НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

НЕСІН ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ

УДК 577.352:612.73

ВЛАСТИВОСТІ КАЛЬЦІЙАКТИВОВАНИХ ТА

АТФ – ІНДУКОВАНИХ КАЛІЄВИХ СТРУМІВ МЕМБРАНИ МІОЦИТІВ ТAENIA CAECI МОРСЬКОЇ СВИНКИ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2008

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: | академік НАН України, доктор медичних наук

професор

Шуба Михайло Федорович

зав. відділом нервово-м’язової фізіології

Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: |

доктор медичних наук, професор

Соловйов Анатолій Іванович

головний науковий співробітник

Інституту фармакології та токсикології АМН України

доктор біологічних наук, професор

Мірошниченко Микола Степанович

зав. кафедри біофізики, біологічного факультету

Київського національного університету ім. Тараса Шевченка

Захист відбудеться “5” лютого 2008 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “5” січня 2008 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основні функції кишечнику тісно пов’язані з його моторикою (сегментарне скорочення та перистальтичні хвилі), і забезпечується узгодженою роботою гладеньких м’язів поздовжнього та кільцевого шару стінки кишки. Моторна функція кишечнику надзвичайно важлива для процесів травлення та всмоктування поживних речовин. Вона забезпечує підвищення внутрішньокишкового тиску, що сприяє фільтрації розчинів з порожнини кишечнику до крові і лімфи та переміщення залишків хімуса за рахунок перистальтики по кишечнику. При багатьох патологічних процесах в травній системі відбувається порушення транзиту вмісту кишечнику. Ці порушення виступають головними причинами виникнення таких ускладнень, як післяопераційні парези, метеоризм, абдомінальний біль та запори. Тому гладенькі м’язи кишечнику є одним із важливих об’єктів дослідження фундаментальної та прикладної науки.

Питання, що стосуються механізмів регуляції тонусу, скорочення та розслаблення гладеньких м’язів з боку вегетативної нервової системи, були і залишаються центральними для фізіології, біофізики та фармакології м’язів. Одним з медіаторів гальмування інтестинальних гладеньких м’язів є аденозин-5’-трифосфат (АТФ), який викликає гіперполяризацію мембрани гладеньком’язових клітин (ГМК), пригнічення спонтанної активності і, як наслідок, розслаблення м’язів (Burnstock et al. 1963). Вперше пуринергічне гальмування вдалося заблокувати апаміном (токсин з отрути бджоли) у відділі Шуби М.Ф. (Владимирова, Шуба 1978). Пізніше в лабораторії Барнстока було показано, що апамін блокує калієву провідність мембрани (Banks et al. 1978). Вважається, що пуринергічне гальмування опосередковане активацією метаботропних пуринорецепторів (P2Y) і центральною ланкою цього гальмування є підвищення рівня внутрішньоклітинного кальцію за рахунок вивільнення його з внутрішньоклітинного інозитолтрифосфатного (IP3) кальцієвого депо та наступною активацією кальційзалежних калієвих каналів малої провідності (SK) (Sanders et al. 1996).

Питання про типи кальційзалежних калієвих каналів (КСа) в мембрані цих клітин та можливої їх участі у пуринергічному гальмуванні залишається відкритим. Тому значний науковий інтерес викликає виділення компонентів кальційзалежного калієвого струму (ІК(Ca)) із сумарного трансмембранного іонного струму, дослідження їх фармако–біофізичних характеристик, а також визначення їх внеску у процеси пуринергічного гальмування гладеньких м’язів шлунково–кишкового тракту (ШКТ).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках наукових програм відділу нервово-м’язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: “Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком’язових клітин”(№ держ. реєстрації 0198U001935), “Мембранні та внутрішньоклітинні механізми регуляції скорочення і активності іонних каналів гладеньком’язових клітин нейромедіаторами”(№ держ. реєстрації 0101U002636) та “Мембранні та метаболічні механізми збуджувальної та гальмівної дії нейромедіаторів на гладенькі м’язи”(№ держ. реєстрації 0105U003235).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи було виділення компонентів сумарного кальційзалежного калієвого струму і визначення їх внеску в пуринергічне гальмування кишечнику. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1. Розробити методику виділення функціонально повноцінних ізольованих гладеньком’язових клітин taenia caeci морської свинки із застосуванням антиоксидантних речовин.

2. Дослідити властивості кальційзалежного калієвого струму мембрани гладеньком’язових клітин taenia caeci морської свинки, розділивши його на компоненти за допомогою паксиліну, ТЕА та d-тубокурарину,

3. Дослідити дію блокаторів кальційзалежних калієвих каналів (d-тубокурарину, паксиліну та ТЕА) на спонтанні вихідні струми.

4. Визначити компоненти кальційзалежного калієвого струму мембрани міоцитів при активації пуринорецепторів.

