Міністерство охорони здоров’я України

Луганський державний медичний університет

Левченко Тетяна Володимирівна

УДК 616:612.017.1:579:161.71-018.46-002

Роль структурних компонентів бактерій у порушенні продукції медіаторів пухлинними клітинами НeLa, епітеліоцитами піхви, моноцитами і лімфоцитами периферійної крові in vitro

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Луганськ-2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Луганському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Казімірко Ніла Казімірівна, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувачка кафедри патофізіології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Комаревцев Віталій Миколайович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри хірургії з урологією

доктор біологічних наук, професор Яковенко Борис Володимирович, Чернігівський державний педагогічний університет імені Тараса Шевченка МОН України, професор кафедри хімії

Захист відбудеться «23» травня 2008 р. об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.02 при Луганському державному медичному університеті (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного медичного університету (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1)

Автореферат розісланий «14» квітня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, доцент Шанько В.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цитокіни приймають активну участь в розвитку імунних реакцій, апоптозі, кровотворенні, запаленні, репарації, репродукції та ембріогенезі (Kasimirko N.K. et al., 2006; Schulz R. et al., 2006). Велика роль цитокінів у розвитку онкологічних захворювань (Бережная Н.М., 1999), травматичного, геморагічного і септичного шоку (Малыш И.Р. та співавт., 2003), у виникненні інсультів, артритів, ішемії і запалення міокарда; при вірусних, бактеріальних і паразитарних інфекціях, при автоімунних захворюваннях (Ветра Я.Я. та співавт., 2000).

Основними продуцентами цитокінів є стромальні клітини сполучної тканини (фібробласти, ендотеліоцити), моноцити/макрофаги та лімфоцити (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995). Цитокіни продукують нейтрофіли, адипоцити, астроцити, остеобласти, а також клітини деяких пухлин – нирково-клітинного раку, аденокарценоми молочної залози, волосатого-клітинного лейкозу (Nishino T. et al., 2006). Спроможність продукувати цитокіни епітеліальними клітинами піхви і пухлинними клітинами HeLa дотепер вивчена недостатньо.

Синтез і продукція цитокінів клітинами здійснюється при дії на них антигенів або інших стимуляторів. Виняток складають деякі цитокіни, які спонтанно продукуються в малих кількостях. Індукторами секреції медіаторів моноцитами, макрофагами і лімфоцитами є структурні компоненти бактерій - ліпополісахариди (ЛПС), пептидоглікани (Гайдаш І.С. та співавт., 2001; Татаров С.В., 2002), тейхоєві кислоти, мітогени, а також бактеріальні екзотоксини (Флегонтова В.В. та співавт., 2005).

В науковій літературі відсутні дані про дозо- і часозалежний вплив ЛПС, пептидогліканів і тейхоєвих кислот бактерій на секрецію епітеліоцитами піхви, пухлинними клітинами HeLa, моноцитами і Т-лімфоцитами периферійної крові людини інтерлейкінів (ІЛ), фактора некрозу пухлини (ФНП), інтерферону (ІФН), трансформуючого фактора росту (ТФР).

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом планової наукової роботи кафедри патофізіології Луганського державного медичного університету (ЛДМУ) № 0198U005713 «Запалення як результат дії бактерій». Авторка є співвиконавцем комплексної теми.

Мета і задачі дослідження: Встановити in vitro механізми впливу структурних компонентів бактерій на продукцію медіаторів пухлинними клітинами HeLa, епітеліоцитами піхви, моноцитами та лімфоцитами периферійної крови здорових жінок.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

Вивчити in vitro:

1.

2.

3.

4.

5.

Об'єкт дослідження: продукція медіаторів моноцитами та лімфоцитами периферійної крови, епітеліоцитами піхви здорових жінок, клітинами HeLa.

Предмет дослідження: механізми впливу структурних компонентів бактерій на продукцію медіаторів клітинами культури HeLa та епітеліоцитами піхви, моноцитами та лімфоцитами периферійної крови здорових жінок.

