НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

_______________________________________________________________

НЕСІН ОЛЕНА МИКОЛАЇВНА

УДК [615.849.11 + 615.212]: 616.8 – 009.7

ВПЛИВ НИЗЬКОІНТЕНСИВНИХ ЕЛЕКТРОМАГНІТНИХ

ПОЛІВ МІКРОХВИЛЬОВОГО ДІАПАЗОНУ

НА ФАРМАКОЛОГІЧНУ АНАЛГЕЗІЮ У МИШЕЙ

03.00.13 – Фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізіології стовбуру мозку

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: | доктор біологічних наук,

професор

Лиманський Юрій Петрович,

завідуючий відділом фізіології стовбуру мозку

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук,

професор

Сторожук Віктор Максимович,

завідуючий відділом фізіології головного мозку

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

кандидат біологічних наук

Мартинюк Віктор Семенович,

доцент кафедри біофізики Київського національного університету ім. Т.Г. Шевченка

Захист відбудеться 5 лютого 2008 р. о 14 00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д – 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4

Автореферат розісланий 5 січня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна ? Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розробка засобів лікування больових синдромів залишається одною з найактуальніших задач сучасної медицини. Постійне зростання кількості відповідних фармакологічних препаратів не вирішує дану проблему, а часто лише призводить до невиправданого їх вживання, що супроводжується небезпечними медикаментозними ускладненнями. Тому останнім часом все інтенсивнішим стає пошук альтернативних методів знеболення. Одним із альтернативних підходів для лікування болю є використання низькоінтенсивних електромагнітних полів (ЕМП) мікрохвильового діапазону.

Визначення впливів радіохвиль надзвичайно високочастотного діапазону (міліметрових хвиль, мікрохвиль) на живі організми було одним із численних досягнень ХХ сторіччя в області біофізики, фізіології та медицини. Була виявлена надзвичайна ефективність дії випромінювання мікрохвильового діапазону, в першу чергу, на процеси регуляції та підтримання гомеостазу (Девятков, 1973; Webb, 1979; Grundler et al., 1983). Однією з особливостей дії зовнішніх ЕМП мікрохвильового діапазону на біологічні об’єкти є багаторівневий характер впливу на всі рівні біологічної організації організму, починаючи з субмолекулярного. Унікальність впливу даного виду випромінювання полягає в можливості його резонансної взаємодії з ендогенним ЕМП біологічного об’єкта (Девятков и др., 1991; Grundler et al., 1992). Це стало об'єктивною передумовою для розробки методів використання мікрохвиль з метою спрямованої корекції відхилень параметрів гомеостазу організму, обумовлених патологічними станами.

Відсутність небажаних безпосередніх ефектів в разі низькоінтенсивного мікрохвильового опромінення (термогенезу та іонізації), неінвазивність впливу, відсутність побічних реакцій та висока терапевтична ефективність лікування широкого спектра захворювань (Киричук, 2007) забезпечують високий інтерес до даного напрямку як в практичній медицині, так і в царині експериментальних досліджень. Біологічна ефективність мікрохвильового опромінення істотно залежить від локалізації впливу. Найкращого ефекту можна досягти, прикладаючи його прямо на уражені тканини, на шкірні проекції уражених органів (Ефимов и др., 2004), або на рефлексогенні зони, зокрема, точки акупунктури (ТА) (Ситько и др., 2001; Teppone et al., 1996).

Результати експериментів на тваринах (Лиманський та ін., 1999; Гура и др., 2002; Тамарова та ін., 2005; Radzievsky et al., 2000), а також результати лікування пацієнтів з хронічними больовими синдромами (Usichenko et al., 2003) показали, що вплив мікрохвиль низької інтенсивності на ТА звичайно призводить до послаблення, а в деяких випадках навіть до повного пригнічення болю. Проте, монотерапія мікрохвилями не забезпечує значного ефекту при інтенсивних больових синдромах; в цих випадках потрібним стає використання аналгетиків (зокрема опіоїдних) у досить високих дозах. Для посилення знеболювального ефекту фармакологічних препаратів та зменшення їх побічних дій сьогодні інтенсивно досліджується можливість комбінованого застосування деяких аналгетиків (наприклад, таких розповсюджених, як аналгін і трамадол), у знижених дозах. Такий спосіб їх прийому показав позитивні результати в експериментах на тваринах та в клініці (Poveda et al., 2003; Stamer et al., 2003). Найбільш помітний аналгетичний ефект було отримано при використанні техніки акупунктури в поєднанні з уведенням фармакологічних препаратів (Vas et al., 2004; Zhang et al., 2004). Слід, проте, визнати, що класична акупунктура досить травматична для пацієнта та створює ризик внесення інфекції. Тому на сьогоднішній день розробка нових методів комбінованого застосування фармакологічних аналгетиків та неінвазивного впливу на ТА для зменшення больових синдромів є одним з актуальних напрямків в фізіології та фармакології болю. Подібний неінвазивний вплив може бути забезпечений, зокрема, мікрохвильовим опроміненням ТА.

Зважаючи на досвід ізольованого використання мікрохвиль з метою створення аналгезії та сумісного застосування акупунктури та фармакологічних засобів для пригнічення болю, ми вважали доцільним дослідити аналгетичну ефективність комбінованого впливу мікрохвиль, прикладених на протибольову ТА, та фармакологічних аналгетиків в експериментах на тваринах.

