Київський національний університет імені Тараса Шевченка

ПЕРЕПЕЛИЦЯ СЕРГІЙ МИКОЛАЙОВИЧ

УДК 539.199

РОЛЬ ПРОТИІОНІВ ЛУЖНИХ МЕТАЛІВ У КОНФОРМАЦІЙНІЙ ДИНАМІЦІ ДВОСПІРАЛЬНИХ ПОЛІНУКЛЕОТИДІВ

Спеціальність 01.04.14 – теплофізика і молекулярна фізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на фізичному факультеті Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Наукові керівники: академік НАН України,

доктор фізико-математичних наук, професор

Булавін Леонід Анатолійович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

фізичний факультет, завідувач кафедри молекулярної фізики;

доктор фізико-математичних наук,

Волков Сергій Наумович,

Інститут теоретичної фізики

ім. М.М. Боголюбова НАН України,

головний науковий співробітник відділу квантової теорії молекул і кристалів.

Офіційні опоненти: доктор фізико-математичних наук, професор

Погорелов Валерій Євгенійович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

фізичний факультет, професор кафедри експериментальної фізики;

доктор фізико-математичних наук, професор

Семенов Михайло Олексійович,

Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усікова НАН України, старший науковий співробітник відділу біофізики.

Захист відбудеться “26” лютого 2008 р. о 1430 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .001.08 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03022, м. Київ-22, пр. Глушкова 2, корпус , фізичний факультет, ауд. 500.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “_23_” січня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат фіз.-мат.наук О.С.Свечнікова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Предметом сучасної молекулярної фізики є дослідження структури, термодинамічних, кінетичних та динамічних властивостей молекулярних систем. В рідкому стані, згідно з класифікацією Л.А. Булавіна [1,2], молекулярні системи можна поділити на рідини та рідинні системи, які, в свою чергу, можуть бути поділені на розчини, колоїдні системи, рідкі кристали. Сучасний стан молекулярної фізики характеризується як суттєвим удосконаленням методів експериментальних досліджень (нейтронна спектроскопія, ядерний магнітний резонанс, квазіпружне розсіяння світла, комбінаційне розсіяння світла тощо), так і суттєвим ускладненням об’єктів дослідження, наприклад, розчини біологічних макромолекул, які часто є поліелектролітами. В зв’язку з цим дослідження розчинів електролітів та поліелектролітів стають дедалі актуальнішими. Термодинамічні властивості електролітів впродовж багатьох років ефективно досліджувалися на кафедрі молекулярної фізики фізичного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка [1,2]. Продовжуючи традиції кафедри молекулярної фізики, в дисертації досліджується поліелектроліт – водний розчин полінуклеотидів з протиіонами лужних металів.

Структура дволанцюгових полінуклеотидів являє собою подвійну спіраль, всередині якої знаходяться пари азотистих основ, а назовні – цукро-фосфатний остов. Фосфатні групи остова полінуклеотиду мають від’ємний заряд ~ 1е, який нейтралізується протиіонами лужних металів. Полінуклеотиди в конденсованому стані є сіллю іонів лужних металів, яка у розчині дисоціює на аніонний поліелектроліт і протиіони. Протиіони разом із водою формують навколо макромолекули іон-гідратний шар, який стабілізує структуру подвійної спіралі [3]. Протиіони в іон-гідратному шарі полінуклеотиду перебувають в стані динамічної рівноваги, що характеризується часом життя протиіонів біля атомних груп полінуклеотиду (переважно біля фосфатів). Проведені дослідження методом молекулярної динаміки [4] показують, що протиіон знаходиться біля фосфатної групи полінуклеотиду протягом ~ 1 нс. В цьому часовому діапазоні фосфатні групи полінуклеотиду формують іонний зв’язок з протиіонами. Оскільки коливання іонів на іонному зв’язку характеризуються періодом ~ 0,1 пс [5], то протиіони мають коливатися відносно фосфатних груп остова макромолекули. Пошук таких іон-фосфатних коливань в спектрі полінуклеотидів є важливим для розуміння процесів функціонування нуклеїнових кислот в природних умовах. Наявність або відсутність частоти іон-фосфатних коливань в спектрі полінуклеотиду може характеризувати стан подвійної спіралі та її здатність до значних конформаційних трансформацій (згин, кручення тощо).

Для визначення іон-фосфатних коливань структура молекули полінуклеотиду з протиіонами може бути представлена як динамічна іон-фосфатна гратка. Частоти коливань такої гратки мають знаходитися у тому ж діапазоні, що й коливання зарядів в іонному кристалі. Як відомо, частота іонних коливань в кристалі NaCl знаходиться в низькочастотному спектрі <200 см-1 [5]. Низькочастотний діапазон спектру двоспіральних полінуклеотидів характеризується конформаційними коливаннями, які пов’язані з рухами цілих структурних елементів всередині макромолекули (нуклеїнових основ, кілець рибоз, фосфатних груп тощо) [6]. Експериментальні дані [7,8] свідчать про те, що низькочастотний спектр полінуклеотидів суттєво залежить від концентрації та типу протиіонів. Для інтерпретації існуючих експериментальних спектрів та виявлення моди іон-фосфатних коливань серед інших мод конформаційних коливань полінуклеотиду слід було розробити нові моделі та отримати нові експериментальні дані.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано на кафедрі молекулярної фізики фізичного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка в рамках фундаментальних досліджень за Комплексною науковою програмою “4. Конденсований стан – фізичні основи новітніх технологій” НДР “Фундаментальні дослідження впливу зовнішніх полів на теплофізичні та кінетичні властивості широкого класу рідин (включаючи медико-біологічні) і полімерних систем та фазових переходів в них”, номер теми – 01БФ05101 (№ державної реєстрації – 0104U006147); “Фундаментальні дослідження молекулярних процесів в рідинних, полімерних, медико-біологічних і наносистемах, які визначають їх рівноважні та кінетичні властивості”, номер теми – 06БФ05101, (№ державної реєстрації – 0106U006363).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертації було виявити моди іон-фосфатних коливань в низькочастотному спектрі двоспіральних полінуклеотидів та визначити вплив протиіонів лужних металів на внутрішню динаміку подвійної спіралі макромолекули.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі.

1. Розробити підхід для описання конформаційних коливань двоспіральних полінуклеотидів з протиіонами лужних металів та провести якісний аналіз структури низькочастотного спектру.

2. Визначити константу взаємодії протиіонів з фосфатними групами остова подвійної спіралі з урахуванням діелектричних властивостей іон-гідратного шару полінуклеотиду.

3. Розрахувати частоти іон-фосфатних коливань полінуклеотидів у висушеному стані з протиіонами Li+, Na+, K+, Rb+ та Cs+ та порівняти їх з експериментальними даними.

4. Розрахувати частоти та амплітуди конформаційних коливань полінуклеотидів у В- та А-формах подвійної спіралі з протиіонами лужних металів і визначити вплив протиіонів на внутрішню динаміку подвійної спіралі.

5. Розробити методику приготування зразків водних розчинів двоспіральних полінуклеотидів із різними протиіонами лужних металів та визначити низькочастотні спектри комбінаційного розсіяння світла Na- та Cs-ДНК.

Об’єктом дослідження є конформаційні коливання двоспіральних полінуклеотидів із протиіонами лужних металів, які нейтралізують заряди на фосфатних групах остова макромолекули.

Предметом дослідження є іон-фосфатні коливання та їх вплив на внутрішню динаміку двоспіральних полінуклеотидів.

Методи дослідження. При побудові моделі конформаційних коливань двоспіральних полінуклеотидів з протиіонами використаний підхід чотирьох мас [6]. Взаємодія протиіону з фосфатною групою остова подвійної спіралі описана в рамках теорії іонних кристалів. В ході приготування зразків водних розчинів молекули Na- та Cs-ДНК використовувались методи електрофорезу, спектрофотометрії та ОЖЕ-спектроскопії. Для отримання низькочастотних коливальних спектрів водних розчинів молекули ДНК використовувався метод комбінаційного розсіяння світла.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше показано, що у водному розчині двоспіральні полінуклеотиди разом з протиіонами лужних металів формують динамічну іон-фосфатну гратку.

2. Удосконалено підхід чотирьох мас Волкова і Косевича [6] для описання конформаційних коливань двоспіральних полінуклеотидів з протиіонами лужних металів.

3. Розроблено підхід для визначення електростатичних властивостей двоспіральних полінуклеотидів з протиіонами лужних металів. У рамках цього підходу визначено константу Маделунга іон-фосфатної гратки та діелектричну проникність іон-гідратного шару макромолекули.

4. Вперше показано, що в низькочастотному спектрі двоспіральних полінуклеотидів існує мода іон-фосфатних коливань в області низькочастотного спектру від 95 до 250 см-1. Значення частоти іон-фосфатних коливань зменшується зі збільшенням маси протиіона і залежить від конформації подвійної спіралі та діелектричної проникності середовища.

5. Вперше показано, що легкі протиіони (Li+, Na+ та K+) не збурюють внутрішню динаміку подвійної спіралі полінуклеотиду, а важкі протиіони (Rb+ та Cs+) примушують рухатися всі її структурні елементи.

6. Розроблено методику дослідження низькочастотних спектрів комбінаційного розсіяння світла водних розчинів молекули ДНК з протиіонами Na+ та Cs+.

7. Вперше спостережено моду іон-фосфатних коливань в низькочастотному спектрі комбінаційного розсіяння світла водних розчинів Cs-ДНК. Показано, що разом з модою розтягу водневих зв’язків в парах азотистих основ вона формує смугу 100 см-1.

Практичне значення одержаних результатів.

1. Визначена в даній роботі динамічна іон-фосфатна гратка двоспірального полінуклеотиду з протиіонами може бути застосована для пояснення механізмів взаємодії молекули ДНК з білками та іншими біологічно активними речовинами.

2. Розроблений підхід для описання конформаційних коливань полінуклеотидів з протиіонами може бути використаний при визначенні вкладу протиіонів в теплоємність полінуклеотиду та при дослідженні взаємодії конформаційних збуджень в макромолекулі з електромагнітним полем.

3. Розвинутий підхід для визначення діелектричної проникності іон-гідратного шару полінуклеотиду може бути використаний в методах молекулярної динаміки та Монте-Карло для розрахунку електростатичної взаємодії в поліелектролітах типу ДНК.

4. Виявлений в роботі вплив важких протиіонів на конформаційні коливання двоспіральних полінуклеотидів може пояснювати механізм впливу важких іонів металів на процеси біологічного функціонування молекули ДНК в живому організмі.

5. Розроблена в дисертації методика дослідження низькочастотних спектрів комбінаційного розсіяння світла водних розчинів Na- та Cs-ДНК може застосовуватися для дослідження інших поліелектролітних систем.

