НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ,

ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

ПРИЗИМИРСЬКА ТАМАРА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК: 616-006.04:577-1:616-085:615-356:57.084

РОЛЬ гіпергомоцистеїнемії У ДИНАМІЦІ РОСТУ

ЗЛОЯКІСНИХ ПУХЛИН

(експериментальне дослідження)

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий керівник - | академік НАН України, доктор медичних наук, професор Чехун Василь Федорович,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, директор інституту, завідувач відділу механізмів протипухлинної терапії.

Офіційні опоненти: - | доктор медичних наук, професор

Шляховенко Володимир Олексійович,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу ензимології пухлин;

- | доктор медичних наук

Баглій Євген Ананійович,

Інститут екогігієни та токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України, завідувач лабораторії канцерогенезу, тератогенезу та токсикології репродуктивної функції.

Захист дисертації відбудеться "16" квітня 2008 року о 15.00 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий " 14 " березня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Л.М.Шлапацька

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. На сьогоднішній день підвищення кількості хворих на онкологічні захворювання та низька ефективність їх лікування залишаються далеко не вирішеними проблемами. Тому, принципово важливим, фундаментальним завданням сучасних експериментальних та клінічних досліджень в онкології є вивчення існуючих та виявлення нових, в тому числі метаболічних чинників, які сприяють виникненню та прогресуванню пухлинного процесу.

Згідно з існуючими уявленнями, канцерогенез - це багатостадійний процес, в якому важливе значення відіграє взаємодія метаболічних, генетичних та епігеномних порушень (Welch D.R. et al., 1998, Almadori G. et al., 2003; Macaluso M. et al., 2003; Pogribny I.P. et al., 2007). Серед епігеномних змін, асоційованих із неопластичним ростом, найбільш відомими є порушення у статусі метилювання ДНК (Das P.M. et al., 2005; Kisseljova N.P. et al., 2005). У даний час численними дослідженнями показано, що рівень метилювання ДНК у малігнізованих клітинах пов’язаний із прогресуванням злоякісних пухлин (Bernardino J. et al., 1997; Soares J. et al., 1999; Kisseljova N.P. et al., 2005), в тому числі з метастазуванням (Pakneshan P. et al., 2004) та формуванням лікарської резистентності пухлин до дії цитотоксичних препаратів (Чехун В.Ф. та співавт., 2006; Chekhun V.F. et al., 2007; Strathdee G., 2007). На жаль, молекулярні механізми, за рахунок яких виникають вищезазначені зміни у метилюванні ДНК при канцерогенезі, поки що залишаються недостатньо зрозумілими, оскільки статус метилювання ДНК регулюється взаємодією багатьох факторів (Vaniushin B.F., 2006; Szyf M., 2006). Зокрема, одним із ключових метаболітів у процесах біологічного метилювання є сірковмісна амінокислота гомоцистеїн (ГЦ), зростання концентрації якої може призводити до гальмування реакцій метилювання ДНК (Yi P. et al., 2000; Castro R. et al., 2000; Ulrey C.L. et al., 2005; Fowler B. et al., 2005; Lucock M.D., 2006).

Не дивлячись на те, що гіпергомоцистеїнемія (ГГЦ) є відомим фактором у патогенезі розвитку численних захворювань та досить часто зустрічається у онкологічних хворих, на сьогодні остаточно не встановлено чи є високий рівень ГЦ у плазмі крові маркером пухлинного росту, чи, навпаки - причиною виникнення деяких видів злоякісних новоутворень, оскільки ГГЦ патогенетично пов’язана із дефіцитом фолієвої кислоти, оксидативним стресом, гомоцистеїнуванням білків та змінами в метилюванні ДНК (Пентюк О.О. та співавт., 2003; Wu L.L. et al., 2002; Fowler B. et al., 2005; Herrmann W. et al., 2007). Залишилися також нез’ясованими питання щодо ролі ГГЦ у порушеннях метилювання ДНК при канцерогенезі та відносно впливу ГГЦ і модуляторів обміну ГЦ на пухлинний ріст, процеси метастазування та чутливість злоякісних клітин до дії хіміотерапевтичних засобів.

Таким чином, все вищесказане свідчить, що дослідження ролі ГГЦ у динаміці росту злоякісних пухлин є актуальним та має важливе значення для експериментального обгрунтування доцільності корекції високого вмісту ГЦ у плазмі крові онкологічних хворих.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відповідності з планом науково-дослідної роботи інституту за темою «Дослідити роль гомоцистеїну в процесах формування лікарської резистентності пухлин до дії цитотоксичних препаратів» (2004-2007 рр., державний реєстраційний № 0104U006131). Частину роботи було виконано за підтримки гранту Президента України для обдарованої молоді „Пошук нових підходів до профілактики та лікування серцево-судинних і онкологічних захворювань, пов’язаних із порушенням обміну гомоцистеїну” (20.01.2005 №36).

Мета дослідження. Встановити роль ГГЦ у динаміці росту злоякісних пухлин та експериментально обгрунтувати доцільність її корекції при злоякісних новоутвореннях.

Задачі дослідження.

1. Визначити концентрацію ГЦ у плазмі крові та рівень загального метилювання ДНК у тканинах пухлини та печінки тварин із експериментальними пухлинами.

2. Створити експериментальну модель ГГЦ та дослідити на ній вплив модуляторів обміну ГЦ на рівень загального метилювання ДНК у печінці щурів.