Зв’язок із науковою тематикою організації. Дисертаційну роботу було виконано як частину плану науково-дослідної тематики № 0103U003286 “Дослідження аналгетичної дії низькоінтенсивних електромагнітних полів мікрохвильового та оптичного діапазонів на вісцеральний біль” в рамках наукових програм відділу фізіології стовбуру мозку Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України на 2003–2005 рр.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було визначення характеристик аналгетичних ефектів ізольованого застосування фармакологічних аналгетиків (аналгіну, трамадолу), впливу низькоінтенсивних мікрохвиль на протибольову ТА, а також комбінованого застосування обох заданих факторів в умовах експериментальної індукції соматичного та вісцерального болю у мишей.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1. Визначити вплив мікрохвильового опромінення протибольової ТА на розвиток соматичного (формаліновий тест) та вісцерального (ацетатний тест) болю у мишей (згідно з характеристиками поведінкових проявів).

2. Визначити зміни поведінкових проявів тварин в аналогічних умовах після введення аналгіну і трамадолу в різних дозах.

3. Визначити ефекти комбінованого застосування зазначених аналгетиків та низькоінтенсивних мікрохвиль в умовах індукції соматичного та вісцерального болю у мишей.

4. Виявити зміни поведінкових проявів тварин після ізольованого та комбінованого застосування фармакологічних аналгетиків та низькоінтенсивних мікрохвиль на фоні блокади опіоїдних рецепторів та в умовах пригнічення синтезу серотоніну.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертаційній роботі в експериментах на тваринах запропонований новий підхід для лікування больових синдромів. Шляхом дослідження зміни поведінкових проявів у мишей вивчені ефекти ізольованого та комбінованого застосування фармакологічних аналгетиків та мікрохвильового опромінення протибольової ТА в умовах експериментальної індукції соматичного та вісцерального болю.

В роботі визначено, що опромінення протибольової ТА Е–36 мікрохвилями низької інтенсивності призводило до істотного пригнічення експериментально викликаного соматичного та вісцерального болю у мишей. Вперше було проведено порівняння антиноцицептивного ефекту після ізольованого застосування фармакологічних аналгетиків (аналгіну або трамадолу) та комбінованого їх застосування з мікрохвильовим опроміненням ТА Е–36 в умовах експериментальної індукції болю у мишей.

Автором вперше показано, що комбіноване застосування половинних середніх доз аналгетиків та мікрохвильового опромінення протибольової ТА створювало знеболювальні ефекти, які близькі до таких ефектів після ізольованого застосування повних середніх разових доз даних препаратів, або навіть перевищують їх.

Виявлено, що в умовах індукції соматичного та вісцерального болю у мишей, пригнічення функції опіоїдної та серотонінергічної мозкових систем призводило до послаблення знеболювальних ефектів, викликаних мікрохвильовим опроміненням ТА Е–36, застосованим окремо та сумісно з половинною середньою дозою кожного з вказаних аналгетиків. Це може свідчити про активну участь антиноцицептивних систем в реалізації зазначених ефектів.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментальні дані показали, що в порівнянні з ізольованим, комбіноване застосування фармакологічних аналгетиків опіоїдного та неопіоїдного ряду та мікрохвильового опромінення протибольової ТА, призводить до посилення знеболювального ефекту.

Отримані результати дослідження дозволяють зробити висновок, що застосування низькоінтенсивних мікрохвиль дає можливість істотно знизити дози фармакологічних аналгетиків без втрати протибольового ефекту та обмежити при цьому негативний вплив фармакологічної аналгезії. Результати дослідження можуть бути рекомендовані для використання з метою зменшення больових синдромів у клініці шляхом часткової заміни фармакологічних аналгетиків впливом низькоінтенсивних мікрохвиль на протибольові ТА.

Особистий внесок здобувача. Здобувачка опанувала методики формалінового та ацетатного тестів для експериментальної індукції соматичного та вісцерального болю, самостійно проводила експерименти та обробку експериментального матеріалу. Виконано огляд літератури за темою дослідження. Автор самостійно проводив статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів дослідження. Друковані праці були особисто підготовлені автором при обговоренні з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були представлені та обговорені на наступних наукових зборах: IBRO Advanced School of Neuroscience “Receptors, Channels, Messengers” (вересень 2004, м. Ялта); І Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (квітень 2005, м. Львів); ІІІ Міжнародній конференції українського товариства нейронаук (травень 2005, м. Донецьк); 11th World Congress of Pain (серпень 2005, Сідней, Австралія); ІІ Науково – практичній конференції молодих вчених та спеціалістів: “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (грудень 2005, м. Київ); 17-му з’їзді фізіологів Українського фізіологічного товариства (травень 2006, м. Чернівці); International Workshop “The study of nociception from periphery to brain stem”, (червень 2006, м. Київ); Міжнародній науковій конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем” (листопад 2006, м. Львів); V Международном симпозиуме “Актуальные проблемы биофизической медицины” (травень 2007, м. Київ); Конференції для молодих вчених “Mechanisms of intracellular signaling” (грудень 2007, м. Київ), семінарі сектору нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Публікації. За результатами роботи опубліковано чотири статті та шість тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з переліку умовних скорочень, вступу, огляду літератури, розділу методів досліджень, розділу результатів досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків та списку використаних джерел. Робота викладена на 107 сторінках (без списку літератури), містить 16 таблиць та ілюстрована 43 рисунками. Список використаної літератури включає 210 посилань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Експерименти проведені на білих нелінійних мишах–самцях масою 24–32 г. Тварини для дослідження відбирались випадковим способом, експериментальні групи складали по 10–20 тварин в кожній. Всього в роботі було використано 560 тварин. Евтаназія тварин проводилась шляхом внутрішньоочеревинного (в/оч.) введення уретану у летальній дозі одразу після експерименту.