Особистий внесок здобувача. Публікації [1-19], що містять основний зміст дисертації, написані у співавторстві з науковими керівниками, а здобувач брав безпосередню участь у їх написанні та оформленні. В роботах [5,18,19] дисертантом узагальнено модель чотирьох мас на випадок приєднання протиіонів до фосфатних груп остова макромолекули в наближенні жорсткого нуклеозиду. У роботах [4,16,17] автором одержано аналітичні вирази для частот коливань розтягу водневих зв’язків у парах нуклеотидів з урахуванням спіральності макромолекули. У роботах [3,11-15] дисертантом одержано вираз для константи іон-фосфатних коливань, оцінено значення константи Маделунга іон-фосфатної гратки і проведено розрахунки частот конформаційних коливань з використанням діелектричних функцій. У роботах [2,9] автором розраховано амплітуди конформаційних коливань полінуклеотидів у В- та А-формах подвійної спіралі з протиіонами лужних металів. В роботах [6-8] здобувачем розроблено підхід для розрахунку діелектричної проникності іон-гідратного шару двоспіральних полінуклеотидів, який ґрунтується на теорії іонних кристалів. У роботах [1,10] дисертант виклав розроблені особисто методики приготування зразків водних розчинів молекули ДНК з протиіонами Na+ та Cs+, методику математичної обробки отриманих спектрів комбінаційного розсіяння світла, а також провів аналіз співвідношення інтенсивностей піків в низькочастотних спектрах Na- та Cs-ДНК. В результаті показано, що в спектрі Cs-ДНК спостерігається мода іон-фосфатних коливань.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на конференціях: I, II and III International Conference “Physics of Liquid Matter: Modern Problems”, Kyiv, Ukraine (14-19 вересня, 2001 р.; 15-17 вересня, 2003 р.; 27-31 травня, 2005 р.); ІІІ з’їзд Українського біофізичного товариства, Львів (8–11 жовтня 2002 р.); International Conference “Spectroscopy in Special Applications”, Kyiv, Ukraine (18-21 червня, 2003 р.); XVI International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, Sevastopol, Ukraine (25 травня - 1 червня 2003 р.); X European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, Szeged, Hungary (30 серпня – 4 вересня 2003 р.); ІІІ и V Харьковская конференция молодых ученых, Харьков (12-15 січня 2004 и 14-16 грудня 2005 р.); V International Conference on Biological Physics, Gothenburg, Sweden (23-27 серпня, 2004 р.); І Українська наукова конференція “Проблеми біологічної і медичної фізики”, Харків (20-25 вересня 2004 р.); на симпозіумах: Симпозіум Київського відділення УБФТ “Фізичні моделі в біології”, Київ (11-12 квітня 2006 р.); The Second International Symposium “Atomic Cluster Collisions: structure and dynamics from the nuclear to the biological scale” Darmstadt, Germany (19-23 липня, 2007 р.); на робочих семінарах: на кафедрі молекулярної фізики фізичного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка; в Інституті теоретичної фізики імені М. М. Боголюбова НАН України; в Інституті фізики НАН України.

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковано в 19 працях, в тому числі 5 статей в реферованих фахових журналах, 1 стаття – в збірці наукових праць та 13 тез доповідей на всеукраїнських та міжнародних конференціях, з’їздах та симпозіумах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, чотирьох розділів, висновків, додатків та списку використаних джерел, що містить 149 найменувань. Роботу викладено на 117 сторінках машинописного тексту, який містить 43 рисунки та 22 таблиці.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі коротко висвітлено стан наукової проблеми, обґрунтовано актуальність дослідження впливу протиіонів лужних металів на конформаційні коливання двоспіральних полінуклеотидів, сформульовано мету роботи та основні завдання. Представлено наукову новизну та практичне значення одержаних результатів. Надана інформація про зв’язок роботи з науковими темами та інформація про апробацію результатів дисертації, вказана кількість публікацій та особистий внесок у них здобувача.

У розділі 1 коротко розглянута роль протиіонів лужних металів у формуванні подвійної спіралі полінуклеотидів. Аналіз експериментальних і теоретичних даних показав, що необхідною умовою для утворення подвійної спіралі полінуклеотиду є нейтралізація негативно заряджених фосфатних груп остова макромолекули. Для визначення впливу протиіонів на коливальну динаміку подвійної спіралі розглянуті дані інфрачервоної спектроскопії та комбінаційного розсіяння світла полінуклеотидів і визначено моди, які залежать від концентрації та типу протиіонів. Огляд теоретичних підходів до описання коливальних спектрів полінуклеотидів показав, що для низькочастотного діапазону спектру двоспіральних полінуклеотидів найбільш адекватним підходом є підхід чотирьох мас [6]. Зроблені висновки про необхідність удосконалення цього підходу для описання впливу протиіонів на конформаційні коливання полінуклеотидів та про необхідність проведення експериментів по визначенню залежності низькочастотних спектрів полінуклеотидів від типу та концентрації протиіонів.

У розділі 2 автором розвинуто модель конформаційних коливань двоспіральних полінуклеотидів з протиіонами лужних металів на основі моделі чотирьох мас [6]. У рамках побудованої моделі нуклеозид (цукор + азотиста основа) представляється у вигляді фізичного маятнику (m), який може коливатися відносно остова макромолекули у площині ортогональній до осі спіралі (рис. 1). Маятники-нуклеозиди приєднуються до фосфатних груп (), що зображені у вигляді точкових мас (m0). Протиіони, які приєднуються до фосфатних груп остова макромолекули, моделювалися у вигляді мас (ma) з зарядом +е. При цьому вважається, що кожна фосфатна група остова молекули ДНК нейтралізована одними протиіоном.

