відповідним покриттям при температурі 37°С. Визначення кінетики тромбоутворення донорської крові після контакту з покриттям проводилося за методиками [Cohn E.J., Gurd F.R.N., Surgenor D.M. 1950, Soffer A., Toribara T. 1995]. Зразки покриттів витримували 2 години при 370С. Функціональний стан тромбоцитів оцінювали на агрегометрі Chrono-Log (США).

Дослідження висадження білків з розчинів на поверхню SS. Дослідження проводили на Фізичному факультеті, Національного Університету імені Т.Г.Шевченко, Київ. Досліджували зразки аустенітної SS 04Х16Н15М3Б, яка містить 16% Cr, 15% Ni, 3% Мо і менше 1 % Nb (вказані вагові відсотки) і практично ідентична, сталі 316L. Перед осадженням білків зразки сталі шліфували та полірували діамантовими пастами. Фінішне полірування здійснювали діамантовою пастою з найменшим розміром зерен 0,1 мкм. Після механічної обробки зразки промивали 60 хвилин етіловим спиртом та 120 хвилин дистильованою водою. Для досліджень використовували розчин альбуміну сироватки крові людини (ЧСА) та розчини стандартних білків, які входять у пул основних білків крові в пропорціях, в яких вони зустрічаються у організмі людини. Вимірювання виконували на спектрометрі SPEKORD (США), в якому використовується двупроменева система. Досліди з осадження альбуміну виконували при температурі 200С, рН розчину складав 7,4. У разі дослідів еx situ зразки SS, інкубували впродовж 45 хвилин та 3 годин в розчині альбуміну. Після цього зразки виймали і просушували на повітрі 60 хвилин, після чого виконували методом еліпсометрії (ЕМ), дослідження при декількох кутах падіння світла. При виконанні експериментів in situ визначали тимчасові залежності еліпсометричних параметрів при одному куті падіння і при одній довжині світлової хвилі. Для інтерпретації даних еліпсометрії еx situ визначили показник заломлення розчину альбуміну на рефрактометрі Аббе. Було отримано, що при довжині хвилі l=632.8 нм n=1.336 (0.001). Тривалість in situ досліду складала 360 хвилин.

Виготовлення стентів для імплантації у судини малого діаметру. У Інституті металофізики, з прута SS 316L, методом холодного волочіння через діамантові філь’єри з послідовним зменшенням діаметру, був отриманий дріт з пружно-динамічними властивостями, діаметром 0, 2-0,18 мм. Потім з дроту були виготовлені Z-образні стенти, здатні саморозширюватись, завдовжки 10 мм і діаметром 8 мм в розкритому стані. Кінці стентів закріплювалися в муфті, з сталі тієї ж марки. Стенти (Малюнок 1) в зібраному вигляді піддавалися електрополіровці. Потім проводилося їх очищення від механічних забруднень шляхом обробки на протязі 10 хвилин у дистильованій воді, при 44 кГц в ультразвуковій мийці “Піранія” (МЦ “Ендомед” м. Київ, Україна). Стенти пройшли випробування і наказом Міністерства охорони здоров'я України від 04.05.1999 року № 110 внесені до Державного реєстру виробів медичного призначення, які дозволені в медичній практиці в Україні під № 767/99. (Реєстраційне посвідчення Серія МЗ №767/99 №000762 вихідний №542-В від 04.05.99).

Мал. 1. Z-стент для імплантації у судини малого діаметру.

Надалі, у в Інституті металофізики імені В.Г.Курдюмова НАНУ, Інституті електрозварювання імені Е.О. Патона НАНУ та Tiers Coating LTD (Великобританія), на ці конструкції були нанесені аморфний вуглець, DLC, керамічні покриття на основі Ti і Zr.

