ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

МОХАМАД ХАНІ РУМІЄХ

УДК: 57.043:612.111:352.462

ВИВЧЕННЯ ВЗАЄМОЗВ'ЯЗКУ МІЖ ПРОЦЕСАМИ ІОННОГО ТРАНСПОРТУ І ЗМІНОЮ ФОРМИ ЕРИТРОЦИТІВ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків–2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України і в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Бондаренко Валерій Антонович,

Харківський національний університет імені

В.Н. Каразіна (м. Харків),

завідувач кафедри фізіології людини та тварин.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Клімова Олена Михайлівна,

Державна установа “Інститут загальної та невідкладної хірургії АМН України” (м. Харків), завідувач діагностичної лабораторії

доктор біологічних наук, професор

Субота Ніна Павлівна,

Харківський національний педагогічний університет імені Г.С. Сковороди (м. Харків), завідувач кафедри валеології.

Захист дисертації відбудеться "______"_____________2008 р. о _____ годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. 3–15).

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4).

Автореферат розісланий "_____"____________2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради В.М. Дзюба

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Відомо, що еритроцити, циркулюючі в руслі крові, мають форму двоввігнутих дисків, яка є оптимальною з погляду виконання еритроцитами своєї головної функції – транспорту і постачання тканин організму киснем. Така форма еритроцитів визначається і підтримується балансом взаємодії глікокалікса, мембрани і цитоскелету (Sheetz & Alhanaty, 1983), і порушення в узгодженій взаємодії цих систем можуть відбитися як на стаціонарній формі еритроцитів, так і на їх здатності протистояти стресовим діям і зміні гемодинаміки в мікроциркуляторному руслі.

Незважаючи на те, що механізмам регуляції форми еритроцитів присвячена велика кількість робіт, це питання розкрите недостатньо. Існує велике число моделей, що пояснюють трансформацію еритроцитів, частка з яких приділяє основну увагу ліпідному бішару. Проте, той факт, що інгібітори аніонного транспорту змінюють конформацію білка смуги 3 і приводять до ехіноцитозу еритроцитів, свідчить на користь того, що зміна форми клітин і транспортні процеси можуть бути зв'язані між собою.

Згідно (Wong, 1999), форма еритроцитів контролюється двома конформаційними станами іонного обмінника – білка смуги 3, стан якого модулює ступінь скорочення і релаксації мембранного скелета. Структурною компонентою механізму зміни форми є мембранний цитоскелет, що формує різні морфологічні типи клітин, тоді як функціональними є спрямовані в клітину і з клітини потоки аніонів, регульовані білком смуги 3 (Wong, 1999). Залежно від напрямів потоку аніонів формується відповідна конформація аніонного переносника (inward-facing and outward-facing conformation), а також скорочується і розслабляється скелет при згортанні і розгортанні спектрину.

Зміни форми еритроцитів можуть бути викликані різними хімічними агентами. Доведено, що ехіноцитоз і стоматоцитоз, що індукується амфіфільними речовинами і детергентами, обумовлений інгібуванням транспорту аніонів через білок смуги 3 (Blank et al., 1994). Раніше запропонована модель конформаційно-контрольованої білком смуги 3 (БЗ) бішарової пари (conformation-controlled bilayer couple CCBC model) (Gimsa & Ried, 1995), яка передбачає, що індукція певної конформації БЗ, відповідно, впливає на відношення площин моношарів мембрани і на форму клітин. Для порівняльного аналізу взаємозв'язку між процесами іонного транспорту і зміною форми еритроцитів є доцільним проведення досліджень, для яких можуть бути залучені еритроцити різних видів тварин.

У зв'язку з викладеним, важливого значення набуває питання, що стосується регуляції форми еритроцитів в умовах зміни іонної сили середовища, коли в мембрані активуються транспортні механізми, які є неактивними в нормальних фізіологічних умовах (Kaestner et al., 2000). Якщо вважати, що між трансформацією і транспортними процесами існує взаємозв'язок, то слід чекати найбільш яскравого його прояву саме в цих умовах. Відповідно, вивчення процесів трансформації еритроцитів, в умовах активації транспортних механізмів, є актуальним і представляє теоретичний і практичний інтерес.

Перспектива досліджень в даному напрямі пов'язана також з можливістю направленої регуляції форми клітин в умовах норми і патології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до наукового напряму робіт, що виконуються в рамках наукової тематики кафедри фізіології людини і тварин Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна, а також відділу фізіології клітини Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Тема НДР кафедри фізіології людини і тварин ХНУ: “Закономірності фізіолого-біохімічної та структурно-функціональної адаптації біологічних систем до факторів середовища в онтогенезі” (№ держреєстрації 0103U005743).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – порівняльне дослідження динаміки морфотрансформації еритроцитів різних видів організмів (людина, щур, півень) при дії на клітини інгібіторів транспорту аніонів і модифікаторів мембрани, в умовах активації транспорту аніонів в мембрані, опосередкованого білком смуги 3 в неелектролітному середовищі.