Індукція больового синдрому. Тонічний соматичний біль індукували в умовах формалінового тесту (ФТ), для чого тваринам вводили 25 мкл 5%-го розчину формаліну під шкіру дорсальної поверхні стопи лівої задньої кінцівки (Saddi,. 2000). Вісцеральний біль викликали подразненням черевної порожнини в/оч. введенням 80 мкл 2%-го розчину оцтової кислоти (ацетатний тест, АцТ) (Ness, 1999).

Дослідження аналгетичних ефектів в умовах експериментального болю. Мікрохвильове опромінення протибольової ТА Е–36, або ділянки шкіри внутрішньої поверхні стегна, поза межами локалізації ТА, проводили в спеціальній камері протягом 10 хв одразу після ФТ або АцТ. Тварини контрольних груп після ФТ або АцТ утрималися 10 хв в камері без опромінення. Найважливіша точка в практиці акупунктури ТА Е–36 розташована у миші в області колінного суглобу латерально та нижче надколінника. ЇЇ стимуляція викликає послаблення болю в нижній половині тіла, а також забезпечує виражену загальнозміцнюючу дію. Опромінення ТА Е–36 проводили за допомогою приладу “ІХТ–Поріг” (“Біополіс”, Україна). Спектр випромінювання даного приладу має характер шуму в діапазоні 30 – 300 ГГц з амплітудною модуляцією низькочастотними сигналами в межах 0,1 – 100 Гц; щільність потоку потужності ? 3·10 – 9 Вт/см2.

В дослідженні використовували два фармакологічних аналгетика, які широко застосовуються в клініці ? аналгін (метамізол натрію, “Дарниця”, Україна) і трамадолу гідрохлорид (“POLPHARMA” S.A., Польща). Використовували 50%-й розчин аналгіну (500 мг метамізолу натрію в 1 мл) та 5%-й розчин трамадолу (50 мг трамадолу гідрохлориду в 1 мл). Дози аналгетичних препаратів були розраховані згідно із середніми разовими дозами для людини, які рекомендовані в довіднику “Фарминдекс”. Для людини масою 60 кг середня разова доза аналгіну становить 500 мг (8.3 мг/кг), а трамадолу – 50 мг (0.83 мг/кг). В нашому дослідженні були використані саме такі середні разові дози кожного з препаратів (далі – повні дози), а також половини середніх разових доз, які для аналгіну і трамадолу відповідно складали 4.2 мг/кг та 0.42 мг/кг (далі ? половинні дози). Аналгетики вводили тваринам в/оч. за 20 хв до ФТ та внутрішньом’язово (в/м.) за 20 хв до АцТ.

Роль антиноцицептивних систем мозку в мікрохвильовій та фармакологічній аналгезії. Щоб оцінити роль опіоїдної системи в розвитку мікрохвильової та фармакологічної аналгезії, були проведені експерименти з блокуванням опіоїдних рецепторів їх антагоністом налоксоном (Sigma, США). У зв’язку з тим, що налоксон швидко всмоктується та має відносно короткий період напіврозпаду (Berkowitz, 1976), його вводили тваринам в дозі 1.5 мг/кг в/оч. за 25 хв до ФТ та в дозі 5 мг/кг в/м. за 25 хв до АцТ.

Для визначення участі серотонінергічної системи в ефектах мікрохвиль та аналгетиків використовували пригнічення синтезу серотоніну його селективним інгібітором DL–парахлорфенілаланіном (ПХФА, Sigma, США). ПХФА вводили тваринам в дозі 300 мг/кг в/оч. (Annerbrink et al., 2003; Munoz?Castaneda et al., 2006) за 72 год до ФТ та в/оч. за 48 год до АцТ (з метою запобігання ускладнень після АцТ). Показано, що ПХФА (300 мг/кг) викликає через 72 год після ін’єкції сильне падіння рівня серотоніну в структурах стовбуру мозку щурів (Jackson, 1982).

Реєстрація поведінкових проявів та статистична обробка даних. Після проведення всіх маніпуляцій реєстрували поведінкові феномени у тварин протягом 60 хв. В умовах соматичного болю вимірювали тривалість больової поведінкової реакції (БПР) – вилизування ураженої кінцівки, а також тривалість небольових поведінкових феноменів – сну, прийняття їжі, локомоції та грумінгу. В умовах вісцерального болю у мишей БПР проявлялись у вигляді характерних торсійних реакцій (корч) ? бокових згинань тулуба, витягування тулуба з розгинанням задніх кінцівок, тертя животом по підлозі, а також вилизуванням живота. Окрім БПР реєстрували тривалість епізодів розслабленого стану тварин, який наступав після проявів болю, а також тривалість локомоції. Для реєстрації поведінкових феноменів використовували спеціальну комп’ютерну програму “Lady Pain”, яка була розроблена у відділі фізіології стовбуру мозку Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Ця програма дозволяє підраховувати тривалість епізодів різних поведінкових феноменів у межах заданих послідовних часових інтервалів (мінімальний інтервал – 1 хвилина) та в межах всього періоду спостереження. Результати представляли у вигляді графіків динаміки поведінкових проявів та інтегральних діаграм тривалості поведінкових проявів за весь період реєстрації (60 хв). Обробка отриманих даних проводилась шляхом порівняння показників кожної експериментальної групи з контрольними, а також шляхом порівняння показників двох груп, які відрізнялись між собою тільки одним фактором впливу. Наприклад, характеристики БПР у тварин після в/оч. введення 0.9%-го розчину NaCl та 2%-го розчину оцтової кислоти (контрольна група та АцТ) представлені у вигляді графіку динаміки інтенсивності больового процесу та сумарної діаграми тривалості реакції за весь період спостереження (рис. 1 А, Б).