Фізико-хімічні методи

Методи нанесення неорганічних та полімерних покриттів на імпланти. У Інституті електрозварювання проводили дослідження процесу осадження найбільш прогресивних покриттів з Zr-Ti-Ni і Zr-Co на дріт SS марки 316L за допомогою планарної магнетронної розпилювальної системи (МРС). Одним із завдань даної роботи було дослідження процесу магнетронного нанесення покриттів на поверхню тонкого дроту. Оскільки вона надалі може бути використана для виготовлення різних моделей стентів для судин малого діаметру. Для проведення таких експериментів було розроблено пристрій для установки дротяних зразків в камері МРС. В попредніх експериментах покриття Zr–Ti–Ni осідало на нерухомі відрізки дроту SS 316L діаметром 0,3 і 0,15 мм, які закріплювалися в рамці, встановленій на відстані 65 мм від поверхні мішені. Було виявлено, що обчислена товщина покриття на дроті d=0,15 мм більша д покриття d=0,3 мм на 16-20 %. Збільшення діаметру від 0,15 до 0,3 мм веде до зниження змісту Ni (з 19,7 до 17,5 ат. %) при зростанні кількості Ti (з 41,6 до 43,1 ат.%) і Zr (з 38,7 до 39,4 ат.%).

В Інституті хімії високомолекулярних сполук плівки з ізомерними фторвмісними подовжувачами полімерного ланцюга (ФПУМ) отримували і наносили, на стенти з SS 316L поливом з 20 % розчину полімерів в діметілформаміде, а для дослідження різних властивостей на тефлонові підкладки. Сушили при температурі 50°С. Залишки діметилформаміду відганяли у вакуумі до постійної маси зразків. Міцності характеристики визначалися швидкістю деформації (510-2 с-1) при температурі 18-20°С на установці РМ-30 (СРСР) у режимі розтягування, при постійному поверхневому напруженні (тг) плівок ФПУМ. Оцінку характеристик проводили за краєвими кутами змочування. В якості стандартної рідини була використана бідистільована вода. Ступінь набухання полімерних плівок визначали при 36оС протягом 24 годин у дистильованій воді, як відношення збільшення ваги плівок до її початкової ваги.

Еліпосметричні методи дослідження поверхні металів. Дослідження проводили на Фізичному факультеті, Національного Університету імені Т.Г.Шевченко Київ. Вимірювання кутових залежностей еліпсометричних параметрів здійснювалися за нульовою методикою за допомогою еліпсометра ЛЕФ-ЗМ-1 (Санкт Петербург, Росія) з робочою довжиною хвилі l=632.8 нм та в діапазоні кутів падіння світла j=65-800, оскільки головний кут j0 (D=p/2) для більшості досліджуваних металевих систем знаходиться в ціх межах. Для сформульованих завдань дослідження достатньо було вимірювань в двох зонах, які відповідають положенню компенсатора C=C0+ 450 ЕМ параметри та визначатимуться наступними співвідношеннями: = - (P1+P2-2P0) та =A1-A2/2. Для дослідження осадження білків на межі розділу “SS/розчин білку” використовували сконструйовану комірку (Малюнок 2). Комірка була виготовлена з плексигласу, вікна для пропуску лазерного променя еліпсометра були виготовлені з плавленого кварцу. Кут між нормалями до поверхні зразка і до поверхні вікна складав 700. Об'єм комірки рівний 4 мл. Цей пристрій дозволяє виконувати дослідження з осадження білків в стаціонарних умовах і за умов ламінарного потоку. Для проведення оптичних досліджень в комірці, зразок неіржавіючий стали, приклеювали на утримувач зразка клеєм на кремнієвій основі, після склеювання, утримувач загвинчували у комірку.

Мал. 2. Комірка для дослідження осадження білків.

Методи скануючої електронної мікроскопії. У новітніх технологічних напрямах, як мікромеханіка, наносенсоріка і інших нанотехнологіях значну роль грають електронопроменеві методи дослідження поверхні і зокрема СЕМ.

Мал. 3. Схема роботи СЕМ. Відбиті від зразка 1 електрони аналізуються по енергіях спектрометром 2 та реєструються кільцевим детектором 3.

Вимірювання СЕМ (10 різновидів стентів і 12 пластин) до початку експерименту і після перебування 8 тижнів в організмі експериментальної тварини, проводилися на приладі JEOL-100 (Японія) в Інституті електрозварювання імені Е.О. Патона НАНУ Київ (Малюнки 3, 4).

У лабораторії був розроблений принципово новий метод діагностики багатошарових структур – мікротомографія у відбитих електронах.

Мал. 4. Реконструкція 3D зображення елемента поверхні зразка сплаву.

