НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ПАНЩИНА ГАННА ІВАНІВНА

УДК 578.26:579.842.1/.2

СТРУКТУРНА ОРГАНІЗАЦІЯ ГЕНОМУ ПОМІРНОГО БАКТЕРІОФАГА ZF40 ERWINIA CAROTOVORA

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата

біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова та у відділі молекулярної генетики бактеріофагів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Товкач Федір Іванович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

НАН України, завідувач відділу молекулярної генетики

бактеріофагів

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Щербатенко Іван Степанович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

НАН України, завідувач відділу фітопатогенних вірусів

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Козировська Наталія Олексіївна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

відділ регуляторних механізмів клітини

Захист відбудеться „19” березня 2008 року о 10 годині на засіданні

Спеціалізованої вченої ради Д26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: Д03680, м. Київ ДСП, вул. Заболотного, 154, зал засідань.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий « 14 » лютого 2008 року.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Під структурною організацією фагового геному розуміють первинний, вторинний, третинний та вищі рівні упорядкування віріонної ДНК [Banfalvi, Caspar, 1986], яка виражається через наявність липких кінців, делецій, вставок, інверсій, пермутації, кінцевої надлишковості, кільцеутворення та надспіралізації ДНК при її упаковці в капсид.

За механізмом упаковки ДНК у віріон всі фаги порядку Caudovirales можна класифікувати на два типи [Ackerman, 1999]. У фагів першого типу формування індивідуальних фагових геномів сталої величини і послідовності відбувається шляхом розрізання лінійного конкатемера в певних фіксованих ділянках, або cos-сайтах. У фагів другого типу процес розрізання і упаковки ДНК в капсид ініціюється в специфічному рас-сайті конкатемерної молекули і далі проходить неспецифічно. В результаті утворюється набір віріонних ДНК сталого розміру, але з циклічно переставленими нуклеотидами і кінцевою надлишковістю. При умові наявності відповідних сайтів за рас-механізмом, або за механізмом „заповнення головки” (headful), можлива упаковка фрагментів бактеріальної або плазмідної ДНК і здійснення генералізованої трансдукції. У зв`язку з цим рас-фаги розглядаються як природні вектори латерального переносу генів, який виступає основним фактором формування бактеріального різноманіття. Отже, вивчення механізмів формування фагових геномів і їх упаковки в фагову частку є актуальною науковою проблемою [Oliveira et al., 2005].

У важливої фітопатогенної бактерії E. carotovora subsp. сarotovora кількість автономних генетичних елементів, які здатні здійснювати горизонтальний генетичний обмін між різними штамами, обмежена [Toth et al., 1993]. Бактеріофаг ZF40 є єдиним помірним фагом цієї бактерії і може розглядатися як генетичний інструмент для дослідження її молекулярної генетики. Особливістю даного фага є те, що він створює унікальний лізогенний стан і приймає участь у формуванні патогенного потенціалу E. carotovora [Кушкина и др., 2006].

Вищезазначені факти були підґрунтям для вивчення структурної організації геному фага ZF40 на рівні пермутації віріонної ДНК, яка призводить до генералізованої трансдукції генетичних маркерів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках науково-дослідної теми „Молекулярна генетика та екологічна роль мегаплазмід фітопатогенної бактерії Erwinia carotovora” (реєстраційний номер 0107V006874) Одеського національного університету ім. І.І Мечникова та бюджетної теми відділу молекулярної генетики бактеріофагів Інституту мікробіології і вірусології НАН України „Молекулярно-генетична організація та біотехнологічне застосування лізогенних систем Erwinia carotovora” (реєстраційний номер 0105U000788).

Мета і задачі дослідження. Робота виконувалась на основі теоретичної концепції відносно мозаїчної організації фагових геномів [Canchaya et al., 2003].

Основною метою роботи було вивчення структурної організації генома помірного бактеріофага ZF40 E. carotovora subsp. сarotovora на рівні пермутації віріонної ДНК. Відповідно до мети вирішували наступні завдання:

? Вивчити процес температурної інактивації бактеріофага ZF40 і одержати та проаналізувати стійкі до температури мутанти clear–типу

? Запровадити метод очищення нестабільних віріонів фага ZF40

? Встановити структурну організацію віріонної ДНК ервініофага ZF40

? Встановити білковий склад віріона фага ZF40 і проаналізувати формування капсидів у фага ZF40 та його с-мутантів

? Здійснити генералізовану трансдукцію плазміди pKM101 фагом ZF40

Об'єкт дослідження – помірний бактеріофаг ZF40 фітопатогенної бактерії E. carotovora subsp. carotovora та його clear-мутанти.

Предмет дослідження – структурна організація геному помірного бактеріофага ZF40, структурні поліпептиди віріона фага ZF40, генералізована трансдукція генетичних маркерів.

Методи дослідження – вірусологічні, мікробіологічні, генетичні, молекулярно–біологічні, біохімічні; комп'ютерна обробка даних.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі вперше показано, що термічна інактивація бактеріофага ZF40 має двостадійний характер, який свідчить про гетерогенність популяції фага ZF40. За допомогою термічної інактивації одержано набір температуростійких мутантів clear-типу, віріонна ДНК яких має інший характер пермутації, ніж така фага ZF40 дикого типу.

В роботі вирішена проблема стабілізації віріонів фага ZF40 із застосуванням буфера на основі фіколу. Для одержання високоочищених віріонів фага ZF40 вперше запропоновано метод двостадійного центрифугування в градієнті метризаміду з наступною їх очисткою в градієнті густини хлористого цезію.