А Б

Рис. 1. А – динаміка тривалості БПР, виміряної в межах послідовних 10 хвилинних інтервалів; Б – сумарна тривалість БПР за весь період реєстрації (60 хв).

Результати оброблялись статистично з розрахунком середньогрупових значень для кожного поведінкового прояву. Після перевірки відповідності розподілів цих значень у межах груп нормальному закону оцінювали вірогідність міжгрупових різниць за допомогою t–критерію Ст’юдента, критерію Даннета (критерій Ст’юдента для множинного порівняння з контрольною групою) та F–критерію Фішера (однофакторний дисперсійний аналіз, ANOVA). Для аналізу зв’язку між двома змінними (в нашому випадку – між двома поведінковими феноменами в одній групі) застосовували кореляційний аналіз. Обчислювали коефіцієнт кореляції Пірсона (r), а також визначали статистичну значущість кореляції (Гланц, 1999).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Антиноцицептивні ефекти після мікрохвильового опромінення та введення аналгетиків в умовах індукції експериментального болю у мишей. Було показано, що при розвитку соматичного болю після мікрохвильового опромінення протягом 10 хв ділянки шкіри мишей, в котрій відсутні ТА (внутрішньої поверхні стегна в паховій області) тривалість БПР була навіть дещо вищою, ніж у контрольній групі тварин. На відміну від цього, опромінення протибольової ТА Е–36 призводило до зниження сумарної тривалості БПР у тварин в середньому на 24.2% (р<0.05) в порівнянні з такою в контрольній групі та на 39% (р<0.05) в порівнянні з тривалістю БПР у тварин, яким опромінювали зону шкіри без наявності ТА (рис. 2 А).

А Б

Рис. 2. Динаміка тривалості БПР, виміряної в межах послідовних 10 хвилинних інтервалів у тварин в умовах соматичного (А) та вісцерального (Б) болю:

1 – контрольна група (ФТ, АцТ);

2 – мікрохвильове опромінення ділянки шкіри, яка не містить ТА (МХ К);

3 – мікрохвильове опромінення ТА Е–36 (МХ ТА).

В умовах вісцерального болю після мікрохвильового опромінення ТА Е–36, сумарна тривалість епізодів БПР зменшувалась в середньому на 36% (p<0.001) в порівнянні з таким показником у тварин контрольної групи. (рис. 2 Б). Динаміка інтенсивності БПР у тварин з мікрохвильовим опроміненням ТА відрізнялась від тривалості такої реакції в контрольній групі тварин з АцТ меншими значеннями як на початку, так і протягом всього періоду спостереження.

В ході дослідження був охарактеризований ефект пригнічення БПР в умовах соматичного та вісцерального болю за допомогою ізольованих ін’єкцій фармакологічних аналгетиків (аналгіну і трамадолу). Введення аналгіну в умовах соматичного болю забезпечувало дозозалежний знеболювальний ефект у тварин: повна доза (8.3 мг/кг) забезпечувала зниження тривалості БПР на 56.2 % (p<0.001), а половинна доза (4.2 мг/кг) – на 29.6% (p<0.01) (рис. 3).

А Б

Рис. 3. Динаміка тривалості БПР, виміряної в межах послідовних 10 хвилинних інтервалів (А) та сумарна тривалість БПР за 60 хв реєстрації (Б) у тварин в умовах соматичного болю:

** – (p<0.01); *** – (p<0.001);

МХ ТА ? мікрохвильове опромінення ТА Е–36;

1. Контрольна група 3. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну;

2. Ін’єкція 8.3 мг/кг аналгіну; 4. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну +МХ ТА;

Комбіноване застосування ін’єкції половинної дози аналгіну та мікрохвильового опромінення ТА Е–36 призводило до зниження сумарної тривалості БПР на 46.3 % (p<0.001) в порівнянні з контрольними значеннями та на 23.7% в порівнянні зі значеннями у групі тварин, яким вводили аналгін в тій же дозі без додаткового опромінення мікрохвилями ТА (p<0.05) (рис. 3).

Отже, у тварин з комбінованим впливом мікрохвильового опромінення ТА та ін’єкції половинної (4.2 мг/кг) дози аналгіну в умовах індукції соматичного болю динаміка БПР була досить близькою до такої в групі тварин з ізольованою ін’єкцією повної дози (8.3 мг/кг) аналгіну.