Даний науково-дослідний метод базується на визначенні в растровому електронному мікроскопі відображених електронів, що мають певний вузький інтервал енергій, адекватний глибині шару під поверхнею, на якій вони відбилися. Прилад дозволяє з прийнятним для мікротомографії енергетичним дозволом (порядка 0,5%) візуалізувати підповерхневі твердотільні структури з субмікронним дозволом і проводити аналіз глибинної будови за спектрами електронів, що знімаються.

Методи атомної силової мікроскопії. Вимірювання АСМ (Малюнок 6) проводилися в Інституті фізики напівпровідників імені В.Е. Лашкарьова НАНУ, Київ, на АСМ Dimension 3000 NanoScope IIIa (США). Серії силових кривих (залежностей величини силової взаємодії від відстані зонд-поверхня) реєструвалися за кімнатних умов в атмосфері і в рідині (0,9% розчин хлориду натрію). Швидкість реєстрації кривих була постійною і складала 400 кГц. У вимірюваннях використовувався стандартний SiN3 АСМ зонд виробництва фірми NanoSensors (США) марки DNP-20 з номінальною жорсткістю консолі 0.06 Н/м (Малюнок 5 A). У другому випадку (Малюнок 5 B) поверхневе натягнення конденсованої рідини, відсутнє. Сила взаємодії визначається за виміряною АСМ величиною пружної деформації консолі зонда Д d як F= Д dk, де k – постійна пружності консолі зонду.

Мал. 5. Схема силових вимірів в атмосфері (A) та в рідині (B).

В якості матеріалів для визначення взаємодії імуноглобулінів (IgG) з антитілами (АТ) були обрані Au, стекло, слюда і Si. Для функционалізації зонда застосовували поліклональні АТ осла проти Альбуміну кроля (специфічність 1/256), які були надані відділом Молекулярної імунології Інституту біохімії. АТ наносилися з розчину концентрацією 0,1 г/мл. Альбумін сироватки кроля (САК) наносився на підкладки з 0,1 г/мл розчину в хлориді натрію (0,9%). Препарати на зонди і підкладки наносилися без попередньої обробки їх поверхонь (зонд занурювався до мікрокраплі препарату за допомогою системи підведення АСМ; краплі препаратів наносилися на підкладки, висушені після очищення сумішшю Никіфорова (Сірчаний ефір : Спирт-1:1). Проводилося по три серії вимірювань силових взаємодій в атмосферних умовах і в рідині:

1. Чистий зонд і чистий підкладковий матеріал АСМ;

2. Функционалізірованний зонд і чистий підкладковий матеріал;

3. Функционалізірованний зонд з білком на підкладковому матеріалі.

У дослідженні вивчалися 28 зразків поверхонь. Для отримання статистично достовірних результатів реєструвалося не менше як 150 кривих в кожному випадку вимірювання.

Біологічні методи.

Експериментальні методи дослідження на тваринах. Експериментальні дослідження на тваринах проводилися на базах віваріїв Національного наукового центру “Інститут кардіології імені Н.Д. Стражеско” АНМ, Київ і Національного інституту хірургії і трансплантології імені О.О. Шалімова АМН, Київ. Ліцензія Академії Наук України видана після сертифікації експериментальної бази відповідно нормам Європейського Суспільства (Інституту Кардіологи на роботу по проведенню експериментів з тваринами № ПТ 0343/01 від 28.12.2001, Реєстраційний Сертифікат віварія № 03/АА00470 від 22.01.2003, Інституту Хірургії і Трансплантології на роботу по проведенню експериментів з тваринами № ПТ 01-76-09/2175 від 02.09.2003, Реєстраційний Сертифікат на віварій № 4479/АА001754 від 26.01.2003).

Для вивчення морфологічних змін у СМД 24 білим безпородним щурам, обох статей, вагою 200-350 гр, під внутрішньочеревним намбуталовим наркозом з розрахунку 0,5-1 мл розчину на 1кг маси тварини, виконували мікровенозне протезування in situ ділянки стегневої вени, судинний шов накладався атравматичною ниткою 10-0 “ETHICON” фірми Ethicon, Inc., (Великобританія). Операції виконувалися під оптичним збільшенням операційного мікроскопа фірми “Karl Zeiss” (Німеччина), модель 310. На 14-у (8 щурів), 30-у (8 щурів) і 90-у (8 щурів) добу, після операції, проводилось вилучення матеріалу для морфологічних досліджень.