Наукова новизна роботи. За допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “whole-cell patch-clamp” було проведено розділення на компоненти інтегральних калієвих струмів та вивчення їх біофізичних та фармакологічних характеристик. Вперше виявлено блокуючу дію відомого нейротоксина d-тубокурарину на трансмембранні іонні струми та кальційзалежні калієві струми поодиноких свіжоізольованих ГМК кишечнику. Показано, що вихідні інтегральні трансмембранні іонні струми мають три складові: потенціалзалежний струм «затриманого випрямлення» та два компоненти ІК(Ca): ІК(Ca), що переноситься через SK канали та блокується d-тубокурарином і ІК(Ca), що переноситься через КСа канали великої провідності (BK) чутливі до дії паксиліну та ТЕА. Показано, що спонтанні вихідні струми (СВС) за своїми ознаками та чутливістю до блокаторів можна розділити на струми малої та великої амплітуди. СВС малої амплітуди чутливі до блокуючої дії d-тубокурарину і обумовлені активацією SК каналів, а СВС великої амплітуди блокуються паксиліном і ТЕА та формуються за рахунок активації BК каналів.

Дослідження клітинних механізмів пуринергічного гальмування показало, що основна роль належить активації кальційзалежних калієвих каналів малої провідності, внаслідок вивільнення Са2+ із інозитолтрифосфатчутливого кальцієвого депо саркоплазматичного ретикулуму.

Теоретичне та практичне значення роботи. Представлена робота має як фундаментальне так і практичне значення, оскільки значно поглиблює та розширює сучасні уявлення про клітинні механізми гальмування в гладеньких м’язах. В роботі проведено розділення вихідного трансмембранного іонного струму на потенціалзалежний та кальційзалежний компоненти, досліджено фармако?біофізичні характеристики кальційзалежних калієвих струмів. Виявлено клітинні механізми регуляції кальційзалежних калієвих каналів, при активації метаботропних пуринорецепторів. Результати досліджень можуть бути використані біофізиками, фізіологами та фармакологами для створення нових засобів корекції розладів ШКТ.

Особистий внесок. Всі електрофізіологічні дослідження вихідного інтегрального трансмембранного іонного струму та його компонент, спонтанних вихідних струмів, описаних в роботі, а також отримання функціонально повноцінних поодиноких ГМК, обробка експериментального матеріалу були виконані особисто автором. Аналіз та узагальнення результатів досліджень були обговорені з науковим керівником та співавторами публікацій.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались на семінарах відділу нервово?м’язової фізіології та поточних наукових семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (2002-2007), на міжнародній спеціалізованій школі нейронаук IBRO “Рецептори, канали, месенджери” (Ялта, 2004), Міжнародній науковій конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи” (Львів, 2004), І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики ” (Харків, 2004), Міжнародній науковій конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем”, (Львів, 2006), 4 з’їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в п’яти наукових статтях і п’яти тезах доповідей в матеріалах наукових зібрань.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків та списку використаних джерел із 175 найменувань. Робота викладена на 111 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 39 рисунками та 2 таблицями.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження було проведено на свіжоізольованих поодиноких ГМК поздовжнього м’язового шару сліпої кишки (taenia cаесi) морської свинки. Для виділення клітин шматочки taenia cаесi поміщали до 2 мл номінально безкальцієвого розчину, що містив 3 мг колагенази (тип IА), 2 мг бичачого сироваткового альбуміну, 2 мг соєвого інгібітору трипсину та 2 мг таурину (поглинач вільних радикалів) на 25 - 35 хв. при 34 оС. Оброблені таким чином шматочки taenia cаесi відмивалися від ферменту і багаторазово пропускалися через пастерівську піпетку в номінально безкальцієвому розчині.

В основній частині експериментів для дослідження іонних струмів ізольованих ГМК застосовувалась “whole-cell” конфігурація методу “patch-clamp” (Hamill et al. 1981). Мікропіпетки виготовляли з м’якого молібденового скла, після заповнення розчином вони мали опір 2 - 4 МОм. Зовнішній розчин мав наступний склад (мМ): NaCl 120.4; КCl 5.9; CaCl2 2.5; MgCl2 1.2; d-глюкоза 11,5; HEPES 5; pH 7.4 (NaOH). Піпетковий розчин мав такий склад (мМ): КCl 135; MgSO4 1; Na2ATФ 2; ЕГТА 0.3; HEPES 10; pH 7.3 (КOH). Внутрішньоклітинна концентрація вільного Са2+ ([Ca2+]i) при використанні останнього розчину була близькою до фізіологічної і становила приблизно 100 нМ. При дослідженні Са2+ струму (ICa) іони К+ в розчинах еквімолярно замінювались на Cs+, також до зовнішнього розчину додавали 5 мМ тетраетиламонію (ТЕА). Експерименти проводились при кімнатній температурі (22-24 oC).

Реєстрація іонних струмів проводилась за допомогою підсилювача “L/M ЕРС-5”. Сигнал з виходу перетворювача струм - напруга надходив через фільтр низьких частот (частота зрізу 1 кГц) на аналого-цифровий перетворювач і далі в комп’ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програм “pCLAMP 5.5” та “Origin 5.0”.

Значення величин вказані як: середнє арифметичне ± стандартна похибка середнього арифметичного. В скобках вказано кількість клітин. Дані порівнювали за допомогою парного двохстороннього t-тест Стьюдента. Відмінності вважали статистично достовірними при значенні Р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ

Рис. 1. Дія паксиліну на вихідний струм ГМК taenia cаесi.

