Київський національний університет імені Тараса Шевченка

МАНЬКО Володимир Васильович

УДК 612.014.42:612.3:591.413.2

СИСТЕМИ ТРАНСМЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТУВАННЯ КАЛЬЦІЮ У СЕКРЕТОРНИХ КЛІТИНАХ СЛИННИХ ЗАЛОЗ ЛИЧИНКИ

CHIRONOMUS PLUMOSUS LINNAEUS

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович,

Львівський національний університет

імені Івана Франка,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин

Офіційні опоненти: член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України,

заступник директора з наукової роботи

та завідувач відділу біохімії м’язів

член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Веселовський Микола Сергійович,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця

НАН України,

завідувач відділу фізіології нейрональних мереж

член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітин НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин

та апоптозу

Захист відбудеться «19» березня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, проспект Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215).

Поштова адреса: 01033 м. Київ, вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (м. Київ, вул. Володимирська, 58).

Автореферат розісланий « 6 » лютого 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради О.В.Цимбалюк

ВСТУП

Актуальність теми. Система внутрішньоклітинного передавання сигналів за участю катіонів Са2+ відіграє надзвичайно важливу роль у багатьох фізіологічних процесах різних типів клітин (Шуба М.Ф., 1981; Костюк, 1986; Рыбальченко, 1988; Пидопличко, Верхратский, 1989; Костерин, 1990; Carafoli et al., 2001). Загальновизнаним є і те, що транспортування Са2+ як через плазмалему, так і через внутрішньоклітинні мембрани є надзвичайно важливим у секреторному процесі (Hokin, 1966; Petersen, Ueda, 1976; Гринькив, Клевец, Шостаковская, 1988; Клевець, 1993; Petersen, 1996; Burgoyne, Morgan, 2003; Дубицький, 2006). Але послідовність процесів, що призводять до активації катіонами Са2+ секреторного процесу, зокрема її завершального етапу – екзоцитозу, ще не до кінця досліджено. Основною причиною цього є аж ніяк не нехтування секреторних клітин дослідниками, а різноманітність травних залоз і об’єктивні проблеми експериментального характеру, що пов’язані із реєстрацією функціонування Са2+-транспортувальних систем та секреції. Тому про властивості Са2+-транспортувальних систем клітинних мембран та їхню роль у підтриманні функціонального рівня цитозольної [Са2+] у секреторних клітинах екзокринних залоз до недавнього часу було відомо мало. Це стримує розроблення можливих методів фармакологічної корекції секреторної функції травних залоз та інших систем, функціонування яких пов’язане із секрецією.

Серед різноманіття травних залоз в організмі тварин розрізняють одно-, мало- і багатоклітинні. Досить ґрунтовно Са2+-транспортувальні системи досліджено у секреторних клітинах багатоклітинних залоз ссавців, таких як великі слинні (Di Julio et al., 1997; Zhang et al., 1997; Liu, Ambudkar, 2001; Федірко та ін., 2003; Федірко, 2006; Larina, Torn, 2005 та інші) та підшлункова (Tepikin et al., 1992; Petersen, 1996; Fitzsimmons et al., 2000; Park et al., 2001; Cancela et al., 2002 та інші). Цікавими для дослідження Са2+-транспортувальних систем є малоклітинні залози. Вони представляють собою популяцію відносно невеликої кількості клітин, спеціалізованих у різних напрямках, але структурно і хімічно зв’язаних між собою та здатних секретувати одночасно кілька речовин, які суттєво відрізняються за своїми властивостями і призначенням.

Відповідним модельним об’єктом для таких досліджень можуть служити слинні залози двокрилих. Вагомі здобутки у дослідженні Са2+-сигналізації проведені на слинних залозах мухи Calliphora (Zimmermann, Walz, 1997; 1999; Zimmermann, 2000). Ще одним об’єктом, який здавна використовується для електрофізіологічних досліджень (Loewenstein, Nakas, Socolar, 1967; Туркевич, 1970; Cohen, 1977; Клевець, 1975-1993), є слинні залози личинки комарів-дергунів Chironomus. У секреторних клітинах цих залоз досліджені високопровідні міжклітинні контакти (Rose, Loewenstein, 1975; 1976), K+-, Na+- і Cl__канали витоку (Клевец, 1986), потенціалкеровані K+- (Клевец, 1990) і Cl__канали (Клевец, 1991). У них, використовуючи метод фіксації потенціалу, ідентифіковані потенціалкеровані Са2+-канали (Клевец, Гураль, 1990; Клевець, Манько, 1992; Манько, 1995). Дисертаційна робота присвячена ідентифікації і дослідженню властивостей інших Са2+-транспортувальних систем цих малоклітинних залоз.

Зв’язок роботи з науково-дослідною тематикою кафедри. Дисертація виконана в рамках таких держбюджетних науково-дослідних тем кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка: «Вияснення механізмів функціонування Nа+–Са2+-обміну мембрани секреторних клітин» (1995-1997 рр., № держреєстрації 0196V002178), «Дослідження Na+-залежного транспорту кальцію через мембрани секреторних клітин у прямому і зворотному режимах та ролі у ньому функціональних груп протеїну обмінника» (1998 р., № держреєстрації 0198V004853), «Кальцієвий гомеостаз і енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом екстремальних факторів» (2000-2002 рр., № держреєстрації 0100О001452), «Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних клітин» (2003-2005 рр., № держреєстрації 0103U001872) і частково за підтримки грантами для молодих вчених Західно-Українського біомедичного пошукового центру (WUBMRC).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала в ідентифікації, з’ясуванні особливостей та властивостей Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин малоклітинних залоз на прикладі слинної залози личинки Chironomus plumosus L.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