Енергію такої системи записано у наступному вигляді:

, (1)

де і є кінетична і потенціальна енергії мономерної ланки ; – енергія взаємодії структурних елементів вздовж подвійної спіралі.

Кінетичну енергію мономерної ланки записано у вигляді:

(2)

де M=m0+m+ma, l – зведена довжина фізичного маятнику-нуклеозиду, ls=lsinиeq; a=sinиeq, b=cosиeq, иeq – рівноважний кут, , де – відстань між протиіоном і зарядженим атомом фосфатної групи , а – відстань від атома фосфатної групи до атому цукру . иij – кут відхилення нуклеозиду i-тої мономерної ланки j-того ланцюжка подвійної спіралі з положення рівноваги иeq; сij – зміщення азотистих основ відносно фосфатних груп остова макромолекули, пов’язані з конформаційною гнучкістю дезоксирибози; Хij, Yij – зміщення фосфатних груп; оij – зміщення протиіонів відносно фосфатних груп остова макромолекули (рис. 1б).

Потенціальну енергію мономерної ланки представлено у вигляді:

, (3)

де б, у, в і г – силові константи розтягу водневих зв’язків в парах азотистих основ, деформації кільця дезоксирибози, ротаційних коливань маятників-нуклеозидів відносно ланцюжка остова та іон-фосфатних коливань відповідно. – амплітуда розтягу водневих зв’язків в i-тій парі азотистих основ.

Енергія взаємодії вздовж ланцюжка макромолекули вважалася рівною нулю (Ui,i+1=0), оскільки для порівняння теорії з експериментом автором розглядалися лише гранично довгохвильові коливання оптичного типу. З точки зору теоретичного розгляду таке наближення аналогічне нехтуванню взаємодії вздовж ланцюжка.

Визначення кінетичної та потенціальної енергії системи (2) і (3) дало можливість отримати рівняння руху, розв’язки яких знаходилися у формі , де – деяка амплітуда коливань, – частота. З рівнянь руху одержано рівняння для частот гранично довгохвильових коливань оптичного типу. В результаті визначено сім частот конформаційних коливань полінуклеотиду з протиіонами. Серед них частоти коливань та , які характеризують розтяг водневих зв’язків в парах нуклеотидів; частота , яка описує деформацію кільця дезоксирибози; частоти та , які описують коливання нуклеозидів як фізичних маятників відносно фосфатних груп остова макромолекули; частоти і , які характеризують коливання протиіонів відносно фосфатних груп остова макромолекули. У позначеннях частот знак “+” відповідає випадку, коли маси мономерної ланки рухаються в фазі, а знак “-” – у протифазі.

Аналіз рівнянь для частот гранично довгохвильових коливань показав, що у випадку легких протиіонів (таких як Li+, Na+ та K+) частоти іон-фосфатних коливань вироджені і можуть бути визначені у вигляді:

(4)

Аналіз формули (4) показує, що частота іон-фосфатних коливань повинна зменшуватися при збільшенні маси протиіону. Для важких протиіонів (таких як Rb+ та Cs+) показано, що моди іон-фосфатних коливань та розщеплюються.

Ґрунтуючись на виразі (4), попередніх оцінках частот конформаційних коливань [6] та на припущенні про існування іон-фосфатної гратки протиіонів і полінуклеотиду, показано, що частоти іон-фосфатних коливань повинні бути більшими, ніж частоти внутрішніх коливань подвійної спіралі:

(5)

Для розрахунку частот і амплітуд конформаційних коливань двоспіральних полінуклеотидів параметри б, в, у, l та иeq взяті з моделі чотирьох мас [6], а константа іон-фосфатних коливань (г) визначена автором.

Для описання взаємодії зарядів іон-фосфатної гратки двоспіральних полінуклеотидів використано потенціал, в якому електростатичне притягання описується за методом Маделунга, а відштовхування описується за допомогою потенціалу Борна-Майєра:

(6)

де Mб – константа Маделунга; е – заряд електрона; е – відносна діелектрична проникність іон-гідратного шару полінуклеотиду; е0 – діелектрична проникність вакууму; r – відстань між зарядами; Mв і g – емпіричні константи, що характеризують відштовхування. Розкладаючи потенціал (6) в ряд відносно положення рівноваги до другого порядку включно, одержано формулу для константи іон-фосфатних коливань:

, (7)

Відстань r0 визначена за даними рентгеноструктурного аналізу як відстань між протиіоном та атомом кисню фосфатної групи . Параметр g взятий такий самий, як і для кристалів хлоридів лужних металів.

Константа Маделунга іон-фосфатної гратки двоспірального полінуклеотиду в дисертації визначалася вперше. Виходячи з геометрії подвійної спіралі, для константи Маделунга одержано наступну формулою:

, (8)

де rij та dij – відстані від додатних та від’ємних зарядів іон-фосфатної гратки до початкового іону; r01?r0 (рис 1а). Значення константи Маделунга, розраховані за формулою (8), вищі в А-формі, ніж в В-формі, і збільшуються при збільшенні розміру протиіону (табл. 1). Оцінені величини константи Маделунга іон-фосфатної гратки полінуклеотиду близькі до значення для одновимірного іонного кристалу (1.386) і значно нижчі, ніж у кристалу NaCl (1,748).