Введення аналгіну в умовах вісцерального болю теж забезпечувало дозозалежний знеболювальний ефект: повна доза аналгіну (8.3 мг/кг) знижувала тривалість БПР на 44.2% (p<0.001), а половинна доза (4.2 мг/кг) – на 26% (p<0.05) в порівнянні з показниками у контрольній групі. При поєднанні половинної дози аналгіну з мікрохвильовим опроміненням ТА Е–36 тривалість торсійних корч у тварин була менше на 71.3% (p<0.001) в порівнянні з контролем, на 61.2% менше (p<0.001) в порівнянні з ефектом окремого застосування такої дози, та на 51.5% менше (p<0.05) в порівнянні з результатом ізольованого застосування вдвічі більшої (повної) дози препарату (рис. 4).

А Б

Рис. 4. Динаміка тривалості БПР, виміряної в межах послідовних 10 хвилинних інтервалів (А) та сумарна тривалість БПР за 60 хв реєстрації (Б) у тварин в умовах вісцерального болю:

* – (p<0.05); *** – (p<0.001);

МХ ТА ? мікрохвильове опромінення ТА Е–36;

1. Контрольна група 3. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну;

2. Ін’єкція 8.3 мг/кг аналгіну; 4. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну + МХ ТА;

Таким чином, комбіноване застосування половинної (4.2 мг/кг) дози аналгіну разом з мікрохвильовим опроміненням протибольової ТА в умовах індукції вісцерального болю забезпечувало антиноцицептивний ефект, який достовірно перевищував за своєю інтенсивністю ефект ізольованого застосування половинної (4.2 мг/кг) та повної (8.3 мг/кг) середніх доз вказаного препарату.

Синтетичний опіоїд трамадол, введений в повній середній разовій дозі (0.83 мг/кг) та в половинній дозі (0.42 мг/кг) тваринам з осередком соматичного болю, знижував тривалість БПР в середньому на 44.7% та на 46.7% відповідно в порівнянні з контролем (p<0.001). Комбіноване застосування 0.42 мг/кг трамадолу разом з опроміненням ТА Е–36 мікрохвилями забезпечувало найбільш значне зниження БПР – на 51.7% (p<0.001) в порівнянні з відповідним показником у контрольній групі мишей (рис. 5).

А Б

Рис. 5. Динаміка тривалості БПР, виміряної в межах послідовних 10 хвилинних інтервалів (А) та сумарна тривалість БПР за 60 хв реєстрації (Б) у тварин в умовах соматичного болю:

*** – (p<0.001); МХ ТА ? мікрохвильове опромінення ТА Е–36;

1. Контрольна група 3. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу;

2. Ін’єкція 0.83мг/кг трамадолу; 4. Ін’єкція 0.42мг/кг трамадолу+МХ ТА;

У мишей з осередком вісцерального болю після введення трамадолу в повній (0.83 мг/кг) та в половинній (0.42 мг/кг) дозах тривалість БПР знижувалась на 41.8% та на 40.0% відповідно (p<0.001) в порівнянні з показником контрольної групи. Комбіноване застосування половинної дози трамадолу разом з мікрохвильовим опроміненням ТА Е–36 викликало зниження БПР на 47.0% (p<0.001) в порівнянні з контролем. Проаналізувавши динаміку тривалості БПР в зазначених групах в умовах вісцерального болю слід відзначити, що тривалість БПР в трьох групах тварин (трамадол 0.83 мг/кг; 0.42 мг/кг; 0.42 мг/кг + мікрохвильове опромінення ТА) була значно нижчою від контрольної та ідентичною в межах перших 20–ти хв реєстрації (рис. 6).

А Б

Рис. 6. Динаміка тривалості БПР, виміряної в межах послідовних 10 хвилинних інтервалів (А) та сумарна тривалість БПР за 60 хв реєстрації (Б) у тварин в умовах вісцерального болю:

*** – (p<0.001); МХ ТА ? мікрохвильове опромінення ТА Е–36;

1. Контрольна група 3. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу;

2. Ін’єкція 0.83 мг/кг трамадолу; 4. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу + МХ ТА;

Отже, після комбінованого застосування 0.42 мг/кг трамадолу разом з мікрохвильовим опроміненням протибольової ТА в умовах вісцерального болю, аналгетичний ефект був дещо інтенсивнішим, ніж після ізольованого застосування такої та вдвічі більшої (0.83 мг/кг) дози трамадолу.

Слід зазначити, що в умовах вісцерального болю у разі ізольованого застосування мікрохвильового опромінення та комбінації його з ін’єкцією половинної дози аналгіну (4.2 мг/кг), знеболювальний ефект (згідно з показниками поведінкових феноменів) був більш значним, ніж при аналогічних впливах в умовах соматичного болю. Це узгоджується з даними, отриманими раніше (Гура, 2002; Багацкая, 2005) та може бути пов’язано зі специфікою структури вісцеральної аферентної системи. Відомо, що вісцеральні аференти складають всього 10% всіх аферентів, які надходять до спинного мозку. Щільність іннервації вісцеральних аферентних волокон набагато менша, ніж соматичних, та серед вісцеральних аферентів лише невелика чистина пов’язана з ноцицепторами. При цьому на нейронах спинного мозку існує не тільки вісцеро?соматична, а й вісцеро?вісцеральна конвергенція.

Участь антиноцицептивних систем мозку в аналгезії, викликаній ізольованим та сумісним застосуванням мікрохвильового опромінення ТА та фармакологічних аналгетиків в умовах експериментального болю у мишей.