Методи дослідження: експериментальні, мікробіологічні, імунологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено, що не піддані дії ЛПС, пептидогліканів та тейхоєвих кислот епітеліальні клітини піхви та пухлинні клітини HeLa in vitro спонтанно продукують невеликі кількості ІЛ-1, -2, -6, -8, -10, -12, ФНП-, ТФР та г-ІФН, з яких епітеліоцити піхви більш інтенсивно секретують ТФР, г-ІФН, ФНО-, ІЛ-1, -8, тоді як клітини HeLa продукують переважно ФНП- та ТФР. Інтактні моноцити секретують невеликі кількості ІЛ-1, -2, -6, -8, -10, -12, ФНП-, ТФР-в та -ІФН з превалюванням секреції ІЛ-1, помірною секрецією ТФР-в, ФНП- і -ІФН, та низькою секрецією ІЛ-6, -8, -10 та -12. Інтактні Т-лімфоцити продукують невеликі кількості ІЛ-2, -6, -10, ФНП-, ФНП-в та г-ІФН з переважанням продукції ІЛ-2 та ФНП-в, помірною продукцією ФНП-, г-ІФН і низькою продукцією ІЛ-6 та -10. Встановлено, що структурні компоненти бактерій in vitro стимулюють секрецію медіаторів епітеліальними клітинами піхви, клітинами HeLa, моноцитами та Т-лімфоцитами периферійної крови людини. Найбільший потенціал мають ЛПС, помірний – пептидоглікани, найменший – тейхоєві кислоти. Інтенсивність секреції медіаторів клітинами-продуцентами суттєво збільшується по мірі збільшення діючої концентрації бактерійних компонентів і тривалості їх контакту з клітинами. Найбільші рівні секреції медіаторів мають місце при використанні структурних компонентів бактерій в концентрації 100 пг/мл та 96-годинному контакті з клітинами, найменші рівні секреції медіаторів спостерігали при діючих концентраціях бактерійних компонентів 10 пг/мл та 24-годинному контакті з клітинами.

Практичне значення отриманих результатів. Результати роботи можна використовувати при трактуванні патогенезу типових патологічних процесів (запалення, лихоманки, пухлинного росту) при вивченні дії біологічних флогогенних факторів на макроорганізм; а також при розробці методів етіопатогенетичної терапії гнійно-запальних захворювань мікробної етіології. Отримані дані використовуються в навчальному процесі кафедр патофізіології і мікробіології ЛДМУ Міністерства охорони здоров’я України, що підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми наукового дослідження, постановка мети, задач і обговорення одержаних результатів, планування роботи були здійснені разом з науковим керівником. Авторкою самостійно проведені: інформаційний пошук з допомогою бази даних «Medline», аналіз літератури, виконана експериментальна частина роботи, написані всі розділи дисертації та автореферат.

Апробація роботи. Основні наукові положення дисертації були викладені та обговорені на: науковій конференції «Четверті читання ім. В.В. Підвисоцького» (Одеса, травень 2005 р.), Х міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, березень 2006 р.), 101-му з’їзді товариства анатомів Німеччини (Фрайбург, квітень 2006 р.), 23-й сесії товариства анатомів Німеччини (секція біології репродуктивної функції) (Вюрцбург, вересень 2006 р.), а також на засіданнях Луганського обласного товариства патофізіологів в 2001-2007 рр.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових статей та 5 тез в часописах та збірках, які відповідають вимогам ВАК України та надруковані згідно вимог, викладених в пункті 3 Постанови № 7-05/1 ВАК України від 15 січня 2003 р.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 163 сторінках комп'ютерного набору та складається з вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, розділу аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків, списку літературних посилань. Робота ілюстрована 40 таблицями. Список літературних посилань включає 161 джерело вітчизняних та іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність проблеми дисертаційного дослідження, сформульовано мету, завдання, об’єкт, предмет та методи дослідження. Висвітлено наукову новизну, теоретичне та практичне значення роботи. Наведені дані про особистий внесок, апробацію, впровадження результатів дослідження, структуру дисертації.

В першому розділі наведений аналітичний огляд наявних літературних даних щодо цитокінпродукуючої активності імунокомпетентних клітин, епітеліоцитів та пухлинних клітин під впливом мікроорганізмів та при різних патологічних станах.

Матеріал і методи дослідження. Епітеліоцити отримували шляхом піхвових лаважів від 15 здорових жінок-волонтерів під час профілактичних оглядів, які проводили в поліклініці № 10 м. Луганська з дотриманням положень біоетики (Страсбург, 1985 р.). Клітинні культури HeLa підтримували на середовищі RPMI 1640 з додаванням 10 % сироватки великої рогатої худоби та антибіотиків при 37єС і в присутності 5 % двоокису вуглецю в атмосфері. Моноцити з периферійної крови здорових донорів виділяли за методом H.R. Recalde (1994). Чистоту суспензії моноцитів (89-98 %) підтверджували імунофлуоресцентним методом з використанням моноклональних антитіл до рецепторів CD14. Життєздатність клітин (89-93 %) в суспензії підтверджували в тесті з трипановою синькою.

Популяції лімфоцитів периферійної крови людини отримували центрифугуванням на градієнті густини фікол-верографін. У всіх дослідах використовували епітеліоцити піхви, клітини HeLa, моноцити та лімфоцити в концентрації (5,00,25)*5 lg клітин/мл.