Завдання:

1. Провести порівняльні дослідження впливу інгібіторів аніонного транспорту (DIDS, SITS, DNDS) на динаміку трансформації еритроцитів людини, щура і півня в неелектролітному середовищі (сахароза).

2. Дослідити вплив модифікаторів форми (SDS, СТАВ, CPR, альбумін) на динаміку трансформації еритроцитів людини, щура і півня в неелектролітному середовищі.

3. Вивчити динаміку зміни форми еритроцитів залежно від складу і іонної сили середовища.

4. Вивчити динаміку транспорту протонів, зв'язану з транспортом хлориду, в еритроцитах людини в неелектролітному середовищі і впливу на неї інгібіторів аніонного транспорту і модифікаторів форми.

5. Охарактеризувати морфологію еритроцитів людини, щура і півня в неелектролітному середовищі і в умовах дії на них інгібіторів аніонного транспорту і модифікаторів форми.

6. Вивчити транспорт флюоресцеїну і характер його розподілу між еритроцитами людини і середовищем, що містить різне співвідношення електроліту і неелектроліту, а також вплив флюоресцеїну на форму клітин.

Об'єкт дослідження – трансформація еритроцитів, транспорт протонів в еритроцитах, транспорт флюоресцеїну в еритроцитах.

Предмет дослідження – чутливість еритроцитів різних видів до трансформації, викликаної зміною електролітного складу середовища і впливом інгібіторів транспортних процесів і модифікаторів форми клітин.

Методи дослідження:

- спектрофотометричний метод реєстрації змін форми, об'єму і гемолізу еритроцитів за допомогою формометра-агрегометра ФА-01;

- рН-метричний метод визначення характеристик транспорту протонів і іонів хлору в неелектролітному середовищі;

- оптична мікроскопія;

- модифікація мембрани і цитоскелету еритроцитів за допомогою інгібіторів аніонного транспорту і хімічних реагентів, що змінюють форму клітин.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримані нові дані про взаємозв'язок між умовами середовища, трансформацією і транспортними процесами в еритроцитах людини, щура і півня.

Вперше показано, що введення еритроцитів в ізотонічне середовище сахарози з низьким вмістом іонів хлору приводить до трифазної послідовності змін форми клітин (морфологічній відповіді, МВ), що складається з швидкої сферуляції (фаза 1), відновлення форми, близької до дискоїдної (фаза 2) і повторної сферуляції (фаза 3). Встановлено, що фази МВ залежать від іонної сили середовища, вмісту іонів хлориду в середовищі і що трифазна МВ зникає при збільшенні вмісту хлоридів понад 15–20 мМ.

Встановлено, що присутність в середовищі додаткових речовин, здатних інгібувати аніонний транспорт, або модифікувати форму еритроцитів у бік ехіноцитів (DIDS, SITS, DNDS, СТАВ, SDS) або стоматоцитів (CPR, альбумін), концентраційно-залежним чином впливає на характер МВ. При збільшенні концентрації всіх модифікаторів, окрім SDS, спостерігається стабілізація фази 1 або інгібування фази 2 МВ. У випадку SDS спостерігається особливість, яка полягає в тому, що у присутності цього агента всі фази МВ зберігались і ставали більш вираженими в порівнянні з контролем. Ефект модифікатів на МВ залежить від їх типу, концентрації і моменту початку дії щодо трифазної послідовності трансформації, що розвивається, і, практично, у всіх випадках характер розвитку процесу значно розрізняється, коли агенти діють на його початковій стадії в порівнянні з їх дією через 150 с.

Показано, що для еритроцитів щура МВ як в присутності, так і у відсутності модифікатів, відбувається в межах інвагінованих, стоматоцитарних форм, що розрізняються за ступенем сферичності, тоді як для еритроцитів людини у випадку SDS і альбуміну спостерігається формування ехіноцитів. Еритроцити півня в сахарозному середовищі трансформувались в стоматоцити, а у присутності модифікаторів практично зберігали свою дискоїдну еліптичну форму і високе значення індексу форми. Разом із вказаними відмінностями у МВ еритроцитів людини і щура ці дані в сукупності указують на видоспецифічність морфологічної реакції цих клітин у сахарозному середовищі.

При вивченні транспорту флюоресцеїну в еритроцити і з еритроцитів людини було показано, що він транспортується в клітини шляхом простої дифузії через ліпідний бішар мембрани і розподіляється, практично, відповідно до трансмембранного потенціалу. Останнє дозволяє використовувати флюоресцеїн як маркер для оцінки значення величини трансмембранного потенціалу еритроцитів при зміні іонного складу середовища.