3. Вивчити вплив ГГЦ на динаміку росту та особливості метастазування трансплантованих пухлин.

4. Дослідити вплив ГГЦ без втручання та за умов її корекції вітамінами В6, В9 та В12 на хімічний канцерогенез у молочній залозі (МЗ) щурів, індукований нітрозометилсечовиною (NMU).

5. Вивчити вплив ГГЦ без втручання та за умов її корекції вітамінами В6, В9 та В12 на протипухлинний ефект доксорубіцину (ДОКС) у щурів із карциносаркомою Уокер-256.

Об’єкт дослідження: лабораторні тварини (щури лінії Вістар та миші лінії С57Bl/6) із експериментальною ГГЦ; лабораторні тварини із трансплантованими пухлинами (карцинома Герена, карциносаркома Уокер-256, аденокарцинома Са 755, карцинома легені Льюїс 3LL) та щури із NMU-індукованими пухлинами МЗ.

Предмет дослідження: концентрація загального ГЦ у плазмі крові, рівень загального метилювання ДНК в печінці та в пухлині, канцерогенний ефект NMU щодо тканини МЗ щурів, протипухлинна дія ДОКС in vivo, морфологічні зміни в тканині пухлин під впливом експериментальної ГГЦ.

Методи дослідження: методи експериментальної онкології in vivo, моделювання ГГЦ у щурів та мишей, світлова мікроскопія, імуноферментний та хроматографічний методи визначення концентрації загального ГЦ у плазмі крові, молекулярно-біологічні методи (рівень загального метилювання ДНК), статистичні методи (кореляційний аналіз, методи міжгрупових порівнянь із використанням параметричного t-критерія Стьюдента та непараметричних критеріїв (медіанний, Уайта, odds ratio, багатовибірковий непараметричний дисперсійний аналіз Фрідмана).

Наукова новизна одержаних результатів. На основі комплексу експериментальних досліджень сформульовано положення про тісний зв’язок між метаболізмом ГЦ і ростом злоякісних пухлин та встановлено, що процес метилювання ДНК є механізмом, який асоційований із ГГЦ. Вперше показано, що ріст злоякісних пухлин супроводжується підвищенням концентрації ГЦ у плазмі крові тварин в період експоненційного росту пухлин та зниженням - у термінальній стадії їх росту. Встановлено, що при рості злоякісних пухлин існує прямий кореляційний зв’язок між зростанням концентрації ГЦ у плазмі крові та зниженням рівня загального метилювання ДНК у тканині пухлини.

Створено нову метіонінову вітамін-дефіцитну модель ГГЦ в системі in vivo, яка дозволяє за 14 днів отримати більше ніж 10-разове зростання концентрації ГЦ у плазмі крові лабораторних тварин. Показано, що за умов метіонін-індукованої ГГЦ зростання вмісту ГЦ у плазмі крові прямо корелює з віком тварин та зі зниженням рівня загального метилювання ДНК у тканині печінки.

Вперше виявлено, що за умов метіонін-індукованої ГГЦ гальмується ріст та метастазування експериментальних пухлин, що відбувається на фоні зниження рівня загального метилювання ДНК в тканині пухлини та посилення процесів тромбоутворення в судинах пухлин. При NMU-індукованому канцерогенезі у МЗ щурів показано, що за умов метіонін-індукованої ГГЦ з, одного боку, зменшується частота виникнення пухлин МЗ та коефіцієнт множинності пухлин МЗ, але з іншого – скорочується латентний період та зростає відносна кількість злоякісних пухлин МЗ. Вперше in vivo продемонстровано, що ГГЦ може бути причиною зниження протипухлинного ефекту ДОКС.

Встановлено, що серед речовин, які нормалізують вміст ГЦ у плазмі крові за умов експериментальної ГГЦ (вітаміни В6, В9 та В12, бетаїн та креатин) протекторними властивостями щодо загального гіпометилювання ДНК в печінці володіє лише комплекс вітамінів В6, В9 та В12, який, крім того, здатен нівелювати ефекти ГГЦ при NMU-індукованому канцерогенезі у МЗ щурів та протидіяти зниженню протипухлинного ефекту ДОКС.

Практичне значення одержаних результів. Отримано дані, що свідчать про можливість впливати на процеси метилювання ДНК, шляхом зміни вмісту ГЦ у плазмі крові. Створено нову метіонінову вітамін-дефіцитну та вдосконалено метіонінову експериментальні моделі ГГЦ для щурів та мишей, що дозволить підвищувати ефективність дослідження механізмів патогенетичної дії ГГЦ та оцінювати здатність різних лікарських засобів нормалізувати вміст ГЦ у плазмі крові.

За допомогою досліджень на метіонін-індукованій моделі ГГЦ показано, що серед засобів, які мають різний механізм дії на метаболізм ГЦ (вітаміни В6, В9 та В12, бетаїн, креатин та холін) для корекції ГГЦ найбільш ефективним є застосування комплексу вітамінів В6, В9 та В12, який не лише знижує вміст ГЦ у плазмі крові, але й попереджає загальне гіпометилювання ДНК. Експериментально обґрунтовано доцільність корекції ГГЦ з метою підвищення ефективності ДОКС при лікуванні хворих на онкологічні захворювання.

Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи здобувачем була зібрана та проаналізована література за темою дисертації, самостійно проведено більшість запланованих експериментів в системі in vivo, проаналізовано отримані результати досліджень. Дисертант брала участь у створенні експериментальних дієтичних раціонів, проводила виділення ДНК та визначення концентрації ГЦ, досліджувала ефективність терапії ДОКС злоякісних пухлин, показники кінетики росту пухлин та процесів метастазування, а також проводила індукцію пухлин МЗ у щурів. Визначення рівня загального метилювання ДНК проводили сумісно із співробітниками лабораторії доктора Ігоря Погрібного (National Center for Toxicological Research, Jefferson, USA), розробку моделі ГГЦ виконували разом із д.м.н. О.О. Пентюком на базі кафедри біохімії та загальної хімії Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова. Морфологічні дослідження проводили разом із д.м.н. М.С. Пушкарьом на базі кафедри гістології ВНМУ ім. М.І. Пирогова. Автором самостійно виконано статистичну обробку результатів і сформульовано основні положення дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на: ІІІ з'їзді онкологів та радіологів СНД (Мінськ, Білорусія, 2004), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004), ХІІ Університетській науково-практичній конференції молодих вчених та фахівців (Вінниця, 2006), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів» (Київ, 2006), науково-практичній міжнародній конференції «Фортификация пищевых продуктов витамином В9 с целью предупреждения врожденных дефектов невральной трубки» (Київ, 2006), VIII конференції молодих онкологів з міжнародною участю «Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології» (Київ, 2007), 2-му з’їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей у фахових наукових журналах та 9 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних з’їздів і конференцій, отримано 1 деклараційний патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 186 cторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділу матеріалів і методів дослідження, 4-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаної літератури, який включає 371 посилання, у тому числі 343 зарубіжних. Дисертаційна робота ілюстрована 44 рисунками та 31 таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на 790 лабораторних тваринах (щурах лінії Вістар із масою тіла 120-150 г; мишах лінії С57Bl/6 із масою тіла 18-22 г), які були отримані з розплідника віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України та віварію ВНМУ ім. М.І. Пирогова. Утримання тварин та роботу з ними проводили у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил виконання робіт з експериментальними тваринами.

Під час кожної серії досліджень тварини отримували напівсинтетичний повноцінний раціон (НПР) та створені на його основі експериментальні дієти. НПР був слідуючого складу: казеїн - 18%, жир (з жиророзчинними вітамінами) - 10%, целюлоза - 2%, суміш мінеральних солей - 3,5%, суміш водорозчинних вітамінів з глюкозою – 0,5%, крохмаль - до 100%. Суміш вітамінів містила: тіаміну хлорид – 10,0; піридоксину гідрохлорид – 15,0; фолієва кислота – 2,0; ціанокобаламін – 0,03; рибофлавін – 10,0; кальцію пантотенат – 15,0; нікотинова кислота – 100,0; біотин – 0,1; альфа-токоферолу ацетат 350,0; нікотинова кислота – 100,0; філохінон – 5,0; ретинолу ацетат – 5,0; ергокальциферол – 0,03; нікотинова кислота – 100,0; аскорбінова кислота – 375,0; холіну хлорид – 10,0 мг/кг сухого корму.

Хронічну ГГЦ викликали шляхом утримання тварин на НПР з додаванням метіоніну (Fluka) в кількостях від 1% до 4,4% від загальної маси НПР (метіонінова модель ГГЦ) або за умов поєднання у раціоні навантаження метіоніном та аліментарної недостатності вітамінів В6, В9 та В12 (метіонінова вітамін-дефіцитна модель ГГЦ). Для корекції експериментальної ГГЦ використовували слідуючі речовини: комплекс вітамінів В6, В9 та В12 (5-ти або 15-ти кратно збільшені кількості вітамінів по відношенню до їх вмісту у НПР), креатин (1% та 5%), бетаїн (1% та 5%) та холін (0,1% та 0,5%), які додавали безпосередньо у НПР чи вводили у шлунок тварин за допомогою зонду.

Для створення експериментальних модельних систем злоякісного росту були використані наступні перещеплювані штами пухлин: карцинома Герена, карцинома легені Льюїс, карциносаркома Уокер-256, аденокарцинома Са 755, отримані із Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Крім того, були досліджені хімічно індуковані пухлини МЗ у щурів. Індукцію пухлин проводили шляхом одноразового внутрішньоперітонеального введення водного розчину NMU (Sigma, USA) самкам щурів лінії Вістар віком 60-70 днів із розрахунку 50 мг/кг маси тіла (Rose et al., 1980). Перебіг пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками: об’єм і маса пухлин; частота та інтенсивність метастазування. Протипухлинний ефект ДОКС («Еbewe», Аustria) у сумарній дозі 7,5 мг/кг маси тіла тварин оцінювали за відсотком гальмування росту пухлин (ГРП) та коефіцієнтом збільшення тривалості життя (ЗТЖ). Відсоток ГРП визначали через 24 години після останньої ін’єкції ДОКС, а коефіцієнт ЗТЖ – після загибелі усіх тварин. Біологічно значимими вважали: ГРП>50%; ЗТЖ>25% (Софьина З.П. и др., 1979). Антиметастатичний ефект оцінювали за індексом інгібування метастазування (ІІМ) та за відсотком гальмування росту метастазів (ГРМ). Біологічно значимими вважали: ГРМ>25%; ІІМ>25% (Ушморов А.Г., 1989).