ідентифікувати Са2+-транспортувальні системи плазматичної і внутрішньоклітинних мембран секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна;

дослідити специфічність Na+–Ca2+-обмінника плазматичної мембрани до одновалентних катіонів, його спорідненість до двовалентних катіонів та чутливість до катіонів перехідних металів;

встановити залежність функціональної активності Na+–Ca2+-обмінника від наявності у середовищі блокаторів і протекторів SH-груп, а також від рН позаклітинного і внутрішньоклітинного середовищ;

з’ясувати механізм залежності струму Na+–Ca2+-обмінника від функціонування Na+–K+- та Са2+-помпи плазматичної мембрани;

перевірити наявність взаємодії між функціонуванням ріанодин- та ІФ3-чутливими Са2+-каналами внутрішньоклітинних мембран;

дослідити роль мітохондрій у Са2+-сигналізації секреторних клітин малоклітинних залоз;

встановити особливості регулювання Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна кальмодуліном, циклічними нуклеотидами та NO.

Об’єкт дослідження: Са2+-сигналізація у секреторних клітинах екзокринних залоз.

Предмет дослідження: роль систем активного і пасивного транспортування Са2+ плазматичної і внутрішньоклітинних мембран у Са2+-сигналізації секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus Linnaeus.

Методи досліджень. Для досягнення мети використовували електрофізіологічні, функціональні, біофізичні, біохімічні, статистично-математичні та кінетичні методи, а також метод електронної мікроскопії. Зокрема, для дослідження Са2+-транспортувальних систем розроблено підхід, який ґрунтується на реєстрації секреторної активності залоз та зміні вмісту сумарного або мембранозв’язаного Са2+ у їхній тканині після інкубації у відповідних середовищах, і підібрано умови пермеабілізації досліджуваних секреторних клітин сапоніном. Вхідний і вихідний струми Na+–Ca2+-обміну реєстрували з використанням методу фіксації потенціалу за умов внутрішньоклітинної перфузії. Функціональну активність Са2+-помп визначали за зміною вмісту неорганічного фосфору у середовищі. Залежність досліджуваних процесів від концентрації агоніста чи антагоніста описували рівнянням Хілла.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі вперше проведено ідентифікацію та дослідження властивостей Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз личинки Chiromomus plumosus – потенціалкерованих Са2+-каналів, Na+–Ca2+-обмінника, Са2+-помпи плазматичної мембрани і ендоплазматичного ретикулуму, Са2+-уніпортера мітохондрій, IФ3-чутливих та ріанодинчутливих Са2+-каналів. Вперше показано, що роль первинного агоніста у малоклітинних залозах може відігравати АТФ, оскільки на плазматичній мембрані досліджуваних секреторних клітин ідентифіковані P2Y- і P2X-рецептори. Вперше виявлено, що Na+–Ca2+-обмінник плазматичної мембрани характеризується низькою специфічністю до одно- та двовалентних катіонів і каталітично регулюється цитозольним Са2+. Встановлено, що функціонування Na+–Ca2+-обмінника залежить і від рН середовища. Вперше показано, що катіони перехідних металів можуть не лише пригнічувати, але й стимулювати Na+–Ca2+-обмін. Отримано переконливі докази важливої ролі SH-груп амінокислотних залишків молекули Na+–Ca2+-обмінника у підтриманні певної його функціональної активності. Вперше встановлено, що Са2+-транспортувальні системи секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна ефективно регулюються кальмодуліном, цАМФ, цГМФ і NO. Для пояснення експериментальних даних запропоновано концепцію Са2+-функціональних одиниць і принцип «зміщених фаз». На основі аналізу просторових властивостей секреторних клітин та властивостей різних Са2+-транспортувальних систем постулюється наявність трьох чітко обмежених кальцієвих доменів (базального, апікального та ядерного), які сформовані за участю плазматичної та внутрішньоклітинних мембран, мають різний набір Са2+-траспортувальних систем і виконують різне функціональне навантаження.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати та їхня інтерпретація розширюють і поглиблюють знання про механізми Са2+-сигналізації у секреторних клітинах травних залоз, тому вони мають фундаментально-теоретичне значення і є необхідними для пояснення причин виникнення і розвитку патологій травних залоз, пов’язаних з порушенням Са2+-гомеостазу, та розробки методів їхньої фармакологічної корекції, а тому мають значення для медицини та ветеринарії. Крім того, вони можуть бути використані для розроблення методів боротьби із шкідливими комахами, у зв’язку з чим вони мають важливе значення і для гігієни та санітарії.

У процесі роботи над дисертацією були розроблені нові методичні підходи до дослідження Са2+-транспортувальних систем, зокрема: а) метод реєстрації струму Na+–Ca2+-обміну плазматичної мембрани в умовах фіксації потенціалу та внутрішньоклітинної перфузії у відповідь на раптову зміну мембранного потенціалу; б) метод дослідження функціонування Са2+-транспортувальних систем на основі аналізу змін вмісту сумарного чи мембранозв’язаного Са2+ після інкубування залоз у відповідних середовищах; в) методичний підхід розрахунку параметрів рівняння Хілла з використанням модифікованих координат Іді-Хофсті. Зазначені методичні підходи можуть викликати зацікавлення у спеціалістів з фізіології людини і тварин, біохімії та біофізики.

Основні положення дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес Львівського національного університету імені Івана Франка і використовуються при викладанні загальних курсів «Фізіологія людини і тварин», «Біофізика» та спецкурсів «Електрофізіологія», «Фізіологія травлення», «Електрофізіологія секреторних клітин». Методичні і експериментальні розробки використовуються студентами в ході виконання курсових і дипломних робіт. Вони можуть бути використані для підготовки спеціалістів медико-біологічного профілю у вищих навчальних закладах України.