Побудовано фізичну карту сайтів рестрикції для ендонуклеаз рестрикції HindIII, BglII, PstI та BamHI геному фага ZF40 і визначено основні параметри циклічної пермутації.

Вперше показано, що для віріонних ДНК фага дикого типу і його температуростійких clear–мутантів властива циклічна пермутація геному. Неперервний характер пермутації у фага дикого типу змінюється на дискретний у температуростійких мутантів clear-типу.

Встановлено, що віріон фага ZF40 складається з трьох мажорних білків з молекулярними масами 39,2, 31,2 і 19,3 кДа, які віднесені до структурних білків капсида, футляру та стержня відповідно. За будовою та білковим складом фаг ZF40 є подібним до фага Р2 Escherichia coli.

Структурна організація геному фага ZF40 є мозаїчною. Вона поєднує в собі циклічно пермутовану ДНК, упаковану в віріон Р2-типу, для якого властива упаковка за headful-механізмом.

Доведено, що наслідком циклічної пермутації фагового геному є здатність фага ZF40 здійснювати загальну трансдукцію генетичних маркерів.

Практичне значення одержаних результатів. Запроваджено буферну систему і розроблено метод для довгострокового зберігання фагових часток, який може бути використано в лабораторній практиці у випадку інших нестабільних бактеріофагів родини Enterobacteriaceae.

Здійснення фагом ZF40 генералізованої трансдукції плазміди pKM101 є основою для створення векторної системи для переносу генів у E. carotovora на основі трансдукуючих фагових часток.

Результати дисертаційної роботи, відносно структури ДНК фага ZF40, є підґрунтям для детального дослідження молекулярно-генетичної організації і виявлення генетичних детермінант патогенності у складі бактеріальних і фагових геномів. На основі одержаних даних можлива оцінка патогенного потенціалу E. carotovora.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна робота, обробка та аналіз одержаних результатів досліджень здійснено безпосередньо здобувачем. Автором проведено термічну інактивацію фагових часток ZF40, відібрано та проаналізовано фагові clear–мутанти, здійснено їх комплементаційний аналіз, вивчено стійкість окремих мутантів до температури, проведено рестрикційний аналіз одержаних с-мутантів. Розроблено метод очистки нестабільних віріонів фага ZF40, вивчено структуру віріонної ДНК досліджуваного ервініофага, виявлено циклічну пермутацію фагового генома, виділено і проаналізовано капсиди фага ZF40, його clear та вірулентних мутантів, а також здійснено генералізовану трансдукцію плазміди pKM101 та вивчено властивості одержаних трансдуктантів.

Встановлення поліпептидного складу часток фага ZF40, визначення кількості білка і оптимізацію умов зберігання фаголізатів проведено із співробітниками відділу молекулярної генетики бактеріофагів к.б.н. Л.А. Максименко, к.б.н. Л.В. Романюк і к.б.н. А.І. Кушкіною, які є співавторами відповідних публікацій.

Планування напрямку роботи, формулювання основних положень і висновків дисертаційної роботи проведено під керівництвом д.б.н. Ф.І. Товкача.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи доповідались на міжнародних конференціях: „Фітопатогенні бактерії. Фітонцидологія. Аллелопатія” (Київ, Україна, 2005), 10-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених „Биология – наука XXI века” (Пущіно, Росія, 2006), „Мікробні біотехнології” (Одеса, 2006), Російській школі-конференції „Генетика микроорганизмов и биотехнология” (Москва – Пущино-на-Оке, 2006), The young scientists` and students` International scientific conference „Modern problems of microbiology and biotechnology” (Odessa, 2007), „Биоресурсы и вирусы” (Київ, Україна, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 робіт, з них 3 - статті в фахових виданнях, 2 статті в збірниках і 6 тез доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, яка має 6 розділів, аналізу та узагальнення результатів досліджень, списку використаних літературних джерел, що охоплює 150 найменувань. Дисертацію викладено на 131 сторінці машинописного тексту. Фактичний матеріал дисертації подано у вигляді 30 рисунків і 7 таблиць.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури, який складається з трьох підрозділів, охарактеризовано загальну молекулярно-генетичну організацію бактеріофагів, описано структуру фагових геномів та механізми трансдукції генетичних маркерів. Огляд літератури обґрунтовує доцільність виконання роботи.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

В роботі були використані такі бактерії і бактеріофаги: 7 штамів E. carotovora subsp. сarotovora (Есс), 1 штам E. horticola, 4 штами Escherichia сoli, 2 штами Salmonella typhimurim; коліфаги л, Р1Cmcts, Т4D, T7M, FE44, ервініофаги 49, ZF40 та його clear-мутанти: с3, с6, с9, с10 [Кушкина, Товкач, 2005], с5/5, с1, с1А3, сВ/3, с2/5, с6/5, с7/5, с8/5 [Панщина, Товкач, 2006]; ZF40с5/5/М2-4/50RI [Черватюк, 2007]; ZF40/421 [Кушкина и др., 2006]; Р22.

Для вирощування бактерій і бактеріофагів використовували повноцінні і мінімальні середовища, склад яких приведено в [Миллер, 1976].

Фагові частки концентрували та очищували диференційним центрифугуванням в роторі SW 28 Spinco L7-70 при 26000 об/хв, протягом 1,5 години. Фагові частки зберігали в буфері STMF такого складу: 200 мМ NaCl;10 мМ тріс-HCl, pH 7,5; 10 мМ Mg2+, 4% фіколу [Кушкина и др., 2004 ].