Пептидоглікани та тейхоєві кислоти, виділені з клітинної стінки золотавого стафілокока; а також комерційний ЛПС Escherichia coli (серотип 055:B5, Sigma, Велика Британія) використовували в робочих концентраціях 10,0; 50,0 і 100,0 пг/мл. Визначення концентрацій ІЛ-1, -2, -4, -6, -8, -10, -12, ФНП-, -в, ТФР-в, - та г-ІФН проводили в супернатантах клітин імуноферментним методом. Характер виявлених змін був проаналізований з використанням варіаційної статистики на ЕОМ.

Результати дослідження та їх аналіз. Секреторна активність інтактних епітеліоцитів піхви. Встановлено, що через 24 години культивування епітеліоцитів піхви при відсутності впливу бактеріальних компонентів у середовищі містилось (пг/мл): ІЛ-1 – 8,60,52, ІЛ-2 – 4,70,28, ІЛ-6 – 3,40,2, ІЛ-8 – 5,10,31, ІЛ-10 – 2,80,17, ІЛ-12 – 4,00,24, ФНП- – 9,30,56, ТФР – 3,10,19, г-ІФН – 2,60,15, що було прийнято в якості референтної норми.

Подальше дослідження показало, що з часом рівні досліджуваних медіаторів збільшувались. Так, через 48 годин вміст ІЛ-1 зріс відносно норми в 1,43 рази, ІЛ-2 – в 1,74 рази, ІЛ-6 – в 1,76 рази, ІЛ-8 – в 1,9 рази, ІЛ-10 – в 1,1 рази, ІЛ-12 – в 1,88 рази, ФНП- – в 2,32 рази, ТФР – в 1,87 рази, г-ІФН – в 2,18 рази (за винятком ІЛ-10, р0,05).

Через 72 години культивування вміст ІЛ-1 в середовищі склав 19,51,2 пг/мл, що було вище норми в 2,27 рази (р0,05), і в 1,58 рази вище (р0,05), ніж при культивуванні протягом 48 годин. Для ІЛ-2 перевищення концентрації на 72 годині склало 2,45 рази проти норми, а відносно рівня 48 годин – 1,4 рази (р0,05 в усіх випадках). Для ІЛ-6 ступені збільшення концентрації склали, відповідно, 2,56 і 1,45 разів, для ІЛ-8 – 2,67 і 1,4 разів, для ІЛ-10 – 1,53 і 1,39 разів, для ІЛ-12 – 2,8 і 1,49 разів (р0,05 в усіх випадках). До 72 години мало місце збільшення вмісту в середовищі ФНП-, рівень якого перевищив норму в 3,26 рази, а рівень на 48 годині – в 1,4 рази (р0,05). Подібні зміни зареєстровані також відносно ТФР, вміст якого до 72 години зріс від вихідного в 4,0 рази, і в 2,14 рази проти рівня на 48 годині. Для г-ІФН аналогічні розбіжності склали 4,08 і 1,93 разів.

На 96 годині зафіксоване збільшення вмісту ІЛ-1 відносно норми в 3,06 рази, ІЛ-2 – в 3,74 рази, ІЛ-6 – в 3,5 рази, ІЛ-8 – в 3,96 рази, ІЛ-10 – в 2,0 рази, ІЛ-12 – в 3,6 рази, ФНП- – в 4,16 рази, ТФР і г-ІФН – в 8,61 і 8,85 разів відповідно.

Таким чином, результати дослідження свідчать про те, що епітеліоцити піхви при відсутності впливу структурних компонентів бактерій спроможні спонтанно продукувати широкий спектр медіаторів, які регулюють як імунні, так і ростові процеси цих клітин. З часом вміст медіаторів у культуральному середовищі збільшується, особливо інтенсивно накопичувались ТФР, г-ІФН і ФНП-.

Секреторна активність пухлинних клітин HeLa, не підданих впливу структурних компонентів бактерій. Встановлено, що найбільш інтенсивно клітини HeLa до 24 години культивування продукували ФНП-. На другому місці знаходилась концентрація ТФР. Рівні інтерлейкінів були в 3,19-15,6 разів нижчими в порівнянні з рівнем ФНП-, і в 2,0-9,8 разів нижчими в порівнянні з рівнем ТФР.

Через 48 годин рівень ФНП- збільшився проти попереднього рівня в 2,23 рази, ТФР – в 2,11 рази (р0,05). Водночас, продукція інтерлейкінів була значно нижчою – в 3,9-18,4 рази проти продукції ФНП-. При цьому найменші рівні продукції були зареєстровані для ІЛ-2, найбільші – для ІЛ-12 і -8. Порівняно з нормою, ступінь підвищення вмісту ІЛ-1 до 48 години культивування склав 2,07 рази, ІЛ-2 – 1,89 рази, ІЛ-6 – 1,77 рази, ІЛ-8 – 1,8 рази, ІЛ-10 – 1,68 рази, ІЛ-12 – 2,0 рази, г-ІФН – 2,55 рази (р0,05 в усіх випадках порівняння).