А – вихідні струми викликані деполяризацією від – 60 мВ до + 50 мВ, в контролі - 1, при дії паксиліну (100нМ) - 2. Б – Зміна амплітуди вихідного струму в часі, контролі-1, при дії паксиліну (100нМ) - 2, відмивання паксиліну з камери - 3

Загальна характеристика Са2+залежних К+ струмів гладеньком’язових клітин taenia cаесі морської свинки. Для розділення та вивчення характеристик компонент ІК(Са), було використано неселективний блокатор К+ каналів – ТЕА, та відомий блокатор ВК каналів великої провідності – паксилін. В якості блокатора SK каналів було використано відомий нейромодулятор d-тубокурарин (d-ТК). Трансмембранні струми викликались за допомогою ступінчастих зміщень мембранного потенціалу від підтримуваного рівня – 60 мВ, що наближується до фізіологічного потенціалу спокою цих клітин. Типові значення вхідного опору клітин, що використовувались в наших експериментах, складали 1 - 2 ГОм. В досліджуваних клітинах при ступінчатих деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу від підтримуваного

Рис. 2. Властивості паксилінчутливого вихідного струму.

А – вольт-амперні характеристики “чистого” паксилінчутливого вихідного струму (¦),вольт-амперні характеристики вхідного кальцієвого струму (^). Б – нормалізована активація вихідного струму в контролі (?), та при прикладенні паксиліну (^).

потенціалу –60 мВ тривалістю 250 мс, виникав вихідний струм з порогом активації –30 мВ. Аплікація паксиліну за таких експериментальних умов викликала значне пригнічення вихідного струму, також знижувались його осциляції. На рис. 1 показана дія паксиліну (100 нМ) на трансмембранний іонний струм. На цьому ж рисунку подана динаміка дії паксиліну на амплітуду вихідного струму. Ефект паксиліну досягав максимуму протягом 2 – 3 хвилин від початку його аплікації. Постійна часу дії паксиліну складала 1,3 0,3 хв (n=5). Відновлення амплітуди вихідного струму при відмиванні токсину відбувалось з постійною часу 0,9 0,1 хв (n=5).

Рис. 3. Сумісна дія паксиліну та ТЕА на вихідні струми.

А – вихідні струми викликані деполяризацією від – 60 мВ до + 40 мВ, в контролі - 1, при дії ТЕА ( 1 мМ ) - 2, при дії паксиліну (100 нМ ) на фоні ТЕА (1 мМ) – 3. Б – в контролі - 1, при дії паксиліну - 2, при дії ТЕА на фоні паксиліну – 3.

На рисунку 2 показано вольт-амперну характеристику (ВАХ) паксилінчутливого ІК(Са), що переноситься через ВК канали, отриманого шляхом відніманням значень струму при дії блокатора від контрольних значень. На ВАХ паксилінчутливого ІК(Са) (рис. 2.А) спостерігається зміна крутизни “перегин” в районі максимуму активації ІСа, що дає змогу казати про залежність, цього струму від концентрації іонів Са2+ в середині клітини. Крім того, канали, через які переноситься паксилінчутливий ІК(Са), проявляли потенціалзалежні властивості. Зі збільшенням рівня деполяризації спостерігалось збільшення його амплітуди, незважаючи на зменшення входу Са2+ в клітини при потенціалах +20…+40 мВ. На рисунку 2.Б показано криві нормалізованої провідності вихідного струму. Половина максимальної активації V0,5 в контролі складала 32.6±1.2 мВ, а коефіцієнт крутизни становив 12±0.7 мВ. При дії паксиліну ці значення становили 19.1± 0.9 мВ та 15± 0.6 мВ відповідно (n=7).

ТЕА ? відомий неселективний блокатор калієвих каналів (Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). В концентрації 1 мМ ТЕА блокував вихідний струм, викликаний зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного рівня –60 мВ до +50 мВ, більш ніж на 50±6 % (n=6). Паксилін, при додаванні його в концентрації 100 нМ до розчину ТЕА (1 мМ), не викликав додаткового зменшення вихідного струму (рис. 3.А). В той же час, додаткова аплікація ТЕА (1мМ) (рис. 3.Б) в присутності паксиліну, призводить до подальшого пригнічення вихідного струму.

Раніше було показано (Повстян та ін. 2000), що IK(Ca), який переносяться через КСа великої провідності ефективно та однаково блокується наномолярними концентраціями харибдотоксину та ТЕА в концентрації 1 мМ. В той же час паксилін, високоспеціфічний блокатор КСа каналів великої провідності призводить до меншого блокування, ніж ТЕА, і, відповідно, харибдотоксин.

Рис. 4. Динаміка дії d-TК на вихідні іонні струми ГМК taenia caeci.

А - Струми викликані ступінчастим зміщенням мембранного потенціалувід –60 до + 40 мВ, в контролі – 1, та після додавання d-ТК (50 мкМ) - 2. Б - Зміна амплітуди вихідного струму з часом при дії d-TК (50 мкМ), та при відмиванні d-TК з робочої камери.