Отримані дані указують на складні взаємовідношення між морфологічними змінами еритроцитів в сахарозному середовищі та іонним транспортом. Оскільки всі досліджені інгібітори аніонного транспорту і модифікатори форми справляють власний вплив на морфологію клітин, результуючий ефект обумовлений суперпозицією їх мембрано-активного ефекту і впливу на аніонний транспорт.

Практичне значення одержаних результатів. Результати, отримані в роботі, можуть бути використані при розробці нових підходів регуляції форми еритроцитів, експериментальній перевірці гіпотез, що лежать в основі сучасних уявлень про механізми морфогенезу, а також для розробки методів тестування мембраноактивних сполук. Результати роботи можуть бути рекомендовані для наукового використання в навчальному процесі в різних областях біології.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Головна ідея роботи запропонована науковим керівником, а її практичне виконання належить дисертантові. Автором дисертаційної роботи самостійно проведені пошук і аналіз наукової літератури, статистична обробка результатів, аналіз і узагальнення отриманих даних, сформульовані основні положення і висновки, проведена апробація результатів досліджень і підготовка до публікації наукових робіт. Спільні публікації відображають результати спільного планування, проведення експериментів і обговорення результатів.

Апробація результатів. Результати проведених досліджень, які включені в дисертацію, були представлені на 2-гому З’їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007) і на Науково-практичній конференції “Нові технології в експериментальній біології і медицині” (Ростов-на-Дону, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи в спеціалізованих наукових журналах опубліковано 9 робіт, з яких 6 – статті у фахових виданнях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 33 малюнками, 2 таблицями. Вона складається із вступу, огляду літератури, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел із 196 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. У експериментах були використані свіжі чоловічі еритроцити людини групи крові А (ІІ)+, щура і півня, які двічі відмивали в незабуференому фізіологічному розчині шляхом центрифугування (3000 об/хв., 2 хв.), на центрифузі ОПН-3. Осад розводили в 10 разів в ізотонічному розчині НBS (150 мМ NaCl, 5 мМ HEPES, рН 7,4) і використовували як сток-суспензію. Кров у птиць (півень) забирали з підкрильцевої вени шприцем. Кров забирали в стерильну пробірку на глюгіцировому консерванті в об'ємному співвідношенні 9:1. Місце забору заздалегідь дезінфікували 70% етанолом. Кров щурів забирали в пробірки, заздалегідь оброблені гепарином (5000 Е). Зразки зберігали в холодильнику і використовували в день забору.

Для вивчення динаміки змін форми еритроцитів у часі після різних дій використовували розроблений і виготовлений в ІПКіК НАН України двоканальний формометр-агрегометр ФА-01, який, разом з виміром оптичної щільності (ОЩ) або світло пропускання, вимірює флуктуації інтенсивності світлового потоку, які несуть інформацію про форму клітин (Руденко та ін., 1998; Руденко, 2006). У ФА-01 застосований спеціальний пристрій, що складається з фільтру низьких частот, який виділяє високочастотну складову інтенсивності світлового потоку, масштабного підсилювача і подальшого програмного блоку обробки, який обчислює середньоквадратичне значення амплітуди флуктуації світлового потоку. Індекс форми (ІФ) розраховувався по протоколу, описаному раніше для визначення форми еритроцитів (Руденко та ін., 1998; Руденко, 2006) і обчислювався за формулою ІФ=k•D, де k – постійний коефіцієнт, залежний від коефіцієнта посилення сигналу і від калібрування приладу, а D – середньоквадратичне значення амплітуди флуктуації світлового потоку, яке обчислювали на інтервалі усереднювання, рівному 1 с. Калібрувальний коефіцієнт k дозволяє сформувати шкалу вимірів ІФ, який відображає ступінь дискоїдності еритроцитів.

У циліндрову скляну або пластикову кювету діаметром 10 мм, що містить 2 мл HBS, додавали 10–12 мкл сток-суспензії еритроцитів так, щоб початкове значення ОЩ було в межах 0,30±0,02, що відповідає концентрації еритроцитів порядку 6•106 в 1 мл. Суспензія клітин перемішувалась магнітною мішалкою із швидкістю 600 об/хв. Для зміни форми еритроцитів в кювету додавали від 5 до 100 мкл концентрованих розчинів досліджуваних речовин до заданої кінцевої концентрації і реєстрували зміни ОЩ або ІФ в часі.

Динаміка морфологічних змін вивчалась при введенні клітин у незабуферене середовище, що містить 300 мМ сахарози (Merck), pH 5,8–6,2. Зміну електролітного і якісного складу цього розчину здійснювали шляхом заміщення його частки (від 20 до 200 мкл) ізотонічним розчином відповідної солі або концентрованого розчину відповідного реагенту (інгібітору). В окремих експериментах модифікатори (від 5 до 40 мкл) додавали безпосередньо в кювету з концентрованих розчинів до отримання заданої кінцевої концентрації через 150 с після введення туди клітин.