Більш глибоку очистку віріонів проводили центрифугуванням в преформованих градієнтах густини: метризаміду, сульфату та хлориду цезію.

Градієнт метризаміду формували за добу до досліду. Він складався з чотирьох частин (об`ємом по 1 мл): 20, 30, 40 і 50 %. Після згладжування градієнту на нього наносили суспензію фага (0,6 мл).

Градієнти густини CsCl (1,42 г/см3 і 1,60 г/см3) та Cs2SO4 (1,27 г/см3 і 1,40 г/см3) готували безпосередньо перед центрифугуванням. Суспензію фага об`ємом 0,6 мл наносили на градієнт і центрифугували 4 години в роторі SW 55, при 10 °С.

Після центрифугування смуги з вірусним матеріалом, відбирали шприцем або автоматичною піпеткою. Для аналітичних цілей градієнт фракціонували «скапуванням». Об`єм фракції при цьому дорівнював 100 мкл. Фракції аналізували на кількісний вміст білку, концентрацію вірусних часток і показник заломлення.

Створення оптимальних умов для вивчення термічної інактивації фага здійснювали в буферах Т (100 мМ тріс-HCl, рН 7,5) та ТЕ (100 мМ тріс-HCl, рН 7,5; 10 мМ Nа2EDTA) в діапазоні температур від 40 до 60 °С . Для пошуку стійких до температури мутантів проводили не менш ніж чотири цикли підрощування-інактивації фагів у буфері ТЕ при температурі 58 °С. Шток фага з концентрацією 4Ч1010 БУО/мл розводили у 50 разів буфером ТЕ. Фагову суспензію розливали по аліквотам об`ємом 400 мкл та інкубували при зазначеній температурі протягом 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 і 40 хв, після чого охолоджували до 0 °С. Облік результатів проводили за показником виживання фага, який виражали через співвідношення титрів, отриманих після інкубації при підвищеній температурі (Р) до титрів фага в контрольних зразках (Ро). Криві інактивації були побудовані в координатах: lg P/Po – t °C.

Фагові мутанти clear–типу клонували не менш ніж 5 разів. Окремі с-мутанти отримували методом зливного лізису в титрах 4–6Ч1010 БУО/мл їх комплементаційний аналіз проводили за методом [Кушкина, Товкач, 2005].

Фагові капсиди розділяли в нативній системі з використанням гелів агарози в 40 мМ тріс-фосфатного буферу, рH 7,8 без додавання Nа2ЕДТА [Lata et al., 2000].

SDS-ПААГ–електрофорез структурних поліпептидів віріона проводили стандартним методом. Молекулярні маси фагових поліпептидів визначали за допомогою комп`ютерної програми Total Lab (версія 2.01).

Трансдукцію плазміди pKM101 здійснювали на твердому середовищі LB. На бактеріальні газони реципієнтів (Есс RC5297 і RC5297Nalr) наносили по 5 мкл вихідного фаголізату (2,4Ч1010 БУО/мл) та його розведень 10-1, 10-2 і 10-3. Агарові блоки розміром 3Ч3Ч3 мм з клітинами індикаторного штаму, які вижили після інфікування фагами переносили в 2 мл рідкого середовища LB і інкубували 18 годин при 28 °С . Відбір і клонування трансдуктантів, їх здатність до росту та стабільне успадкування антибіотикостійкості перевіряли на середовищі LB з ампіциліном (50 мкг/мл) і налідиксовою кислотою (20 мкг/мл). Для кількісного визначення частоти трансдукції, клітини вирощували в рідкому середовищі LB до концентрації 1,4Ч108 кл/мл і заражали фагами. Суміш інкубували 20 хв при 28 °С. Після адсорбції її висівали на чашки з ампіциліном і далі визначали кількість клонів, стійких до ампіциліну. Частоту трансдукції визначали за співвідношенням числа трансдуктантів до числа бляшкоутворюючих часток в 1 мл (БУО/мл) [Романюк и др., 1985].

Виділення фагової ДНК здійснювали детергент-фенольним методом [Товкач и др., 1988]. Плазмідну ДНК виділяли лужним методом [Kado, Liu, 1981].

Для рестрикційного аналізу фагової ДНК були використані ендонуклеази рестрикції: HindIII, BglII, PstI та BamHI.

Для ідентифікації кінцевих рестрикційних фрагментів використовували екзонуклеазу III E. coli. Для цього продукти гідролізу осаджували спиртом, розчиняли у відповідному буфері для рестрикції та гідролізували ендонуклеазою рестрикції BamHI протягом 3-х годин.

Розділ 3. ДОСЛІДЖЕННЯ ТЕМПЕРАТУРНОЇ ІНАКТИВАЦІЇ ПОМІРНОГО БАКТЕРІОФАГА ZF40 ERWINIA CAROTOVORA SUBSP.

CAROTOVORA

Для досягнення основної мети роботи була поставлена задача одержати фагові мутанти, які б мали суттєві зміни в структурі ДНК і були в подальшому використані для визначення циклічної пермутації геному фага ZF40.

Такі мутанти виділяли стандартним методом температурної інактивації. Було встановлено, що термоінактивація фага ZF40 характеризується двома стадіями (рис. 1, а).