В якості критеріїв канцерогенної дії NMU щодо тканини МЗ у щурів використовували загальноприйняті показники: латентний період, гістологічний тип індукованих пухлин МЗ, частота пухлин МЗ у групі, співвідношення між доброякісними та злоякісними пухлинами МЗ, коефіцієнт множинності, маса та об’єм пухлин МЗ у групі (Турусов В.С. и др., 1986).

Концентрацію загального ГЦ у плазмі крові тварин визначали методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на апараті Hewlett Packard (USA) із використанням колонки Hypersil BDS C-18 за методикою Пентюка О.О. та інш. (2001). В частині досліджень вміст ГЦ у плазмі крові визначали методом імуноферментного аналізу (ІФА) з використанням набору реактивів фірм „Axis-Shield” (UK) та “Dіazyme” (USA) на імуноферментному аналізаторі “Stat Fax 2100” (USA).

Для мікроскопічного дослідження брали пухлинну тканину у 2-3 тварин з кожної групи на 14 добу після перещеплення карциносаркоми Уокер-256, а в експериментах із NMU-індукованим канцерогенезом у МЗ щурів - у кожної тварини-пухлиноносія. Забір гістологічного матеріалу, його фіксацію у 10%-му розчині нейтрального формаліну та подальшу обробку проводили загальноприйнятим методом. Морфологічні дослідження тканини здійснювали на зрізах, фарбованих гематоксиліном та еозином на мікроскопі Laborlux S (Leitz).

Виділення ДНК із тканин печінки та пухлини виконували модифікованим методом Blin et al. (1976), який включає послідовні етапи ферментативного протеолізу, депротеїнізації та переосадження ДНК спиртом. Рівень загального метилювання ДНК визначали по співвідношенню між вмістом 5-метилцитозину та цитозину за методом Pogribny et al. (1999). Для рестрикції геномної ДНК використовували два типи ендонуклеаз рестрикції - метилчутливу HpaII (New England Biolabs, Beverly, MA) та її метилнечутливий ізошизомер MspI (Fermentas, Lithuania). Необроблена рестриктазами ДНК слугувала в якості фонового контролю. Аліквоту рестриктованої ДНК використовували в реакціях ампліфікації. Реакційна суміш (25,0 мкл) містила: 1,0 мкг ДНК, 1X PCR buffer II, 1,0 мM MgCl2, 0,25 одиниць AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA) та 0,1 мкл [3H]dCTP (57.4 Ci/mmol) (NEN, Boston, MA). Суміш інкубували при температурі 56o C протягом однієї години. В подальшому зразки наносили на іонообмінний фільтрувальний папір DE-81 та тричі промивали 0,5 M натрій-фосфатним буфером (pH 7.0) при кімнатній температурі. Фільтри висушували, переносили у флакони з сцинтиляційною рідиною та знімали показники включення мітки [3H]dCTP у ДНК. Рівень загального метилювання ДНК оцінювали як середнє значення кількості розпадів за хвилину (dpm) на мкг ДНК з урахуванням фонової величини радіоактивності контрольних (необроблених рестриктазами) зразків ДНК.

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми Statistiсa 6.0 та програмного забезпечення (Лапач С.Н. и др., 2002). Для міжгрупових порівнянь результатів використовували параметричні (Стьюдента) чи непараметричні (медіанний та Уайта) критерії. Ступінь кореляційного зв’язку між показниками визначали методом непараметричної рангової кореляції Спірмена (rs). Для дослідження міжгрупової дисперсії використовували багатовибірковий дисперсійний аналіз Фрідмана. Різницю між показниками вважали вірогідною при рівні значимості Р<0,05, а при розрахунках по критерію ч2 (хі-квадрат) - за умов У?3,8.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Зміни концентрації ГЦ у плазмі крові та рівня загального тканиноспецифічного метилювання ДНК у тварин з експериментальними пухлинами. Оскільки ріст злоякісних пухлин завжди супроводжується різними метаболічними порушеннями, на першому етапі досліджень було доцільним з’ясувати чи змінюється вміст ГЦ у плазмі крові тварин-пухлиноносіїв і яким чином ці зміни пов’язані із особливостями росту пухлин. З цією метою було використано декілька експериментальних модельних систем злоякісного росту.

В дослідженнях на тваринах із карциномою 3LL встановлено, що на 25-ту добу після перещеплення (стадія експоненційного росту та активного метастазування), вміст ГЦ у плазмі крові тварин-пухлиноносіїв був вірогідно у 3,35 рази вищим за аналогічний показник у плазмі крові тварин із групи інтактного контролю (5,12±0,28 мкмоль/л), прямо корелював із масою пухлин (rs=0,73; P=0,0009) та зворотно - з кількістю метастазів у легенях (rs =-0,75; P=0,03).

На NMU-індукованій моделі пухлин МЗ у щурів нами було встановлено, що вміст ГЦ у плазмі крові тварин із злоякісними пухлинами МЗ (карцинома, фібросаркома) на термінальній стадії їх росту вірогідно в 1,37 рази перевищував аналогічний показник у тварин із групи інтактного контролю (2,62 ±0,15 мкмоль/л) та зворотно корелював з масою пухлин (rs=-0,92; P=0,00006). У тварин із доброякісними пухлинами МЗ (аденома, фіброма, фіброаденома) спостерігали збільшення даного показника в 1,33 рази (0,05<Р<0,1), а в групі тварин із передпухлинними змінами в тканині МЗ (інтрадуктальна проліферація) концентрація ГЦ в плазмі крові вірогідно не перевищувала значення контролю.