Для визначення діелектричної проникності іон-гідратного шару двоспіральних полінуклеотидів із протиіонами лужних металів автором розроблено новий підхід, який ґрунтується на теорії іонних кристалів. У рамках цього підходу діелектрична проникність представлена у вигляді суми:

, (9)

де перший доданок описує внесок електронної поляризовності системи, а другий – іонної поляризовності. У формулі (9) n – коефіцієнт заломлення світла для полінуклеотиду з іон-гідратним оточенням; V – об’єм нуклеотидної пари з іон-гідратною оболонкою. Параметри n і V взяті з експериментальних даних, наведених в огляді [3], а також з робіт, які в ньому цитуються. Внесок іонної поляризовності (другий доданок у формулі (9)) визначався, за допомогою формули Борна, що описує внесок іонної поляризовності в діелектричну проникність іонних кристалів [5].

Розрахунки діелектричної проникності, проведені за формулою (9), показують, що найбільший внесок в діелектричну проникність дає величина квадрату коефіцієнту заломлення, а внесок механізму іонної поляризовності по порядку величини складає ~(3ч10)%. Діелектрична проникність іон-гідратного шару полінуклеотидів залежить від типу протиіонів і у В-формі подвійної спіралі нижча, ніж в А-формі та полінуклеотиду у сухому стані (табл. 1). Залежність е від типу протиіонів суттєва лише у випадку В-форми, і за своєю формою схожа з залежністю для іонних кристалів [5].

Таблиця 1

Значення константи Маделунга (Mб), діелектричної проникності (е) та константи іон-фосфатних коливань (г у ккал/мольЕ2) для полінуклеотиду у В-формі подвійної спіралі та у висушеному стані (значення для висушених полінуклеотидів наведені у дужках)

Іон | Na+ | K+ | Rb+ | Cs+ | Mб | 1,29 (1,39) | 1,29 (1,41) | 1,29 (1,44) | 1,32 (1,46) | е | 2,3 (2,7) | 2,3 (2,7) | 2,6 (2,7) | 2,6 (2,7) | г52,3 (49,1) | 50,8 (48,4) | 41,0 (43,4) | 42,2 (45,0) |

Рис. 2. Залежність частоти іон-фосфатних коливань висушених полінуклеотидів від відстані між протиіоном та атомом кисню фосфатної групи остова подвійної спіралі (розміру протиіона): ? – розрахункові значення частот; ? і 0 – експериментальні дані для висушених полінуклеотидів [7,8]; ? значення частот іонних коливань в кристалах хлоридів лужних металів [5]

Після визначення усіх необхідних параметрів оцінено константу іон-фосфатних коливань за формулою (7). Результати розрахунків показали, що значення константи г, залежно від типу протиіону та конформації подвійної спіралі, змінюється в межах від 67,8 до 35,6 ккал/мольЕ2. У випадку легких протиіонів (Li+, Na+ та K+) константа іон-фосфатних коливань більша в В-формі подвійної спіралі, а у випадку важких протиіонів (Rb+ та Cs+), константа іон-фосфатних коливань більша у висушених полінуклеотидів та полінуклеотидів у А-формі подвійної спіралі (табл. 1).

Отримані значення константи г дозволили розрахувати частоти іон-фосфатних коливань. Оскільки експериментальні дані були відомі лише для висушених полінуклеотидів [7,8], то спочатку визначалися частоти коливань для висушених полінуклеотидів. Порівняння теорії з експериментом (рис. 2) показало, що отримані значення частот іон-фосфатних коливань добре узгоджуються з експериментальними даними [7,8], а також з даними для кристалів хлоридів лужних металів [5]. Це свідчить про те, що двоспіральні полінуклеотиди разом з протиіонами можуть формувати динамічну іон-фосфатну гратку і запропонований підхід може використовуватися для описання впливу протиіонів на внутрішню динаміку подвійної спіралі.

У розділі 3 розраховані частоти конформаційних коливань полінуклеотидів у В- та А-формах подвійної спіралі. Показано, що всі частоти низькочастотного спектру полінуклеотидів (незалежно від форми подвійної спіралі) зменшуються при збільшенні маси протиіонів. Ця залежність особливо помітна у випадку мод іон-фосфатних коливань (щ+ion і щ-ion), частоти яких зменшуються від 250 см-1 до 103 см-1.

У випадку мод внутрішніх коливань подвійної спіралі (щ+H, щ-S, щ+H+S, щ+B та щ-B) частоти коливань зменшуються на (4ч20) см-1 при збільшенні маси протиіону (див табл. 2). У випадку легких протиіонів (Li+, Na+ та K+) значення частот внутрішніх коливань двоспіральних полінуклеотидів у В- та А-формах близькі до значень, які були одержані раніше в рамках моделі чотирьох мас без урахування протиіонів [6].

Для визначення впливу протиіонів на конформаційні коливання полінуклеотидів розраховані амплітуди зміщень структурних елементів В- і А-форм подвійної спіралі для кожної моди за методикою, запропонованою в моделі чотирьох мас [6].