На 72 годині відзначено подальше підвищення вмісту в середовищі досліджуваних медіаторів. Так, концентрація ФНП- досягла 151,69,06 пг/мл, перевищуючи норму в 5,1 рази (р0,01). Відносно ТФР збільшення склало 4,0 рази (р0,01). Вміст ІЛ-1 в середовищі зріс проти норми в 2,8 рази, ІЛ-2 – в 2,79 рази, ІЛ-6 – в 2,8 рази, ІЛ-8 – в 2,7 рази, ІЛ-10 - в 2,7 рази, ІЛ-12 - в 2,73 рази, г-ІФН - в 5,3 рази (р0,05 в усіх випадках).

Аналогічні тенденції змін рівнів медіаторів зареєстровані і на 96 годині. Концентрація ФНП- перевищувала аналогічний показник норми в 10,9 рази, ТФР – в 8,5 рази. Рівень ІЛ-1 перевищував вихідний в 3,46 рази, ІЛ-2 – в 4,4 рази, ІЛ-6 – в 3,85 рази, ІЛ-10 – в 3,7 рази, ІЛ-12 – в 3,7 рази, г-ІФН – в 11,0 разів (р0,05 в усіх випадках).

Таким чином, пухлинні клітини HeLa in vitro продукували ІЛ-1, -2, -6, -8, -10, -12, ФНП-, ТФР і г-ІФН. При цьому мало місце значне переважання продукції ФНП- і ТФР над інтерлейкінами та інтерфероном.

Істотний інтерес подавало порівняння секреторної активності клітин HeLa з секрецією епітеліоцитів піхви. Проведений аналіз дозволив відзначити, що рівень продукції ТФР до 24 години культивування клітин HeLa виявився в 6,0 разів вищим, ніж в епітеліоцитів піхви, вміст ФНП- також був в культурах клітин HeLa вищим в 3,2 рази. Навпаки, вміст ІЛ-1 був у 3,07 рази більшим в середовищі епітеліоцитів, ІЛ-2 – в 2,5 рази, г-ІФН – в 2,9 рази. Між рівнями ІЛ-10 розбіжність склала 1,21 рази (р0,05). Рівні ІЛ-12, -8 і -6 на 24-й годині перевищували в 2,1, 1,82 і в 2,2 разів, відповідно, аналогічні рівні продукції епітеліоцитів (р0,05 в усіх випадках).Аналогічна динаміка змін відзначена також на 48, 72 і 96 годинах культивування.

Секреторна активність інтактних моноцитів. До 24 години культивування рівень ІЛ-1 був найбільшим, складаючи, у середньому, 14,70,9 пг/мл, що виявилося більше, ніж ІЛ-6, у 6,1 рази, ніж ІЛ-8 - у 9,8 рази, ІЛ-10 і -12 - у 8,2 і в 6,1 разів відповідно. Рівні ФНП- і ТФР виявилися нижчими рівня ІЛ-1 більш ніж у 2,0 рази, -ІФН - у 3,1 рази (р(0,05 у усіх випадках порівняння).

Через 48 годин абсолютний вміст ІЛ-1 виявився в 2,2 рази вищим, ніж при 24 годинах культивування. Аналогічне збільшення було відзначено також для ІЛ-6, -8, -10 і -12 (відповідно, 2,2, 2,1, 2,27 і 2,33 разів). До 48 годин культивування продукція моноцитами ФНП- досягла за абсолютним показником 13,20,8 пг/мл, що свідчило про подвоєння продукції в порівнянні з нормою. Вдвічі збільшилася також продукція -ІФН і ТФР-в).

Вивчення вмісту медіаторів на 72 годині культивування виявило подальше збільшення їх рівнів у середовищі, проте темп збільшення був знижений приблизно в 1,5 рази в порівнянні з таким при 48 годинах. Як виявилося, зростання концентрації ІЛ-1 склало проти 48 годин 1,5 рази, ІЛ-6 - 1,57 рази, ІЛ-8 - 1,59 рази, ІЛ-10 та -12 - 1,51 і 1,43 разів відповідно (р0,05 у усіх випадках). Для ФНП- збільшення склало 1,42 рази, для ТФР-в - 1,47 рази, для -ІФН - 1,38 рази.

Порівняння рівнів медіаторів на 96 годині з такими на 72 годині дозволило відзначити, що темп приросту абсолютного вмісту кожного з медіаторів знизився, складаючи 1,3-1,4 рази. Так, на 96 годині концентрація ІЛ-1 виявилася в 4,35 рази вищою проти норми, і в 1,32 разу вищою, ніж на період 72 години (р0,05). Збільшення рівня ІЛ-6 проти норми і до 72 годин склало, відповідно, 4,75 і 1,37 разів, для ІЛ-8 - 4,87 і 1,43 разів, для ІЛ-10 і -12 - 4,72, 1,37 і 4,33, 1,30 разів (р0,05 в усіх випадках).