В дослідженнях на тваринах із карциносаркомою Уокер-256, яка мала експоненційний характер росту протягом усього періоду спостереження (рис.1), нами було встановлено, що вміст ГЦ у плазмі крові щурів прогресивно зростав та на 17-ту добу після перещеплення в 17,3 рази був більшим за даний показник у плазмі крові інтактних тварин (2,47±0,14 мкмоль/л). Проведений кореляційний аналіз виявив, що концентрація ГЦ у плазмі крові тварин-пухлиноносіїв має прямий і сильний кореляційний зв'язок із показниками об’єму та маси пухлин (rs=0,88; P<0,0001 та rs=0,91; P<0,0001 відповідно). |

Рис.1. Кінетична крива росту карциносаркоми Уокер-256 та концентрація ГЦ у плазмі крові інтактних щурів лінії Вістар (контроль) та тварин-пухлиноносіїв.

Примітка:

(a) - Р<0,05 порівняно з показником в контролі; (b) - Р<0,05 порівняно з показником на 11 добу після перещеплення; (с) - Р<0,05 порівняно з показником на 14 добу після перещеплення.

Дослідження концентрації ГЦ у плазмі крові щурів із карциномою Герена показало, що в період її експоненційного росту (з 0-ї по 16-ту добу після перещеплення) рівень ГЦ прогресивно зростав та прямо корелював із масою пухлин (rs=0,66; P=0,02). При зниженні швидкості росту пухлин у термінальній стадії (з 16-ї по 22-гу добу) – вміст ГЦ знижувався, однак не досягав значення контролю (4,28±0,23 мкмоль/л) та зворотно корелював із масою пухлин (rs=-0,68; P=0,014) (рис.2). |

Рис.2. Кінетична крива росту карциноми Герена та концентрація ГЦ у плазмі крові інтактних щурів лінії Вістар (контроль) та тварин-пухлиносіїв.

Примітка:

(a) - Р<0,05 порівняно з показником у контролі; b) - Р<0,05 порівняно з показником на 9 добу після перещеплення.

Подібну закономірність нами було виявлено при дослідженні концентрації ГЦ у плазмі крові мишей із аденокарциномою Са 755. Зокрема, в період експоненційного росту пухлин (з 0-ї по 10-ту добу після перещеплення) рівень ГЦ зростав та прямо корелював із масою пухлин (rs=0,79; P=0,018). При зниженні швидкості росту пухлин у термінальній стадії (з 10-ї по 28-му добу) вміст ГЦ знижувався і майже досягав значення контролю (2,00 ±0,28 мкмоль/л), зворотно корелючи із масою пухлин (rs=-0,74; P=0,00011) (рис.3). |

Рис.3. Кінетична крива росту аденокарциноми Са 755 та концентрація ГЦ в плазмі крові інтактних мишей лінії С57Вl/6 (контроль) та тварин-пухлиноносіїв

Примітка: (a) - Р<0,05 порівняно з показником в контролі; (b) - Р<0,05 порівняно з показником на 7 добу після перещеплення; (с) - Р<0,05 порівняно з показником на 10 добу після перещеплення; (d) - Р<0,05 порівняно з показником на 16 добу після перещеплення; (e) - Р<0,05 порівняно з показником на 22 добу після перещеплення.

Таким чином, отримані нами дані щодо зростання концентрації ГЦ у плазмі крові в експоненційну фазу росту пухлин та прямої кореляційної залежності між даним показником та масою чи об’ємом пухлин доповнюють дані літератури в системі in vitro про пряму залежність між кількістю проліферуючих злоякісно трансформованих клітин та рівнем ГЦ у культуральному середовищі (Wu L.L. et al., 2002). В той же час, зниження концентрації ГЦ у плазмі крові тварин-пухлиноносіїв у термінальний період росту пухлин та зворотна кореляція даного показника з масою пухлин дозволила нам зробити припущення про можливий прямий або опосередкований гальмуючий вплив ГГЦ, яка розвивається в період експоненційного росту пухлин, на їх подальший ріст у термінальний період.

Як відомо, загальне деметилювання геному вважають невід’ємною ознакою росту злоякісних пухлин, але на сьогоднішній день причини та механізми його розвитку до кінця не з’ясовані (Vaniushin B.F., 2006). Тому, наступним завданням даного етапу роботи було вивчення змін у статусі загального тканиноспецифічного метилювання ДНК та аналіз кореляційного зв'язку між концентрацією ГЦ у плазмі крові та кількістю неметильованих CCGG сайтів у ДНК, виділеній із тканин печінки та пухлини. В якості моделі пухлинного росту ми використали карциносаркому Уокер-256 та встановили, що в період її експоненційного росту кількість неметильованих CCGG сайтів в ДНК, виділеній із тканини печінки, змінювалася нерівномірно, але на термінальних строках (17-та доба після перещеплення) була на 45% вищою в порівнянні з інтактним контролем (3287,75±182,47 dpm/мкг ДНК). В той же час, кількість неметильованих CCGG сайтів в ДНК, виділеній із тканини пухлини, прогресивно зростала та на 17-ту добу після перещеплення на 87% вірогідно перевищувала вихідний рівень (7-ма доба після перещеплення) даного показника (2960,80±210,55 dpm/мкг ДНК). Проведений кореляційний аналіз показав, що збільшення кількості неметильованих CCGG сайтів в ДНК печінки було помірно пов’язане як із зростанням концентрації ГЦ у плазмі крові (rs=0,25; P=0,02), так із збільшенням об’єму пухлин (rs=0,48; P=0,019). В той же час, збільшення кількості неметильованих CCGG сайтів в ДНК пухлини сильно корелювало як із зростанням концентрації ГЦ у плазмі крові (rs=0,73; P=0,00008), так із збільшенням об’єму пухлин (rs=0,88; P<0,0001).