Особистий внесок здобувача. Здобувач є автором усіх наукових ідей, покладених в основу дисертаційної роботи. Ним здійснене планування експериментів, підбір та адаптація методів експериментальних та теоретичних досліджень, опрацювання та обговорення результатів, формулювання основних висновків дисертації. Експериментальні дослідження проведені автором особисто та за участю співавторів публікацій – Н.В.Федірко, Т.В.Король, О.А.Ларіної, С.В.Бичкової і О.Ю.Великопольської. Електронно-мікроскопічні дослідження здійснені за допомоги к.б.н. О.Р.Кулачковського. Аналіз основних результатів здійснено спільно з науковим консультантом проф. М.Ю.Клевцем.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні положення, які включені до дисертації, були представлені на: XV, XVI і XVII з’їздах Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998; Вінниця, 2002; Чернівці, 2006); II, ІІІ і IV з’їздах Українського біофізичного товариства (Харків, 1998; Львів, 2002; Донецьк, 2006); VIII і ІX Українському біохімічному з’їздах (Чернівці, 2002; Харків, 2006); 4-ій Парнасівській конференції «Молекулярні механізми клітинної активації: біологічний сигнал та його молекули-мішені» (Вроцлав, 2002); 6-ій Парнасівській конференції «Молекулярні механізми клітинної сигналізації» (Краків, 2007), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), Міжнародній школі «Мембрана і сигналізація» (Київ, 2000), Всеукраїнській науковій конференції «Актуальні проблеми гастроентерології» (Київ, 2001); Всеукраїнській науковій конференції «Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології» (Київ, 2002); ІІІ Всеукраїнській науковій конференції «Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології» (Київ, 2006); Конференції до 100-річчя з дня народження заслуженого діяча науки України проф. Я.П.Склярова «Механізми фізіологічних функцій в експерименті та клініці» (Львів, 2001); Міжнародній конференції, присвяченій пам’яті проф. І.В.Шостаковської (Львів, 2002); Міжнародній конференції «Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи» (Львів, 2004); Міжнародній науковій конференції «Механізми функціонування фізіологічних систем» (Львів, 2006), 41-му щорічному з’їзді Біофізичного товариства (Новий Орлеан, 1997), XXXIII Міжнародному конгресі фізіологічних наук (Санкт-Петербург, 1997); ІІ з’їзді біофізиків Росії (Москва, 1999); 2-му конгресі Федерації європейських фізіологічних товариств (Прага, 1999); 2-му і 3-му Європейському біофізичному конгресах (Орлеан, 1997; Мюнхен, 2000); XIII Міжнародному біофізичному конгресі (Нью Делі, 1999), Європейському пошуковому з’їзді «Кальцій як молекула клітинної інтеграції» (Кент, 2000), Міжнародному симпозіумі «Внутрішньоклітинна сигналізація в рослинних та тваринних системах (ISPAS)» (Київ, 2001), Спільному з’їзді Британського фармакологічного та фізіологічного товариств (Манчестер, 2003); З’їзді фізіологічного товариства (Кембридж, 2003); Другому міжнародному симпозіумі «Фізіологія і біофізика гладеньких м’язів» (Київ, 2003); 29-му з’їзді Федерації європейських біофізичних товариств (Варшава, 2004); 2-ій Міжнародній конференції «Нейрогуморальні і клітинні регуляторні механізми травних процесів» (Київ, 2005), а також на щорічних звітних конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (1996-2007 рр.) та на міжкафедральному семінарі біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка у вересні 2007 р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 96 наукових праць, з них 26 статей у наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень та їхнього обговорення, узагальнення, висновків та списку використаних джерел з 490 найменувань. Робота викладена на 345 сторінках (основна частина на 278 сторінках), ілюстрована 100 рисунками і 14 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проведені на слинних залозах личинки Chironomus plumosus L. Для пермеабілізації секреторних клітин слинні залози обробляли сапоніном. Про функціональний стан Са2+-транспортувальних систем судили за зміною вмісту Са2+ у тканині залоз, виміряного за допомогою арсеназо ІІІ. Вміст білка визначали за методом Лоурі (Lowry, Rosenbrough, Farr et al., 1951).

Для реєстрації струмів Nа+–Cа2+-обміну використовували метод фіксації потенціалу в умовах внутрішньоклітинної перфузії за допомогою пластикової мікропіпетки (Крышталь, Пидопличко, 1975). Вхідний струм Na+–Ca2+-обміну, який відображає функціонування Na+–Ca2+-обмінника у прямому режимі, реєстрували у відповідь на тривале (3,5 с) гіперполяризувальне зміщення мембранного потенціалу від _ мВ до _ мВ, а вихідний струм Na+–Ca2+-обміну, що відповідає роботі антипортера у зворотному режимі, – у відповідь на деполяризацію плазматичної мембрани клітин до +20 мВ.

Про стан Са2+-транспортувальних систем судили також за зміною вмісту мембранозв’язаного Са2+. Для цього ізольовані слинні залози інкубували у базовому та дослідних розчинах протягом 20-30 хв при кімнатній температурі (19-22 °С). Після такої інкубації залози 15-20 хв фарбували хлортетрацикліном (2 мкмоль/л), який додавали у розчини інкубації. Після відмивання залоз від барвника визначали інтенсивність флуоресценції за довжини збуджуючого світла (збуд.) 380 нм; флуоресценцію реєстрували за ф. 480-530 нм.