Для імплантації 118 металевих пластин SS з 23 неорганічними, 8 полімерними і 2 біологічними покриттями, було відібрано 50 білих безпородних щурів обох статей, вагою 200-350 гр. Перед імплантацією пластини з металу стерилізувалися в 1% розчині BODENPHEN-№125 (Bode Chemie, Hamburg 54, Німеччина) впродовж 15 хвилин. 12 кролям-самцям, породи “Сірий велетень”, вагою 2,5-3,5 кг були імплантовано розширювані балоном стенти, дозволені для застосування у клінічній практиці, моделей: Gianturco-Roubin, RX ML Pixel “Sengewald”, Bx Sonic “Cordis” та “BiodivVsio”. По 3 стенти кожної моделі які, були люб'язно надані для імплантації у експерименті School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, University of Brighton (Великобританія).

Для дослідження нових і традиційних покриттів для експерименту було відібрано 130 кролів-самців, породи “Сірий велетень”, вагою 2,5-3,5 кг. Тварини відсаджувалися в стандартні клітки поодинці. Температура в приміщенні складала 24 ± 1єС, з відносною вологістю 30-70 % та 12:12 годинним світловим циклом. Тварини отримували стандартне живлення для тваринних відповідно до правил МОЗ України. Тварини мали доступ до води ad libitum. Для імплантації стентів тварини були поділені на 5 груп по 12 тварин у кожній, відповідно до кількості неорганічних покриттів (аморфний вуглець, DLC, керамічні покриття на основі Ti і Zr) і контрольна група з 10 тварин з ендопротезами виготовленими з неіржавіючої сталі марки 316L. Тварини для імплантації стентів з полімерними покриттями були поділені на 3 групи по 12 тварин в кожній, відповідно до кількості полімерних покриттів нанесених на стенти.

Для імплантації стентів з ауто покриттями тварини були поділені на 2 групи по 12 тварин в кожній, відповідно до нанесення на стенти ауто покриття або покриття альбуміном бичої сироватки (БСА). Усім кролям імплантували Z-подібні стенти, що саморозширювались (дозвіл Мінохоронздоров'я України для клінічного застосування № 767/99 від 04.05.99). До імплантації стенти стерилізувалися в 1% розчині BODENPHEN-№125 (Bode Chemie, Hamburg 54, Німеччина) на протязі течія 15 хвилин. Потім стенти знаходилися в стерильному фізіологічному розчині. Всі 142 стенти імплантували тваринам в просвіт аорти через ендоваскулярний доступ в загальній стегновій артерії із застосуванням збільшення під час операції у 10 разів. При проведенні операцій використовувалися операційні бінокулярні окуляри фірми “Karl Zeiss” (Німеччина). Анестезія, яка застосовувалася експериментальним тваринам під час операцій з імплантації стентів і пластин була загальною. Тваринам перед операцією вводили седативний препарат кетамін (2 мл/кг ваги) внутрим'язево. Через 5-10 хвилин (залежно від часу початку дії премедикації) щурам вводили розчин тіопенталу натрію у концентрації 8 міліграм/кг внутрим'язево, кролям у концентрації 15 міліграм/кг внутривенно.

Для створення атерогенної моделі відповідно до розробленої методики, кролям, внутрим'язево вводили розчин пірогеналу по 1,25 мікрограм через день протягом 2-х тижнів. Потім у післяопераційному періоді, по 1,25 мікрограм один раз у тиждень впродовж 8-х тижнів. Запальна модель була вибрана для експерименту на підставі робіт [Lassila R. 1993, Талаева Т.В. 1998, Быць Ю.И., Атаман А.В. 1989]. На прикінці експерименту виконувалось вилучення матеріалу для морфологічних дослідженнь. Кролів та щурів виводили з експерименту шляхом премедикациї внутрим'язево кетаміну (2 мл/кг ваги). Потім, внутривенно струменевого кролям і внутрим'язево щурам, вводили розчин тіопенталу натрію по 50 міліграм/кг до повної зупинки дихання і серцебиття.

Морфологічні та біохімічні методи дослідження тварин. Ліцензія Академії Медичних Наук України видана після сертифікації експериментальної бази відповідно нормам Європейського Суспільства (Інституту Кардіологи на роботу з кров'ю і проведення біохімічних аналізів № ПТ 0343/01 від 28.12.2001, Інституту Хірургії і Трансплантології на проведення патоморфологічних досліджень № ПТ 0290/03 от 24.03.2003).