Опіоїдна система. Функції опіоїдної системи пригнічували за допомогою введення неселективного антагоніста опіоїдних рецепторів налоксону гідрохлориду. Це синтетичне похідне оксіморфона, яке конкурентно зв’язується з опіоїдними рецепторами, перешкоджаючи їх з’єднанню з ендо – та екзогенними опіоїдними агоністами (Berkowitz, 1976).

В умовах індукції соматичного болю налоксон негативно впливав на дію низькоінтенсивних мікрохвиль, зменшуючи їх аналгетичний ефект. Тривалість БПР у тварин з мікрохвильовим опроміненням ТА Е–36 на тлі попереднього введення налоксону становила в середньому 137% (p<0.05), порівняно з тривалістю такої реакції у тварин без введення даного агента (рис. 7 А). Це цілком узгоджується з експериментальними даними, які свідчать про задіяння опіоїдної системи в реалізацію антиноцицептивної дії мікрохвиль (Rojavin et al., 1998; Куликович и др., 1999; Radzievsky et al., 2004), а також з клінічними дослідженнями (Sitko, 1989) про підвищення концентрації опіоїдних пептидів в периферичній крові під час сеансів мікрохвильової терапії. Тобто, можна вважати, що попереднє введення налоксону буде послаблювати антиноцицептивний ефект мікрохвиль, прикладених на протибольову ТА.

А Б

Рис. 7. Вплив налоксону на сумарну тривалість БПР (А) та сну (Б) за 60 хв реєстрації у тварин в умовах соматичного болю:

* – (p<0.05); ** – (p<0.01); *** – (p<0.001); МХ ТА ? мікрохвильове опромінення ТА Е–36;

1. Контрольна група; 4. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну+ МХ ТА;

2. МХ ТА; 5. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу;

3. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну; 6. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу+ МХ ТА;

Але попереднє введення налоксону практично не зменшує знеболювального ефекту аналгетиків, застосованих окремо або разом з мікрохвильовим опроміненням. Очевидно, це пов’язано з особливостями механізмів дії аналгіну і трамадолу. Дія аналгіну пов’язана зі зменшенням активності циклооксигенази (ЦОГ) – ферменту, який регулює біотрансформацію арахідонової кислоти в простагландини, простациклін 12 і тромбоксан А2 (основні медіатори запалення та болю). Гальмування синтезу простагландинів зменшує вивільнення деяких ендогенних субстанцій та ензимів (нейрокінін 1, субстанція Р, протеінкіназа С), які ще більше підвищують локальну концентрацію медіаторів запалення (Siebel et al., 2004). Проте в літературі є дані і про центральну дію аналгіну, а саме активацію низхідних опіоїдних систем больового контролю та гальмування ноцицептивних імпульсів на рівні спинного мозку (Vazquez et al., 2005). Інші автори показують (Beirith et al., 1998), що налоксон не гальмує знеболювальний ефект, викликаний дією аналгіну. Існують навіть такі роботи, де показана можливість антиноцицептивної дії антагоністів опіоїдних рецепторів в умовах ФТ у мишей (Choi et al., 2003). Трамадол має подвійний механізмом центральної дії: з одного боку він зв’язується з ?–опіоїдними рецепторами, а з другого – пригнічує зворотне нейрональне захоплення серотоніну та норадреналіну синапсами (Filip et al., 2004). На фоні пригнічення опіоїдної системи ефект трамадолу може реалізуватися через залучення серотонінергічної системи головного мозку (Oliva et al., 2002).

Але разом з тим, в умовах ФТ у тварин з попереднім введенням налоксону значно зменшувався або повністю усувався такий поведінковий прояв, як сон (рис. 7. Б). Спостерігалось тенденція до пригнічення комфортної поведінки (грумінгу, приймання їжі) та підвищення локомоції в порівнянні з групами тварин без введення налоксону. Це може бути проявом збудженого стану тварин, викликаного дією ушкоджуючого стимулу (ін’єкцією формаліну).

В умовах індукції вісцерального болю налоксон негативно впливав на мікрохвильове опромінення протибольової ТА, та на комбінацію його з половинною дозою аналгіну, що проявлялось в збільшеній тривалості БПР, яка становила відповідно 131% (p<0.05) та 193.5% (p<0.05) порівняно з таким показником у тварин без введення налоксону (рис. 8 А). Тривалість локомоції при цьому достовірно (p<0.05) підвищувалась та становила в контрольній групі 161%, в групі з мікрохвильовим опроміненням ТА Е–36 ? 791% та в групі з комбінацією опромінення ТА мікрохвилями та ін’єкції половинної дози аналгіну ?335% відносно тривалості такого показника в групах мишей, які не отримували налоксон (рис. 8 Б).

А Б

Рис. 8. Вплив налоксону на сумарну тривалість БПР (А) та локомоції (Б) за 60 хв реєстрації у тварин в умовах вісцерального болю:

* – (p<0.05); МХ ТА ? мікрохвильове опромінення ТА Е–36;

1 Контрольна група; 4. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну + МХ ТА;

2 МХ ТА; 5. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу;

3 Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну; 6. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу + МХ ТА;

Таким чином, в умовах вісцерального болю антиноцицептивний ефект мікрохвильового опромінення протибольової ТА та комбінації його з ін’єкцією половинної дози аналгіну може бути реалізований через активацію опіоїдного низхідного шляху ноцицептивного контролю. В літературі є численні дані про гальмування активності спинальних ноцицептивних нейронів аналгіном, введеним як в середину ЦСР, так і внутрішньовенно. Ці ефекти опосередковані активацією ендогенних опіоїдних рецепторів, щільно розташованих безпосередньо в ЦСР, в ретикулярній формації довгастого мозку (основній релейній структурі між ЦСР та спинним мозком), та в спинному мозку (Vazquez et al., 2000; 2005). Значне підвищення локомоції у мишей під впливом налоксону може бути обумовлено активацією дофамінергічної системи, яка відіграє значну роль в моторній активності. Показано, що деякі опіоїдні рецептори знаходяться на дофамінергічних нервових терміналях та можуть бути залучені в опосередковане опіатами вивільнення дофаміну. Налоксон, зв’язуючись з опіоїдними рецепторами може збільшувати вихід дофаміну з терміналей цих нейронів (Feigenbaum et al., 1982).