Са2+, Mg2+-АТФазну активність гетерогенної фракції мембран секреторних клітин оцінювали за різницею вмісту неорганічного фосфату (Рн) у різних середовищах після інкубації, концентрацію якого визначали за методом Фіске-Суббароу (Fiske, SubbaRow, 1925).

Для електронно-мікроскопічних досліджень інтактні залози фіксували охолодженим до 0 С 1,5 % розчином глутарового альдегіду на какодилатному буфері, постфіксацію проводили 1 % розчином OsO4 у какодилатному буфері. Фіксовані зразки промивали і витримували у 1,5 % водному розчині уранілацетату, зневоднювали в зростаючих концентраціях етанолу, окису пропілену та переносили в епоксидну смолу Epon-812. Ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-6 і контрастували солями свинцю за Рейнольдом. Перегляд і фотографування зразків виконували на електронному трансмісійному мікроскопі ПЕМ-100.

Статистично-математичне опрацювання даних здійснювали з використанням програмного пакета для персональних комп'ютерів Microsoft Excel. Для розрахунку параметрів рівнянням Хілла використовували модифіковані нами координати Іді-Хофсті.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

1. Ідентифікація Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus

Потенціалкеровані Са2+-канали плазматичної мембрани. Деполяризація плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз гіперкалієвими розчинами супроводжувалася збільшенням вмісту Са2+ у їхній тканині (рис. 1). Залежність К+-стимульованого збільшення вмісту Са2+ у тканині залози від [К+]е задовільно описується рівнянням Хілла з близьким до одиниці коефіцієнтом n.

За зниженої до 35 ммоль/л [Na+]e залежність змін вмісту Са2+ від [К+]e виявилася менш вираженою і не описується рівнянням Хілла. Зумовлено це тим, що за фізіологічної [К+]e зниження [Na+]e супроводжується збільшенням вмісту Са2+ у тканині залоз у 2,01 ± 0,17 рази (P < 0,001, n = 6). За [К+]e 20 ммоль/л це збільшення становило лише 1,36 ± 0,17 рази (P < 0,05, n = 6), а за вищих концентрацій взагалі виявилося статистично недостовірним. Це дає змогу розглядати зменшення [Na+]e як своєрідне інгібування К+-стимульованого збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз. Зумовлене це «інгібування», швидше за все, обмеженістю Са2+-ємності внутрішньоклітинних органел, тому однозначної відповіді, який вклад Na+–Ca2+-обміну через плазматичну мембрану у К+-стимульоване збільшення вмісту Са2+ ми не отримали.

Встановлено також, що вміст Са2+ у тканині зростає із збільшенням [Ca2+]e як у базальних умовах (5,36 ммоль/л К+), так і за гіперкалієвої деполяризації мембрани (40 ммоль/л К+). Згідно даних двофакторного дисперсійного аналізу вміст Са2+ у тканині залоз з високим ступенем ймовірності (Р < 0,001) визначається [Ca2+]e на 67,87 % і лише на 9,14 % [K+]e. Спільний вплив обох факторів є ще меншим і становить лише 5,17 % (Р < 0,05). Властиво, це і має спостерігатися, оскільки малоймовірний є вхід Са2+ у цитоплазму із позаклітинного середовища, в якому він практично відсутній. За підвищеної до 5 ммоль/л [Ca2+]e статистично достовірні зміни вмісту Са2+ у тканині під впливом гіперкалієвої деполяризації теж є відсутні. Причиною цього є зростання вмісту Са2+ у тканині із збільшенням [Ca2+]e вже за фізіологічної [K+]e. І лише за фізіологічної [Ca2+]e гіперкалієва деполяризація спричиняє достовірне збільшення Са2+ у тканині.

К+-стимульоване збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз пригнічується La3+ з константою інгібування К0,5 = 70 мкмоль/л. Значення коефіцієнта Хілла (n = 0,47) свідчить про можливу наявність негативної кооперативності і є наслідком, мабуть, того, що La3+ пригнічує не лише Са2+-транспортувальні системи, які забезпечують вхідний потік Са2+, але і системи вихідного потоку. Оскільки К0,5 інгібування K+-стимульованих змін вмісту Са2+ у тканині суттєво менша, ніж К0,5 інгібування струму Na+–Ca2+-обміну (див. рис. 10), то, найімовірніше, катіони La3+ пригнічують і потенціалкеровані Са2+-канали, і Са2+-помпу плазматичної мембрани.

Крім того, К+-стимульоване збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз пригнічується верапамілом (на 58,82 %; P < 0,01, n = 6), дилтіаземом (на 64,50 %; P < 0,05, n = 6) та ніфедипіном (на 62,02 %; P < 0,05, n = 6). Дилтіазем і ніфедипін пригнічували і стимульоване гіперкалієвим розчином збільшення вмісту мембранозв’язаного Са2+. Це підтверджує наявність у мембрані досліджуваних секреторних клітин раніше ідентифікованих (Клевец, Гураль, 1990; Клевець, Манько, 1992) потенціалкерованих Са2+-каналів. Потенціалкеровані Са2+-канала ідентифіковані також у плазматичній мембран секреторних клітин слинних залоз амазонської п’явки Haementeria ghilianii (Wuttke, Berry, 1993; Wuttke, Munsch, Deitmer, 1996).

Функціональне підтвердження наявності Na+–Ca2+-обміну через плазматичну мембрану. Залежність змін нормалізованого вмісту Са2+ у тканині від [Na+]e задовільно описується рівнянням Хілла з коефіцієнтом n = 6,60 (рис. 2, крива 1). Але у цьому випадку розрахована крива віддаляється від експериментальних точок, отриманих за умови збереження фізіологічної осмотичності. Графік Хілла для тих експериментальних точок, які були визначені за фізіологічної осмотичності середовища (рис. 2, крива 2), характеризується значно меншим коефіцієнтом n (2,32). Ми схиляємося до думки, що високе значення коефіцієнта n у рівнянні Хілла для усіх експериментальних точок зумовлена порушенням осмотичності середовища. Тим не менше, той факт, що значення коефіцієнта n > 2, дає змогу стверджувати про електрогенність Na+–Ca2+-обміну через мембрану досліджуваних клітин.

