МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ ІМЕНІ П.Л. ШУПИКА

ПЕТРІЩЕВА ВАЛЕНТИНА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК:615.32:615.451.16:582.635.5

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ВИВЧЕННЯ РОСЛИН РОДУ URTICA L.

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фітотерапії, фармакогнозії, гомеопатії та біоенергоінформаційної медицини Медичного інституту Української асоціації народної медицини.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

Кисличенко Вікторія Сергіївна

Національний фармацевтичний університет,

завідуюча кафедрою хімії природних сполук

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

Цуркан Олександр Олександрович

Державна установа «Інститут фармакології та

токсикології» АМН України,

завідувач Державної лабораторії з контролю

якості лікарських засобів

кандидат фармацевтичних наук, доцент

Тодорова Віолета Іванівна

Національна медична академія післядипломної

освіти імені П.Л.Шупика,

доцент кафедри фармацевтичної хімії

і фармакогнозії

Захист відбудеться „_20___”__червня_______ 2008 р. о ___14.00_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика за адресою: 04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9).

Автореферат розісланий „_16___”__травня____ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Л.Б. Пилипчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Біологічно активні речовини лікарських рослин мають переваги перед синтетичними сполуками у зв`язку з тим, що їх хімічна природа максимально наближена до організму людини, вони не викликають серйозних побічних дій, менш токсичні, мають досить широкий спектр фармакологічної активності, можуть використовуватися протягом тривалого часу. Тому розробка препаратів на основі лікарських рослин є актуальним напрямком фармацевтичної науки.

У науковій та народній медицині здавна використовується кропива. Завдяки багатому хімічному складу препарати кропиви виявляють різнобічну лікувальну і профілактичну дію при багатьох патологіях. Рідкий екстракт і настій листя кропиви дводомної застосовують як кровоспинний засіб. Екстракт листя кропиви входить до складу вітчизняного препарату „Алохол”. За кордоном фармакопейною сировиною кропиви дводомної та жалкої є листя, насіння, трава та корені. Їх використовують у виробництві лікарських препаратів, біологічно активних добавок до раціону харчування для профілактики і лікування захворювань передміхурової залози. Екстракт кореня кропиви входить до складу простатопротекторних препаратів: Логомед, Уртирон, Базотон-уно, Уртіка-плюс, Простатофіт, Простанеурин, Простагален, Полістімол.

Значну біомасу сировини можна отримати, використовуючи всю надземну частину цієї трав’янистої рослини, але, на відміну від листя, коренів та насіння, трава кропиви й досі застосовується лише в народній медицині. Отже, дослідження можливості використання надземної частини та коренів кропиви, з огляду на достатньо великі запаси сировини на території України, є актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Медичного інституту Української асоціації народної медицини і є фрагментом науково-дослідної роботи «Роль біологічно активних речовин у регуляції функціональних можливостей органів та систем організму» (номер державної реєстрації № 0104U006047).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було фармакогностичне вивчення рослин роду кропива (Urtica L.) з дослідженням різних груп біологічно активних речовин і визначення можливості отримання лікарських засобів на їх основі.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

- провести попередні фітохімічні дослідження якісного складу різних органів кропиви дводомної (Urtica dioica) та жалкої (Urtica urens);

- визначити кількісний вміст основних груп біологічно активних речовин (БАР) різних органів кропиви дводомної та жалкої;

- отримати біологічно активні субстанції, визначити їх хімічний склад та фармакологічну дію;

- виділити в індивідуальному стані БАР і встановити їх структуру;

- розробити потенційні лікарські засоби на основі сировини та біологічно активних субстанцій кропиви;

- встановити основні анатомо-діагностичні ознаки трави кропиви дводомної та жалкої;

- провести стандартизацію лікарської рослинної сировини – трави кропиви дводомної та жалкої і розробити відповідні проекти аналітичної нормативної документації (АНД).

Об’єкти дослідження: трава, листя, корені, насіння кропиви дводомної, трава кропиви жалкої, виділені з них БАР - вільні і зв`язані цукри, амінокислоти, макро- та мікроелементи, полісахариди, пектинові речовини, органічні кислоти, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, стероїди, дубильні та ліпофільні речовини.

Предмет дослідження: виявлення, виділення, ідентифікація БАР трави, листя, коренів, насіння кропиви дводомної, трави кропиви жалкої, отримання і стандартизація нових лікарських субстанцій, вивчення їх фармакологічної активності, розробка потенційних лікарських засобів (ЛЗ).

Методи дослідження: якісний склад і кількісний вміст БАР визначали фармакопейними методами з використанням тонкошарової хроматографії (ТШХ), паперової хроматографії (ПХ) та газорідинної хроматографії (ГРХ). Ліпофільні комплекси досліджували за допомогою тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в ультрафіолетовому та видимому діапазонах спектру. Для розділення БАР використовували колонкову хроматографію на поліаміді та силікагелі, а також препаративну хроматографію на папері та в тонкому шарі сорбенту. Хімічну будову виділених сполук встановлювали за допомогою УФ-, ІЧ-, ПМР-спектрів та їх хімічних перетворень. Анатомічну будову вивчали на препаратах з поверхні та поперечних зрізах мікроскопічно. Фармакологічні дослідження проводили in vitro та in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичне фітохімічне вивчення БАР трави, листя, коренів, насіння кропиви дводомної та трави кропиви жалкої.

Встановлено наявність та кількісний вміст амінокислот, полісахаридів, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин, сапонінів, хлорофілів, каротиноїдів, жирних кислот, макро- і мікроелементів.