Серотонінергічна система. Функції серотонінергічної системи пригнічували за допомогою введення селективного інгібітору синтезу серотоніну ПХФА. Відомо, що ПХФА гальмує триптофангідроксилазу – фермент, який перетворює L–триптофан в попередник серотоніну 5–гідрокситриптофан (Tohyama et al., 2002), що призводить до зниження рівня серотоніну в ЦНС. Показано, що після введення тваринам ПХФА навіть в невеликих дозах, зменшувалась кількість серотоніну в стовбурі мозку на 60%, а в цілому мозку – на 80% (Pujol et al., 1971).

В умовах індукції соматичного болю на фоні введення ПХФА відзначалось послаблення аналгетичного ефекту в усіх експериментальних групах, що проявлялось у збільшенні тривалості БПР в порівнянні з тривалістю такої реакції у тварин, яким ПХФА не вводили (p<0.05 – p<0.001) (рис. 9 А).

А Б

Рис. 9. Вплив ПХФА на сумарну тривалість БПР (А) та сну (Б) за 60 хв реєстрації у тварин в умовах соматичного болю:

* – (p<0.05); ** – (p<0.01); *** – (p<0.001);

МХ ТА ? мікрохвильове опромінення ТА Е–36;

1. Контрольна група; 4. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну + МХ ТА;

2. МХ ТА; 5. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу;

3. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну; 6. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу + МХ ТА;

Попередніми дослідженнями було показано, що серотонінергічна система може приймати активну участь в знеболювальній дії мікрохвиль, прикладених на протибольову ТА (Гура, 2002; Багацкая, 2005). Зменшення антиноцицептивної дії аналгіну (p<0.05) на фоні ПХФА, може бути обумовлене додатковим механізмом дії аналгіну, незалежним від гальмування ЦОГ, який пов’язаний з активацією низхідних серотонінергічних шляхів контролю ноцицепції (Miranda et al., 2003). При комбінації половинної дози аналгіну та мікрохвильового опромінення ТА на тлі введення ПХФА, істотне зниження їх протибольового ефекту (p<0.01) може бути пов’язано з активною участю серотонінергічної системи в реалізації аналгетичного ефекту цих двох чинників. Найбільше зменшення знеболювального ефекту на тлі введення ПХФА спостерігалось в групах тварин з окремим та сумісним з дією мікрохвиль застосуванням половинної дози трамадолу (p<0.001). Це цілком логічно з урахуванням того, що трамадол безпосередньо пригнічує зворотний захват терміналями аксонів норадреналіну та посилює вивільнення серотоніну синапсами (Grond, 2004). Показано, що в умовах формалінового тесту даний агент викликає аналгезію за участі серотонінергічної системи головного мозку (Oliva et al.., 2002; Rojas–Corrales et al., 2005).

На фоні введення ПХФА реєструвалось значне (p<0.05 – p<0.001) зниження сумарної тривалості сну майже у всіх групах (рис. 9 Б), що додатково може свідчити про збуджений стан тварин, який обумовлений дією ушкоджуючого фактору (ін’єкцією формаліну).

Отже, в реалізації знеболювального ефекту мікрохвильового опромінення протибольової ТА, застосованого окремо та сумісно з ін’єкцією аналгіну або трамадолу в умовах соматичного болю, може приймати участь серотонінергічна церебральна система.

В умовах індукції вісцерального болю, попереднє введення ПХФА також викликало послаблення антиноцицептивного ефекту. Це проявлялось в збільшенні тривалості БПР майже в усіх групах тварин в порівнянні з такою реакцією у тварин без введення даного агента (p<0.01 – p<0.001) (рис. 10 А).

А Б

Рис. 10. Вплив ПХФА на сумарну тривалість БПР (А) та розслабленого стану (Б) за 60 хв реєстрації у тварин в умовах вісцерального болю:

* – (p<0.05); ** – (p<0.01); *** – (p<0.001);

МХ ТА ? мікрохвильове опромінення ТА Е–36;

1. Контрольна група; 4. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну + МХ ТА;

2. МХ ТА; 5. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу;

3. Ін’єкція 4.2 мг/кг аналгіну; 6. Ін’єкція 0.42 мг/кг трамадолу + МХ ТА;

Разом з цим, сумарна тривалість епізодів розслабленого стану достовірно зменшувалась на тлі введення ПХФА в групі тварин з мікрохвильовим опроміненням ТА Е–36 ? на 21% (p<0.05), в групах з окремим та сумісним з дією мікрохвиль застосуванням половинної дози трамадолу ? на 43% (p<0.01) та на 40% (p<0.01) відповідно (рис. 10 Б).