В якості блокатора SК каналів було застосовано d-ТК, що є відомим модулятором нікотинових холінорецепторів (Wenningmann et al. 2001) та широко застосовується як в дослідницьких цілях, так і в медицині. Але відомі інші дані про його додаткові властивості, як блокатора КСа каналів (Vacher et al. 1998, Ishii et al. 1997). В зв’язку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявність нікотинових холінорецепторів, це дало підстави використати та вивчити вплив d-ТК на іонні струми, що протікають через мембрану міоцитів. Аплікація d-ТК (500нМ–1мМ) пригнічувала вихідний трансмембранний струм, викликаний ступінчастим зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного рівня ? 60 мВ, у концентраційно–залежний спосіб. З побудованої кривої доза-ефект, було встановлено, що концентрація половинного ефекту становить ІС50 = 38±5 мкМ (n=7).

На рисунку 4. подано динаміку дії d-ТК на амплітуду вихідного струму з часом. Часова розгортка дії d-ТК (50 мкМ) показала, що повний ефект блокування досягав максимуму через 2,5 - 3,5 хвилини після початку прикладання блокатора. Постійна часу дії d-ТК складала 1 0,2 хв (n=5). Відновлення амплітуди вихідного струму при відмиванні токсину 1,2 ± 0,2 хв (n=5).

Усереднені (n=9) ВАХ дії d-ТК на трансмембранний іонний струм наведено на рис 5. Як видно з рисунка, вклад d-TK чутливого струму в загальний вихідний струм на максимумі та в кінці деполяризуючого імпульсу, тривалістю 500 мс, був приблизно однаковим. Виходячи з динаміки кривої ВАХ можна зробити висновок, що канали,

Рис. 5. Усередненні ВАХ вихідного струму при дії d-тубокурарину.

Усереднені ВАХ вихідного струму (отриманим на 12-ти клітинах), знятих на максимумі – А, та на при кінці деполяризуючого імпульсу –Б. ¦ – контроль, ? - на фоні дії d-тубокурарину, ^ - “чистий” ІК(Са) чутливий до d-тубокурарину

через які переноситься d-TKчутливий струм, не проявляють потенціалзалежних властивостей. Поряд з цим на ВАХ досить добре простежується максимум в районі +40 мВ, що не співпадає з максимумом ICa , котрий знаходиться в

Рис. 6. Дія d-ТК та паксиліну на вихідний іонний струм.

А –в контролі – 1,при дії паксиліну (100нМ) – 2, при наступні аплікації d-ТК (50мкМ) на фоні паксиліну (100нМ) – 3.

Б – в контролі – 1, при дії d-тубокурарину (50мкМ) –2, при одночасовій аплікації d-ТК (50мкМ) та паксиліну (100нМ) – 3.

діапазоні потенціалів біля +10 мВ (рис 2). Подібні ефект було отримано на вісцеральних гладеньком’язових клітинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), що було, на думку авторів, пов’язано з кальційзалежними механізмами вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного кальцієвого депо.

В наступних дослідах для розділення вихідного струму на компоненти та вивчення його характеристик було використано селективний блокатор BK каналів - паксилін (100нМ) (Gungdi et al. 1999). Додавання до зовнішнього розчину паксиліну викликало значне пригнічення вихідного струму (рис 6.А), та суттєво зменшувались осциляції. Додаткове додавання d-TK на фоні паксиліну викликало додатково незначне пригнічення вихідного струму. На рис 6. Б наведено дію d-ТК на вихідний струм. Як і в попередньому разі, d-ТК заблокував незначну частину вихідного струму, до того ж осциляції струму та його кінетика майже не змінилась. Додавання паксиліну до розчину в присутності d-ТК, призводило до значного пригнічення вихідного струму, при цьому значно зменшувались осциляції струму та його кінетика. Отриманні дані дозволяють зробити припущення, що паксилін та d-ТК діють на різні типи каналів незалежно один від одного. До того ж слід відмітити, що вклад паксилінчутливих каналів до загального вихідного струму значно більший, ніж вклад d-тубокураринчутливих каналів.

Властивості спонтанних вихідних струмів гладеньком’язових клітин. Друга частина роботи була присвячена вивченню характеристик спонтанних вихідних струмів (СВС), та впливу на них блокаторів калієвих каналів. В багатьох клітинах при деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу виникали СВС, реєстрація яких проводилась протягом 100 с. СВС починали з’являтись

Рис. 7. Реєстрація спонтанни вихідних струмів (СВС).

СВС були записані при відповідних наведеним тестових потенціалах від – 50 до – 10 мВ.

при потенціалах більш позитивних ніж ? 60 мВ (рис. 7). Як видно з рисунка, зі збільшенням мембранного потенціалу зростали амплітуда та частота зареєстрованих СВС.