Стаціонарна морфологія клітин в кюветі контролювалась оптичною мікроскопією. Для цього 2–3 мкл клітинної суспензії з вимірювальної кювети наносили на предметні скельця з лунками (Санкт-Петербург, Росія) і накривали покривним склом. Зразки аналізували і фотографували у тонкому рідкому шарі без застосування фіксуючих агентів, щоб врахувати ефект скла (Eriksson, 1990) в світлому полі на мікроскопі Біолам-М.

Для дослідження транспорту Н+ в сахарозному середовищі методом рН-метрії еритроцити людини двічі відмивали безбуферним розчином 0,15 М NACl за стандартною методикою і 50 мкл еритромаси вносили до 2 мл розчину сахарози (0,3 М) (кінцевий гематокрит 2%), що містить та не містить необхідну концентрацію інгібіторів аніонного транспорту або інших реагентів, і далі реєстрували зміну рН розчину в часі. Виміри проводили при кімнатній температурі 20–22єС. Внутрішньоклітинний рН в еритроцитах визначали за значенням рН в 2 мл розчину води після перенесення туди 50 мкл еритромаси і повного гемолізу клітин.

На рисунках представлені типові дані, від 3 до 5 незалежних експериментів, проведених з кров'ю різних донорів при температурі 20–22°С.

Для дослідження транспорту флюоресцеїну в еритроцитах в експериментах використовували консервовані еритроцити донорської крові людини 2 групи. Перед експериментом еритроцити відмивали 4 рази середовищем, що містить в мМ: К Cl – 90, NaCl – 45, сахароза – 44, глюкоза – 5. Для обчислення констант швидкості транспорту ФЛ в еритроцити будували графік в координатах ln((F100%–Ft)/F100%) від часу, де F100% – інтенсивність флюоресценції після повного розподілу субстрату між клітинами і середовищем, Ft - інтенсивність флюоресценції в певний момент часу. Графік лінеазували методом найменших квадратів і константу швидкості визначали по тангенсу кута нахилу залежності. Для визначення вихідного транспорту ФЛ з еритроцитів, клітини (гематокрит 2%) заздалегідь навантажували ФЛ шляхом інкубації їх в розчині ФЛ відповідної концентрації протягом 1 години при 25єС, відмивали в холодному середовищі, потім переносили в чисте середовище та інкубували 0, 5, 10, 20, 45 хвилин. Далі після центрифугування в надосадах визначали концентрацію ФЛ, як указувалося вище, і розраховували постійну транспорту.

Для дослідження перерозподілу флюоресцеїну між еритроцитами і середовищем з різним змістом сахарози і NaCl внутрішньоклітинну концентрацію ФЛ обчислювали за формулою:

Флin=

де: Флin – концентрація внутрішньоклітинного ФЛ. Фл0 – початкова концентрація ФЛ (5 мМ). Флout – концентрація ФЛ у надосаді. h – гематокрит. 0,71 – об'ємна фракція води в еритроциті.

Обчислювали мембранний потенціал по розподілу молекул ФЛ, припускаючи, що він може бути аналогічним розподілу аніонів хлору, яке є зворотним розподілу протонів (Gedde & Huestis 1997). В цьому випадку вираз для визначення мембранного потенціалу має наступний вигляд:

E=2,303 RT/F lg(Флin/Флout)

Статистична обробка результатів проводилась за методом Стьюдента-Фішера.

Вплив інгібіторів аніонного транспорту на зміни електролітного складу середовища. Інгібітори аніонного транспорту, до яких належать стильбенові похідні, такі як DIDS, SITS, DNDS та інші, викликають ехіноцитоз еритроцитів у фізіологічних умовах (Hoefher et al., 1994; Blank et al., 1994; Betz et al., 2007). Згідно (Wong, 1994; Wong, 1999; Gimsa & Ried, 1995; Gimsa, 1998) при зв'язуванні інгібітора з білком конформація білка змінюється і вірогідність його переходу в конформацію з більшою поверхневою площею збільшується, що приводить до збільшення спільної площі поверхні зовнішнього моношару мембрани і до формування спікул (Sheetz et al., 1983). На цій основі можна припустити наявність взаємного зв'язку як між конформацією аніонного переносника і обумовленою нею формою еритроцитів (Blank et al., 1994; Gimsa, 1998; Betz et al., 2007), так і зворотним впливом форми клітин на конформацію переносника (Betz et al., 2007) і, отже, на транспортні процеси. При цьому важливим чинником є іонна сила середовища, що модулює активність транспортних процесів.