Це є свідченням того, що в умовах вісцерального болю знеболювальні ефекти мікрохвильового опромінення протибольової ТА, застосованого окремо та сумісно з половинною дозою аналгіну або трамадолу можуть бути реалізовані за участі серотонінергічної системи головного мозку.

Виявлена кореляція між поведінковими проявами в групах тварин, зображених на схемі.

Схема 1. Кореляція між тривалістю поведінкових проявів в групах тварин з індукцією експериментального болю

Групи тварин Групи тварин

Групи тварин Групи тварин

Примітка: Представлені тільки статистично достовірні кореляційні зв’язки.

МХ ТА – мікрохвильове опромінення протибольової ТА; 8.3 Ан – ін’єкція повної середньої дози аналгіну; 4.2 Ан - ін’єкція половинної середньої дози аналгіну; 0.83 Тр - ін’єкція повної середньої дози трамадолу; 0.42 Тр - ін’єкція половинної середньої дози трамадолу; Н– ін’єкція налоксону; ПХФА - ін’єкція DL-парахлорфенілаланіну.

Прямий зв’язок в умовах індукції соматичного та вісцерального болю був виявлений між тривалістю БПР та тривалістю локомоції у тварин. Це означає, що зменшення тривалості БПР супроводжувалось зниженням рухової активності у вказаних групах. Зворотний зв’язок в умовах індукції соматичного болю у тварин був виявлений між тривалістю БПР та тривалістю епізодів сну, тобто зменшення тривалості БПР відбувалось одночасно з підвищенням тривалості епізодів сну протягом експерименту (схема 1). Зворотний зв’язок в умовах індукції вісцерального болю був виявлений між тривалістю БПР та тривалістю епізодів розслабленого стану в усіх тварин як контрольних, так і експериментальних груп. У тварин цих груп зменшення тривалості БПР супроводжувалось підвищенням тривалості епізодів розслабленого стану

Таким чином, в даній роботі описані поведінкові феномени мишей в нормальних умовах та в умовах експериментальної індукції соматичного та вісцерального болю. Проаналізована тривалість поведінкових проявів тварин після мікрохвильового опромінення протибольової ТА, після ін’єкції фармакологічного аналгетика (аналгіну або трамадолу) та після сумісного застосування обох факторів. Вивчені зміни поведінкових проявів тварин в умовах пригнічення функції опіоїдної та серотонінергічної мозкових систем.

ВИСНОВКИ

У дисертації в експериментах на тваринах тестований новий підхід для лікування больових синдромів, який полягає в комбінованому застосуванні фармакологічних аналгетиків у значно зменшених дозах та мікрохвильового опромінення протибольової точки акупунктури (ТА). Такий підхід дає можливість істотно обмежити негативні побічні ефекти фармакологічної аналгезії без втрати інтенсивності протибольового ефекту.

1. В експериментах на білих нелінійних мишах виявлено, що опромінення протибольової ТА Е–36 мікрохвилями низької інтенсивності (30–300 ГГц; 3·10 – 9 Вт/см2) призводить зниження тривалості больових поведінкових реакцій, викликаних подразненням соматичних ноцицепторів та вісцеральних ноцицепторів, в середньому на 24.2% (р<0.05) та на 36% (p<0.001) відповідно. Отже, мікрохвильове опромінення протибольових ТА справляє істотний антиноцицептивний вплив.

2. В умовах індукції соматичного та вісцерального болю комбіноване застосування половинних середніх разових доз аналгіну (4.2 мг/кг) або трамадолу (0.42 мг/кг) та мікрохвильового опромінення ТА Е–36 створює знеболювальні ефекти, які близькі до таких ефектів після ізольованого застосування повних середніх разових доз (8.3 мг/кг аналгіну та 0.83 мг/кг трамадолу) вказаних препаратів, або навіть перевищують їх.

3. Залежності між тривалістю больової реакції та локомоцій в умовах соматичного та вісцерального болю є прямими. Залежності між тривалістю больової реакції та сну у тварин в умовах соматичного болю та між тривалістю больової реакції та розслабленого стану у тварин в умовах вісцерального болю є зворотними.

4. Пригнічення функції опіоїдної та серотонінергічної мозкових систем призводить до послаблення знеболювальних ефектів, викликаних мікрохвильовим опроміненням ТА Е–36 в умовах індукції соматичного та вісцерального болю, що свідчить про активну участь згаданих антиноцицептивних систем в реалізації цих ефектів.

5. Пригнічення функції серотонінергічної церебральної системи призводить до послаблення знеболювальних ефектів, викликаних комбінованим застосуванням мікрохвильового опромінення протибольової ТА та введення половинних доз аналгіну або трамадолу в умовах як, соматичного, так і вісцерального болю. Пригнічення ж функції опіоїдної системи послаблює знеболювальні ефекти комбінованого застосування мікрохвильового опромінення та введення половинної дози аналгіну лише у разі вісцерального болю.

Отже, дія низькоінтенсивних електромагнітних полів мікрохвильового діапазону, прикладених на протибольові ТА, дозволяє забезпечити оптимальні рівні аналгезії при істотному зниженні доз фармакологічних аналгетиків і, відповідно, зменшити побічні ефекти, які супроводжують дію фармакологічних агентів.

Роботи, опубліковані за матеріалами дисертації:

Статті:

О.М. Гончар, О.В. Гура. Фармакологічне та індуковане мікрохвильовим опроміненням пригнічення