Залежність збільшення вмісту Ca2+ у тканині, стимульоване інкубацією залоз у гіпонатрієвому середовищі, від [Сa2+]е теж задовільно описується рівнянням Хілла (рис. 3). Високе значення коефіцієнта n цієї залежності аж ніяк не можна розцінювати як доведення здатності Na+–Ca2+-обмінника плазматичної мембрани транспортувати 2 катіони Са2+ у клітину взамін виведення кількох (скількох?) катіонів Na+. Швидше за все, зміни вмісту Са2+ у тканині залоз у цій серії дослідів спричинені не лише функціонуванням обмінника у зворотному режимі, а й зміною функціональної активності Са2+-помпи плазматичної мембрани. Збільшення позаклітинного Са2+ повинно зменшувати швидкість транспортування Са2+ помпою і навпаки. Це пов’язано не з афінністю Са2+-помпи плазматичної мембрани до цитозольного Са2+, яка є набагато вищою за афінність Na+–Ca2+-обмінника (Blaustein, Lederer, 1999), а лише з термодинамічним зміщенням.

Ідентифікація струму Na+–Ca2+-обміну. У відповідь на гіперполяризувальне зміщення мембранного потенціалу прямокутними імпульсами від рівня фіксованого потенціалу за наявності фізіологічного натрієвого градієнта (ENa = +54,2 мВ) через мембрану секреторних клітин розвивається вхідний струм, що характеризується повільною кінетикою зростання (рис. 4 А). Ліквідація натрієвого градієнта (ЕNa = 0 мВ) призводить до суттєвого зменшення амплітуди вхідного струму. За зворотного натрієвого градієнта (ЕNa = _,3 чи _,3 мВ) у відповідь на гіперполяризацію мембрани виникає струм вихідного напрямку (рис. 4 Б).

Вихідний струм розвивається і у відповідь на деполяризувальне зміщення мембранного потенціалу від рівня фіксованого потенціалу за фізіологічного натрієвого градієнта, наявності у середовищі верапамілу, еозину Y, відсутності у розчинах К+ та за хлорного градієнта, зміненого таким чином, щоб ЕCl дорівнював тестованому потенціалу. Амплітуда виявленого за таких умов вихідного струму, як і вхідного, що розвивається у відповідь на гіперполяризацію мембрани, залежить від натрієвого градієнта: як зменшення [Na+]е, так і збільшення [Na+]і викликала її суттєве зменшення. Отримані результати узагальнені на рис. 5 у вигляді залежності амплітуди струмів, що розвиваються у відповідь на гіпер- та деполяризацію плазматичної мембрани, від рушійної сили іонів Na+ (ДЕNa = Em - ENa) при тестованому потенціалі.

Таблиця 1

Умови реєстрації струмів, представлених на рис. 5

Крива залежності амплітуди вихідного струму, який розвивається у відповідь на гіперполяризацію плазматичної мембрани за фізіологічного натрієвого градієнта, від рушійної сили транспорту Na+ (криві 3 і 4 на рис. 5) не перетинає вісь абсцис при ДЕNa = 0 мВ. Аналогічна закономірність характерна і для вихідних струмів, спричинених деполяризацією плазматичної мембрани (криві 6 і 8). Тобто, внаслідок зміни знаку ДЕNa при тестованому потенціалі не змінюється ні напрям струму, ні характер залежності амплітуди вихідного струму від ДЕNa. Це свідчить, що вихідні струми, спричинені як гіперполяризацією мембрани, так і деполяризацією, є не канальними та визначаються не тільки натрієвим електрохімічним градієнтом.

Знак ДЕNa при фіксованому потенціалі визначає напрям струму. За негативного значення ДЕNa у відповідь на гіперполяризацію мембрани виникає струм вхідного напрямку (криві 1, 2, 5 і 7), а за позитивного – вихідного напрямку (криві 3 і 4). Для струму, що виникає у відповідь на деполяризацію мембрани, притаманна зворотна закономірність: за негативного значення ДЕNa при тестованому потенціалі виникає струм вихідного напрямку (криві 6 і 8).

Є також усі підстави вважати, що струм, зареєстрований у відповідь на раптову зміну мембранного потенціалу, визначаються й електрохімічним градієнтом Ca2+. На рис. 6 представлено залежність амплітуди вхідного струму Na+–Ca2+-обміну від [Сa2+]e. Вхідний струм Na+–Ca2+-обміну, зареєстрований за фізіологічного натрієвого градієнта, відображає Na+e-залежне виведення з клітини цитозольного Са2+. У зв’язку з цим його амплітуда мала би прямо залежати від [Сa2+]і і обернено – від [Сa2+]е при тестованому потенціалі. Встановлена ж залежність задовільно описується рівнянням Хілла. Це можна пояснити, виходячи з твердження, що за тривалого фіксування мембранного потенціалу внаслідок функціонування Na+–Ca+-обмінника встановлюється термодинамічна рівновага між ДмNa і ДмСa. Якщо припустити, що в умовах поза- і внутрішньоклітинної перфузії ДмNa є досить стабільною величиною, то внаслідок збільшення [Сa2+]е збільшиться і [Сa2+]і. Тому встановлена залежність вхідного струму Na+–Ca2+-обміну від [Сa2+]е відображає, по суті, його залежність від [Сa2+]і. Високе значення коефіцієнта n зумовлене, на нашу думку, не стільки здатністю обмінника одночасно транспортувати велику кількість катіонів Са2+, скільки його активацією цими іонами.