Рівень ФНП- до 96 годин досяг 24,71,5 пг/мл, що перевищувало аналогічний показник норми в 3,58 рази, а показник на 72 годині - у 1,32 рази. Для ТФР-в темп приросту в останньому випадку склав 1,29 рази, для -ІФН - 1,39 рази (р0,05).

Таким чином, інтактні моноцити спроможні продукувати у навколишнє середовище цілий ряд медіаторів, у тому числі ІЛ-1, -6, -8, -10 і -12, ФНП-, ТФР-в і -ІФН. З часом темп приросту зазначених медіаторів знижується. Найбільший темп приросту спостерігали між 24 і 48 годинами культивування, найменший - між 72 і 96 годинами.

При порівнянні інтенсивності продукції медіаторів моноцитами, епітеліоцитами піхви і клітинами HeLa встановлено, що, до 24 години абсолютний вміст ІЛ-1 у середовищі культивування моноцитів був в 1,71 рази й у 5,25 рази вищим, ніж у епітеліоцитів піхви і пухлинних клітин HeLa, відповідно (р0,05 в обох випадках).

Секреторна активність інтактних Т-лімфоцитів. До 24 години рівень продукції ІЛ-2 виявився в 7,25 рази вищим, ніж продукція ІЛ-6, а також у 9,7, 2,7, 4,1 і в 1,25 разів вищим, ніж продукція, відповідно, ІЛ-10, ФНП-, г-ІФН і ФНП-в.

Абсолютний вміст ІЛ-2 до 48 години виявився вищим аналогічного показника норми в 2,05 рази, ІЛ-6 - в 2,3 рази, ІЛ-10 – в 2,17 рази, ФНП- - в 2,21 рази, г-ІФН і ФНП-в – в 2,25 і 2,15 разів відповідно (р0,05). Як і раніше, абсолютні рівні ІЛ-2 і ТФР-в в середовищі були найбільшими, перевищуючи в декілька разів концентрації інших медіаторів. Високий рівень мав також ФНП-в.

До 72 години культивування темпи секреції медіаторів у середовище знизилися, складаючи для ІЛ-2 1,52 рази проти аналогічного показника при 48 годинах, для ІЛ-6 - 1,35 рази, для ІЛ-10 - 1,5 рази, для ФНП- - 1,55 рази, для г-ІФН і ФНП-в - 1,87 і 1,64 разів відповідно (р0,05 в усіх випадках). Найбільш високими концентраціями характеризувалися ІЛ-2 і ФНП-в.

До 96 години культивування зареєстровані найбільші концентрації медіаторів. Рівень ІЛ-2 виявився в 4,17 рази вищим проти норми, і у 1,34 рази вищим порівняно з показником, зареєстрованим на 72 годині. Збільшення концентрації ІЛ-6 відносно 72 години культивування склало 1,36 рази, ІЛ-10 - 1,38 рази, ФНП- - 1,33 рази, для г-ІФН і ФНП-в - 1,30 і 1,35 разів відповідно (р0,05 в усіх випадках).

Таким чином, інтактні Т-лімфоцити in vitro продукують до середовища культивування ІЛ-2, -6, -10, ФНП-, ФНП-в і г-ІФН, секреція яких із часом слабшає, але не припиняється.

Вплив структурних компонентів бактерій на епітеліоцити піхви. Встановлено, що через 24 години інкубації рівень ІЛ-1 у середовищі епітеліоцитів після контакту з пептидогліканами в концентрації 10 пг/мл виявився в 1,93 рази вищим порівняно з інтактними епітеліоцитами, через 48 годин - у 1,57 рази, до 72 і 96 годин - у 2,19 і 3,48 разів відповідно. Приріст концентрації ІЛ-1 між 48 і 72 годинами склав 1,4 рази, між 72 і 96 годинами - 1,59 рази. Рівень ІЛ-2 до 24 години перевищував показник норми в 1,55 рази (р0,05), до 48 годин він виявився в 1,95 рази вищим, ніж до 24 годин, а до 72 і 96 годин - у 2,59 і в 4,12 разів вищим проти вихідного рівня. Приріст ІЛ-2 в проміжку між 48 і 72 годинами склав 1,33 рази, між 72 і 96 годинами - 1,59 рази (р0,05 в обох випадках).

Рівень ІЛ-6 до 24 годин виявився вищим норми у 1,44 рази, до 48 годин - у 2,04 рази, до 72 години - у 2,76 рази, до 96 години - у 4,06 рази (р0,05 у усіх випадках порівняння). Приріст ІЛ-6 в проміжку між 48 і 72 годинами склав 1,35 рази, між 72 і 96 годинами - 1,97 рази. Рівень ІЛ-8 до 24 годин перевищив норму в 1,51 рази, до 48 годин - у 2,05 рази, до 72 і 96 годин - у 2,78 і в 4,4 разів відповідно. Приріст ІЛ-8 у проміжках між 48 і 72 годинами склав 1,35 рази, між 72 і 96 годинами - 1,58 рази.