Таблиця 2

Частоти конформаційних коливань полінуклеотиду у B-формі подвійної спіралі з протиіонами Na+ та Cs+ (см-1). щ+ion і щ-ion – частоти іон-фосфатних коливань; щ+H та щ+H+S – частоти коливань розтягу водневих зв’язків в парах нуклеотидів; щ-S – частота внутрішньонуклеозидних коливань; щ+B та щ-B – частоти коливань нуклеозидів як фізичних маятників відносно фосфатних груп остова подвійної спіралі

Протиіони | Розрахунки, проведені в дисертації | Na+ | 181 | 181 | 110 | 79 | 58 | 14 | 16 | Cs+ | 110 | 103 | 94 | 60 | 44 | 11 | 13 | Модель 4-х мас [6] | - | - | - | 113 | 80 | 61 | 15 | 17 |

Аналіз результатів показав, що характер конформаційних коливань суттєво відрізняється у випадку легких (Li+, Na+ та K+) та важких (Rb+ та Cs+) протиіонів. Так, у випадку легких протиіонів моди іон-фосфатних коливань та характеризуються найбільшими амплітудами зміщень протиіонів відносно фосфатних груп остова макромолекули, в той час, як інші структурні елементи практично не рухаються (рис. 3а). У випадку важких протиіонів мода іон-фосфатних коливань, навпаки, характеризується найбільшими амплітудами зміщень азотистих основ, що супроводжується розтягом водневих зв’язків та деформацією кільця дезоксирибози (рис. 3б).

Моди коливань розтягу водневих зв’язків (щ+H і щ+H+S) та внутрішньонуклеозидних коливань (щ-S) у випадку легких протиіонів характеризуються зміщеннями фосфатних груп остова макромолекули а також зміщеннями азотистих основ, які викликають деформацію кільця дезоксирибози, в той час, як протиіони практично не рухаються. У випадку важких протиіонів ці моди, навпаки, характеризуються суттєвими амплітудами коливань протиіонів відносно фосфатних груп.

У випадку мод коливань нуклеозидів як фізичних маятників (щ+B і щ-B) характер коливань полінуклеотидів з легкими і важкими протиіонами практично однаковий, а значення амплітуд коливань близькі до тих, що отримані в рамках моделі чотирьох мас [6].

Рис. 3. Напрямки рухів в мономерних ланках полінуклеотиду у В-формі для моди іон-фосфатних коливань щion+: а) випадок протиіонів Na+; б) випадок протиіонів Cs+ (біля стрілок вказані величини амплітуд зміщень в ангстремах)

Таким чином, легкі протиіони коливаються лише у випадку моди іон-фосфатних коливань, а у випадку інших мод рухаються разом з фосфатними групами остова подвійної спіралі як жорстко закріплені маси. Водночас важкі протиіони безпосередньо впливають на внутрішню динаміку подвійної спіралі, примушуючи рухатися усі структурні елементи полінуклеотиду зі значними амплітудами. Такий ефект може бути пов’язаний з негативним впливом важких іонів на біологічні системи.

У розділі 4 викладені результати експериментального дослідження низькочастотних спектрів комбінаційного розсіяння світла молекули ДНК з протиіонами Na+ та Cs+.

Докладно методика приготування зразків описана в п. 4.1. Для приготування зразків Na- та Cs-ДНК використовувалась натрієва сіль ДНК з тимусу теляти. Cs-ДНК отримана з Na-ДНК шляхом заміни протиіонів Na+ на Cs+ за методикою, описаною в роботі [8]. Для заміни протиіонів у розчин Na-ДНК додавали 0,5 моль CsCl і два об’єми етилового спирту. У спиртовому розчині ДНК з сіллю CsCl відбувалася заміна протиіонів Na+ на Cs+, яка контролювалася за допомогою ОЖЕ спектрів. У висококонцентровані розчини Na- та Cs-ДНК (4%) додавали 0,5 моль відповідної солі NaCl або CsCl.

Зразки збуджувалися випромінюванням аргонового лазера з довжиною хвилі 5145Е. Реальна потужність випромінювання на зразку становила ~ (60ч80) мВт. Промінь лазера потрапляв в кварцову кювету так, що трек променя і вхідна щілина монохроматора ДФС-24 були паралельними. Об’єм кювет, в які поміщувався досліджуваний зразок, становив ~0,06 мл, висота ~15 мм. Досліджувані спектри комбінаційного розсіяння світла ДНК мали малу інтенсивність, тому для покращення співвідношення сигнал/шум необхідно було збільшити час накопичення в точці до ~ (4ч8) с. У результаті проведеного експерименту одержано спектри комбінаційного розсіяння світла водних розчинів Na- та Cs-ДНК в діапазоні від 30 см-1 до 230 см-1 (рис. 4). Спектри мають характерну для ДНК смугу 100 см-1, інтенсивність якої в Cs-ДНК більша, ніж в Na-ДНК.

Для виділення моди іон-фосфатних коливань ДНК проводилась детальна математична обробка форми отриманих спектрів. Обробка полягала в згладжуванні спектрів кривою Лоренца. Після віднімання від спектру лоренцевої кривої, його розкладали на криві Гауса. В результаті були визначені положення мод з похибкою ±2 см-1. Інтенсивності коливальних мод нормувалися на інтенсивність широкої смуги коливань води в області ~180 см-1, оскільки в обох спектрах вона має приблизно однакову величину. Нормовані спектри Na- і Cs-ДНК представлено на рис. 4.

Як видно з рис. 4б, в області від 50 см-1 до 120 см-1 в спектрі Na-ДНК спостерігаються піки 78 см-1 і 118 см-1, а також смуги 64 см-1 та 97 см-1. Порівняння з існуючими експериментальними даними показує, що структура спектру розчину Na-ДНК така ж, як у висушених плівок полінуклеотидів [7]. У спектрі Cs-ДНК у цій області спостерігаються моди 60 см-1, 79 см-1 і 118 см-1, а також інтенсивна смуга 100 см-1. Смуга 100 см-1 в спектрі Cs-ДНК майже вдвічі інтенсивніша, ніж відповідна смуга в спектрі Na-ДНК, а моди 79 і 118 см-1, навпаки, – набагато слабші (рис. 4б). В отриманих спектрах Na- і Cs-ДНК в діапазоні вище 130 см-1 спостерігається широка смуга коливань води 180 см-1.