З трави, листя, коренів, насіння кропиви дводомної та трави кропиви жалкої в індивідуальному стані виділено 21 речовину: 2 похідні бензойної кислоти, 4 гідроксикоричні кислоти, 3 похідні кумарину, 11 флавоноїдів, 1 стероїд. Вперше виділені: з трави кропиви дводомної та жалкої – кислота елагова, кислота неохлорогенова, апігенін, кемпферол, ізорамнетин; з насіння – ізорамнетин, ізорамнетин-3-О--D-глюкопіранозид, нарцисин. Встановлено наявність 18 амінокислот, 14 макро- та мікроелементів, жирнокислотний склад ліпофільних фракцій.

Вперше вивчені анатомічні ознаки трави кропиви дводомної і жалкої, які були використані для діагностики лікарської рослинної сировини та створення проекту АНД на сировину.

Вперше розроблено склад фітозасобу «Гепафіт-1» у вигляді збору, для якого визначена специфічна активність. Наукова новизна одержаних результатів підтверджена патентом України на корисну модель № 24432 від 25.06.2007 р.

Отримано ліпофільний екстракт та розроблено склад і досліджено біологічну активність супозиторіїв «Аденоуртикон» з використанням субстанції ліпофільного комплексу з коренів кропиви дводомної.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено склад фітозасобу «Гепафіт-1» та встановлено його антиоксидантну, гепатопротекторну та жовчогінну активність. Розроблено склад супозиторіїв «Аденоуртикон» з використанням субстанції ліпофільного комплексу з коренів кропиви дводомної та встановлено їх простатопротекторну дію. Розроблені проекти АНД на «Траву кропиви», «Корені кропиви дводомної», «Збір «Гепафіт-1». Результати досліджень впроваджені в навчальний процес кафедри ботаніки Національного фармацевтичного університету; кафедри якості, стандартизації та сертифікації ліків Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації Національного фармацевтичного університету; кафедри фармацевтичної хімії та фармакогнозії Луганського державного медичного університету; кафедри фармакогнозії, фармацевтичної хімії та технології ліків ФПО Запорізького державного медичного університету. Технологію збору «Гепафіт-1» впроваджено в виробничий процес ЗАТ «Ліктрави» м. Житомир.

Розроблено і затверджено Українським центром наукової медичної інформації та патентно-ліцензійної роботи МОЗ України інформаційний лист «Застосування фітозасобів «Гепафіт-1», «Артишоку екстракт-Здоров’я» в комплексній превентативній терапії та реабілітації хворих на неалкогольні стеатогепатоз та стеатогепатит у поєднанні з цукровим діабетом ІІ типу» (№ 63-2007), який впроваджено в лікувальний процес клінік міст Києва і Донецька.

Особистий внесок здобувача. Безпосередньо автором здійснено:

- інформаційний пошук за темою дисертаційної роботи, аналіз отриманих даних з питань сучасних досліджень за проблематикою, результати яких стали підгрунтям до вибору об’єктів дослідження;

- встановлено наявність і визначено кількісний вміст полісахаридів (та їх фракційний склад), амінокислот, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин, стероїдних сполук, жирних кислот, хлорофілів, каротиноїдів, макро- та мікроелементів;

- виділено та ідентифіковано 21 сполуку;

- розроблено склад фітозасобу «Гепафіт-1»;

- розроблено склад супозиторіїв «Аденоуртикон»;

- вивчено анатомічну будову трави кропиви та коренів кропиви дводомної;

- розроблено проекти АНД на сировину «Трава кропиви», «Корені кропиви дводомної», «Збір «Гепафіт-1».

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційного дослідження доповідались та обговорювались на VI Національному з’їзді фармацевтів України (Харків, 2005), науково-практичній конференції «Актуальные проблемы образования, науки и производства в фармации» (Ташкент, 2005), Х Міжнародному з’їзді ФИТОФАРМ 2006 «Актуальные проблемы создания нових лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2006), Міжнародному медико-фармацев- тичному конгресі «Ліки та життя» (Київ, 2007), науково-практичній конференції «Вікова поліморбідність і медикаментозна терапія» (Київ, 2007), Міжнародній науково-практичній конференції «Віддалені наслідки впливу іонізуючого випромінювання» (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, у тому числі 4 статті (3 статті у наукових фахових виданнях), 1 патент України, 5 тез доповідей, 1 інформаційний лист.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 201 сторінці машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, трьох розділів експериментальних досліджень, загальних висновків, 12 додатків, списку використаних джерел літератури. Обсяг основного тексту дисертації складає 134 сторінки. Робота ілюстрована 15 рисунками та 37 таблицями. Список використаних джерел включає 164 найменувань, з них 53 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Ботанічна характеристика, розповсюдження, хімічний склад, застосування в медицині, косметиці та народному господарстві кропиви дводомної та жалкої (огляд літератури). В розділі наведено ботанічну характеристику, дані про розповсюдження, хімічний склад, застосування в медицині, косметиці та народному господарстві кропиви дводомної та жалкої. З даних літератури видно, що кропива дводомна та жалка широко розповсюджені по всій території України та застосовуються в народній медицині, входять до складу біологічно активних добавок. Викладені дані свідчать, що кропива дводомна та жалка є перспективною сировиною для фітохімічного і фармакологічного дослідження з метою створення лікарських засобів, враховуючи біологічну дію і забезпеченість сировинною базою.

Розділ 2. Вивчення хімічного складу різних органів кропиви дводомної та жалкої. Як об’єкти дослідження нами були обрані листя, трава, корені та насіння кропиви дводомної та трава кропиви жалкої, які заготовляли в Харківській, Київській і Миколаївській областях. Листя кропиви дводомної заготовляли до цвітіння рослини; траву кропиви обох видів – під час цвітіння; насіння кропиви дводомної – у період повної стиглості; корені кропиви дводомної – в кінці вегетаційного періоду.