Вміст ІЛ-10 до 24 годин перевищив норму в 1,43 рази, до 48 годин - у 1,88 рази (р>0,05), до 72 годин - у 1,58 рази. Між 72 і 96 годинами приріст ІЛ-10 склав 1,32 рази (р0,05). До 24 годин рівень ІЛ-12 перевищував показник норми в 1,38 рази (р0,05), до 48 годин - у 2,18 рази, до 72 і 96 годин - відповідно, 2,98 і 3,95 разів.

На вплив пептидогліканів епітеліоцити відповідали посиленням секреції ФНП- - у 1,65 рази порівняно з показником норми на 24 години досліду, у 2,21 рази - до 48 години; до 72 і 96 години - у 3,23 і 4,22 разів відповідно. Збільшення ФНП- між 48 і 72 годинами склало 1,46 рази, між 72 і 96 годинами - 1,31 рази.

Пептидоглікани в дозі 10 пг/мл викликали посилення секреції епітеліоцитами ТФР, рівень якого до 24 годин збільшився проти інтактних клітин у 1,66 рази, до 48 годин - у 1,87 рази, до 72 годин - у 4,36 рази, до 96 годин - у 10,89 рази (р0,05). До 24 годин культивування концентрація г-ІФН перевищувала аналогічний показник норми в 1,65 рази, до 48 годин - у 2,0 рази, до 72 годин - у 4,33 рази, до 96 годин - у 9,95 рази (р0,05 у усіх випадках). Рівні продукції всіх медіаторів епітеліоцитами, стимульованими пептидогліканами, істотно перевищували такі для інтактних епітеліоцитів відповідних часових періодів. Найбільш інтенсивно секретувались ФНП-, ІЛ-1, ТФР і г-ІФН.

Збільшення концентрації пептидогліканів до 50 пг/мл супроводжувалося наступним посиленням секреції медіаторів епітеліоцитами піхви, при цьому рівні медіаторів значно перевищували такі, зареєстровані в дослідах із використанням пептидогліканів у концентраціях 10 пг/мл. Подвоєння діючої концентрації пептидогліканів (100 пг/мл) викликало ще більш інтенсивне виділення в навколишнє середовище медіаторів епітеліоцитами піхви.

Поряд з пептидогліканами, для стимуляції епітеліоцитів піхви використовували різні концентрації тейхоєвих кислот. У цілому, отримані результати дослідження свідчать про те, що тейхоєві кислоти є менш активними стимуляторами секреції медіаторів епітеліоцитами, ніж пептидоглікани аналогічних концентрацій. У іншому динаміка змін була подібною з такою для пептидогліканів: секреція медіаторів клітинами-мішенями збільшувалася в міру підвищення діючої концентрації тейхоєвих кислот, а також тривалості їх контакту з клітинами-мішенями. Найбільшою спроможністю стимулювати секрецію володіли тейхоєві кислоти в концентрації 100 пг/мл.

Істотний інтерес подавало також дослідження секреторної активності епітеліоцитів піхви під впливом ЛПС бактерій. Встановлено, що ЛПС значно активували секреторну активність епітеліоцитів, що виражалося в істотному збільшенні секреції ряду медіаторів. Стимулюючий ефект ЛПС виявився найбільш потужним порівняно з пептидогліканами і тейхоєвими кислотами. Як і у випадку з ними, ступінь виразності секреції медіаторів залежав від діючої концентрації ЛПС і тривалості контакту з ними епітеліоцитів піхви. Найбільші рівні продукції медіаторів зареєстровані при використанні ЛПС у концентрації 100 пг/мл і тривалості інкубації з епітеліоцитами 96 годин. Найменша секреторна активність клітин-мішеней зареєстрована при використанні ЛПС у концентрації 10 пг/мл і тривалості інкубації їх з епітеліоцитами 24 години.

Вплив структурних компонентів бактерій на клітини HeLa. Встановлено, що найменшим стимулюючим потенціалом відносно клітин HeLa володіли тейхоєві кислоти, серед яких концентрація 10 пг/мл викликала найменшу стимуляцію секреції. Збільшення концентрації тейхоєвих кислот до 50 пг/мл супроводжувалося посиленням секреторної функції клітин HeLa: так, рівень ІЛ-1 перевищив відповідний показник норми в 2,29 рази, і був у 3,96 рази нижчим аналогічного показника при стимуляції піхвових епітеліоцитів (р0,05 в обох випадках). У той же час, зазначений рівень секреції ІЛ-1 був у 1,52 рази вищим, ніж аналогічний показник при стимуляції клітин HeLa тейхоєвими кислотами малої концентрації (р0,05). Рівень ІЛ-1 до 48 годин досліду з 50 пг/мл тейхоєвих кислот виявився вищим норми в 2,19 рази; у 1,53 рази вищим, ніж у досліді з тейхоєвими кислотами в дозі 10 пг/мл; і в 3,43 рази нижчим проти секреції ІЛ-1 піхвовими епітеліоцитами за аналогічних умов. Зазначені тенденції мали також місце при 72 і 96 годинах експерименту.