Для того, щоб збагатити фаговий шток мутантами, стійкими до дії температури, було проведено чотири цикли підрощування-інактивації. В результаті цього у фракції збагачених температурних мутантів, ZF40rt2/4, (рис. 1., б) виявлено мутанти clear-типу. Частота їх появи складала 0,53 %. В подальшому було відібрано і клоновано 11 clear-мутантів. Їх повторно проаналізували за допомогою термічної інактивації. Виявлено, що дані мутанти, порівняно з фагом дикого типу і його точковим мутантом с6, більш стійкі до дії температури. Встановлено, що один із цих мутантів - ZF40с5/5 здатний здійснювати продуктивну інфекцію лізогена Есс 62А – d1/10-21. У зв`язку з цим він може розглядатися як вірулентний мутант фага ZF40.

За допомогою рестрикційного аналізу показано, що у одержаних c-мутантів, порівняно з фагом ZF40wt і його точковим мутантом с6, змінюється загальна картина рестрикції (див. розділ 5). Наявність додаткових рестрикційних смуг доводить, що ці мутанти можуть мати більш суттєві зміни в молекулі віріонної ДНК; можливо, це зміни делеційно-вставочного типу.

Розділ 4. МЕТОДИ ОЧИЩЕННЯ НЕСТАБІЛЬНИХ ВІРІОНІВ

ФАГА ZF40

Необхідною передумовою для вивчення структурно-морфологічної організації бактеріальних вірусів і їх таксономії є ретельне очищення віріонів [Ackerman, 1999]. Сучасна протеоміка фагів, яка доповнює геномний сиквенс, неможлива без наявності препаратів чистих фагових часток [Roberts et. аl., 2004].

При дослідженні фага ZF40 перед нами постала проблема, пов`язана з нестабільністю його віріонів. Для її розв`язання було використано кілька незалежних підходів. На відміну від фага Т4 (морфотип А2), для фага ZF40 характерним є більш глибоке руйнування фагових часток після скорочення хвостового відростка. Ми оцінювали ступінь стійкості фага ZF40 у порівнянні з коліфагом Р1, того ж морфотипу А1, але більшого розміру. Метод температурної інактивації дозволив виявити парадоксальний факт. Фаг Р1 виявився в 10 разів більш стійким до дії температури, ніж фаг ZF40, віріон якого в два рази менший за розміром.

Для попередження неконтрольованого шокування фагових капсидів, при одержанні фага ZF40 в препаративній кількості, ми вперше запропонували буфер STMF наступного складу: 200 мМ NaCl;10 мМ тріс-HCl, pH 7,5; 10 мМ Mg2+, 4% фіколу.

Подальші дослідження були направлені на розробку методу очистки нестабільних віріонів фага ZF40. Детальний аналіз показав, що віріони фага руйнуються на всіх етапах очищення і, особливо, при використанні традиційного методу градієнтного центрифугування в солях важких металів. Наприклад, у випадку CsCl тільки 0,2 % фагових часток залишаються нативними.

Вперше для очищення фага в роботі використали метризамід – йодоване похідне бензойної кислоти. У нашому випадку використання градієнту густини метризаміду дало змогу позбавитися від макромолекулярних бактеріоцинів (фагові хвостові відростки). При цьому фагові частки з густиною 1,23 г/см3 звільнялися від інших домішок клітинного походження, густина яких складала 1,14 г/см3.

Для ще більш ретельного очищення віріонів ми використали поетапний метод очищення фагових часток - ультрацентрифугування в градієнті метризаміду з наступною очисткою в градієнті хлористого цезію.

Оцінку чистоти одержаних фагових препаратів проводили методом електрофорезу. Було встановлено, що фагові частки, очищені в градієнті метризаміду, можливо, неспецифічно пов`язані з клітинною РНК (рис. 2, доріжки 3, 4, 5, 6). Препарати ж фага, отримані за допомогою подвійного градієнтного центрифугування, не містять домішок ні клітинних нуклеїнових кислот, ні вільної віріонної ДНК (рис. 2, доріжки 1, 2).

Таким чином, з використанням запропонованого методу одержані високоочищені віріони і ДНК, які були вихідним матеріалом для рестрикційного аналізу і для аналізу поліпептидів фага ZF40.

Рис. 2. Електрофореграма очищених препаратів бактеріофага ZF40. Препарати одержано подвійним градієнтним центрифугуванням (1, 2) і в градієнтах: метризаміду (3, 4, 5, 6) і CsCl (7, 8). 2, 4, 6 – зразки, оброблені 0,5 % SDS при 60 С, 10 хв. Стрілками позначено: а–„стартове” розміщення нативних капсидів і ДНК-білкових комплексів; б, в та г – положення ДНК нефагового походження.

Розділ 5. ВИВЧЕННЯ ПЕРМУТАЦІЇ ВІРІОННОЇ ДНК ЕРВІНІОФАГА ZF40

Для вивчення внутрішньомолекулярної організації фагової ДНК поряд з фагом ZF40 дикого типу були використані його температурні clear–мутанти описані вище (розділ 3). Враховуючи те, що утворення неточкових мутацій с-типу може суттєво змінювати загальну структуру ДНК, віріонні ДНК цих мутантів були проаналізовані на наявність змін делеційно-вставочного типу, які у випадку пермутації могли б вплинути на молярність фрагментів рестрикції.

Рестрикційний аналіз ДНК ендонуклеазою BamHI показав, що температуростійкі мутанти можна розділити на три групи. Перша з них представлена єдиним мутантом с5/5, профіль ДНК-рестрикції якого лише частково відрізняється від такого ДНК фага дикого типу (рис. 3; а, б).