За допомогою якісних реакцій, паперової та тонкошарової хроматографії в траві, листі, коренях і насінні кропиви дводомної та траві кропиви жалкої були виявлені: вільні і зв`язані цукри, полісахариди, пектинові речовини, органічні та гідроксикоричні кислоти, кумарини, флавоноїди, дубильні речовини, сапоніни, 18 амінокислот, 14 макро- і мікроелементів.

З метою найбільш повного фітохімічного вивчення та стандартизації сировини кропиви дводомної та жалкої було проведено визначення кількісного вмісту основних груп БАР: пектинових речовин, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, поліфенолів, що окиснюються, органічних кислот, полісахаридів, стероїдних сполук. З метою комплексної переробки сировини та вивчення ліпофільних сполук були отримані ліпофільні фракції, вихід яких склав з трави кропиви дводомної – 5,64%, з листя кропиви дводомної – 6,89%, з коренів кропиви дводомної – 1,18%, насіння кропиви дводомної – 6,25%, трави кропиви жалкої – 5,13%. Із шроту, який залишився після отримання ліпофільних фракцій з сировини кропиви дводомної та жалкої, послідовно виділяли окремі фракції полісахаридів: спирторозчинні сполуки (СРС), водорозчинні полісахариди (ВРПС), пектинові речовини (ПР) та геміцелюлози (ГЦ). Результати дослідження наведені в табл. 1.

Таблиця 1

Результати визначення вмісту полісахаридів за фракціями в різних органах кропиви дводомної та траві кропиви жалкої

Назва рослинної сировини | Вміст полісахаридів за фракціями, %

СРС | ВРПС | ПР | ГЦ

1 | 2 | 3 | 4 | 5

Листя кропиви дводомної | 7,52 | 4,32 | 1,25 | 0,48

Трава кропиви дводомної | 6,48 | 3,68 | 1,28 | 9,67

Корені кропиви дводомної | 3,24 | 1,1 | 0,46 | 3,48

Насіння кропиви дводомної | 4,67 | 3,46 | 0,78 | -

Трава кропиви жалкої | 7,46 | 4,56 | 0,86 | 0,34

За допомогою амінокислотного аналізатора в сировині кропиви дводомної та жалкої було виявлено наявність 18 амінокислот та визначено їх кількісний вміст. В найбільших кількостях у всіх видах сировини, що досліджувалася, містяться аспарагінова та глутамінова кислоти. Крім того, в коренях кропиви дводомної у великій кількості міститься лізин. Методом атомно-абсорбційної спектроскопії визначено елементний склад трави, листя, коренів і насіння кропиви дводомної. Встановлено наявність та визначено кількісний вміст 14 макро- та мікроелементів. Спостерігається найбільший вміст таких елементів: кальцій, калій, кремній, особливо в листі, що було заготовлений після цвітіння.

Для вивчення якісного складу ліпофільних фракцій нами застосовано тривимірну скануючу спектрофлуориметрію в ультрафіолетовому та видимому діапазонах спектру. Тривимірні спектри флуоресценції ліпофільних фракцій та їх проекції на площину збудження/випромінення наведені на рис. 1.

А | Б

В | Г

Д

Рис. 1. 3DF-спектри та їх проекції на площину збудження/емісія: А – ліпофільної фракції листя кропиви дводомної; Б – ліпофільної фракції трави кропиви дводомної; В – ліпофільної фракції коренів кропиви дводомної; Г – ліпофільної фракції насіння кропиви дводомної; Д – ліпофільної фракції трави кропиви жалкої.

Аналіз одержаних спектрів дозволив зробити висновок щодо наявності в ліпофільних фракціях кропиви дводомної та жалкої хлорофілів, каротиноїдів, кумаринів, агліконів флавоноїдів та інших поліфенольних сполук.

З метою стандартизації отриманих ліпофільних фракцій нами визначені основні числові показники: кислотне число, число омилення, ефірне число, йодне число та вміст хлорофілів і каротиноїдів (табл. 2).

Таблиця 2

Результати визначення числових показників і кількісного вмісту БАР ліпофільних екстрактів трави, листя, коренів і насіння кропиви дводомної

та трави кропиви жалкої

Числовий показник | Значення

ліпофільні фракції кропиви дводомної | ліпофільна фракція трави кропиви жалкої

трава | листя | корені | насіння

Кислотне число | 2,59±1,41 | 1,80±0,91 | 3,10±0,96 | 2,90±0,97 | 2,26±0,88

Число омилення | 99,98±1,86 | 125,22±2,11 | 122,52±2,20 | 121,14±2,101 | 115,32±2,299

Ефірне число | 97,39±1,30 | 123,42±2,14 | 119,42±2,54 | 118,34±2,10 | 113,06±2,73

Йодне число | 30,72±1,17 | 75,14±2,10 | 42,21±1,10 | 98,57±2,11 | 40,44±2,17

Каротиноїди | 0,08±0,003 | 0,57±0,002 | 0,06±0,003 | 0,05±0,003 | 1,37±0,002

Хлорофіли | 1,57±0,003 | 9,30±0,009 | 0,16±0,004 | 0,40±0,005 | 0,78±0,01

Методом газорідинної хроматографії встановлено якісний склад та визначено кількісний вміст вільних жирних кислот. Результати дослідження показали, що сума насичених жирних кислот більша в ліпофільних фракціях листя та коренів кропиви дводомної, а ненасичених жирних кислот – в ліпофільних фракціях трави та насіння кропиви дводомної і трави кропиви жалкої, що дає можливість передбачити їх F-вітамінну активність. Серед насичених кислот в найбільшій кількості міститься пальмітинова кислота, серед ненасичених – ліноленова та лінолева кислоти (табл. 3).