Навпаки, прозапальні ІЛ-6 і -8 переважали над секрецією ІЛ-1 і -2. Подібна динаміка змін зареєстрована для ІЛ-10 і -12, проте абсолютні значення концентрацій зазначених медіаторів були значно нижчими таких для ІЛ-6 і -8. У цілому, зміни секреції ІЛ-10 і -12 клітинами HeLa під впливом середніх доз тейхоєвих кислот нагадували такі для ІЛ-1.

Як і у випадку з тейхоєвими кислотами малої концентрації, на використання їх середніх доз клітини HeLa реагували істотним посиленням секреції ФНП- і ТФР. У порівнянні з раніше перерахованими медіаторами, тейхоєві кислоти стимулювали секрецію г-ІФН менш активно.

При впливі на клітини HeLa тейхоєвими кислотами в концентрації 100 пг/мл рівень ІЛ-1 до 24 години перевищував відповідну норму в 4,96 рази (р0,05), був у 2,17 разу вищим, ніж при використанні тейхоєвих кислот середньої концентрації, і в 2,7 рази нижчим в порівнянні із секрецією епітеліоцитів піхви при контакті з високими дозами тейхоєвих кислот. Відзначені тенденції зберігалися у всіх часових точках експерименту.

Секреція ІЛ-6 і -8 перевищувала таку для ІЛ-1, як це було відзначено раніше в дослідах із середньою і малою концентрацією тейхоєвих кислот. Високі концентрації тейхоєвих кислот найбільш інтенсивно стимулювали секрецію ТФР клітинами HeLa.

Таким чином, клітини HeLa (які мають епітеліальне походження) були чутливі до дії тейхоєвих кислот бактерій (особливо у високих концентраціях), що виражалося в посиленні секреції ними інтерлейкінів, г-ІФН і ТФР. Особливостями секреції медіаторів клітинами HeLa слід вважати високу продукцію ТФР, низьку продукцію ІЛ-1, -2 і г-ІФН, переважання секреції ІЛ-6 і -8 над секрецією ІЛ-1 і -2. У порівняльному аспекті секреторна активність клітин HeLa була істотно вищою секреції піхвових епітеліоцитів при всіх інших рівних умовах проведеного досліду.

Крім тейхоєвих кислот, клітини HeLa були чутливі також до дії пептидогліканів бактерій. Клітини HeLa на стимуляцію пептидогліканами відповідали характерною реакцією, яка полягала в переважанні секреції ІЛ-6, і -8 над ІЛ-1 і -2; більш низькій секреції ІЛ-1 і -2 і більш високою концентрацією ІЛ-6, -8, -10 і -12 проти епітеліальних клітин піхви. У цілому ж стимулюючий потенціал пептидогліканів був істотно вищим такого для тейхоєвих кислот в аналогічній концентрації.

Істотний інтерес подавало вивчення чутливості клітин HeLa до дії ЛПС. Встановлено, що ЛПС мали найбільший потенціал порівняно з такими пептидогліканів і тейхоєвих кислот, і посилювали продукцію клітинами HeLa ІЛ-1, -2, -6, -8, -10, -12, г-ІФН і ТФР. Найбільші рівні медіаторів мали місце на 96 годині досліду. Найбільш активно клітини HeLa продукували ІЛ-6 і -8, найменш активно - ІЛ-1. Продукція г-ІФН характеризувалася найменшою інтенсивністю серед усіх медіаторів, а продукція ТФР - найбільшою інтенсивністю.

Вплив структурних компонентів бактерій на моноцити. Вплив тейхоєвих кислот на секреторну активність моноцитів залежав від дози і тривалості дії. Мінімальна концентрація тейхоєвих кислот (10 пг/мл) викликала збільшення секреції моноцитами до 24 години ІЛ-1 проти норми в 9,8 рази, ІЛ-6 - у 40,1 рази, ІЛ-8 - у 38,3 рази, ІЛ-10 - у 8,2 рази, ІЛ-12 - у 30,9 рази, ФНП- - у 8,6 рази, ТФР-в - у 3,8 раз, -ІФН - у 2,9 рази.

В міру збільшення часу контакту моноцитів з тейхоєвими кислотами концентрації медіаторів мали спрямованість до збільшення. На 96 годині підвищення рівнів медіаторів відносно вихідного рівня склало для ІЛ-1 8,4 рази, для ІЛ-6 - 9,08 рази, для ІЛ-8 - 5,7 рази, для ІЛ-10 - 10,4 рази, для ІЛ-12 - 9,3 рази, для ФНП- - 10,2 рази, для ТФР-в і -ІФН - 10,2 і 11,2 разів відповідно.