У гідролізаті ДНК с5/5, окрім субмолярного фрагмента б, характерного для обох фагів, у незначній кількості виявляються й інші фрагменти, в тому числі і фрагмент в, розмір якого складає 14,9 кб.

Друга група включає мутанти (с1, с1А3, с6/5, с7/5 і с8/5), в ДНК яких за аналогічних умов рестрикції та електрофоретичного розділення, субмолярні фрагменти б і в не виявляються (рис. 3; а, трек 3). В останньому випадку два мутанти третьої групи (сВ/3 і с2/5), крім фрагментів б і в, характеризуються наявністю додаткових фрагментів б` і в`. Однак, усі додаткові фрагменти не можна вважати субмолярними, бо поряд з основними фрагментами А, В, С і (D) вони представлені в еквімолярних кількостях (рис. 3; б, трек 5).

Перевірка показала, що додаткові фрагменти не є продуктами неповного гідролізу ДНК: профілі рестрикції не змінюються при надлишку ендонуклеази BamHI, або при збільшенні часу гідролізу. Доказом того, що вони є продуктами гідролізу пермутованої ДНК, є їх зникнення при обробці ДНК ендонуклеазами BamHI та HindIII (рис. 4).

Комп`ютерний аналіз денситометричних зображень електрофореграм дозволив виявити циклічну пермутацію в геномі фага ZF40. Встановлено, що фрагмент В BamHI-рестрикта має меншу денситометричну інтенсивність, ніж послідуючий фрагмент С. Його кількість складає 0,85 від кількості фрагмента С.

Рис. 3. Рестрикційний аналіз ДНК clear-мутантів фага ZF40 (а, б) та ідентифікація BamHI-кінцевих фрагментів фагового геному (в). ДНК фагів ZF40 (2, 7), с8/5 (3), с5/5 (4) і сВ/3 (5). HindIII-фрагменти ДНК фага – 1, 6 та 10. А, В, С – основні фрагменти; б, б`, в і в` - додаткові фрагменти рестрикції. 8 і 9 – BamHI-гідроліз ДНК ZF40 після її обробки екзонуклеазою III протягом 30 і 40 хв., відповідно

Цю «аномалію» можна пояснити циклічною перестановкою нуклеотидів у фаговому геномі. При внесенні сайт-специфічного розриву в набір (популяцію) пермутованих молекул ДНК однакової довжини, кінцеві фрагменти рестрикції будуть гетерогенними за розміром [Jackson et al., 1978]. При електрофоретичному розділенні вони «втрачають» інтенсивність за рахунок зменшення дискретності. Тому можна припустити, що фрагмент В BamHI включає послідовності, які розміщені на одному з кінців ДНК. Те, що саме цей фрагмент є одним з двох кінцевих, було доведено за допомогою двонаправленого зменшення розміру ДНК ZF40 екзонуклеазою III E. coli та послідуючим BamHI-аналізом продуктів гідролізу (рис. 3; в – 8, 9). Поступове зменшення відносної кількості фрагментів А і В BamHI протягом цієї реакції свідчить про те, що сайти, які утворюють ці фрагменти, розміщені на кінцях віріонної молекули ДНК.

Отже, за допомогою ферментативного аналізу, вперше показано, що для віріонних ДНК, як для фага ZF40 дикого типу, так і його температурних clear–мутантів, властива циклічна пермутація геному.

Наявність кінцевих гетерогенних фрагментів, виявлених за допомогою ендонуклеази HindIII з одним сайтом рестрикції, є додатковим аргументом на користь пермутації ДНК фага дикого типу і його температурних c-мутантів (рис. 4, доріжки 3, 6, 9, 13).

Гетерогенність фрагмента В HindIII виражена в різному ступені для мутантів і фага ZF40. Поряд з незвичайним характером рестрикції ДНК таких мутантів, як, наприклад, сВ/3 (рис. 3; б – 5) і с2/5 (рис. 4, доріжки 11 - 13), зазначений факт може відображати наявність неординарних циклічних перебудов нуклеотидної послідовності.

У цих мутантів фаговий геном складається з популяції молекул, яка, поряд з основною частиною (фрагменти А, В, С, D BamHI), містить додаткову (наприклад, фрагменти б`, в`, С, D - або інший набір). Такі набори фрагментів утворюються внаслідок заповнення фагової головки ДНК, яка має зміни делеційно-вставочного типу, за headful-механізмом при дозріванні фага [Jackson et al., 1978]. Не дивлячись на те, що точне визначення характеру зазначених змін в структурі фагового геному не входило в задачі наших досліджень, його перспектива не викликає сумніву. Ці мутації, ймовірно, є плейотропними, і, крім зміни упаковки ДНК в капсид, суттєво впливають на імунну область геному, порушуючи встановлення лізогенії у E. сarotovora.