Таким чином, отримані нами дані щодо наявності прямого кореляційного зв'язку між зростанням концентрацієї ГЦ у плазмі крові та зниженням рівня загального метилювання ДНК у тканині пухлини, дозволяють зробити висновок, що ГГЦ може бути одним із метаболічних чинників загального гіпометилювання ДНК у злоякісно трансформованих клітинах.

Експериментальна ГГЦ та її вплив на рівень загального метилювання ДНК у тканині печінки. Відповідно до мети роботи, наступним нашим завданням було створити модель ГГЦ, придатну для її використання в експериментальній онкології. Тому, нами була апробована загальновідома метіонінова модель ГГЦ, а також розроблена нова - метіонінова вітамін-дефіцитна модель ГГЦ.

При проведені експериментів на щурах із використанням метіонінових навантажень у дієті, нами було виявлено дозозалежний вплив метіоніну на вміст ГЦ у плазмі крові (табл.1). Показано, що зростання концентрації ГЦ у плазмі крові асоціюється з віком тварин (рис.4А) та із зниженням рівня загального метилювання ДНК у печінці (рис.4Б).

Експериментальні дослідження на щурах різних вікових груп, що перебували на раціонах із метіоніновими навантаженнями (1%) на фоні дефіциту вітамінів В6, В9 та В12, показали, що поєднання цих двох основних етіологічних чинників розвитку ГГЦ у людей призводить до швидкого (15 днів) та суттєвого (в 11,6 раз) зростання концентрації ГЦ у плазмі крові тварин.

Таблиця 1

Концентрація ГЦ у плазмі крові щурів, які протягом 30 днів перебували на раціонах із метіоніновим навантаженням

Характеристика груп | n | ГЦ, мкмоль/л

НПР (контроль) | 5 | 4,29±0,88

Метіонін (1%) | 5 | 5,06±0,55

Метіонін (2%) | 5 | 18,52 ±4,70*

Метіонін (3%) | 5 | 48,13 ±14,31*

Примітка: * Р<0,05 порівняно з показником у групі контролю.

Рис.4. Концентрація ГЦ у плазмі крові (А) та відсоток неметильованих CCGG сайтів у ДНК (Б), виділеної з печінки щурів ювенільного (1), постпубертантного (2) та середнього віку (3), які протягом 15 днів перебували на раціоні з метіоніновим навантаженням.

Примітка: (a) - Р<0,05 порівняно з контролем.

При моделюванні синдрому ГГЦ у мишей нами був використаний аналогічний підхід щодо модифікації їх раціонів харчування та встановлено, що у тварин, які 28 днів перебували на раціоні з метіоніновим навантаженням (4,4%) та раціоні з метіоніновим навантаженням на фоні дефіциту вітамінів В6, В9 та В12 вміст ГЦ у плазмі крові вірогідно зростав у 7,87 та 9,97 рази відповідно в порівнянні з контролем (5,04±0,45 мкмоль/л).

Таким чином, за допомогою експериментальних дієт нами були створені декілька моделей ГГЦ та показано, що зростання концентрації ГЦ у плазмі крові під впливом метіонінових навантажень у дієті супроводжується зниженням рівня загального метилювання ДНК у тканині печінки.

Вплив вітамінів В6, В9 та В12, бетаїну, креатину та холіну на концентрацію ГЦ у плазмі крові та рівень загального метилювання ДНК у печінці щурів за умов експериментальної ГГЦ. Не менш важливим завданням дослідження було вивчення підходів до корекції ГГЦ, оскільки вона вважається одним із можливих шляхів модуляції процесів метилювання ДНК (Чехун В.Ф. та співавт., 2006). Слід зазначити, що існують різні речовини, які мають властивість знижувати вміст ГЦ у плазмі крові, однак на сьогоднішній день питання щодо найбільш ефективного методу корекції ГГЦ перебуває на стадії розробки та обговорення. Тому, ми провели дослідження по вивченню протекторної дії речовин, які безпосередньо залучені до метаболізму ГЦ (комплекс вітамінів В6, В9 та В12, бетаїн, креатин та холін), щодо експериментальної ГГЦ та гіпометилювання ДНК.

Результати досліджень показали, що переведення щурів, які протягом 14-ти днів перебували на метіоніновій вітамін-дефіцитній моделі ГГЦ, на раціони із збільшеними у 5 або 15 разів кількостями вітамінів В6, В9 та В12 по відношенню до контролю призводить до швидкої (протягом 4-х днів) нормалізації концентрації ГЦ у плазмі крові. Причому, за ефективністю дії на вміст ГЦ у плазмі крові щурів різниці між 5-ти та 15-ти кратно збільшеними кількостями вітамінів В6, В9 та В12 у дієті не було.