Рис. 4. Низькочастотні спектри комбінаційного розсіяння світла водних розчинів Na- та Cs-ДНК: а) вихідні спектри; б) спектри після математичної обробки

Порівняння експерименту з отриманими нами розрахунковими даними (табл. 2) показало, що іон-фосфатні коливання Cs-ДНК разом з модами розтягу водневих зв’язків в парах азотистих основ формують смугу 100 см-1. При цьому інтенсивність смуги зростає майже вдвічі порівняно з спектром Na-ДНК (рис. 4). Мода іон-фосфатних коливань Na-ДНК знаходиться в більш високочастотній області (181 см-1) і не виділяється серед мод цього діапазону спектру.

Як відомо, інтенсивність коливальної моди, яка є активною в спектрах комбінаційного розсіяння світла, пропорційна квадрату похідної від поляризовності по нормальній координаті. Водночас, у попередньому розділі показано, що мода іон-фосфатних коливань у випадку протиіонів Na+ характеризується малими амплітудами зміщень, а у випадку протиіонів Cs+ структурні елементи рухаються зі значними амплітудами (рис. 3). Зміщення структурних елементів Cs-ДНК мають призводити до суттєвих змін поляризовності молекули, тому інтенсивність моди іон-фосфатних коливань в спектрі Cs-ДНК має бути значно вищою, аніж в спектрі Na-ДНК. Це пояснює більшу інтенсивність смуги 100 см-1 в спектрі Cs-ДНК порівняно з Na-ДНК. Таким чином, смуга 100 см-1 в спектрі Cs-ДНК характеризує іон-фосфатні коливання.

ВИСНОВКИ

1. У водних розчинах протиіони і фосфатні групи остова подвійної спіралі полінуклеотиду можуть утворювати регулярну динамічну структуру, яка за своїми властивостями подібна до гратки іонних кристалів.

2. В низькочастотному спектрі двоспіральних полінуклеотидів існує дві моди іон-фосфатних коливань. У випадку легких протиіонів (Li+, Na+ та K+) моди іон-фосфатних коливань вироджуються в одну, а у випадку важких протиіонів (Rb+ та Cs+) вони розщеплюються на дві моди.

3. Діелектрична проникність іон-гідратного шару полінуклеотиду змінюється від 2,3 до 2,7 залежно від типу протиіонів та конформації подвійної спіралі. Значення константи Маделунга іон-фосфатної гратки близьке до значення одновимірної іонної гратки і змінюється від 1,15 до 1,46.

4. Значення частоти іон-фосфатних коливань перевищує значення частот внутрішніх коливань подвійної спіралі та зменшується від 250 до 95 см-1 при збільшенні маси протиіону (Li+, Na+, K+, Rb+ чи Cs+).

5. Частота іон-фосфатних коливань у випадку А-форми подвійної спіралі з протиіонами Na+ та K+ вища, ніж у В-форми, а з протиіонами Rb+ та Cs+, навпаки, – нижча. У випадку висушених полінуклеотидів частота іон-фосфатних коливань нижча, ніж в В- та А-формах для всіх протиіонів.

6. Характер конформаційних коливань двоспіральних полінуклеотидів суттєво відрізняється у випадку легких та важких протиіонів. Легкі протиіони (Li+, Na+ та K+) не збурюють внутрішньої динаміки подвійної спіралі, а важкі протиіони (Rb+ та Cs+) безпосередньо впливають на її конфірмаційні коливання.

7. В низькочастотному спектрі комбінаційного розсіяння світла водних розчинів Cs-ДНК експериментально виявлена мода іон-фосфатних коливань, що підтверджує теоретичні розрахунки. Показано, що ця мода формує смугу 100 см-1.

СПИСОК ЦИТОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Булавін Л.А., Гаврюшенко Д.А., Сисоєв В.М. Молекулярна фізика. – К.: Знання, 2006. 540 с.

2. Адаменко І.І., Булавін Л.А. Фізика рідин та рідинних систем. К.: АСМІ, 2006. 660 с.

3. Малеев В.Я., Семенов М.А., Гасан А.И., Кашпур В.А. Физические свойства системы ДНК-вода //Биофизика. – 1993. Т. 38, № 5. – С. 768-790.

4. Varnai P., Zakrzewska K. DNA and its counterions: a molecular dynamics study //Nucleic Acids Res. – 2004. Vol. 32, №14. – P. 4269-4280.

5. Киттель Ч. Введение в физику твердого тела, М.: Гос. издат. физ.-мат. лит. 1963. 696 с.

6. Volkov S.N., Kosevich A.M. Theory of low-frequency vibrations in DNA macromolecules //J. Biomolec. Struct. Dyn. – 1991. – Vol. 8. – P. 1069-1083.

7. Powell J.W., Edwards G.S., Genzel L., Kremer F., Wittlin A. Investigation of far-infrared vibrational modes in polynucleotides //Phys. Rev. A. – 1987. Vol. 35, №9. – P. 3929-3939.

8. Weidlich T., Powell J.W., Genzel L., Rupprecht A. Counerion effects on the far-IR vibrational spectra of poly(rI)·poly(rC) //Biopolymers. – 1990. – Vol. 30. – P. 477-480.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Булавін Л.А., Волков С.Н., Кутовий С.Ю., Перепелиця С.М. Спостереження моди іон-фосфатних коливань макромолекули ДНК //Доп. НАН України. – 2007. – № 10. – С. 69-73.