СВС різної амплітуди можуть утворюватись за рахунок багаторазового локального звільнення Са2+ з внутрішньоклітинного депо, а також неоднорідності популяції кальційактивованих калієвих каналів. Як встановлено, в утворенні СВС приймають участь як ВК канали, так і SК канали. Окрім цього, в деяких роботах (Kong et al. 2000) припускають, що СВС малої амплітуди в більшості формуються за рахунок активації SК, в той час як СВС великої амплітуди ? за рахунок активації ВК.

Рис. 8. СВС та їх пригнічення під впливом d-ТК та ТЕА.

А:а – СВС малої та великої амплітуди при потенціалі фіксації – 30 мВ в контролі, б –дія d-ТК (50мкМ), в – наступне додавання ТЕА (1мМ). Б – амплітудна гістограма, що відображає пригнічуючи дію d-тубокурарину та ТЕА на частоту СВС великої та малої амплітуди, за 100 секунд реєстрації.

Дія блокаторів КСа каналів, d-ТК та ТЕА, на СВС (підтримуваний потенціал – 30 мВ) наведено на рис. 8. Аплікація d-ТК, як блокатора SК каналів, призводила до пригнічення СВС малої амплітуди, в той час як частота появи СВС великої амплітуди майже не зменшувалась. Додавання ТЕА (1мМ) як блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК призводило до пригнічення не тільки СВС великої амплітуди, але і залишкових СВС малої амплітуди. На рисунку 8.Б подано амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС мембрани ГМК. Ймовірно, що СВС великої амплітуди мають в своєму складі d-ТК чутливий компонент, що переноситься через SК канали. В той же час в формуванні СВС малої амплітуди приймає участь ТЕАчутливий компонент.

Ці дослідження показали, що СВС в ГМК taenia cаесі морської свинки є результатом відкривання ВК каналів, чутливих до дії паксиліну та ТЕА, та SК каналів, чутливих до дії d-TK.

Властивості спонтанних вихідних струмів, викликаних пуринергічною активацією ГМК кишечнику морської свинки. Активація пуринорецепторів мембрани інтестинальних ГМК аплікацією АТФ, доданого до зовнішнього розчину, активує КCa канали. Ми вивчали ефекти наведеного агоніста на струм при підтримуваному потенціалі ? 40 мВ.

Рис. 9. Вплив АТФ на СВС. Клітини утримувалися при потенціалі -40 мВ. А: а – контроль СВС, б – після додавання АТФ (100 мкМ). Б: Загальна гістограма відображає кількість СВС протягом 100 сек. Запису протоколу.

За таких умов АТФ в концентрації 100 мкM істотно підвищував частоту появи СВС, а особливо компоненти малої амплітуди. Приріст СВС малої амплітуди на максимумі складав 60% ±5% (n=4) (рис. 9).

Рис. 10. Вплив АТФ на СВС в присутності блокатора ІР3 рецепторів 2-АРВ.

Підтримуваний потенціал складав -40 мВ; А: а – аплікація АТФ без 2-АРВ, б –. Преінкубації 10 хв в 2-АРВ (30 мкМ), в – наступна аплікація АТФ (100 мкМ) на фоні 2-АРВ.;Б: гістограма що відображає частоту СВС при аплікації АТФ (100 мкМ) фоні блокування ІР3 рецептрорів

У більшості ГМК локальне спонтанне вивільнення кальцію (спарки) обумовлено активністю ріанодинових депо, оскільки аплікація ріанодину викликає блокування спонтанного та підсиленого агоністами вивільнення іонів Са2+ (Guerrero-Hernandez et al. 2002). З іншого боку показано, що виділення кальцію з інозитолтрифосфат (ІР3) - керованого депо є як джерелом активності Са2+ “puffs” в гладеньких м`язах, так і регенеративної взаємодії між виділенням кальцію з ІР3 рецепторів та ріанодинових рецепторів (Boittin et al., 2000). Зазвичай, підсилення продукції ІР3 та наступне виділення Са2+ є характерною рисою для відповіді на аплікацію гальмуючих агоністів в гладеньких м`язах. У випадку гладеньких м`язів ШКТ, цей механізм може пояснити пригнічувальну дію АТФ, який вважається гальмівним нейротрансміттером, виділеним з ентеро-мотонейронів (Shuba et al. 2003).

Преінкубація клітин в розчині, що містив 30 мкМ 2-АРВ, блокатора ІР3 рецепторів, протягом 10 хвилин показала, що прикладення АТФ (100 мкМ) не призводить до суттєвих змін у частоті появи викликаних СВС, як малої так і великої амплітуди (рис. 10). Окрім цього, інкубація в розчині 2-АРВ призводить до незначного зменшення частоти СВС малої амплітуди (дані не наведено), що може свідчити про залежність цієї частини СВС від кальцію, що звільняється з ІР3 чутливого депо. До того ж можна припустити, що активація

Рис. 11. Вплив АТФ на СВС в присутності блокатора PLС U73122. Підтримуваний потенціал складав -40 мВ.: А. а – Преінкубації 10 хв в U73122 (5 мкМ), в – наступна аплікація АТФ (100 мкМ) на фоні U73122.; Б. гістограма що відображає частоту СВС при аплікації АТФ (100 мкМ) фоні блокування PLC

ІР3 залежного депо виступає пусковим механізмом в ефекті активації гальмування, викликаного АТФ.