На метіоніновій моделі ГГЦ нами вивчався вплив на рівень ГЦ у плазмі крові щурів комплексу вітамінів В6, В9 та В12, креатину, бетаїну та холіну в різних дозах. Результати визначення концентрації ГЦ у плазмі крові показали, що в умовах метіонінового навантаження (2%) у дієті протекторними властивостями до зростання вмісту ГЦ у плазмі крові володіли вітаміни В6, В9, В12, у кількостях, які в 5 разів перевищують їх вміст у НПР, бетаїн (1%) та креатин (5%) (табл.2).

Таблиця 2

Концентрація ГЦ у плазмі крові щурів, які 14 днів перебували на експериментальних раціонах

Характеристика груп | n | ГЦ, мкмоль/л

НПР (контроль) | 10 | 7,07±0,84

Метіонін (2%) | 10 | 21,97±1,70*

Метіонін (2%) + вітаміни В6, В9 та В12 ^ в 5 раз | 10 | 7,11 ±0,59#

Метіонін (2%) + креатин (1%), | 10 | 30,63 ±1,91*#

Метіонін (2%) + креатин (5%) | 10 | 6,55 ±0,79#

Метіонін (2%) + бетаїн (1%) | 10 | 6,28 ±1,05

Метіонін (2%) + бетаїн (5%) | 10 | 15,34 ±2,36*#

Метіонін (2%) +холін (0,1%) | 10 | 35,11 ±4,04*#

Метіонін (2%)+холін (0,1%) | 10 | 23,20 ±6,92*

Примітка: *Р<0,05 – порівняно з показником у групі «контроль»;

# Р<0,05 - порівняно з показником в групі «метіонін+дефіцит вітамінів В6, В9 та В12».

На заключному етапі даного фрагменту роботи нами було досліджено вплив на рівень загального метилювання ДНК у печінці лабораторних тварин речовин, які протидіяли зростанню вмісту ГЦ у плазмі крові при 2% метіонінових навантаженнях в дієті. Встановлено, що протекторними властивостями до загального гіпометилювання ДНК володів лише комплекс вітамінів В6, В9 та В12, у кількостях, які в 5 разів перевищують їх вміст у НПР (рис. 5). Проведений кореляційний аналіз виявив, що між концентрацією ГЦ у плазмі крові та рівнем загального метилювання ДНК у тканині печінки щурів, які перебували на експериментальних раціонах, існує прямий кореляційний зв’язок (rs=0,48; P=0,024). |

Рис.5. Кількість неметильованих CCGG сайтів у ДНК, виділеній із тканини печінки щурів, які 30 днів перебували на експериментальних дієтах.

Примітка: (а) - Р<0,05 – порівняно з показником у групі «контроль»; (b) - Р<0,05 – порівняно з

показником у групі «метіонін».

Таким чином, нами експериментально (за умов метіонін-індукованої ГГЦ) продемонстровано, що серед речовин, які здатні знижувати рівень ГЦ у плазмі крові, лише комплекс вітамінів В6, В9 та В12 проявляв у використаних дозах протекторні властивості як до зростання концентрації ГЦ у плазмі крові, так і до зниження рівня загального метилювання ДНК у печінці тварин.

Вплив експериментальної ГГЦ на розвиток індукованих та трансплантованих злоякісних пухлин. Оскільки ГГЦ може призводити до гіпометилювання ДНК та змін в експресії певних генів, залучених до канцерогенезу, в наступній частині роботи ми дослідили вплив експериментальної ГГЦ без втручання та за умов її корекції вітамінами В6, В9 та В12 на злоякісну трансформацію клітин МЗ під дією NMU. Аналіз отриманих результатів показав, що перебування тварин в умовах хронічної ГГЦ протягом мінімального латентного періоду канцерогенної дії NMU на тканину МЗ призводило, з одного боку, до зниження частоти виникнення пухлин МЗ (на 25,6%) та коефіцієнта множинності (на 19,8%), а з іншого – до скорочення латентного періоду (в 1,2 рази) та до збільшення кількості (на 26,7%), маси (на 14,6 %) та об’єму (на 12,4%) злоякісних пухлин МЗ у порівнянні з аналогічними показниками у тварин із групи контролю (табл.3).

Таблиця 3

Вплив ГГЦ на NMU-індукований канцерогенез у МЗ щурів

Показники | Групи тварин

НПР | ГГЦ | ГГЦ+Вітаміни

Кількість тварин, шт | 30 | 31 | 30

Латентний період (Me), дні | 260 | 210* | 270*#

Частота виникнення пухлин МЗ, % | 93,33 | 67,74* | 46,67*#

Відносна кількість злоякісних пухлин МЗ, % | 68,42 | 95,12* | 76,00#

Коефіцієнт множинності

злоякісних пухлин МЗ, пухл./тв | 2,73±0,73 |

2,19±0,39* |

1,83±0,31*#

Об’єм злоякісних пухлин МЗ (Me), cм3 | 17,12 | 19,24 | 3,21

Маса злоякісних пухлин МЗ (Me), г | 22,8 | 26,12 | 5,3

Примітка: Ме –медіана; * У?3,8 – порівняно з показником в групі «НПР»;

# У?3,8- порівняно з показником в групі «ГГЦ» по критерію ч2.

Корекція ГГЦ комплексом вітамінів В6, В9 та В12 у кількостях, які в 5 разів перевищують їх вміст у НПР, призводила як до збільшення латентного періоду, так і до зменшення коефіцієнта множинності, кількості, маси та об’єму NMU-індукованих злоякісних пухлин МЗ у порівнянні з групою тварин, які отримували раціон із додаванням метіоніну (табл.3).