На рис. 1А показані типові криві зміни ОЩ і ІФ еритроцитів, поміщених в ізотонічний розчин сахарози в присутності різної кількості SITS. Видно, що присутність в середовищі SITS істотним чином змінює динаміку морфологічних змін клітин. При збільшенні концентрації SITS пик ІФ спочатку зміщується праворуч по осі часу (рис. 1Б), після чого спостерігається стабілізація фази 2 (дископодібна фаза з високим значенням ІФ) за рахунок елімінації фази 3 (рис. 2В).

Далі швидкість збільшення ІФ у фазі 2 поступово зменшується і, врешті-решт, відбувається стабілізація фази 1, яка характеризується низьким значенням ІФ, яке надалі не змінюється (рис. 1Г). Практично аналогічний результат був отриманий для DIDS з тією лише різницею, що концентрація DІDS, яка приводить до подібного результату, була приблизно в 2-5 разів більшою в порівнянні з SITS. На відміну від DІDS і SITS, інший інгібітор DNDS при збільшенні його концентрації в середовищі монотонно зрушував положення піку залежності ІФ від часу праворуч, одночасно розширюючи його. З рис. 1 (В, Г) видно, що в цьому випадку тривалість фази 1 значно зростає, що не спостерігається у випадку DIDS і SITS. Така дія DNDS передбачає, що він справляє свою дію на всі фази морфологічних змін еритроцитів приблизно однаковою мірою, тоді як DІDS і SITS більшою мірою діють на фази 2 і 3 і потім стабілізують фазу 1 (рис. 1В, Г).

Рис. 1. Динаміка змін ОЩ (оптична щільність) і ІФ суспензії еритроцитів, поміщених в сахарозне середовище (0,3 М) з різним змістом SITS (А) і DIDS (Б).

Примітки: 1 – крива “контроль” відповідає сахарозному середовищу без інгібітора; 2 – концентрації SITS і DNDS вказані біля кривих у мкМ.

Слід зазначити, що DIDS і SITS при великих концентраціях усувають початкове збільшення ОЩ, яке виразно спостерігається при малих концентраціях інгібіторів (рис. 1, А і Б), а DNDS не дає такого ефекту. Це вказує на те, що наявність в середі інгібіторів впливає як на початкову реакцію клітин на зміну електролітного складу середовища, так і на більш віддалені процеси трансформації різним чином, що, очевидно, визначається конкретною хімічною структурою інгібітора.

На рис. 2 показана динаміка зміни рН суспензії, після введення еритроцитів в сахарозне середовище у присутності DIDS, SITS, DNDS і альбуміну, а також при їх відсутності.

Як і слід було чекати, інгібування аніонного транспорту приводить до супутнього уповільнення закислення середовища у присутності інгібіторів аніонного транспорту, особливо SITS і DNDS. Дані по зміні рН добре корелюють з даними, що стосуються трансформації клітин в тому відношенні, що агенти, що викликають великі зміни рН суспензії, також є ефективнішими відносно інгібування трансформації форми клітин. Це указує на прямий зв'язок між транспортом іонів хлориду і зміною форми клітин, на підставі чого можна припустити, що основна роль в цих процесах належить аніонному каналу БЗ і його конформаційному стану.

Рис. 2. Вплив інгібіторів аніонного транспорту і альбуміну на динаміку зміни рН суспензії еритроцитів після їх введення в ізотонічне середовище сахарози (0,3 М), що містить вказані реагенти в наступних концентраціях в мкМ: DIDS – 40; SITS – 20; DNDS – 20.

Примітка. Концентрація альбуміну дорівнює 125 мкг/мл.

Виходячи з гіпотези бішарового сполучення, можна вважати, що між дією різних агентів з однією і тією ж спрямованістю індукції морфологічних змін (ехіноцитарних або стоматоцитарних) повинні існувати адитивність або синергізм. Це означає, що два агенти, діючи спільно, принаймні, не повинні ослабляти дію одне одного, за умови, що вони безпосередньо хімічно не взаємодіють один з одним. Аналогічно, для агентів з протилежною спрямованістю дії має існувати антагонізм. У нашому випадку неелектролітне середовище може розглядатись як один агент, і інгібітор аніонного транспорту – як інший і підстав до безпосередньої взаємодії немає. Відповідно, спостережувана адитивність підтверджує гіпотезу бішарового сполучення (Deuticke, 1968; Руденко, 1998).