2. Перепелица С.Н., Волков С.Н. Ион-фосфатные колебания ДНК в В- и А-формах //Біофізичний вісник. – 2005. – Т. 1(15). – C. 5-10.

3. Perepelytsya S.M., Volkov S.N. Ion mode in the DNA low-frequency vibration spectra // Ukr. J. Phys. – 2004. Vol. 49, №11. – P. 1074-1080; Ion-phoshate mode in the DNA low-frequency spectra // e-print, arXiv/q-bio.BM/0412022, 2004.

4. Bulavin L.A., Perepelytsya S.M., Suprun A.D. Quasi-crystalline model of the DNA vibrational dynamics //Functional Materials. – 2003. – Vol. 10, № 4. – P. 599-606.

5. Волков С.Н., Перепелиця С.М. Іонні коливання у низькочастотному спектрі ДНК //Вісник Київ. ун-ту, серія: фіз.-мат. науки. – 2002 . – № 1. – С. 388-395.

6. Перепелиця С.М., Волков С.Н., Іон-фосфатні коливання ДНК. Кристалічний підхід //Сучасні проблеми молекулярної фізики: Зб. наук. праць. ВПЦ “Київський університет”, 2006 р. – С. 265-271.

7. Perepelytsya S.M., Volkov S.N. Counterion influence on DNA conformational vibrations //Atomic and Cluster Collisions, structure and dynamics from the nuclear to the biological scale: II International Symposium. Darmstadt, Germany, 19-23 July 2007. - Darmstadt. – P. 117.

8. Перепелица С.Н., Волков С.Н. ДНК как ионный кристалл //Радіофізика та НВЧ електроніка: V Харківська конференція молодих науковців. Харків, 14-16 грудня 2005 р. - Харків, 2005. – С. 52.

9. Perepelytsya S.M., Volkov S.N. Ion-phosphate mode in the A- and B-DNA conformations //Physics of Liquid Matter Modern Problems: III International conference. Kyiv, 27-31 May, 2005. - Kyiv, 2005. – P. 179.

10. Biliy M.M., Kutovyi S.Yu., Perepelytsya S.M., Volkov S.N. The low-frequency Raman spectra of DNA water solutions //Physics of Liquid Matter Modern Problems: III International conference. Kyiv, 27-31 May, 2005. - Kyiv, 2005. – P. 209.

11. Перепелица С.Н., Волков С.Н. Конформационные колебания ДНК с противоионами //Проблеми біологічної і медичної фізики: І Українська наукова конференція. Xapків, 20-25 вересня 2004 р. - Харків, 2004. – С. 40.

12. Perepelytsya S.M., Volkov S.N. Ion-phosphate mode in the DNA low-frequency spectra //V International Conference on Biological Physics. Gothenburg, Sweden, 23-27 August. 2004. - Gothenburg, 2004. – P. 78.

13. Perepelytsya S.M., Volkov S.N. Ion vibration in the low-frequency spectra of DNA

//Радиофизика и СВЧ электроника: ІІІ Харьковская конференция молодых учених. Харьков, 12-15 января 2004 г. - Харьков, 2004. – C. 35.

14. Perepelytsya S.M., Volkov S.N. Low-frequency vibrational spectra of the DNA with ions of alkaline metals //Physics of Liquid Matter Modern Problems: II International conference. Kyiv, 15-17 September. 2003. - Kyiv, 2003. – P. 169.

15. Perepelytsya S.M., Volkov S.N. Ion modes in the DNA conformational vibrations //Spectroscopy of Biological Molecules: X European Conference. – Szeged, Hungary, 30 August - 4 September 2003. - Szeged; JATEPress, 2003. – P. 48.

16. Bulavin L.A., Perepelytsya S.M., Suprun A.D. Theoretical calculation of the vibrational spectra of double-stranded DNA //Spectroscopy in Special Applications: International scientific and practical conference. Kyiv 18-21 June 2003. - Kyiv, 2003. – P. 96.

17. Bulavin L.A., Perepelytsya S.M., Suprun A.D. Quasicrystal model of vibrational dynamics of double-stranded DNA //Spectroscopy of Molecules and Crystals: XVI International School-Seminar. Sevastopol, 25 May - 1 June 2003. – Kyiv, 2003. – P. 74.

18. Перепелиця С.М., Волков С.Н. Йонні моди у низькочастотному спектрі конформаційних коливань молекули ДНК //ІІІ з’їзд Українського біофізичного товариства. Львів, 8-11 жовтня 2002 р. - Львів, 2002. – С. 21.

19. Volkov S.N., Perepelytsya S.M. The conformation low-frequency vibrations of DNA macromolecules in a native state //Physics of Liquid Matter Modern Problems: І International conference. Kyiv, 11-19 September 2001. - Kyiv, 2001. – P. 182.

АНОТАЦІЇ

Перепелиця С.М. Роль протиіонів лужних металів у конформаційній динаміці двоспіральних полінуклеотидів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 01.04.14 – теплофізика і молекулярна фізика. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2007

У дисертації молекула двоспірального полінуклеотиду з протиіонами лужних металів розглядається, у вигляді гратки іонного кристалу. Динаміка такої гратки досліджувалася в рамках підходу чотирьох мас Волкова і Косевича і теорії іонних кристалів. Для визначення електростатичних взаємодій між зарядами подвійної спіралі та протиіонами розроблено