Рис. 12. Вплив d- тубокурарину та ТЕА на СВС активованих АТФ.

А: а – СВС активовані прикладенням АТФ (100 мкМ), б – аплікація d-тубокурарину, в – додаткова аплікація ТЕА (1 мМ).Б: загальна гістограма, що відображає кількість СВС протягом 100 сек. запису протоколу.

Для блокування ІР3 шляху застосовували блокатор фосфоліпази С (U73122). За таких умов не відбувалось збільшення частоти СВС при аплікації АТФ. (Рис. 11). Відсутність збільшення частоти СВС у відповідь на аплікацію АТФ на фоні U73122 до зовнішнього розчину свідчить, що ІР3 залежне збільшення вивільнення кальцію ? основний механізм P2Y рецептор-модульованої стимуляції вихідного струму та гіперполяризації. Вивільнення кальцію асоційоване з активацією SK та BK каналів міоцитів taenia caeci.

На рис. 12 подано вплив блокаторів КСа каналів на викликані агоністіндукованою активацією СВС. Потенціал фіксації становив – 40 мВ. Як видно d-ТК, як антагоніст SK каналів, в концентрації 50 мкМ послаблював СВС малої амплітуди (Рис. 12). СВС записано протягом 100 сек. реєстрації (n= 5). СВС великої амплітуди були також дещо пригнічені застосуванням d-ТК. Це вказує на наявність в складі викликаних СВС великої амплітуди компоненти струму d-ТКчутливих каналів. Результати свідчать, що СВС у ГМК taenia caeci морської свинки, є результатом відкривань BK каналів та d-ТКчутливих каналів. Аплікація ТЕА (1 мМ), як неселективного блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК блокувала не лише СВС великої амплітуди, але і залишкові СВС малої амплітуди. На рис. 12 Б. наведено амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС, індуковані аплікацією АТФ. Пригнічення SK каналів може призводити до редукції СВС великої амплітуди та сприйняття останніх в якості СВС малої амплітуди після застосування d-ТК.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

В результаті проведених досліджень по розділенню сумарного трансмембранного іонного струму ГМК поздовжнього м’яза сліпої кишки (taenia саесі) морської свинки на компоненти, дослідженню їх фармако-біофізичних характеристик було показано, що при ступінчастій деполяризації мембрани в переносі вихідного струму приймають участь потенціалкеровані К+ канали затриманого випрямлення та два типи КСа каналів, що узгоджується з літературними даними (Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989). Показано наявність паксилінчутливого IK(Ca), що переноситься через ВК, та паксиліннечутливого компоненту. Раніше було показано (Повстян та ін. 2000), що IK(Ca), які переносяться через КСа великої провідності, ефективно блокуються наномолярними концентраціями харибдотоксину та ТЕА в концентрації 1 мМ. В той же час паксилін, високоспеціфічний блокатор КСа каналів великої провідності не призводив до блокування вихідних струмів, як це було показано для харибдотоксина та ТЕА. На фоні дії паксиліну (100 нМ) ТЕА в концентрації 1 мМ проявляв подальше пригнічення вихідних К+ струмів. ВАХ паксиліннечутливого компоненту виявила, що цей струм проявляє потенціалзалежні властивості, тобто зі збільшенням рівня деполяризації відбувається збільшення його амплітуди. Поряд з цим вольт-амперна характеристика має перегин в області максимуму кальцієвого струму, що може свідчити про залежність цього струму від внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Це вказує на наявність паксиліннечутливого компоненту К+ струмів, який блокується менш селективними блокаторами, такими як ТЕА та харибдотоксин, останній має блокуючий вплив, як на ВК канали (Knaus et al. 1994, Orio et al. 2002), так і на КСа проміжної провідності (ІК) (Bychkov et al. 2002, Edwards et al. 1998; 2000). З’ясування природи цього компоненту К+ струму вимагає застосування більш селективних блокаторів К+ каналів.

Другий вагомий компонент КСа струму переноситься через КСа канали малої провідності, для яких селективним блокатором виступає апамін (Shuba et al. 1981, Shuba et al. 2000, Burnham et al. 2002). Але, як було показано (Повстян та ін. 2000), апамін має побічну дію у вигляді активації каналів, що переносять неселективний катіонний струм. Для усунення невизначеності дії апаміну, в наших дослідах в якості блокатора SК каналів було застосовано d-TK, що є відомим модулятором нікотинових холінорецепторів та широко застосовується, як в дослідницьких цілях, так і в медицині (Wenningmann et al. 2001). Але окрім впливу на нікотинові холінорецептори існують дані про його додаткові властивості, як блокатора КСа каналів (Wang et al. 1999, Barfod et al. 2001). В зв’язку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявність нікотинових холінорецепторів, це дало підстави використати та вивчити вплив d-ТК на іонні струми, що протікають через мембрану ГМК taenia cеасі морської свинки.

Ефект блокування IK(Ca) аплікацією d-ТК досягав максимума через 2,5 - 3,5 хвилини після початку прикладення блокатора. IK(Ca), що переноситься через SК канали, не проявляв на відміну від паксилінчутливого струму, часозалежної інактивації та потенціалзалежних властивостей. Крива ВАХ цього струму мала максимум в діапазоні + 30, + 50 мВ, що не співпадає з максимумом кальцієвого струму котрий знаходиться в діапазоні потенціалів біля +10 мВ. Подібні ефекти було описано на вісцеральних гладеньком’язових клітинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), та були пов’язані з кальційзалежними механізмами вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного кальцієвого депо. Поряд з цим дослідження, проведені по вивченню впливу d-ТК на вхідні Са2+ струми показали, що d-ТК не впливає на потенціалзалежні Са2+ канали L – типу, котрі були виявлені на мембрані ГМК (Yamamoto et al. 1989, Жолос та ін. 1986, Зима та ін. 1994), що збігається з літературними даними (Wang et al. 1999).

Окрім наведених відмінностей встановлено, що ВК та SK канали сильно відрізняються по чутливості до ТЕА, неселективного блокатора К+ каналів. Як було сказано вище, ВК канали блокуються при додаванні до зовнішнього розчину ТЕА в низьких концентраціях, що в наших дослідах складало 1 мМ. В той же час SK канали, що з успіхом блокувались низькими концентраціями d-ТК (50 мкМ), виявились нечутливими до аплікації ТЕА навіть в концентраціях 4 – 5 мМ, що узгоджується з літературними даними (Latorre et al. 1983, Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). Більше того, було показано (Blatz et al. 1986), що ТЕА не виявляє блокуючої дії на SK канали навіть в великих концентраціях (20– 25 мМ).

Одною з найважливіших характеристик IK(Ca), що переноситься як через ВК канали так і SK канали, є чутливість цих каналів до зміни [Са2+]i. З літературних джерел відомо (Becker et al. 1989, Ganitkevich et al. 1991), що при фізіологічних умовах [Са2+]i в ГМК знаходиться в діапазоні 100 – 120 нМ. При деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу до 0 мВ [Са2+]i різко зростає, досягаючи рівня 1000 нМ, після чого спадає до стаціонарного рівня 200 – 300 нМ, на якому продовжує триматися протягом декількох секунд до припинення деполяризації. Аналогічні дані були отриманні в дослідах на тонкому кишечнику мишей (Vogalis et al. 1997). В цій роботі було визначено порогову [Са2+]i необхідну для активації К+ каналів, що становила 85 нМ. В той же час для активації ВК каналів необхідна значно вища [Са2+]i, ніж для SК каналів. Проведені досліди з використанням іонів Со2+ в зовнішньому розчині також підтверджують дані, що для активації ВК каналів необхідне значне підвищення [Са2+]i за рахунок надходження іонів Са2+ ззовні клітини, та/або вивільнення їх з внутрішньоклітинного депо.

Відносний вклад кожного з компонентів в сумарний вихідний струм варіював у різних клітин, але в більшості випадків величина їх залишалась в певних межах. Було встановлено, що близько 90% вихідного трансмембранного струму переноситься через потенціалкеровані К+ канали “затриманого випрямлення” та ТЕАчутливі ВК канали. В свою чергу, більш детальний вклад кожного компоненту до загального струму варіював наступних межах: 30 – 45% для Са2+незалежного К+ струму “затриманого випрямлення”, 40 – 50% для паксилінчутливого IK(Ca), що переноситься через ВК канали, 5 – 15% для ТЕАчутливого IK та 5 – 15% для d-ТКчутливого IK(Ca), що переноситься через SК канали. Потрібно наголосити, що результати про процентний вклад кожного з вищеназваних компонент до загального вихідного струму, отримані за допомогою фармакологічного розділення, співпадали з результатами отриманими за допомогою віднімання окремих компонент вихідного струму.

Отриманні нами дані свідчать, що в ГМК taenia cаесi морської свинки окрім викликаних вихідних калієвих струмів можуть також виникати СВС. На сьогоднішній день аналогічні струми вже описані в багатьох ГМК: трахеї, різних відділах кишечнику та кровоносних судин (Шуба 1965, Bolton et al. 1996). Фізіологічна роль СВС, поки що достеменно невідома.

Велике зацікавлення викликає питання з приводу джерела Са2+ , необхідного для активації кожного зі згаданих раніше компонентів IK(Ca). На сьогодні існує багато думок з цього приводу. Проведені нами досліди, а також отриманні раніше дані (Cole et al. 1989, Повстян та ін. 1997) наочно демонстрували, що амплітуда вихідного К+ струму, через наявність Са2+чутливої компоненти, сильно залежить від кількості Са2+, що входить до клітини через потенціалкеровані Са2+ канали під час деполяризуючого зміщення мембранного потенціалу. Блокування цих каналів іонами Со2+ призводило до значного пригнічення вихідного струму. Нездатність паксиліна пригнічувати вихідний струм в умовах блокування входу іонів Са2+ в клітину може слугувати доказом того, що для активації КСа каналів великої провідності ГМК taenia caeci морської свинки необхідне значне підвищення [Са2+]i в даному разі за рахунок входу іонів Са2+ ззовні через потенціалкеровані Са2+ канали L-типу. В той самий час, для активації SК потрібно незначне підвищення [Са2+]i вище порогового рівня, як зазначалось раніше, близько 85 нМ (Vogalis, Goyal 1997).