Вплив хлорпомазину, СТАВ, SDS і флюоресцеїну на динаміку трансформації еритроцитів в сахарозному середовищі. Для подальшого вивчення природи морфологічних перетворень еритроцитів в сахарозному середовищі ми досліджували вплив деяких інших модифікаторів на динаміку зміни форми клітин. Хлорпромазин (ХП) належить до групи фенотіазинів і має добре виражені стоматоцитарні властивості (Reinharl & Chien, 1986; Reinhart & Chien, 1987; Nelson et al., 1983), СТАВ і SDS належать до поверхнево-активних речовин з ехіноцитарним типом дії (Isomaa et аl., 1987; Isomaa & Paatero, 1981). ФЛ має слабко виражену здатність змінювати форму еритроцитів, а також здатність швидко перерозподілятись між цитоплазмою і середовищем.

У випадку ХПР має місце закономірність, що виявлена раніше для інших модифікаторів, яка виявляється в тому, що із збільшенням концентрації XП спостерігається інгібування фаз 3 і 2 і стабілізація фази 1.

Видно, що додавання СТАВ веде до зростання ІФ. Величина і швидкість зміни ІФ збільшується із зростанням концентрації СТАВ, проте при концентрації СТАВ, рівній 0,2 мкМ – зростання змінюється подальшим зменшенням. Якщо СТАВ початково був присутній у середовищі, тоді він, за аналогією з іншими агентами, зрештою, блокував трансформацію клітин.

Вплив SDS значно відрізняється від впливу СТАВ і хлорпромазину. Діючи через 150 с, SDS додатково зменшує ІФ, а при збільшенні концентрації в середовищі він викликає появу другого піка змін ІФ, висота якого залежала від концентрації SDS і при великих концентраціях дорівнювала висоті першого піка ІФ. Дія SDS, коли він був присутній у середовищі, відрізнялась від усіх випадків, розглянутих раніше, вона була однотиповою і виявлялась у вигляді одного піка. В цілому дія SDS зводилась до того, що він зменшував значення ІФ як ліворуч, так і праворуч від максимуму ІФ, внаслідок чого залежність ІФ від часу виглядала у вигляді гострого, добре оформленого піка (рис. 3).

Рис. 3. Динаміка змін ОЩ і ІФ суспензії еритроцитів, поміщених в сахарозне середовище (0,3 М) із вмістом SDS 10, 20, 40 і 60 мкМ (Б, Г, Е, 3), і коли таку ж кількість SDS додавали в середовище через 150 с після клітин (А, В, Д, Ж). Концентрації SDS вказані біля кривих у мкМ.

Для того щоб встановити, якою мірою модифікатори форми впливають на транспорт протонів і хлориду, ми вимірювали динаміку зміни pН суспензії клітин в сахарозному середовищі в їх присутності. З рис. 4 видно, що присутність СТАВ практично не відбивається на кривій залежності рН від часу, а хлорпромазин викликає невелике інгібування потоку протонів, яке спостерігається до 40 с і не впливає на подальше залуження суспензії. SDS справляє істотний інгібуючий впливом, як на початкових, так і на подальших стадіях процесу, і його дія за характером нагадує дію DNDS (рис. 2).

Рис. 4. Вплив ХП, СТАВ і SDS на динаміку зміни рН суспензії еритроцитів після їх введення в ізотонічне середовище сахарози (0,3 М), що містить вказані реагенти в наступних концентраціях в мкМ: Хп – 80; CTAB – 0,2; SDS – 60.

Було досліджено, також, дію такого агента як флуоресцеїн, – чинника, який може бути використаний для вивчення транспортних процесів в еритроцитах, бути маркером для оцінки мембранного потенціалу і впливати на форму клітин.

На рис. 5 показана динаміка зміни внутрішньоклітинної концентрації ФЛ в контрольних клітинах і клітинах, оброблених DIDS і фенілгідразином.

Рис. 5. Вплив модифікаторів мембрани і цитоскелету на транспорт флюоресцеїну в еритроцити.

Примітки: 1 – контроль, 2 – DIDS (20 мкМ), 3 – фенілгідразин (1 мМ).

Видно, що інгібування аніонного транспорту (DIDS) і модифікація структурного стану цитоскелету в еритроцитах (фенілгідразин) не призводять до суттєвих змін динаміки накопичування в них ФЛ. Інші варіанти модифікації еритроцитів за допомогою геміну, NEM, іодацетамиду і ДТНБ також не призводили до зміни транспортних характеристик ФЛ у порівнянні з контролем. Ці дані свідчить на користь того, що транспорт ФЛ не опосередковується переносником, а відбувається шляхом дифузії через ліпідний бішар.

У порівнянні з іншими модифікаторами, ФЛ впливає на динаміку трансформації еритроцитів у сахарозному середовищі тільки у відносно великих концентраціях (рис. 6). Відмінною рисою його дії є здатність збільшувати тривалість фази 1 і, при цьому, в меншій мірі впливати на інші фази процесу, в результаті чого кінетична крива зміщується вправо за віссю часу. У концентрації, де ФЛ використовувався для вивчення механізму його транспорту в еритроцитах (5 мкМ), він не впливає на морфологічну відповідь клітин. Це означає, що речовини, вільно дифундують через ліпідний бішар мембрани, не торкаються механізмів, що відповідають за трансформацію форми клітин. В той же час, поверхнево активні речовини, які володіють мембранотропним ефектом (CPR, СТАВ, SDS) значно впливають на клітини.