Таблиця 3

Результати вивчення жирнокислотного складу ліпофільних фракцій трави, листя, коренів і насіння кропиви дводомної та трави кропиви жалкої

Назва жирної кислоти | Вміст, %

ліпофільні фракції кропиви дводомної | ліпофільна фракція трави кро-

пиви жалкої

трава | листя | корені | насіння

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

Пропіонова | - | - | - | - | 2,39

Бутірова | - | - | - | - | 0,13

Капроінова | - | - | - | - | 0,21

Каприлова | 1,50 | - | - | - | 0,10

Капринова | 1,76 | - | - | - | 0,09

Міристинова | 1,23 | 0,91 | 43,18 | 0,05 | 0,08

Пентадеканова | 0,40 | - | - | 0,01 | сліди

Пентадекенова | сліди | - | - | 0,02 | 0,11

Продовж. табл. 3

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6

Пальмітинова | 29,91 | 15,59 | - | 3,25 | 8,01

Пальмітолеїнова | 1,83 | - | - | 0,05 | 0,85

Гепатдеканова | 1,16 | - | - | 0,02 | 0,14

Гептадекенова | - | - | - | 0,05 | 0,17

Стеаринова | 3,80 | 3,67 | 10,89 | 0,68 | 3,11

Олеїнова | 9,56 | 5,65 | 9,78 | 11,20 | 23,20

Лінолева | 14,27 | 5,70 | 9,31 | 81,46 | 59,34

Ліноленова | 33,18 | 26,80 | 26,81 | 1,38 | 0,82

Арахінова | 0,69 | 9,84 | - | 0,21 | 0,80

Ейкозенова | сліди | - | - | 0,20 | сліди

Ейкозадієнова | - | - | - | 0,03 | -

Ейкозатриєнова | - | - | 0,14 | -

Бегенова | - | 10,71 | - | 1,25 | 1,17

Сума насичених | 40,45 | 49,32 | 54,10 | 5,47 | 15,51

Сума ненасичених | 58,84 | 46,26 | 45,90 | 94,53 | 84,49

Розділ 3. Виділення біологічно активних речовин з трави, листя, коренів, насіння кропиви дводомної та трави кропиви жалкої і встановлення їх структури. Методом колонкової хроматографії, рехроматографії на поліаміді і силікагелі, препаративної хроматографії на папері та в тонкому шарі з трави, листя, коренів, насіння кропиви дводомної та трави кропиви жалкої було виділено і ідентифіковано 21 речовину: 2 похідні бензойної кислоти, 4 гідроксикоричні кислоти, 3 кумарини, 11 флавоноїдів та 1 стероїд. Структуру виділених речовин встановлювали за допомогою вивчення фізико-хімічних властивостей, даних УФ-, ІЧ-, ПМР-спектроскопії у порівнянні з вірогідними зразками. Вперше виділені з сировини, що вивчалася: з трави кропиви дводомної та жалкої – кислота елагова, кислота неохлорогенова, апігенін, кемпферол, ізорамнетин; з насіння – ізорамнетин, ізорамнетин-3-О--D-глюкопіранозид, нарцисин. Основні фізико-хімічні властивості виділених речовин наведені в табл. 4.

Таблиця 4

Основні фізико-хімічні властивості речовин, виділених з трави, листя, коренів, насіння кропиви дводомної та трави кропиви жалкої

Речовина, її структурна характеристика | Джерело отримання сполуки | Т пл. єС | [б],

град | УФ-спектр, л нм | Rf у системах розчинників

Система | Rf

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7

Похідні бензойної кислоти

3.1. Галова кислота

(3,4,5-тригідроксибензойна кислота) | кропива дводомна і жалка | 226-228 | - | 272 | 1 | 0,65

Продовж. табл. 4

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7

3.2. Елагова кислота

(дилактон гексагідроксидифенової кислоти) | кропива дводомна і жалка | 360 розк. | - | 366 | 1

2 | 0,33

0,82

Похідні коричної кислоти

3.3. n-Кумарова кислота

(4-гідроксикорична кислота) | кропива дводомна і жалка | 212-214 | - | 310

228 | 1

2 | 0,89

0,48

3.4. Кавова кислота

(3,4-дигідроксикорична кислота) | кропива дводомна і жалка | 194-195 | - | 325

300

245 | 1

2 | 0,81

0,32

3.5. Хлорогенова кислота

(5-О-кофеїл-D-хінна кислота) | кропива дводомна і жалка | 203-205 |

-32 (мета-нол) | 325

300

245 | 1

2 | 0,62

0,66

3.6. Неохлорогенова кислота

(3-О-кофеїл-D-хінна кислота) | кропива дводомна і жалка | аморф. | +2,6 (ета-нол) | 325

300

245 | 1

2 | 0,66

0,7

ПГідроксикумарини

3.7. Умбеліферон

(7-гідроксикумарин) | кропива дводомна і жалка | 228-230 | - | 218

251

323 | 3

4 | 0,64

0,36

3.8. Ескулетин

(6,7-дигідроксикумарин) |

кропива дводомна і жалка | 344-350 | - | 230

258

270

316 | 3

4 | 0,51

0,08

3.9. Скополетин

(6-метокси-7-гідрокси-кумарин) | кропива дводомна і жалка | 202-204 | - | 228

340 | 3

4 | 0,5

0,58

ПФлавони

ПГрупа апігеніну

3.10. Апігенін

(5,7,4-тригідроксифлавон) | кропива дводомна і жалка | 345-346 | - | 275

321

401 | 1

2 | 0,9

0,1

ПФлавоноли

ПГруппа кемпферолу

3.11. Кемпферол

(3,5,7,4-тетрагідроксифлавон) | кропива дводомна і жалка | 276-278 | - | 366

266 | 1

2 | 0,83

0,1

3.12. Астрагалін

(кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозид) | кропива дводомна і жалка | 175-176 | -12