Раніше було встановлено, що неперервна та дискретна пермутація віріонної ДНК властива для двох помірних фагів 59 і 49 аміловороподібної фітопатогенної бактерії E. horticola [Товкач и др., 2002]. Результати наших досліджень вказують на те, що це явище може бути широко розповсюджене серед ервініофагів. Проте, помірний бактеріофаг ZF40 E. сarotovora є унікальним, тому що популяція його ДНК поєднує в собі два види внутрішньогеномної гетерогенності – циклічну пермутацію і когезивні кінцеві структури. У зв`язку з тим, що поєднання рас- і cos-механізму упаковки в одного і того ж фага принципово неможливе, ми припускаємо два альтернативні способи формування гетерогенної популяції віріонної ДНК фага ZF40. По-перше, вона може відображати наявність двох частково споріднених, фізіологічно нероздільних компонентів – фага-помічника і фага-сателіта. Найбільш відомою аналогією для цього випадку може виступати система фагів Р2-Р4 E. сoli [Deho, Ghisotti, 2006]. З іншого боку, виявлене нами кільцеутворення пермутованої ДНК і, відповідно, „злипання” кінцевих фрагментів, відбувається за рахунок молекул(и), подібних до білка N фага Mu E. сoli, який упаковує ДНК в капсид за рас-механізмом [Paolozzi, Ghelardini, 2006].

Для того, щоб встановити параметри пермутації фагового геному, була побудована карта сайтів рестрикції (рис. 5).

Рис. 5. Фізична карта сайтів рестрикції геному фага ZF40 для ендонуклеаз рестрикції HindIII, BglII, PstI та BamHI. Розмір віріонної ДНК 45,8 кб прийнято за 100% (верхня шкала). А, В, С і D – фрагменти рестрикції

Картування проводили за допомогою простої стратегії: використовували одиничний і подвійний гідроліз фагової ДНК ендонуклеазами рестрикції HindIII (1 сайт), BglII (1 сайт), PstI (1 сайт) і BamHI (3 сайти). Ми підтвердили, що BamHI-фрагменти А і В є кінцевими.

Враховуючи результати рестрикційного аналізу с-мутантів і кінцевих фрагментів запропоновано схему пермутації фагового геному. Встановлено, що для фага ZF40 пермутація складає 56 %. Рас-сайт розміщений в районі фрагмента В BglII, але його точна ідентифікація потребує додаткових досліджень.

Основна геномна одиниця, або перший headful віріонної ДНК, який, як правило, захищається двома молекулами пакази [Oliveira, 2005], у випадку фага ZF40 складає 44 %. Для clear–мутантів ця величина може коливатися від 53 до 96%, що свідчить про зміну характеру пермутації в напрямку її дискретності. У мутанта с2/5 ця дискретність виражена найбільше. Як видно із BamHI-рестрикції ДНК, він може упаковувати дві або три геномні одиниці з дискретно переставленими нуклеотидами.

Розділ 6. ЗАГАЛЬНА БУДОВА ВІРІОНУ БАКТЕРІОФАГА ZF40 ТА ФОРМУВАННЯ ФАГОВИХ КАПСИДІВ

Як було нами встановлено, геном фага ZF40 складається з циклічно пермутованих молекул ДНК, за морфологією він є близьким до фага Р2 Escherichia coli, який використовує стратегію cos-упаковки ДНК [Nilsson, Ljungquist, 2006]. Для того, щоб остаточно довести існування генного мозаїцизму цієї пари морфологічно споріднених фагів, ми ретельно проаналізували білковий склад віріонів фага ZF40. В роботі використовували фагові препарати, очищені за допомогою подвійного градієнтного центрифугування (розділ 4).

На рис. 6 представлені електрофореграма і денситограма білкового профілю віріона фага ZF40. У його складі виявлено 13 структурних поліпептидів – р1 – р13 (рис. 6, а – 1) з молекулярними масами від 16,6 до 90,7 кДа.

Рис. 6. SDS-ПААГ–електрофорез структурних поліпептидів віріона ервініофага ZF40. а – електрофореграма: 1 – поліпептиди віріона ZF40 (р1 – р13); 2 – маркерні білки (фосфорилаза, альбумін, трипсин-інгібітор; молекулярні маси наведено в кДа); б – денситограма (відмічені деякі структурні поліпептиди). По осі абсцис – молекулярна маса (М) в кДа, по осі ординат – інтенсивність (I) електрофоретичних смуг у пікселях

Їх можна розділити на 3 групи: мінорні (р1, р2, р3, р4, р5, р7 і р9), проміжні (р6, р11 і р13) і мажорні білки (р8, р10 і р12). Мажорні структурні білки представлені трьома поліпептидами з молекулярними масами 39,2, 31,2 і 19,3 кДа. Ми спробували співвіднести знайдені білки з певними структурними частинами віріона ZF40.

Відомо, що найбільш консервативною частиною віріона бактеріофагів є стержень хвостового відростка. Як правило, він утворюється за рахунок однакових за своєю молекулярною масою поліпептидів, яка складає близько 20 кДа для фагів родини Myoviridae [Ackerman, 1999]. Згідно нашим даним для фага ZF40 на білок стержня претендує р12 з молекулярною масою 19,3 кДа. Структурним поліпептидом головки, скоріш за все, є р8, який має молекулярну масу 39,2 кДа, його відносний вміст (26,6 %) приблизно дорівнює вмісту поліпептиду стержня (31,7 %). Третій поліпептид р10, вірогідно, представляє собою структурний компонент футляра хвостового відростка, його кількісний вміст (13,8 %) є найменшим серед цих мажорних структурних білків віріона.

Для того, щоб підтвердити зроблені припущення, ми порівняли одержані результати з даними літератури, які стосуються структурних білків добре вивчених фагів Р2, Т4, Р1 і каротоворіцина Er (табл. 1). Найбільша подібність спостерігається між структурними білками стержня, різниця їх молекулярних мас складає лише близько 4 кДа, тоді як за розміром вони абсолютно однакові для фагів Р2 і ZF40.