Рис. 6. Динаміка змін ОЩ та ІФ суспензії еритроцитів, що розміщені в сахарозному середовищі (0,3 М) з різним вмістом ФЛ.

Примітки: 1 – крива “контроль” відповідає сахарозному середовищу без інгібітору; 2 – концентрації ФЛ зазаначені біля кривих в мкМ.

Вплив іонної сили та альбуміну на морфотрансформацію еритроцитів. Введення еритроцитів у середовище з низькою іонною силою, де електроліт хлорид натрію изоосмотично заміщений сахарозою, призводить до ряду ефектів, що не спостерігаються у середовищах з високою іонною силою. Відбувається деполяризація мембрани (Bennekou et al., 2004), збільшується її проникність для калію і натрію (Bernhardt et al., 1987), а також більших молекул (Culliford et al., 1995), відбувається закислення позаклітинного середовища і луження цитоплазми клітин (Kummerow et al., 2000).

На рис. 7 представлені дані про змінення ОП та ІФ еритроцитів, розміщених в ізотонічному розчині сахарози з різним вмістом хлориду натрію. Як видно на рис. 7, незначне збільшення іонної сили сахарозного середовища (до 3,75 мМ), призводить до елімінації фази 3, і збільшенні фаз 1 і 2. При концентрації NaCl в середовищі, яка дорівнює 15 мМ і вище ІФ клітин при їх переносі з фізіологічного розчину в розчин сахарози змінюється незначно.

Рис. 7. Динаміка змін ОЩ та ІФ суспензії еритроцитів, розміщених в сахарозних середовищах (0,3 М) з різним вмістом NaCl в мМ: А – 1,5; Б – 3,75; В – 7,25; Г – 15.

Примітка. Крива “контроль” відповідає сахарозному середовищу без солі.

Альбумін, в залежності від концентрації в сахарозному середовищі, може стабілізувати еритроцити як в квазі-дискоїдній формі, так і в фазі сфероцитозу. Завдяки такій властивості альбуміну залежність стаціонарного ІФ (виміряного через 5 хвилин) від концентрації альбуміну, має характерний вигляд з максимумом, положення якого відповідає концентрації білка, що стабілізує фазу 2. Данні показують, також, що дзвоновидна форма цієї залежності зберігається, але положення максимуму, як видно, у випадку різних донорів може відрізнятися.

Отримані дані показують, що збільшення вмісту хлоридів в сахарозному середовищі повністю усуває трифазну послідовність морфологічних перетворень еритроцитів. Вплив альбуміну на ці процеси при його невеликих концентраціях має спільні риси з впливом іонної сили, але значно відрізняється при великих концентраціях, що вказує на специфічність впливу цього агента.

Порівняльне дослідження видової специфічності морфологічних змін еритроцитів людини, щура і півня в сахарозному середовищі. На рис. 8 показані типові криві змін ІФ еритроцитів людини, щура і півня, що розміщені в ізотонічному розчині сахарози, за відсутністю модифікаторів (ліві треки) і за їх наявністю (праві треки). Стрілкою на лівих треках позначений момент додавання тієї ж кількості модифікаторів, що і на правих треках. Видно, що в середовищі без модифікаторів морфологічні реакції еритроцитів щура мають схожий характер з еритроцитами людини і складаються, принаймні, з трьох фаз, які відмічались вище при дослідженні еритроцитів людини. Із графіків видно, що на відміну від еритроцитів людини і щура, які демонструють практично однакову трифазну залежність ІФ від часу, у випадку еритроцитів півня не спостерігається суттєвих змін ІФ, незалежно від того, чи додається модифікатор через 150 с, чи він початково був присутній у середовищі.

Виявлені відмінності в морфологічній реакції еритроцитів людини та щура в неелектролітному середовищі при наявності модифікаторів або при дії модифікаторів на пізніших етапах, демонструють видоспецифічність, що, у свою чергу, вказує на те, що механізми, контролюючі трансмембраний обмін компонентів мембрани, можуть суттєво відрізнятися в цих близьких за своєю організацією типах кліток ссавців. Суттєвим чинником, очевидно, є також механізми тонкої регуляції змін форми клітин, які залежать від складу ліпідів мембрани, організації цитоскелету, щільності розподілу та інтеграції компонентів, що опосереднюють іонний транспорт і т. д. Додатковим фактором є об'єм клітин, що опосереднює зміни форми або зміни іонної сили та осмолярності середовища.