(ета-нол) | 375

270 | 1

2 | 0,69

0,37

Продовж. табл. 4

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7

3.13. Нікотифлорин | кропива дводомна і жалка | 220-222 | -66 (мета-нол) | 350

298

266 | 1

2 | 0,49

0,58

ПГруппа кверцетину

3.14. Кверцетин

(3,5,7,3,4-пентагідроксифлавон) | кропива дводомна і жалка | 310-312 | - | 375

268

256 | 1

2 | 0,69

0,7

3.15. Кверцитрин

(кверцетин-3-О-б-L-рамнопіранозид) | кропива дводомна і жалка | 182-185 | - | 355

257 | 1

2 | 0,63

0,49

3.16. Ізокверцитрин

(кверцетин-3-О-в-D-глюкопіранозид) | кропива дводомна і жалка | 227-229 | -12,5

(мета-нол) | 355

256 | 1

2 | 0,52

0,36

3.17. Рутин

(кверцетин-3-О--D-рутинозид) | кропива дводомна і жалка | 189-192 | -32,3

(мета-нол) | 362

258 | 1

2 | 0,46

0,54

Група ізорамнетину

3.18. Ізорамнетин

(3,5,7,4-тетрагідрокси - 3 - метоксифлавон) | кропива дводомна і жалка | 167-170 | - | 370

254 | 1

2 | 0,85

0,11

3.19. Ізорамнетин-3-О-в-D-глюкопіранозид | кропива дводомна і жалка | 244-248 | -59 (ДМФА) | 365

255 | 1

2 | 0,52

0,46

3.20. Нарцисин (ізорамнетин-3-О-в-D-рутинозид) | кропива дводомна і жалка | 180-182 | -31 (ДМФА) | 355

255 | 1

2 | 0,66

0,74

Стероїди

3.21. в-Ситостерин | кропива дводомна і жалка | 138-140 | +37,5 (хлороформ) | 1

5 | 0,95

0,34

Примітка. Системи розчинників: 1 – н-бутанол - кислота оцтова - вода БОВ (4:1:2); 2 - 15 % кислота оцтова; 3 – хлороформ (формамід 25 %); 4 - хлороформ-кислота оцтова-вода (13:6:2); 5 - гексан-ацетон (8:2).

Похідні бензойної кислоти. Речовини 3.1 і 3.2 утворювали з 1% розчином заліза (ІІІ) хлориду синє і сіре забарвлення відповідно, що свідчило про їх фенольну природу. Крім того, при обробці речовини 3.1 лугом утворювалося червоно-фіолетове забарвлення, яке переходило в буре, що дозволило припустити наявність галоїльного угруповання. Речовина 3.2 давала позитивну реакцію на вільну елагову кислоту – червоно-фіолетове забарвлення з натрію нітритом в оцтовокислому середовищі. На підставі проведених досліджень і порівнянні з вірогідними зразками речовини 3.1 і 3.2 були ідентифіковані як галова та елагова кислоти (див. табл. 4).

Похідні гідроксикоричних кислот. Речовини 3.3-3.6 давали якісні реакції з заліза (ІІІ) хлоридом, кислотою сульфаніловою діазотованою, що вказувало на їх фенольну природу. Кислотні властивості цих сполук виявляли за допомогою розчину бромтимолового синього. Блакитне забарвлення речовин 3.5 і 3.6 після обробки хроматограм реактивом кислоти барбітурової вказувало на наявність в їх складі кислоти хінної. За результатами хімічних перетворень, даних УФ-спектрів, у порівнянні з вірогідними зразками речовини 3.3-3.6 були ідентифіковані відповідно як n-кумарова, кавова, хлорогенова та неохлорогенова кислоти (див. табл. 4).

Похідні кумарину. Речовини 3.7-3.9 на підставі наявності блакитної, золотисто-жовтої, жовтої флуоресценції в УФ-світлі при обробці хроматограм 10%-ним спиртовим розчином лугу та жовтогарячого забарвлення при денному світлі після обробки хроматограм кислотою сульфаніловою діазотованою віднесені до похідних кумарину. Присутність в УФ-спектрі інтенсивного максимуму поглинання в області 320-340 нм та наявність в ІЧ-спектрі смуги поглинання при 1710-1730 см-1 характерно для валентних коливань карбонільної групи б-пірону. Порівняння фізико-хімічних властивостей речовини 3.7-3.9 з вірогідними зразками дозволило ідентифікувати їх як умбеліферон, ескулетин і скополетин відповідно (див. табл. 4).

Флавоноїди. З флавоноїдних сполук нами було виділено 11 речовин, які представлені агліконами, монозидами та біозидами. Речовина 3.10 є флавоновим агліконом – лютеолін; речовини 3.11, 3.14, 3.18 є флавоноловими агліконами – кемпферол, кверцетин, ізорамнетин; речовини 3.12, 3.13 є глікозидами кемпферолу – астрагалін, нікотифлорин; речовини 3.15, 3.16, 3.17 є глікозидами кверцетину – кверцитрин, ізокверцитрин, рутин; речовини 3.19, 3.20 є глікозидами ізорамнетину – ізорамнетин-3-О-в-D-глюкопіранозид, нарцисин, про що свідчать результати якісних реакцій, хімічних перетворень, хроматографічна поведінка в різних системах розчинників, дані УФ-, ІЧ-, ПМР-спектроскопії (див. табл. 4).

Стероїди. Речовину 3.21 за результатами якісних реакцій, хроматографування в різних системах розчинників з наступною обробкою хроматограм реактивами, у порівнянні з вірогідним зразком було віднесено до стероїдів та ідентифіковано як в-ситостерин.