Са2+-помпа плазматичної мембрани та ендоплазматичного ретикулуму. Ще однією транспортувальною системою, що забезпечує виведення Са2+ з цитозолю чи не всіх клітин, є Са2+-помпи плазматичної мембрани і ендоплазматичного ретикулуму. Тому наші зусилля були спрямовані на підтвердження наявності Са2+-помпи у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна, використовуючи метод визначення Са2+, Mg2+-АТФазної активності.

Рівень Рн у середовищі, яке містило 0,1 ммоль/л Са2+ і 5 ммоль/л АТФ, після 30 хв інкубації фракції клітинних мембран збільшився і становив 12,46 0,11 мкмоль / мг білка. Під впливом строфантину К він зменшувався на 19,98 1,17 % (P < 0,001, n = 16), що свідчить про наявність Nа+, К+-АТФази у плазматичній мембрані клітин слинної залози. Додавання до безкальцієвого середовища інкубації ЕГТА (0,65 ммоль/л) на фоні строфантину К призводило до блокування і Са2+-помп. Розрахована Са2+, Мg2+-АТФазна активність становила 15,94 0,13 мкмоль Рн / мг білка за 30 хв (22,88 0,56 % від загальної АТФазної активності).

Залежність Са2+, Мg2+-АТФазної активності фракції клітинних мембран досліджуваних залоз від [Са2+] у середовищі має куполоподібний характер з максимумом за наявності у середовищі 0,1 ммоль/л Са2+. Така ж закономірність характерна і для інших Са2+, Mg2+-АТФаз, зокрема плазматичної мембрани еритроцитів людини (Sarkadi, 1980), міометрію корів (Костерин, 1990) та міокарда морських свинок (Курский, Костерин, Воробец, 1987), а також саркоплазматичного ретикулуму скелетних м’язів (Болдырев, 1977).

Еозин Y (10 мкмоль/л) повністю пригнічував Са2+, Мg2+-АТФазну активність фракції клітинних мембран слинних залоз (P < 0,001, n = 6). Са2+, Mg2+-АТФазна активність під впливом бутилгідроксихінону (25 мкмоль/л) зменшувалася на 68,62 9,26 % (P < 0,05, n = 6), а під впливом окситоцину (100 мкмоль/л) – на 65,74 13,50 % (але P = 0,079, n = 5).

Під впливом еозину Y у концентраціях 1-5 мкмоль/л вміст Са2+ у тканині інтактних слинних залоз суттєво збільшився (рис. 7), що є підтвердженням наявності у плазматичній мембрані досліджуваних клітин Са2+-помпи. Причому, це збільшення задовільно описується рівнянням Хілла з коефіцієнтом n = 1. Це, на нашу думку, – надзвичайно цікавий факт, оскільки засвідчує, що еозин Y у заданих концентраціях діє лише на одну Са2+-транспортувальну систему.

Ефект еозину Y у концентрації 10 мкмоль/л (рис. 7), навпаки, є наслідком дії еозину Y не лише на Са2+-помпу плазматичної мембрани, але і Са2+-помпу внутрішньоклітинних депо. Пригнічення цієї Са2+-транспортувальної системи призводить до зменшення акумуляції Са2+, відповідно його вміст у тканині зменшується. Оскільки при цьому пригнічене функціонування і Са2+-помпи плазматичної мембрани, вказане зменшення є відносне.

Внаслідок дії еозину Y у концентрації 20 мкмоль/л на залози, оброблені сапоніном з метою пермеабілізації плазматичної мембрани, вміст Са2+ у їхній тканині зменшився відносно контролю на 20,27 ± 6,92 % (Р < 0,05, n = 17). Тапсигаргін у концентрації 1 мкмоль/л теж зменшував вміст Са2+ у тканині залоз на 40,61 ± 9,91 % (Р < 0,05, n = 7). Це є прямим підтвердженням функціонування у внутрішньоклітинних мембранах досліджуваних секреторних клітин Са2+-помпи.

Внутрішньоклітинні канали вивільнення Са2+. Вміст Са2+ у тканині оброблених сапоніном залоз внаслідок додавання до середовища інкубації IФ3 (10 мкмоль/л) зменшився на 41,14 ± 11,75 % (Р < 0,05, n = 11). За наявності гепарину (500 мкг/мл) вміст Са2+ у тканині під впливом IФ3 не змінювався. Не змінювався він під впливом ІФ3 і за наявності еозину Y (20 мкмоль/л), який, пригнічуючи Са2+-помпу ендоплазматичного ретикулуму, призводить до спустошення внутрішньоклітинного депо Са2+. Отже, у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара, як і в ацинарних клітин підшлункової (Nathanson et al., 1994; Cancela, Van Coppenolle, Galione, Tepikin, 2002), слинних (Lee et al., 1997; Ambudkar, 2000) та шлункових (Дубицький, 2006) залоз вищих тварин, наявні ІФ3-чутливі Са2+-канали.

В ході ідентифікації ріанодинчутливих Са2+-каналів ми з’ясували, що зміни вмісту Са2+ у тканині інтактних слинних залоз та їхня секреторна активність внаслідок додавання до базового розчину кофеїну у концентраціях 1-15 ммоль/л мають складний характер. Спочатку спостерігалося збільшення вмісту Са2+ у тканині та секреції загального білка, яке виявилося найсуттєвішим під впливом кофеїну у концентрації 4 ммоль/л. За вищих концентрацій кофеїну спостерігалося відносне зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз.