Зразки тканин щурів з імплантами, ділянки аорти щурів із швами та аорти кролів із стентами вилучали для морфологічних досліджень. Вилучення матеріалу проводили по наступній схемі. Із стінки аорти через усю товщу, в місці знаходження швів, стентів і з умовно інтактної зони, одноманітно у всіх випадках, були циркулярно відокремлені шматочки матеріалу. Зразки його фіксувалися протягом 24 годин у 10% розчині формаліну на 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,4), дегідратували матеріал за стандартизованою схемою у спиртах зі зростаючою міцністю та заливалися у парафін. З тканин виготовлялися зрізи товщиною 5 мкм.

Для адекватної оцінки процесів альтерації, регенерації і склерозування судинної стінки був виконаний комплекс імуногістохімічних і гістологічних досліджень за допомогою оглядового фарбування гематоксиліном і еозіном, забарвлення по Ван Гізону, для ідентифікації колагенових волокон і гладком'язових клітин, забарвлення комбінованими методами по Вейгерту–Ван Гизону, для виявлення різних структурних компонентів сполучної тканини і судинної стінки, забарвлення по Хочкиссу-Мак Манусу, що дозволяє оцінити накопичення в судинній стінці глікозогліканов при плазматичному просоченні, або деструкції сполучної тканини і забарвлення альдегід фуксином, для виявлення наявності еластичної тканини. Так само були застосовані флюорісцентне барвники для верифікації процесу запалення в місці встановлення стентів [Скопичев В.Г., Шумилова Б.В. 2004, Лилли Р. 1969, Histopathology Kits 1997].

Морфометрія всіх досліджуваних 1354 гістологічних препаратів [Автандилов Г.Г. Яблучанский Н.И., Губенко В.Г. 1981] проводилася на мікроскопі Olympus ВХ-41 (Японія) за допомогою програмного забезпечення DP-Soft (Японія). У ході дослідження тричі проводився забір крові для підтвердження наявності змін в організмі кроля. Для виконанні біохімічних досліджень кров кроля набирали з вушної вени по 2 мл в пластикові пробірки, які містили 50 мкл гепарину (5000 од/мл) і 50 мкл фізіологічного розчину. Зібрану кров швидко перемішували і центрифугували 5 хвилин при 4000 об/хв. Плазму обережно відбирали в епендорфи і зберігали при –20єС [Lizana J., Hellsing K. 1974, Chernecky C.C., Krech R.L., Berger B.J. 1993].

Визначення біохімічних параметрів крові (рівень холестерину та С-реактивного білку сироватки крові) тварин проводилось на автоматичному аналізаторі BS 2000 (BioSystem, Іспанія) відповідними наборами реактивів тієї ж фірми. С-реактивний білок визначали турбодіметрчним імуноферментним методами. Показники чинників згортання крові (плазмовий лізис, протромбіновий індекс, фібриноген, кількість тромбоцитів, зміна функціональній активності тромбоцитів) експериментальних тварин були отримані на коагулометре KG-4 фірми TECO (Німеччина) з наборами для реагентів FIB Kit фірми TECO (Німеччина). Функціональний стан тромбоцитів оцінювали на агрегометрі Chrono-Log (США).

Всі результати досліджень піддавалися обробці статистичними методами за допомогою програм Microsoft Excel 2003 і STATISTICA 6.0, а також виконанням математичного аналізу розподілу отриманих результатів за Максвелом.

РАЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Розглянемо отримані результати по розділах:

Визначення предикторів розвитку рестенозу у стенті, після імплантації його у судини малого діаметру. На 1308 гістологічних препаратах аорти кролів після імплантації стентів всіх зазначених вище моделей були відзначені виражені явища склерозу у адвентиції (А) з наявністю великої кількості коллагенових волокон. Медія (М) в місцях розташування елементів стенту була значно стоншена внаслідок атрофії ГМК, простежувалося зменшення кількості й витончення еластичних волокон, аж до їх зникнення на окремих ділянках. Гіперплазія клітинних елементів інтими (І) над елементами стенту та між ними, була виражена по різному, залежно від моделі стенту та виду покриття, нанесеного на нього. Послідовні фази реконструкції стінки аорти у кролів після імплантації стенту та вшивання