Розділ 4. Стандартизація сировини та отриманих фітозасобів і вивчення їх фармакологічних властивостей. З метою розробки аналітичної нормативної документації на траву кропиви і корені кропиви дводомної нами досліджено 5 серій кожної рослинної сировини. Для цього визначали макро- та мікроскопічні ознаки, вміст вологості, золи, проводили визначення якісного складу, встановлювали вміст екстрактивних речовин, флавоноїдів і стероїдів (для трави кропиви) і стероїдів (для коренів кропиви дводомної).

У траві кропиви вміст флавоноїдів має бути не менше 2%, вміст стероїдних сполук не менше 2%.

Вміст стероїдних сполук у коренях кропиви має бути не менше 1,5%.

На базі кафедри ботаніки Національного фармацевтичного університету при консультативній допомозі професора Сербіна А.Г. та доцента Руденко В.П. встановлено основні анатомічні діагностичні ознаки трави кропиви та коренів кропиви дводомної. Для трави кропиви – це видовжені клітини епідерми реберної частини стебла; жалкі та залозисті волоски на поверхні стебла, звивистостінні клітини нижньої епідерми листа з продихами, жалкі та ретортовидні волоски, цистоліти. Для коренів кропиви – вузька пробка з тонкостінних клітин; товстостінні поодинокі або зібрані в групи луб`яні волокна; камбій з декількох рядів витягнутих клітин; широкопорожнинні сітчасті та крапчасті судини в радіально симетричних групах; наявність друз кальцію оксалату.

Стандартизацію ліпофільного комплексу проведено за вмістом хлорофілів і каротиноїдів, який складає в ліпофільній фракції відповідно: з трави кропиви дводомної 1,57% і 0,08%; з листя кропиви дводомної – 9,30% і 0,57%; з коренів кропиви дводомної – 0,16% і 0,06%; насіння кропиви дводомної – 0,40% і 0,05%, трави кропиви жалкої – 0,78% і 1,37%.

З метою створення нових лікарських засобів з достатньою сировинною базою нами було розроблено склад фітозбору «Гепафіт-1», на який одержано патент України на корисну модель № 24432. Стандартизацію запропонованого збору «Гепафіт-1» проводили за числовими показниками та вмістом екстрактивних речовин, які включені в проект АНД.

Вивчення антиоксидантної, гепатопротекторної та жовчогінної активності фітозбору «Гепафіт-1» проводили на базі відділу фармакології та патоморфології Інституту геронтології АМН України під керівництвом д. мед. н., професора Гарник Т.П. та к. мед. н. Білоусової І.В.

Вивчення гепатопротекторної активності фітозбору «Гепафіт-1» проводили на моделі хронічного гепатиту у щурів, викликаного тетрахлорметаном. Досліджуваний та референтний препарат «Гепатофіт» вводили внутрішньошлунково щодня протягом 12 днів у добовій дозі 900 мг сухої суміші рослин на 1 кг маси тіла тварин у вигляді свіжоприготованого настою. Результати дослідження свідчать, що фітозбір «Гепафіт-1» проявляє достатньо виражену гепатопротекторну дію. При цьому, досліджуваний збір за антиоксидантною складовою гепатопротекції дещо поступається активності референтного препарату – збору «Гепатофіт» (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив фітозбору «Гепафіт-1» на перебіг ферментативного і аскорбатзалежного ПОЛ мікросом печінки щурів

Група | Нмоль МДА/мг білка за 5 хвилин

аскорбатзалежне ПОЛ | ферментативне ПОЛ

Інтактний контроль | 12,04±1,02 | 16,15±1,42

«Гепафіт-1» | 9,00±0,50*/** | 11,32±0,95*/**

«Гепатофіт» | 6,50±0,17* | 7,32±0,29*

Примітки: * - відхилення показника достовірне відносно показника групи інтактного контролю, р<0,05;

** - відхилення показника достовірне відносно показника групи референтного препарату, р<0,05.

Вивчення жовчогінної активності фітозбору «Гепафіт-1» проводили в умовах його тривалого застосування у здорових щурів. Досліджуваний та референтний препарат «Гепатофіт» вводили внутрішньошлунково щодня протягом 4 тижнів у добовій дозі 900 мг сухої суміші рослин на 1 кг маси тіла тварин у вигляді свіжоприготованого настою. За результатами проведеного дослідження можна стверджувати, що БАР фітозасобу «Гепафіт-1» в умовах експерименту здійснюють багатосторонній вплив на перебіг фізіолого-біохімічних процесів у печінці, пов’язаних із забезпеченням її зовнішньосекреторної функції. Збір проявляє виразну жовчогінну активність, є справжнім холеретиком, підвищує швидкість жовчовиділення, стимулює синтез кон’югованих жовчних кислот і фосфоліпідів (табл. 6).

Таблиця 6

Вплив фітозасобу «Гепафіт-1» на динаміку жовчовиділення у здорових щурів в умовах тривалого введення препарату

Показник | Інтактний контроль | «Гепафіт-1», 900 мг/кг | «Гепатофіт», 900 мг/кг

0-30 хвилин жовчовиділення

Швидкість секреції жовчі, мг/хв/100 г | 5,10±0,31 | 6,14±0,24* | 5,57±0,25

30-60 хвилин жовчовиділення

Швидкість секреції жовчі, мг/хв/100 | 4,84±0,20 | 5,71±0,20* | 5,15±0,31

60-90 хвилин жовчовиділення

Швидкість секреції жовчі, мг/хв/100 | 4,65±0,29 | 5,35±0,14 | 4,93±0,24

Загальна кількість виділеної жовчі, мг | 437,63±22,48 | 570,00±14,89*/** | 469,38±22,72

Примітки: * - відхилення показника достовірне відносно показника групи інтактного контролю, р<0,05;

* * - відхилення показника достовірне відносно показника групи референтного препарату, р<0,05.