У присутності бутилгідроксихінону (25 мкмоль/л) і еозину Y (10 мкмоль/л) кофеїн в концентрації 4 ммоль/л спричиняв не збільшення, а зменшення вмісту Са2+ в тканині залоз відповідно на 31,66 ± 4,32 і 62,24 ± 4,51 % (P < 0,001, n = 7). Тому ми вважаємо, що збільшення вмісту Са2+ в тканині залоз під впливом низьких концентрацій кофеїну спричинене або пригніченням Са2+-помпи плазматичної мембрани, або стимуляцією Са2+-помпи ендоплазматичного ретикулуму. Під впливом кофеїну у концентрації 10 ммоль/л зменшення вмісту Са2+ у тканині інтактних залоз виявилося значно суттєвішим на фоні еозину Y і бутилгідроксихінону, ніж у контролі. Отже, кофеїн у високих концентраціях дійсно сприяє вивільненню Са2+ з внутрішньоклітинних депо досліджуваних клітин, інкубованих у базових умовах.

Під впливом ріанодину у концентрації 5 нмоль/л вміст Са2+ у тканині слинних залоз, оброблених сапоніном, зменшився на 35,18 ± 3,87 % (Р < 0,001, n = 13), а у концентрації 500 нмоль/л – збільшився на 40,72 ± 12,52 % (Р < 0,05, n = 7). Зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз під впливом ріанодину у низькій концентрації зумовлене, власне, активацією ріанодинчутлих Са2+-каналів і переконливо свідчать про їхню наявність. Мабуть, частина цих каналів при інкубації у контрольному розчині знаходиться у активному стані, оскільки ріанодин у вищій концентрації, спричинив збільшення вмісту Са2+ у тканині.

Отже, у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна, як і в секреторних клітинах екзокринних залоз вищих тварин (Lee et al., 1997; Di Julio et al., 1997; Zhang et al., 1997; Fitzsimmons et al., 2000; Федірко, 2006) наявні й ріанодинчутливі Са2+-канали, які досить ефективно блокуються ріанодином у субмікромолярних концентраціях.

Са2+-уніпортер мітохондрій. Рутеній червоний (10 мкмоль/л) зменшував вміст Са2+ у тканині інтактних залоз на 28,95 ± 6,70 %. Проте за наявності у середовищі еозину Y (5, 10 і 20 мкмоль/л) рутеній червоний практично не змінював вмісту Са2+ у тканині інтактних залоз. З’ясувалося також, що під впливом рутенію червоного за наявності у середовищі інкубації еозину Y (20 мкмоль/л) вміст Са2+ у тканині слинних залоз, оброблених розчином сапоніну, зменшився на 26,98 ± 9,00 % (P < 0,05, n = 7). Швидше за все, це зменшення воно зумовлене впливом рутенію червоного на акумуляцію Са2+ мітохондріями.

Пуринові рецептори. Внаслідок додавання у середовище з фізіологічною [Са2+] АТФ у концентраціях 0,1, 1 і 2 ммоль/л вміст Са2+ у тканині залоз статистично достовірно не змінювався (рис. 8). Лише за дії АТФ у концентрації 0,01 ммоль/л спостерігалося незначне (на 16,33 ± 6,24 %) зменшення вмісту Са2+. Таке ж зменшення збереглося і за підвищеної до 10 ммоль/л [Са2+]e – на 12,93 ± 4,74 %. За дії АТФ у вищих концентраціях зміни вмісту Са2+ у тканині залоз, інкубованих у середовищі з підвищеною [Са2+], також не змінювалися відносно контролю. Ми припускаємо, що індуковане АТФ у низькій концентрації зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз в обох випадках може бути зумовлене його вивільненням з депо внаслідок активації Р2Y-рецепторів. Вивільнений у цитозоль Са2+ виводиться системами активного транспортування у позаклітинне середовище, тому його сумарний вміст у тканині зменшується. За вищих концентрацій АТФ активує, очевидно, P2X-рецептори, що спричиняє збільшення надходження Са2+ у клітину з позаклітинного середовища. Це і нівелює зменшення Са2+ у тканині залоз, спричинене активацією P2Y-рецепторів.

Зовсім інша картина спостерігалася за інкубування залоз у номінально безкальцієвому середовищі. За цих умов АТФ у всіх зазначених концентраціях спричиняв зниження вмісту Са2+ у тканині залоз (рис. 8). Причому, за 0,01 ммоль/л АТФ у середовищі інкубування нормалізоване зменшення вмісту Са2+ у тканині виявилося більшим, ніж за наявності у середовищі фізіологічної і підвищеної [Са2+], і становило 29,31 ± 7,30 %. Але найпомітніше зниження було під впливом АТФ у концентрації 1 ммоль/л – на 57,93 ± 12,35 %. АТФ-стимульоване зменшення вмісту Са2+ у тканині за його відсутності у середовищі переконливо свідчить про наявність у досліджуваних клітинах P2Y-рецепторів.

Внаслідок додавання до ЕГТА-вмісного безкальцієвого середовища АДФ у тих же концентраціях, що й АТФ, ми спостерігали зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз. Більше того, спорідненість P2Y-рецепторів досліджуваних клітин до АДФ, як і в епітеліальних клітинах (Yang, 2000), є більшою, ніж до АТФ.

Ще одним підтвердженням наявності у досліджуваних клітинах Р2Y-рецепторів є те, що вміст мембранозв’язаного Са2+ після інкубування у номінально безкальцієвому розчині зменшився під впливом АТФ (0,1 ммоль/л) на 19,6 % (Р = 0,018, n = 5).