Таблиця 1

Молекулярні маси (кДа) структурних білків бактеріофагів родини Myoviridae ZF40, Р2 [Lengyel et al., 1973], T4 [Miller et al., 2003], P1 [Јobocka et al., 2004] і каротоворіцина Еr [Nguyen et al., 2001]

Основні (мажорні) білки | Бактеріофаг

ZF40 | Р2 | T4 | P1 | Еr

головки:

1 | 39,2 | 36,1 | 43,0 | 44,0 | -

2 | - | - | 40,4 | - | -

3 | - | - | 9,1 | - | -

хвостового відростка:

футляра | 31,2 | 43,2 | 71,3 | 56,9 | 50,0

стержня | 19,3 | 19,1 | 18,5 | 22,3 | 19,0

Примітка: « - » - відповідний білок відсутній

Отже, фаг ZF40 за морфологічною будовою та білковим складом подібний до фага Р2. Але на відміну від рас-фага ZF40, ДНК фага Р2 упаковується за соs-механізмом. Даний факт додатково підтверджує положення про те, що геноми фагів є мозаїчними структурами. Така мозаїка може утворюватись за рахунок рекомбінації модулів.

Оскільки у випадку пермутації ДНК її розмір прямо залежить від розміру капсиду, то вивчати упаковку доцільно, аналізуючи капсидні структури. Ми створили просту експериментальну систему для вивчення процесу упаковки ДНК фага ZF40. Перехід неперервної пермутації до дискретної свідчить про те, що змінюється процес упаковки фагової ДНК. Для того, щоб це показати, ми проаналізували формування фагових капсидів, заповнених ДНК, за їх рухливістю. Використовували електрофорез в нативній системі, в гелях агарози, а капсидні структури виявляли за наявністю упакованих молекул ДНК.

Встановлено, що фаг дикого типу і точковий мутант с6 мають дві форми капсидів С1 і С2. С1 є основним капсидом. Він характеризується найбільшим молярним вмістом в концентрованих фагових лізатах. У температурних с-мутантів рухливість основного капсиду змінюється, що свідчить про порушення процесу його збирання. Найбільш показовим в цьому аспекті є формування капсиду у вірулентного мутанта ZF40/421. Для даного фага спостерігається формування додаткового капсиду С3 (рис. 7).

Для детального вивчення капсидів фаги ZF40 с5/5 і ZF40/421 адаптували до нового господаря (культура Есс М2-4/50RI). Аналіз одержаних варіантів дозволив виявити додатковий капсид С3 у фага ZF40c5/5, а також збільшення рухливості основного капсиду (рис. 7, доріжка 3). Ці результати свідчать про наявність мутації, що порушуює процес збирання, а також про можливу невідповідність бактеріальних і фагових шаперонів один одному, які приймають участь у збиранні фага. Інший фаг, ZF40/421, був не здатним розмножуватись на культурі Есс М2-4/50RI і характеризувався зниженням ефективності висіву на індикаторному штамі на 2 порядки. Це свідчить не про адаптацію до R/M системи, а про наявність більш суттєвих дефектів в упаковці ДНК.

Отже, використовуючи вірулентні мутанти фага ZF40 – c5/5 та 421 і дві чутливі культури Ecc RB5297 та М2-4/50RI, ми створили просту експериментальну систему, яка дозволяє вивчати headful-механізм упаковки геномної ДНК ервініофага ZF40.

Розділ 7. ГЕНЕРАЛІЗОВАНА ТРАНСДУКЦІЯ ПЛАЗМІДИ pKM101 БАКТЕРІОФАГОМ ZF40

Всі фаги з пермутованими ДНК характеризуються здатністю здійснювати генералізовану трансдукцію бактеріальних і плазмідних генетичних маркерів [Hertwig, 1999]. У ервіній ця властивість була раніше встановлена для бактеріофагів 59 і 49 [Муквич и др., 1991].

При вивченні перенесення екстрахромосомальних генів фагом ZF40 та його вірулентними мутантами ZF40c5/5 і ZF40/421, ми використовували плазміду pKM101. Відомо, що трансмісивна плазмида pKM101 належить до N–групи несумісності (Inc N) і характеризується широким колом хазяїв. Вона є багатокопійною і утворює мультимерні форми; так, наприклад, в донорному штамі S. typhimurium ТА38 плазмідна ДНК знаходиться в двох формах - мономерній та димерній [Горб, Товкач, 2002]. Плазміда pKM101 містить ген ard, продукт якого інгибує активність рестриктаз I-го типу, що сприяє подоланню pKM101 рестрикційного бар`єру клітини і адаптації до хазяїна, а також несе маркер стійкості до ампіциліну (Apr) [Завильгельский и др., 1994]. Даній плазміді властива здатність до трансмісії у E. carotovora [Горб, Товкач, 2002]. Молекулярна маса pKM101 складає 35,4 кб, що не перевищує пакувальну ємність головки фага ZF40 - 45,8 кб [Товкач, 2002] - тому вона могла б переноситися, як аутентична плазміда. Для доведення цього припущення здійснювали експерименти з перенесення плазмідної ДНК мутантами фага ZF40 згідно схеми, яка описана в розділі 2. Для підсилення адсорбції фага використовували тверде середовище LB. Це було зумовлено тим, що процес прикріплення фага до чутливих клітин має двохстадійний характер. Після стадії швидкої адсорбції (10 – 20 хв), відбувається реадсорбція, при якій 50% фага знаходиться в вигляді вільних, неадсорбованих часток [Кушкина, Товкач, 2005].