Таким чином, отримані дані показали, що комплекс вітамінів В6, В9 та В12 може повністю нівелювати негативний модулюючий вплив експериментальної ГГЦ на NMU-індукований канцерогенез у МЗ щурів.

Враховуючи виявлений нами у термінальній стадії росту пухлин зворотний кореляційний зв’язок між масою пухлин та концентрацією ГЦ у плазмі крові, на заключному етапі даного фрагменту роботи ми провели серію досліджень по вивченню впливу хронічної ГГЦ на ріст та метастазування експериментальних пухлин. Отримані дані показали, що перебування тварин із трансплантованими пухлинами (карцинома Герена, карцинома легені 3LL, карциносаркома Уокер-256) в умовах хронічної метіонінової ГГЦ призводить, з одного боку, до вірогідного, але не значного (не більше ніж у 2 рази) зростання концентрації ГЦ у плазмі крові в порівнянні з контролем, а, з іншого боку, супроводжується помірним гальмуванням росту пухлин (коефіцієнт ГРП не перевищував 30%). В той же час, перебування тварин із карциномою 3LL в умовах хронічного метіонінового навантаження в дієті на фоні дефіциту вітамінів В6, В9 та В12 супроводжувалося як більш значним зростанням концентрації ГЦ у плазмі крові (майже в 3 рази), так і більш вираженим гальмуванням росту пухлин (ГРП ? 50%) (табл. 4А).

Подібну закономірність ми виявили при дослідженні впливу експериментальної ГГЦ на ріст метастазів у легенях мишей із карциномою 3LL. Так, у тварин, які перебували в умовах хронічного метіонінового навантаження на фоні дефіциту вітамінів В6, В9 та В12 концентрація ГЦ у плазмі крові та коефіцієнт ГРМ були у 1,38 та 1,23 рази відповідно вищими в порівнянні з аналогічними показниками у мишей, які знаходилися на дієті з хронічним метіоніновим навантаженням (табл. 4Б).

Таблиця 4

Вплив ГГЦ на ріст (А) та метастазування (Б) експериментальних пухлин

Показники | Експериментальні пухлини

Карцинома

Герена

(21 доба) | Карциносаркома

Уокер-256

(16 доба) | Карцинома легені

Льюїс

(26 доба)

Раціон | НПР | ГГЦМ | НПР | ГГЦМ | НПР | ГГЦМ | ГГЦМ+Д

Кількість тварин, шт | 8 | 8 | 7 | 7 | 10 | 15 | 15

Концентрація ГЦ,

мкмоль/л | 12,14

±2,22 | 17,61

±1,69* | 36,72

±4,53 | 52,51

±6,36 | 16,31

±2,21 | 33,33

±4,41* | 46,00

±6,02*#

Маса пухлини, г | 31,52

±2,48 | 24,15

±1,85* | 69,55

±5,68 | 51,60

±6,20* | 2,88

±0,27 | 2,04

±0,22* | 1,52

±0,14*

ГРП, % | - | 23,38 | - | 25,81 | - | 29,17 | 47,22#

Таблиця 4 (продовження)

Показники | Групи тварин

НПР | ГГЦМ | ГГЦМ+Д

Кількість тварин, шт | 10 | 15 | 15

Концентрація ГЦ, мкмоль/л | 16,31±2,21 | 33,33±4,41* | 46,00±6,02*#

Частота метастазування, % | 100 | 100 | 100

Кількість метастазів на мишу, шт | 13,27±2,24 | 7,33±0,96* | 8,88±0,80*

ІІМ, % | - | 55,24 | 33,08#

Площа метастазів на мишу, ммІ | 10,38±1,06 | 6,75±0,11* | 5,92±0,77*

ГРМ, % | - | 34,97 | 42,97

Примітка: ГГЦМ – метіонінова модель ГГЦ; ГГЦМ+Д – метіонінова вітамін-дефіцитна модель ГГЦ; * Р<0,05 – порівняно з показником в групі «НПР»; # Р<0,05 - порівняно з показником в групі «ГГЦМ » по критерію ч2 .

Слід зазначити, що при високому рівні ГЦ у плазмі крові мишей із карциномою 3LL індекс інгібування метастазування перевищував 30%, що свідчило про суттєве гальмування процесів метастазування за умов експериментальної ГГЦ.

Таким чином, наведені результати щодо гальмуючого впливу ГГЦ на ріст пухлин та їх метастазування узгоджуються із даними літературних джерел про те, що реакції метилювання ДНК та активність ДНК – метилтрансфераз мають важливе значення для прогресії пухлин, оскільки підтримують аберантне гіперметилювання промоторів генів-супресорів пухлинного росту і генів-інгібіторів метастазування та ангіогенезу (Lyko F. et al., 2005; Szyf M., 2006).

Вплив ГГЦ на протипухлинний ефект доксорубіцину. Відомо, що резистентність злоякісних пухлин до ДОКС є мультифакторним явищем, який останнім часом також пов’язують з гіпометилюванням ДНК (Chekhun