Отже, зменшення вмісту Са2+ як у тканині залоз, так і мембранозв’язаного зумовлене вивільненням його з ІФ3-чутливого депо внаслідок активації Р2Y-рецепторів. Відсутність змін вмісту Са2+ у тканині залоз у відповідь на дію АТФ у високих концентраціях за наявності Са2+ у середовищі може бути спричинене одночасною активацію P2Y- та Р2X-рецепторів. Тому, на нашу думку, АТФ може виконувати функцію первинного посередника у досліджуваних клітинах.

2. Характеристика Na+–Ca2+-обміну через плазматичну мембрану секреторних клітин слинних залоз комара-дергуна

Специфічність обмінника до одноваленитних катіонів. Внаслідок еквімолярної заміни Na+ катіонами Cs+, NH4+ або K+ відбувається збільшення амплітуди вхідного струму відносно струму Na+–Ca2+-обміну на 69,94 ± 4,03 (P = 0,0003, n = 10), 60,83 ± 15,11 (P = 0,042, n = 7) і 50,60 ± 8,75 (P = 0,031, n = 6) % відповідно. А внаслідок заміни Na+ у позаклітинному середовищі на OHNH3+, Li+ та NH2NH3+ амплітуда вхідного струму зменшувалася на 33,02 ± 5,52 (P = 0,003, n = 6), 41,52 ± 4,50 (P = 0,0009, n = 9) і 64,52 ± 1,71 (P = 0,0002, n = 6) % відповідно. Таким чином, одновалентні катіони за здатністю замінювати Na+ у Me+-залежному виведенні Ca2+ з цитозолю секреторних клітин слинних залоз комара-дергуна утворюють такий ряд:

Cs+ ? NH4+ ? K+ > Na+ > OHNH3+ ? Li+ > NH2NH3+,

де співвідношення між амплітудами вхідних струмів, що супроводжують функціонування Cs+–Ca2+- та Li+–Ca2+-обмінів, становить 2,91.

Отриманий нами ряд дозволяє зробити кілька висновків. По-перше, Na+–Ca2+-обмінник плазматичної мембрани досліджуваних клітин не належить до родини NCKX. Це випливає з того, що вхідний струм Me+–Ca2+-обміну (відображає фізіологічний режим функціонування обмінника) реєструється без наявності катіонів K+ у внутрішньоклітинному середовищі. Крім того, додавання катіонів К+ до позаклітинного середовища супроводжується збільшенням, а не зменшенням амплітуди вхідного струму. І, нарешті, ряд, що описує здатність одновалентних катіонів активувати K+-залежний Na+–Ca2+-обмін секреторних клітин (Lee et al., 2007), суттєво відрізняється від отриманого нами ряду. По-друге, за здатністю транспортувати катіони Li+ досліджуваний нами Na+–Ca2+-обмінник є близьким до описаної недавно родини NCLX (Palty et al., 2004).

Спорідненість обмінника до двовалентних катіонів. При еквімолярній заміні Са2+ у позаклітинному середовищі на Sr2+ і Ва2+ у відповідь на гіперполяризацію мембрани реєструється вхідний струм, за кінетикою досить близький до вхідного струму Na+–Ca2+-обміну. Тому ми припустили, що катіони Sr2+ і Ва2+ можуть транспортуватися Na+–Ca2+-обмінником і, відповідно, ці струми відображають Na+–Sr2+- чи Na+–Ва2+-обмін через плазматичну мембрану.

За частоти гіперполяризувальних імпульсів 0,1 Гц амплітуда струму Na+–Sr2+-обміну виявилася більшою від амплітуди струму Na+–Са2+-обміну у 1,05 ± 0,01 раз (P < 0,01, n = 6). Амплітуда струму Na+–Ва2+-обміну теж була більшою від амплітуди струму Na+–Са2+-обміну у 1,22 ± 0,05 раз (P < 0,01, n = 6). Внаслідок збільшення частоти гіперполяризувальних імпульсів до 0,2 Гц як амплітуда струму Na+–Sr2+-, так і Na+–Ва2+-обміну суттєво зменшилися – на 62,05 ± 2,89 і 59,34 ± 2,65 відповідно. Причому, зменшення струму Na+–Ва2+-обміну виявилася статистично достовірно (P < 0,01, n = 6) суттєвішим, ніж аналогічне зменшення амплітуди струму Na+–Са2+-обміну, яке у цій серії дослідів становило 49,24 ± 1,77 %.

У ході порівняння параметрів рівняння Хілла, розрахованих для залежності амплітуди вхідних струмів Na+–Me2+-обмінів від [Me2+]e (рис. 9), напрошуються досить цікаві висновки. Перш за все, розраховане значення Іmax зростає в послідовності Ca2+ > Sr2+ > Ba2+. А значення коефіцієнта n і K0,5, навпаки, у названій послідовності суттєво зменшуються. Оскільки здатність до комплексоутворення у названій послідовності теж зменшується (Доссон и др., 1990), то зменшення коефіцієнта n, на нашу думку, зумовлене порушенням процесів каталітичної активації обмінника. Про здатність Ва2+ і Sr2+ замінювати Са2+ у каталітичній активації обмінника у літературі даних практично немає. Відомо лише, що катіони Ва2+ здатні каталітично активувати Na+–Ca2+-обмінник кардіоміоцитів (NCX1), але менш ефективно (KD ~10 мкмоль/л), ніж Са2+ (KD ~0,3 мкмоль/л; Trac et al., 1997). Про інші родини Na+–Сa2+-обмінників відомо лише те, що NCLX не каталізує, на відміну від NCX-білків, Na+–Ba2+-обмін навіть у зворотному режимі, чим він є