З метою розширення асортименту простатопротекторних засобів разом з кафедрою промислової фармації та економіки Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації Національного фармацевтичного університету розроблено супозиторії «Аденоуртикон», які містять 0,5 г ліпофільного екстракту коренів кропиви дводомної, вивчено їх фармакологічні властивості.

Вивчення простатопротекторної активності проводили на експериментальній моделі простатиту, яку викликали дихлоретаном. Як препарат порівняння використовували супозиторії з олією гарбуза. Підвищення рівня кислої фосфатази в гомогенаті простати і зниження в сироватці крові до рівня інтактного контролю, вірогідне збільшення масового коефіцієнту предміхурової залози на фоні введення супозиторіїв свідчило про нормалізацію функціонального стану органу (табл. 7).

Таблиця 7

Вплив супозиторіїв «Аденоуртикон» і супозиторіїв з олією гарбуза на деякі клінічні та біохімічні показники крові та предміхурової залози щурів на

моделі кріоураження простати

Показник | Група тварин (n=6)

Інтактний контроль | Контрольна патологія | Супозиторії «Аденоур-тикон» | Супозиторії з олією гарбуза

Показники крові клінічні | ШОЕ, мм/год | 7,17±0,65 | 18,20±0,02* | 9,13±1,11* | 9,67±1,36**

Лейкоцити, х109/л | 12,46±1,19 | 23,28±1,44* | 18,03±0,72*/** | 17,25±1,18*/**

Показники крові біохімічні | Кисла фосфатаза, моль/гл | 0,66±0,05 | 9,93±0,05* | 0,53±0,004** | 0,60±0,06**

ТБК активні продукти, моль/г | 0,51±0,05 | 1,10±0,06* | 0,58±0,06** | 0,64±0,06**

Відновле-ний глутатіон, мкмоль/г | 5,70±0,52 | 2,89±0,34* | 5,60±0,62** | 5,68±0,19**

Показники простати | Масовий коефіцієнт простати |

0,53±0,06 |

0,26±0,03* |

0,41±0,03** |

0,42±0,02**

Кисла фосфатаза, моль/гл |

1,83±0,09 |

1,07±0,17* |

1,78±0,21** |

1,79±0,20**

ТБК активні продукти, моль/г |

33,33±2,27 |

66,29±4,33* |

42,44±3,13*/** |

41,11±1,79*/**

Примітки: * - відхилення показника достовірне відносно показника групи інтактного контролю, р<0,05;

** - відхилення показника достовірне відносно показника групи референтного препарату, р<0,05.

Препарат, що вивчався, знижував інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів, про що свідчило зниження рівня тіобарбітурової кислоти, підвищував активність антиоксидантного захисту в сироватці крові та тканинах простати, що підтверджувалося нормалізацією рівня відновленого глутатіону. Експеримент виявив більш виражений терапевтичний ефект у супозиторіїв «Аденоуртикон» у порівнянні з супозиторіями з олією гарбуза.

висновки

1. Вперше проведено систематичне фармакогностичне вивчення трави, листя, коренів, насіння кропиви дводомної та трави кропиви жалкої з дослідженням груп біологічно активних речовин, отриманням комплексів біологічно активних речовин у вигляді субстанцій ліпофільних сполук, а також стандартизацією сировини та отриманих субстанцій, встановленням їх біологічної активності, що дало можливість запропонувати ряд лікарських засобів різної фармакологічної дії.

2. За допомогою якісних реакцій, тонкошарової хроматографії і хроматографії на папері в траві, листі, коренях, насінні кропиви дводомної та траві кропиви жалкої були виявлені: вільні і зв`язані цукри, полісахариди, пектинові речовини, органічні кислоти, кумарин, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, дубильні речовини, сапоніни, 18 амінокислот, 14 макро- і мікроелементів.

3. За допомогою спектральних, титриметричних та гравіметричного методів аналізу визначено кількісний вміст основних груп БАР: пектинових речовин, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, окислюваних поліфенолів, органічних кислот, полісахаридів.

4. З сировини, що вивчалася, отримані ліпофільні фракції, вихід яких склав з трави кропиви дводомної – 5,64%, з листя кропиви – 6,89%, з коренів кропиви дводомної – 1,18%, насіння кропиви дводомної – 6,25%, трави кропиви жалкої – 5,13%. За допомогою тонкошарової, газорідинної хроматографії та тривимірної скануючої спектрофлуориметрії вивчено якісний склад отриманих ліпофільних фракцій: встановлено наявність хлорофілів, каротиноїдів, кумаринів, агліконів флавоноїдів, інших поліфенольних сполук та жирних кислот.

5. В отриманих ліпофільних фракціях визначено кількісний вміст хлорофілів і каротиноїдів, який складає в ліпофільній фракції відповідно: з трави кропиви дводомної 1,57% і 0,08%; з листя кропиви дводомної – 9,30% і 0,57%; з коренів кропиви дводомної – 0,16% і 0,06%; насіння кропиви дводомної – 0,40% і 0,05%, трави кропиви жалкої – 0,78% і 1,37%.

6. З сировини кропиви дводомної та жалкої було виділено в індивідуальному стані 21 речовину: 2 похідні бензойної кислоти, 4 гідроксикоричні кислоти, 3 кумарини, 11 флавоноїдів та 1 стероїд. Структуру виділених речовин встановлювали за допомогою фізико-хімічних властивостей, даних УФ-, ІЧ-, ПМР-спектроскопії у порівнянні з вірогідними зразками. Вперше виділені: з трави кропиви дводомної та жалкої – кислота елагова, кислота неохлорогенова, апігенін, кемпферол, ізорамнетин; з насіння – ізорамнетин, ізорамнетин-3-О--D-глюкопіранозид, нарцисин.