Рис. 8. Вплив інгібіторів аніонного транспорту, альбуміну, CPR, SDS і СТАВ на динаміку зміни ІФ суспензії еритроцитів щура після їх введення в ізотонічне середовище сахарози (0,3 М) і подальшого додавання до нього модифікаторів через 150 с (ліві треки), а також після введення еритроцитів в сахарозне середовище, яке містить ту ж кількість модифікаторів (праві треки).

Примітки: 1 – стрілками позначені моменти введення в середовище реагентів у наступних кінцевих концентраціях в мкМ: DІDS – 10, DNDS – 16, CPR – 20, SDS – 10, СТАВ – 0,2, DIDS – 20 (A); DNDS – 20, CPR – 80, SDS – 100, СТАВ – 0,2 (Б); 2 – концентрація альбуміну дорівнює 125 (А) і 250 (Б) мкг/мл.

ВИСНОВКИ

У роботі досліджено вплив модифікаторів форми еритроцитів різної природи, що включають інгібітори аніонного транспорту і деякі детергенти на морфотрансформацію еритроцитів людини, щура і півня, а також взаємозв’язок між активацією транспортних процесів і зміною форми еритроцитів при експозиції клітин в ізотонічному сахарозному середовищі.

1. Введення еритроцитів в ізотонічне середовище сахарози з низьким вмістом іонів хлору призводить до трифазної послідовності змін форми клітин (морфологічній відповіді, МВ), яка складається із швидкої сферуляції (фаза 1), відновленню форми близькою до дискоїдної (фаза 2) і повторної сферуляції (фаза 3).

2. МВ концентраційно-залежним чином залежить від наявності в сахарозному середовищі модифікаторів форми еритроцитів эхіноцитарного (DIDS, SITS, DNDS, СТАВ, SDS) або стоматоцитарного (CPR, альбумін) типів дії. При збільшенні концентрації всіх модифікаторів, окрім SDS, спостерігається стабілізація фази 1 або інгібування фази 2 МВ.

3. Фази МВ еритроцитів залежать від іонної сили середовища та його складу, при цьому трифазна структура МВ еритроцитів зникає при збільшенні вмісту хлоридів в середовищі до рівня 15–20 мМ.

4. Вплив модифікатів на формування МВ еритроцитів залежить від їх типу, концентрації та моменту початку дії щодо трифазної послідовності трансформації клітин, що розвиваються.

5. Для еритроцитів щура МВ як за наявністю, так і за відсутністю модифікатів розвивається у напрямку інвагінованих, стоматоцитарних форм, що розрізняються за ступенем сферичності, тоді як в разі еритроцитів людини під впливом SDS та альбуміну відбувається формування ехиноцитів.

6. Еритроцити півня в сахарозному середовищі трансформувалися в стоматоцити, а при наявності модифікаторів практично зберігали свою дискоїдну еліптичну форму та високе значення індексу форми. Поряд зі вказаними відмінностями в МВ еритроцитів людини і щура ці дані вказують на видоспецифічність морфологічної реакції цих клітин в сахарозному середовищі.

7. Вивчення транспорту флюоресцеїну в еритроцитах людини показало, що він транспортується в клітини шляхом простої дифузії через ліпідний бишар мембрани і розподіляється, практично у відповідності з трансмембранним потенціалом. Останнє дозволяє використовувати флюоресцеїн як маркер для оцінки значення розміру трансмембранного потенціалу еритроцитів при зміні іонного складу середовища.

Список праць, опублікованих за темою дісертації

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

АНОТАЦІЯ

Мохамад Хані Румієх. Вивчення взаємозв'язку між процесами іонного транспорту і зміною форми еритроцитів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин – Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2008.

Дисертація присвячена вивченню взаємовідношень між умовами середовища, процесами іонного транспорту та морфології еритроцитів людини, щура та півня. Вивчалися також особливості взаємодії мембрани еритроцитів з модифікаторами форми і інгібіторами аніонного транспорту в умовах модифікації іонної сили і складу позаклітинного середовища.

Встановлено що введення еритроцитів в ізотонічне середовище сахарози з низьким вмістом іонів хлору призводить до трифазної послідовності змін форми клітин (морфологічній відповіді, МВ), що складається зі швидкої сферуляції (фаза 1), відновленню форми близькою до дискоїдної (фаза 2) і повторної сферуляції (фаза 3). Встановлено, що фази МВ залежать від іонної сили середовища та вмісту в ній іонів хлориду. Ефект модифікаторів на МВ залежить від їх типа, концентрації і моменту зачала дії щодо трифазної послідовності трансформації, що розвивається. Показано, що для еритроцитів щура МВ як в присутністі, так і у відсутності модифікатів, відбувається в межах тих, що інвагінують, стоматоцитарних форм, що