У роботі використовували три фагові clear-мутанти - с6, с5/5 і 421. Мутант ZF40с6, у порівнянні з фагом дикого типу, характеризується меншим ступенем лізогенізації чутливих індикаторів [Кушкина, Товкач, 2005]. Другий із обраних фагів, ZF40с5/5, є clear-мутантом, стійким до дії температури. Дослідження показали, що ZF40с5/5 і ZF40с6 - представники однієї групи комплементації, k. Однак ZF40с5/5 здатен до репродукції в клітинах специфічного лізогена і його класифіковано як вірулентний мутант [Панщина, Товкач, 2006]. Фаг ZF40/421, як показано в попередньому розділі, має більш суттєві зміни в упаковці ДНК і є також вірулентним мутантом. В результаті експериментів встановлено, що частота трансдукції трансмісивної плазміди pKM101 мутантом ZF40с5/5 на твердому середовищі LB складала 10-4, що на порядок нижче, ніж частота трансдукції мутантом ZF40с6. Зниження частоти трансдукційного переносу маркера Apr фагом ZF40с5/5, у порівнянні з фагом ZF40с6, може свідчити про дефекти упаковки ДНК в віріон. Фаг ZF40/421 взагалі не здійснював трансдукцію плазміди pKM101. Кількісне визначення частоти трансдукції проводили в рідкому середовищі LB. Частота трансдукційного переносу Apr-маркера фагом ZF40с6 знаходилась в межах від 2 до 8х10-8. Ці результати добре узгоджуються з такими для ервініофагів 49 і 59 [Романюк и др., 1985] та є близькими до інших систем [Mann, 1997]. Вивчення позахромосомної ДНК штамів Есс RC5297(pKM101) та Есс RC5297Nalr(pKM101), отриманих при трансдукції фагами ZF40с6 і ZF40с5/5, показало наявність в клітинах аутентичної плазміди (рис. 8).

Рис. 8. Плазмідні спектри ДНК трансдуктантів E. carotovora RC5297, які несуть аутентичну плазміду pKM101: Есс RC5297 (pKM101), одержані при трансдукції фагом ZF40с5/5 (1, 2) і фагом ZF40с6 (3, 4); 5, 6 і 8 - 10 – Есс RC5297Nalr (pKM101), одержані при трансдукції фагами ZF40с5/5 і ZF40с6 відповідно; 7 – Есс RC5297 (pKM101); 11 – контрольний зразок вихідного штама Есс RC5297; I і II – мономерна та димерна форми плазміди pKM101 відповідно. Сh – хромосомна ДНК

У контрольному зразку Есс RC5297 рис. 8 (доріжка 11) плазміда була відсутня. Плазмідні спектри трансдуктантів свідчать про те, що ДНК pKM101 знаходиться в мономерній та димерній формі. Ця особливість властива не тільки донорному штаму S. typhimurium ТА38, але й транскон`югантам Есс (pKM101) [Горб, Товкач, 2002].

Для трьох з досліджуваних клонів трансдуктантів властива спонтанна індукція каротоворіцинів, яка, ймовірно, є наслідком дестабілізації дефектної лізогенії при репродукції бактеріофага ZF40 [Кушкина, Товкач, 2006]. Дефектна лізогенія у E. carotovora проявляється за рахунок кілерної активності вірусоподібних часток (VLP) типу фагових хвостових відростків або макромолекулярних каротоворіцинів (MCTV). Нещодавно були виявлені ДНК-вмістні частки, які утворювались за рахунок експресії дефектних профагів E. carotovora [Иваница, Товкач, 2007]. Відомо, що окремі капсиди і віріони дефектних фагів можуть упаковувати не тільки свій геном, але й позахромосомну і бактеріальну ДНК. Вони також здатні до перенесення цієї ДНК [Прозоров, 1996]. Однак наші результати вказують на кореляцію між збільшенням частоти від кількості адсорбованого фага, і свідчать про те, що саме фаг ZF40, а не VLP-частки, здійснює таке перенесення.

За допомогою генералізованої трансдукції вдалося показати, що лізогенам, які несуть фаг ZF40, властива імунність на рівні цитоплазматичної репресії.

Таким чином, вперше показано, що помірний бактеріофаг ZF40 E. carotovora здатен здійснювати перенесення позахромосомних генів плазміди pKM101 за типом загальної трансдукції. Перенесення маркера антибіотикостійкості співвідноситься з фактом циклічної пермутації фагового геному. Одержані результати створюють передумови для подальшого використання бактеріофага ZF40 як трансдукуючого вектора для генетичного вивчення E. carotovora.

ВИСНОВКИ

1. Термічна інактивація бактеріофага ZF40 має двостадійний характер. Методом термоінактивації одержано стійкі до температури варіанти фага (rt-типу), серед яких мутанти clear-типу складають 0,53 %.

2. У температуростійких мутантів clear-типу на відміну від фага ZF40 виявлено зміну характера пермутації і формування капсидів із збільшеною електрофоретичною рухливістю.

3. Геном фага ZF40 являє собою набір (популяцію) циклічно пермутованих молекул ДНК. Циклічна перестановка нуклеотидів складає 56%. Неперервний характер пермутації у фага дикого типу змінюється на дискретний у температуростійких мутантів clear-типу.

4. Віріон фага ZF40 складається з трьох мажорних білків з молекулярними масами 39,2, 31,2 і 19,3 кДа, які віднесені до структурних білків капсиду, футляру