В той же час було виявлено, що іони Ca2+, які спонтанно вивільняються з саркоплазматичного ретикулуму (СР), так звані Са2+ спарки, також можуть викликати активацію КСа , при цьому активність каналів буде проявлятись у вигляді СВС (Bolton et al. 1996, Gordienko et al. 1998, Bayguinov et al 2001). Са2+ спарки призводять до локального підвищення [Са2+]i, що в свою чергу призводить до активації невеликої кількості КСа (10-100) (Бурый та ін. 1992, Benham et al. 1986), які генерують появу СВС. Лише суттєве вивільнення Са2+ з СР (викликане наприклад аплікацією кофеїну) може призвести до активації великої кількості КСа каналів та викликати появу вихідного інтегрального макроструму (Гордиенко та ін. 1995, Повстян та ін. 2000). Однак в реальних умовах, подібне масове вивільнення Са2+ депо видається мало ймовірним.

В одній з недавніх робіт, що стосувалась вивчення впливу апаміна на іонні струми ізольованих ГМК ШКТ (Kong et al. 2000) було показано, що СВС можна розділити на два типи – великої та малої амплітуди. Перші блокувались харибдотоксином та утворювались завдяки активації ВК каналів, а другі ? апаміном, і, відповідно формувались SК каналами. Проведені нами досліди показали, що паксилін ефективно блокував СВС великої амплітуди, при цьому частота СВС малої амплітуди майже не змінювалась, і, відповідно, не блокувались паксиліном. що узгоджується з наведеними даними. В той же час d –TK призводив до блокування СВС малої амплітуди, що може свідчити про те, що вони формуються за рахунок активації SК. ТЕА неселективний блокатор К+ каналів, на відміну від паксиліна, блокуючи СВС великої провідності також незначно пригнічував СВС малої амплітуди. Як було показано, на інтегральних струмах існує К+ провідність, яка нечутлива до паксиліну, але блокується ТЕА, і відповідно робить вклад в СВС малої амплітуди.

Підсумовуючи вище згадані дані, можна зробити висновок, що в ГМК taenia cаесi морської свинки існує щонайменше два компоненти IK(Ca). Ці компоненти відрізняються між собою не лише провідністю каналів, через які вони переносяться, але і їх чутливістю до [Са2+]i та змін мембранного потенціалу, а також відрізняються кінетичними характеристиками. Окрім наведеного вище, ці канали відрізняються чутливістю до блокаторів (d-TK, паксиліну, ТЕА). Так, d–TK виступає ефективним блокатором SК каналів ГМК ШКТ та може бути використаний, як інструмент для розділення та вивчення іонних струмів.

Локальне підвищення Са2+ виступає важливою ланкою в регуляції мембранного потенціалу, збудливості клітини та агоністіндукованих реакцій (Gordienko et al. 1998, Collier et al. 2000). Ці процеси є безпосереднім результатом вивільнення іонів Са2+ через ріанодинчутливі канали, або через ІР3 активовані канали на саркоплазматичному ретикулумі. В деяких клітинах, локальне вивільнення Са2+ може призводити до утворення так званої Са2+ хвилі, що може розповсюджуватись навколо місця ініціації та через всю клітину (Gordienko et al. 1998, Jaggar et al. 2000). Локальне вивільнення Са2+ в безпосередній близькості до плазматичної мембрани, викликає просторово обмежене збільшення концентрації останнього, що сягає 1 мкМ (Perez et al. 1999). Таке локальне підвищення [Са2+]i активує Са2+залежні іонні канали, що розташовані поблизу місця вивільнення іонів Са2+. Тому головним зв’язуючим ланцюгом між вивільненням Са2+ та клітинною відповіддю, виступає активація іонної провідності в плазматичній мембрані.

Активація вихідного калієвого струму відповідає за генерацію неадренергічних нехолінергічних гальмівних синаптичних потенціалів (НАНХ ГСП). На сьогоднішній день загальноприйнята думка, що АТФ, так само як і NO, виступає медіатором гальмівної нейропередачі в ШКТ (Шуба та ін. 1998, Shuba et al.2003, Moore et al. 1990). В taenia cаесi морської свинки стимуляція НАНХ-нейронів призводила до генерації двофазного ГСП (И.А. Владимирова та ін. 1984,1993). Повільний компонент цього ГСП блокується інгібіторами NO-синтази та харибдотоксином, блокатором BК каналів (Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003, Загороднюк та ін. 1994), а швидкий – антагоністом пуринорецепторів суруміном, та блокатором SК каналів апаміном (Владимирова та ін. 1986, Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003). Проведені нами досліди по вивченню впливу АТФ на поодинокі ГМК taenia cаесi морської свинки показали, що АТФ (100 мкМ) при підтримуваному потенціалі в –40 мВ, призводив до значного приросту СВС малої амплітуди. При цьому частота СВС великої амплітуди сильно не змінювалась.