Контакт моноцитів із тейхоєвими кислотами в концентрації 50 пг/мл супроводжувався більш інтенсивною секрецією медіаторів у порівнянні з такою при використанні 10 пг/мл тейхоєвих кислот.

Вплив на моноцити тейхоєвими кислотами в концентрації 100 пг/мл супроводжувався більш високою секрецією медіаторів у порівнянні з такою при контакті моноцитів із тейхоєвими кислотами в концентрації 50 пг/мл. Більш активно моноцити під впливом тейхоєвих кислот секретували ІЛ-1, найменш активно - ІЛ-10 і -ІФН.

Секреція медіаторів моноцитами істотно змінювалася також при контакті з пептидогліканами бактерій. Стимулюючий потенціал 10 пг/мл пептидогліканів істотно перевищував такий при використанні 10 пг/мл тейхоєвих кислот відносно ІЛ-8, -10, -12, а також ФНП-, ТФР-в і -ІФН. Збільшення дози пептидогліканів до 50 пг/мл супроводжувалося збільшенням продукції медіаторів моноцитами. Використання в якості стимулу пептидогліканів у концентрації 100 пг/мл супроводжувалося більш інтенсивною секрецією моноцитами медіаторів, ніж при застосуванні пептидогліканів у дозі 50 пг/мл.

Порівняно з тейхоєвими кислотами і пептидогліканами, стимулюючий потенціал ЛПС був найбільшим. Крім того, продукція моноцитами медіаторів прогресивно збільшувалась в міру подовження часу контакту ЛПС з моноцитами.

Вплив на лімфоцити. Встановлено, що контакт Т-клітин з тейхоєвими кислотами в концентрації 10 пг/мл сприяв посиленню секреції даними клітинами ІЛ-2, рівень якого до 24 години експерименту виявився в 1,8 рази вищим показника норми, до 48 години - у 2,13 рази, до 72 і 96 годин - у 2,98 і 3,87 разів (р0,05).

Збільшення концентрації тейхоєвих кислот до 50 пг/мл супроводжувалося посиленням продукції Т-лімфоцитами медіаторів. Так, до 24 години вміст ІЛ-2 виявився в 3,2 рази вищим в порівнянні з рівнем ІЛ-2, отриманим до 24 годин при контакті Т-лімфоцитів з тейхоєвими кислотами в дозі 10 пг/мл (р0,05). До 48 години ступінь збільшення ІЛ-2 проти його вихідного рівня склав 2,0 рази, до 72 і 96 годин - 3,18 і 4,13 разів.

Використання тейхоєвих кислот у концентрації 100 пг/мл викликало посилення секреції ІЛ-2 у 8,64 рази в порівнянні з використанням тейхоєвих кислот у дозі 10 пг/мл, і в 2,7 рази - порівняно з використанням тейхоєвих кислот у дозі 50 пг/мл. Рівень ІЛ-2 на 48 годині в 2,02 рази перевищував вихідний його рівень, на 72 і 96 годинах - у 3,03 і 4,07 разів (р0,05 в усіх випадках). Подібну динаміку змін секреції відзначали і для ІЛ-6.

Інкубація Т-лімфоцитів із тейхоєвими кислотами в дозі 10 пг/мл супроводжувалася викидом ФНП- із рівнем, який до 24 години перевищував нормативний показник у 2,09 рази (р0,05). До 48 години культивування продукція ФНП- Т-лімфоцитами проти вихідного рівня зросла в 2,17 рази, до 72 і 96 години - у 3,16 і 4,31 разів відповідно. Збільшення концентрації тейхоєвих кислот до 100 пг/мл супроводжувалося посиленням секреції ФНП- Т-клітинами: до 24 години рівень даного медіатора виявився вищим норми в 20,1 рази і вірогідно перевищував показники секреції ФНП- у дослідах з нижчими концентраціями тейхоєвих кислот. Продукція ФНП-в Т-лімфоцитами під впливом тейхоєвих кислот була більш інтенсивною, ніж секреція ФНП-.

Більш виразно, порівняно з тейхоєвими кислотами, на секрецію Т-лімфоцитів впливали пептидоглікани. Найбільш активно секрецію медіаторів викликали ЛПС бактерій.

ВИСНОВКИ

У дисертації викладене теоретичне обгрунтування ролі структурних компонентів бактерій (ЛПС, тейхоєвих кислот і пептидогліканів) в дозозалежній, часовій і специфічній стимуляції продукції медіаторів пухлинними клітинами HeLa, епітеліоцитами піхви, моноцитами і лімфоцитами крові здорових жінок in vitro.

1.

2.

3.

4.

5.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ

ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.