7. Вперше встановлено основні анатомічні діагностичні ознаки трави кропиви та коренів кропиви дводомної. Для трави кропиви – це видовжені клітини епідерми реберної частини стебла; жалкі та залозисті волоски на поверхні стебла, звивистостінні клітини нижньої епідерми листа з продихами, жалкі та ретортовидні волоски, цистоліти. Для коренів кропиви – вузька пробка з тонкостінних клітин; товстостінні поодинокі або зібрані в групи луб`яні волокна; камбій з декількох рядів витягнутих клітин; широкопорожнинні сітчасті та крапчасті судини в радіально симетричних групах; наявність друз кальцію оксалату.

8. Проведено визначення антиоксидантної, гепатопротекторної та жовчогінної активності фітозбору «Гепафіт-1». Встановлено, що «Гепафіт-1» виявляє чітко виражений антиоксидантний ефект, гепатопротекторну та високу жовчогінну активність.

9. Проведено визначення простатопротекторної активності супозиторіїв «Аденоуртикон». Встановлено, що супозиторії «Аденоуртикон» виявляють виражену простатопротекторну дію, яка перевищує препарат порівняння супозиторії з олією гарбуза.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Вивчення деяких ізопреноїдів ліпофільних фракцій Urtica dioica та Urtica urens / В. О. Петрищева, І. О. Журавель, О. І. Нещерет, В. С. Кисличенко // Зб. наук. праць співробітників НМАПО ім. П. Л. Шупика. – К., 2006. – Вип. 15, кн. 1. – С. 854-857. (Особистий внесок - отримання експериментальних даних, узагальнення результатів, написання статті).

2. Дослідження мінерального складу кропиви дводомної / В. О. Петрищева, В. С. Кисличенко, І. О. Журавель, О. І. Нещерет // Фітотерапія. Часопис. – 2006. – №3. – С. 46-48. (Особистий внесок - отримання експериментальних даних, узагальнення результатів, написання статті).

3. Флавоноїди трави кропиви дводомної / В. О. Петрищева, В. С. Кисличенко, І. О. Журавель, О. І. Нещерет // Фітотерапія. Часопис. – 2007. – №2. – С. 51-53. (Особистий внесок - отримання експериментальних даних, узагальнення результатів, написання статті).

4. Патент на корисну модель №24432. Україна МПК (2007) А61К36/005. Збір лікарських рослин Гепафіт-1 / Т. П. Гарник, І. В. Білоусова, В. О. Петрищева, В. С. Кисличенко, І. О. Журавель - № u200703195; заявл. 26.03.2007; опубл. 25.06.2007. Бюл. № 9. (Особистий внесок – участь у патентному пошуку, розробка складу, участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у підготовці матеріалів патенту).

5. Принципы создания простатопротекторов на основе природних соединений / В. С. Кисличенко, В. А. Петрищева, А. В. Зайченко, И. А. Журавель, Л. В. Яковлева // Актуальне проблемы создания нових лекарственных препаратов природного происхождения: материалы Х Междунар. съезда ФИТОФАРМ 2006, 27-30 июня 2006 г. – СПб, 2006. – С. 145-148. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальненні результатів, написанні статті).

6. Петрищева В. О. Перспективи дослідження рослин роду Urtica / В. О. Петрищева, І. О. Журавель, В. С. Кисличенко // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України: матеріали VI Нац. з’їзду фармац. України, Харків, 28-30 верес. 2005 р. – Х., 2005. – С. 797-798. (Особистий внесок - проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).

7. Петрищева В. А. Трава Urtica dioica L. – перспективное простатопротекторное средство / В. А. Петрищева, И. А. Журавель, В. С. Кисличенко // «Актуальне проблемы образования, науки и производства в фармации»: материалы науч.-прат. конф., Ташкент, 18-19 октяб. 2005 г. – Т., 2005. – С. 180-181. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).

8. Дослідження якісного складу та кількісного вмісту фенольних сполук та органічних кислот у генеративних та вегетативних органах кропиви дводомної / В. О. Петрищева, В. С. Кисличенко, І. О. Журавель, О. І. Нещерет // Ліки та життя; міжнар. мед.-фармацевт.конгрес, 6-9 лютого 2007 р.: тези доп. – К. 2007. – С.107. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).

9. Кропива дводомна (Urtica dioica L.) – лікарський рослинний засіб як радіопротектор природного походження / В. О. Петрищева, І. В. Білоусова, Т. П. Гарник, І. О.Журавель, В. С.Кисличенко, О. І. Нещерет // Віддалені наслідки впливу іонізуючого випромінювання: міжнар. наук.-практ. конф., 23-26 травня 2007 р.: тези доп. – К., 2007. – С. 246-247. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання тез).

10. Роль і місце рослин роду Urtica L. у лікуванні і профілактиці осіб похилого віку / В. О. Петрищева, Г. В. Зайченко, І. О. Журавель, В. С. Кисличенко // Вікова поліморбідність і медикаментозна терапія: матеріали наук.-практ. конф., 11-12 жовт. 2007 р. – К., 2007. – С. 30-31. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальненні результатів, написанні тез).

11. Гарник Т. П. Застосування фітозасобів «Гепафіт-1», «Артишоку екстракт – Здоров’я» в комплексній превентивній терапії та реабілітації хворих на неалкогольні стеатогепатоз та сеатогепапит у поєднанні з цукровим діабетом ІІ типу / Т. П. Гарник, І. В. Білоусова, В. О. Петрищева // Інф. лист про нововведення в системі охорони здоров’я. – Київ, 2007. – №63. – 5 с. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальненні результатів і підготовці інформаційного листа).

Петріщева В.О. Фармакогностичне вивчення рослин роду Urtica L. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня