ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

РУСНАК НАДІЯ ІГОРІВНА

УДК 577.112:577.122:579.222

ВНУТРІШНЬОКЛІТИННИЙ МЕТАБОЛІЗМ МІКРОБНИХ ПОПУЛЯЦІЙ ТРАВНОГО ТРАКТУ ТВАРИН ЗА ДІЇ ЕКЗОГЕННИХ ФАКТОРІВ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Науково-дослідному інституті біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького Міністерства агрополітики України.

Науковий керівник– | доктор біологічних наук, професор

Калачнюк Григорій Іванович,

Науково-дослідний інститут біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького, директор, професор кафедри органічної та неорганічної хімії.

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, професор

Сологуб Леонід Ілліч,

Інститут біології тварин УААН, головний науковий співробітник лабораторії обміну речовин;

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент УААН Мельничук Сергій Дмитрович,

Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, директор Української лабораторії якості і безпеки продукції АПК, проректор з навчальних та науково-виробничих питань якості, стандартизації і сертифікації продукції АПК.

Захист відбудеться “15” квітня 2008 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН (79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38)

Автореферат розісланий “14” березня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради __________________________________ О. І. Віщур

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У процесі росту й розвитку тварин роль мікробних популяцій шлунково-кишкового тракту (ШКТ) стає вагомішою. Мікроорганізми-симбіонти метаболізують поживні речовини раціону до кінцевих продуктів, які засвоюються як мікробами, так і клітинами макроорганізму тварини-господаря. У жуйних тварин такі мікробні популяції містяться, головним чином, у передшлунках, а у свиней, кролів та інших тварин – переважно у товстій кишці, куди надходять всі неперетравні поживні частки рослин низької розчинності й ензимної недоступності (проламіни й глютаміни, клітковина тощо), а також протеїди ендогенного походження (ензими, секрети муцину, клітинні десквамати тощо). Визначальну роль у їх засвоєнні відіграє склад дієти та вплив багатьох екзо- й ендогенних факторів, серед яких виділяють фізико-хімічні й поживні властивості біосубстратів, доступність їх для ензимів мікробного й ендогенного походження та наявність біоцидів сильної дії. Доведено, що однією з найпоширеніших токсичних сполук у довкіллі є пентахлорофенол (ПХФ), у зв’язку з чим пріоритетним вважається вивчення особливостей його дії на всі ланки екобіосистеми, в тому числі й на стан здоров’я людини та тварин, а також на пошук ефективних способів його деградації за допомогою мікробів тощо (Keit L.H., Talliard W.A., 1979; Sato K., 1985; Valo R. et al., 1985; Yokoyama М.Т. et al., 1988; Kmet’ V., Baran M., Kalachnyuk G.I., 1990; Калачнюк Л.Г. та ін., 2002-2006). Маючи надзвичайно сильний токсичний вплив на всі живі організми в природних умовах, ПХФ постійно циркулює у замкненому циклі, в якому утворюються продукти харчування для людей і тварин. Незважаючи на все це, зазначену токсичну речовину продовжують інтенсивно застосовувати у виробництві гербіцидів та фунгіцидів і забруднюють нею довкілля й водні ресурси. Потрапляння ПХФ у ШКТ може супроводжуватися зниженням резистентності мікробної популяції і цілого макроорганізму-господаря, а також значними втратами продуктивності тварин та низькою якістю одержаної продукції.

Отже, актуальність питань, що пов’язані з проблемами надмірного розповсюдження ПХФ у природі, не викликає сумнівів. Однак механізм його біологічної дії на окремі мікроби та їх асоціації залишається нез’ясованим. Зовсім не розкрито зв’язок між умовами живлення та ступенем токсичності згаданого біоциду на мікробні популяції, що заселяють ШКТ. Невідомою залишається сила дії певної його дози на екзо- й ендогенні ензими як цілого комплексу, так і чистих штамів мікроорганізмів, а також на спектр кінцевих продуктів ферментації різних за фізико-хімічними властивостями біосубстратів. Тому на вивчення вказаних актуальних питань, у тому числі й на з’ясування основних біохімічних аспектів антитоксичної та протекторної дій природних сорбентів – кліноптилолітів (Кл), були спрямовані наші дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана дисертаційна робота була складовою частиною комплексних досліджень НДІ біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій ім. С.З. Ґжицького, які виконувалися на замовлення Департаменту кадрової політики, аграрної освіти та науки Мінагрополітики України з тем 9/1 і 9/9 (№ держреєстрації 0198U008022) “Розробити нові, комплексні біотехнологічні способи підвищення вмісту рістстимулюючих речовин у природних кормових засобах”, а також фрагментом науково-дослідних робіт, проведених спільно з Інститутом фізіології і генетики тварин Чеської Академії наук, з тем: 1) “Розробка фізіолого-біохімічних і біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин”; 2) “Біотехнологічні аспекти регуляції процесів травлення у тварин”; 3) “Вивчення метаболічних процесів в організмі тварин”, у яких автором вивчалися біохімічні процеси в клітинах мікробних популяцій травного тракту тварин за дії екзо- й ендогенних чинників.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – з’ясувати особливості й роль інтрацелюлярного метаболізму змішаних мікробних популяцій та чистих штамів бактерій шлунково-кишкового тракту у різних видів тварин за умов дії окремих антимікробних сполук (ПХФ) і речовин із протекторними властивостями (Кл) на тлі зміни використання різних за доступністю й поживною цінністю біосубстратів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було виконати такі завдання:

· встановити ступінь гальмівної дії різних доз ПХФ на метаболічну здатність рубцевих мікробних популяцій, сформованих на менш і більш доступних біосубстратах;

· дослідити рівень зниження токсичної дії біоциду на рубцеву мікробну популяцію за допомогою кліноптилоліту;

· оцінити зміни активності інтрацелюлярних ензимів рубцевого бактеріального комплексу за дії біоциду й природного сорбенту;

· показати метаболічні особливості мікробних популяцій сліпої кишки свиней і кролів за умов використання різних біосубстратів, а також дії біоциду та сорбенту;

· виявити зміни в кінетиці росту клітин Butyrivibrio fibrisolvens 787 та метаболізації ними альдоз різної молекулярної маси за дії інгібітора й протектора;

· з’ясувати особливості стехіометрії метаболізму глюкози й ксилози клітинами чистого бактеріального штаму за дії ПХФ та Кл;

· вивчити активність специфічних ензимів у цукролітичної бактерії залежно від молекулярної структури біосубстрату та дії ПХФ і Кл.

Об’єкт дослідження. Метаболічні процеси у клітинах чистих штамів бактерій, бактеріальних комплексів і змішаних мікробних популяцій шлунково-кишкового тракту різних видів тварин.

Предмет дослідження. Вплив антимікробної сполуки ПХФ, біосубстратів різної доступності й сорбенту на інтрацелюлярний метаболізм, ключові ензимні реакції і кінцеві продукти ферментації у клітинах чистих штамів бактерій, бактеріальних комплексів і змішаних мікробних популяцій ШКТ жуйних тварин, свиней і кролів.

Методи дослідження. Для досягнення мети та виконання завдань були використані біохімічні (газохроматографічне визначення кінцевих продуктів мікробного метаболізму та спектрофотометричне визначення концентрації метаболітів й активності ензимів), біологотехнологічні (аналіз продуктивних якостей тварин), мікробіологічні (одержання зразків мікробних популяцій та їх культивування), фармакологічні (встановлення ступеня токсичності різних доз біоциду) й статистичні (вірогідність отриманих результатів) методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлено, що різні дози антимікробної сполуки ПХФ проявляють неоднакову інгібуючу дію на метаболічні реакції змішаних рубцевих мікробних популяцій, сформованих на різних за поживною доступністю біосубстратах. Додавання природних сорбентів (Кл) у культуральне середовище на тлі інгібуючої дії ПХФ проявляє у 2 рази більший протекторний ефект там, де мікробні популяції були сформовані на доступніших біосубстратах. Навіть низькі дози біоциду (до 40 мкМ) вірогідно (р.<.0,05) знижують активність інтрацелюлярних ензимів бактеріального комплексу мікробної популяції рубця, а застосування Кл дозволяє відновити їх функції на 19?47 %. Під дією низьких доз ПХФ метаболічні процеси у сліпій кишці свиней і кролів також вірогідно (р < 0,05) знижуються, а присутність Кл у культуральному середовищі значно послаблює інгібуючу дію антимікробної сполуки, особливо там, де були доступніші джерела поживних речовин (глюкоза, РНК, муцин).

Клітини цукролітичної бактерії Butyrivibrio fibrisolvens 787 метаболізують альдози різної молекулярної маси з неоднаковою швидкістю. Глюкоза використовується у 2,5 раза швидше, ніж ксилоза. За наявності у ростовому середовищі обох альдоз клітинами цього штаму спочатку використовується глюкоза, а потім ксилоза. На обох вказаних мономерах у клітинах штаму не проявляється активність фосфокетолази, тоді як у них та у контрольної бактерії-свідка (Lactobacillus plantarum 185) активність лактатдегідрогенази проявляється на досить високому рівні. Високий рівень метаболізму клітин B. fibrisolvens забезпечується функціонуванням специфічних ензимних реакцій, які каталізуються 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазою (КДФГА; завдяки чому використовується метаболічний шлях Ентнера-Дудорова) та фруктозодифосфатальдолазою (ФДФА, за допомогою якої вуглеводи утилізуються шляхом Ембдена-Мейєргофа-Парнаса). Вказані метаболічні шляхи гальмуються під впливом навіть малих доз ПХФ, а за наявності у середовищі (Кл) вірогідно (р < 0,05) послаблюється інгібуюча дія біоциду.

Практичне значення одержаних результатів. Результати є необхідними при з’ясуванні механізмів біологічної дії антимікробних сполук та речовин з протекторними властивостями на структурно-функціональний стан клітин мікроорганізмів-симбіонтів, що заселяють травний тракт тварин, а також на метаболічні процеси цілого організму тварини-господаря, його продуктивність та якість тваринницької продукції. Вони можуть бути експериментальним підґрунтям для розробки більш ефективних способів підвищення продуктивності тварин та одержання високоякісної, екологічно чистої продукції. Їх вже використовують при викладанні спецкурсів на біологічному факультеті Львівського національного університету ім. І. Франка, а також на факультетах біологотехнологічному, харчових технологій і ветмедицини Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій ім. С.З. Ґжицького.

Особистий внесок здобувача. Дисертантка самостійно опрацювала експериментальну частину і провела статистичний аналіз отриманих результатів. Дослідження особливостей метаболізму мікробних популяцій ШКТ на різних біосубстратах за дії ПХФ та впливу Кл, а також у клітинах бактерій та чистих штамів проведені за участю к.б.н. Л.Г. Калачнюк та доктора наук, професора Інституту фізіології і генетики тварин Чеської Академії наук М..Мароунека, що висвітлено у спільних наукових працях. Аналіз і обговорення отриманих даних проведені спільно з науковим керівником професором Г.І. Калачнюком.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації представлялися на XIX Dni Ћivoиiљnej fyziolуgie (Slovensko, Koљice, 2001), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), Jubilejnich XX. DNЩ Ћivoиiљnй fyziolуgie (Иeskб Republika, Tшeљt, 2002), Конференції молодих вчених і спеціалістів “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002), Третьому Західноукраїнському симпозіумі з адсорбції та хроматографії (Львів, 2003), Науково-практичній конференції “Актуальні проблеми токсикології, гігієни та аналітичної хімії пестицидів і агрохімікатів” (Київ, 2003), The First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (Lviv, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики (Львів, 2003 і 2004), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006), щорічних звітних наукових конференціях Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій ім. С.З. Ґжицького (2001-2007).

Публікації. За матеріалами дисертації надруковано 18 наукових праць, з них 9 статей у фахових виданнях, 1 патент, 8 публікацій у матеріалах з’їздів, конференцій і симпозіумів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 4-х розділів (огляд літератури, загальна методика та основні методи досліджень, проведені експериментальні дослідження, аналіз і узагальнення результатів досліджень), висновків та списку використаних джерел, який містить 279 найменувань. Робота охоплює 178 сторінок, містить 34 рисунки і 26 таблиць, які займають 22 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено і проаналізовано сучасні дані про метаболічні реакції симбіотичних мікробних популяцій шлунково-кишкового тракту (ШКТ) тварин за різних умов їх функціонування. Детально охарактеризовано мікробний метаболізм у передшлунках та інших відділах ШКТ жуйних тварин та у сліпій кишці свиней і кролів за дії екзо- й ендогенних факторів, передусім пентахлорофенолу й природних сорбентів.

Матеріали і методи досліджень. Експериментальна частина роботи проведена на мікробних популяціях рубця жуйних тварин, сліпої кишки свиней і кролів та на клітинах чистих штамів бактерій за умов in vivo й in vitro.

У першій серії досліджень вивчали метаболізм рубцевих мікробних популяцій, що були сформовані на біосубстратах і з різною доступністю, щоб з’ясувати вплив на них різних доз ПХФ та протекторної здатності Кл. Для цього у добовий раціон п’яти бичків чорно-рябої породи масою тіла 400?450 кг (І група) вводили підвищену кількість клітковини (5?6 кг злакового бобового сіна і 2?2,5 кг зерноконцентратів), а таким же 5 бичкам-аналогам ІІ групи щодоби згодовували по 2,5?3 кг злаково-бобового сіна і 4?5 кг зерноконцентратів, тобто приблизно у 2 рази зменшували вміст грубих кормів та удвічі збільшували кількість концентрованих. Інші компоненти добових раціонів для тварин обох груп були однаковими (силос кукурудзяний – вволю і кормовий буряк – по 10 кг). Середньодобові прирости коливалися у межах 800 – 1100 г.

Рубцеву рідину, відібрану носостравохідним зондом через 2?3 год після ранкової годівлі, фільтрували крізь нейлонову тканину. Фільтрат змішували з буфером McDougall (1:2), який, окрім необхідних поживних речовин, містив вітаміни й мікроелементи. Виділені мікробні популяції інкубували при 39 °С в атмосфері СО2 протягом 12?24 год. Токсичну дію ПХФ оцінювали в умовах in vitro за таких варіантів інкубації: 1 – контроль (ростове середовище зі змішаною рубцевою популяцією; 2?7 ? дослідні варіанти, при яких в інкубаційне середовище ще додавали, відповідно, по 10, 20, 40, 100, 150 і 300 мкМ ПХФ.

На початку експерименту та переважно через 2, 4, 6, 8, 10 і 12 год інкубації відбирали аліквоти для проведення біохімічних досліджень. В інкубаційному середовищі постійно визначали за допомогою платинових електродів за Жакобом (1970) динаміку рівнів рН і зовнішньоклітинного редокс-потенціалу (Eh), прирости мікробної і білкової біомаси – спектрофотометрично (А600 і А280 відповідно). Для оцінки протекторної здатності Кл у культуральному середовищі, що містило ПХФ, окремо проводили три варіанти досліджень в умовах in vitro: 1 – контрольний (К), у якому було ростове середовище зі змішаною мікробною популяцією рубця (без внесення ПХФ і Кл); 2 – ростове середовище (К) з додаванням ПХФ (40 мкМ); 3 – ростове середовище (К) з додаванням ПХФ (40 мкМ) і Кл (3 г/пробу). В процесі інкубації відбирали аліквоти для біохімічних досліджень. Окрім цього, із змішаних мікробних популяцій шляхом диференційного центрифугування виділяли фракцію бактерій за методикою М.Ш. Кафарова (1976), в якій, після руйнування клітин, вивчали зміни активності таких внутрішньоклітинних ензимів, як лактатдегідрогенази, малатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази, форміатдегідрогенази, малік-ензиму, аконітази і фумарази за різних умов експерименту, використовуючи загальноприйняті методики, описані Г.І..Калачнюком, М. Мароунеком, О.А. Войтюком та ін. (1994; 1997).

У другій та третій серіях досліджень у динаміці вивчали особливості мікробного метаболізму сліпої кишки свиней і кролів за умов використання різних за доступністю субстратів (казеїну, ріпакового шроту, глютену, гліадину, зеїну, муцину, РНК і глюкози) на тлі дії інгібітора (ПХФ) та протектора (Кл). У культуральному середовищі шляхом парової дистиляції в апараті Маркгама з наступним титруванням визначали сумарну концентрацію летких жирних кислот (ЛЖК), за K. Jensen (1973) газовою хроматографією –молярний відсоток ацетату (С2), пропіонату (С3), ізобутирату (іС4), бутирату (С4), ізовалеріату (іС5), валеріату (С5), продукцію метану (СН4) і неслеризацією із спектрофотометрією – рівень нітрогену амоніаку (N·NH3) (Marounek M., Kalachnyuk G.I.; 1995).

У четвертій серії досліджень вивчали внутрішньоклітинні особливості метаболізму в чистих штамів бактерій за дії екзогенних факторів. Основну увагу приділяли вивченню: 1) кінетики росту та швидкості утилізації альдоз із різною молекулярною масою клітинами Butyrivibrio fibrisolvens 787; 2) рівнів утворення клітинної маси і кінцевих продуктів метаболізму та параметрів білкового синтезу на глюкозі й ксилозі; 3) почерговості використання моноцукрів; 4) активності фосфокетолази, 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолази (КДФГА) і фруктозодифосфоальдолази (ФДФА); 5) токсичності ПХФ на моноцукрах і пектині; 6) протекторної здатності Кл за інгібуючої дії ПХФ. Чисті штами бактерій одержували з Інституту фізіології і генетики тварин Чеської Академії наук (Прага). Глюкозу, ксилозу і пектин додавали в окремі інкубаційні середовища після стерилізації у кінцевій концентрації 4 г/л ·10-1. У цій серії досліджень також використовували методи визначення активності ензимів, які описані L. Kovaш et al., 1996; M. Marounek, D. Duљkova, 1999; D. Duљkova, M. Marounek, 2001.

Статистичне опрацювання цифрових даних проводили з використанням критерію Стьюдента .

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Метаболізм мікробних популяцій, сформованих на біосубстратах різної доступності. Формування й ефективність мікробних популяцій передусім залежать від поживності й доступності кормових засобів у дієті. Якщо у сухій речовині раціонів переважає вміст менш доступного біосубстрату – клітковини (за рахунок соломи й сіна), то сформована на ній рубцева мікробна популяція продукує підвищену кількість ацетату й метану при більших витратах тепла. Зростання в раціоні вмісту доступніших біосубстратів – крохмалю (переважно за рахунок зерноконцентратів) призводить до формування мікробної популяції, яка продукує підвищену кількість ЛЖК, у сумі яких вірогідно збільшується молярний відсоток пропіонату при зниженні процесів метаноутворення й тепловитрат. Адже синтез пропіонової кислоти конкурує з утворенням СН4 у процесах використання водню. Такі зміни супроводжуються підвищенням рівня амілолітичної активності, лактатогенезу й аміакоутворення при зниженні целюлозолітичної активності та рН. Молярне співвідношення коротколанцюгових карбонових кислот (С2, С3, С4) змінюється із 59,1:31,2:9,7 на 50,4:40,9:8,7, вказуючи на те що за допомогою субстратної корекції рубцевого мікробного метаболізму можна досягнути значних кількісно-якісних зрушень у процесах формування фонду кінцевих продуктів ферментації, які далі суттєво впливають на інтермедіарний метаболізм тварини-господаря і його продуктувність. Так, на рубцевій ферментації більш доступних біосубстратів у крові відгодівельних бичків приблизно на 30 % зростають концентрації глюкози й амінного нітрогену при вірогідному (р.<.0,05) зниженні (приблизно на 20?40 %) вмісту сечовини, лактату і кетонових тіл. При цьому середньодобові прирости маси тіла тварин збільшуються приблизно на 32 % (1064±46 проти 802±38 г).

Інгібуюча дія різних доз ПХФ на метаболічну здатність мікробних популяцій, сформованих на менш і більш доступних біосубстратах. Перша змішана популяція мікроорганізмів-симбіонтів рубця, що була сформована на менш доступних біосубстратах при поїданні бичками багатих на клітковину кормів із порівняно невеликим вмістом зерноконцентратів, є значно чутливішою від другої до дії навіть знижених концентрацій ПХФ (10, 20 і 40 мкМ; рис. 1).

Середні дози ПХФ (100 і 150 мкМ) тут гальмують ріст мікробів на 80?90.%, а високі (300 мкМ) – повністю зупиняють метаболізм. Це чітко підтверджується вірогідними змінами (р < 0,05) показників динаміки утворення різних кінцевих продуктів ферментації (ЛЖК, N·NH3, лактат, рН, активність ензимів целюлази й амілази, ріст мікробної біомаси тощо). Подібна картина спостерігається і при вивченні токсичної дії ПХФ на другу мікробну популяцію, яка була сформована на доступніших біосубстратах, тобто за умов споживання тваринами у 2 рази більше зерноконцентратів та майже вдвічі менше клітковини (рис. 2).

Однак слід зазначити, що другій мікробній популяції рубця притаманна нижча целюлозолітична і суттєво вища амілолітична активності. Згадані ензими тут менш чутливі до дії метаболізму більш доступних кормових засобів і загалом створюють порівняно потужніший пул необхідних біосубстратів для багатьох різновидів мікробів, що утилізують їх та здатні успішніше протистояти токсичній дії ПХФ. Тому низькі дози останнього (10?40 мкМ), очевидно, менше впливають на весь мікробний комплекс. Середні дози (100 і 150 мкМ) інгібують метаболізм лише на 40-50 % і тільки високі дози (300 мкМ) повністю паралізують функції цієї більш життєздатної мікробної популяції.

За умов формування першої популяції на менш доступних біосубстратах дуже чутливими до дії біоциду виявилися бактерії, які продукують пропіонат. В інкубаційному середовищі вже за концентрації 20 мкМ ПХФ кількість пропіонату вірогідно (р < 0,05) зменшується (на 15 %). А із збільшенням дози (40 мкМ і вище) ступінь вірогідності інгібуючої дії біоциду прямо пропорційно зростає. З аналізу отриманих даних випливає, що мікробна популяція, яка формується на доступніших джерелах поживних речовин, вірогідно (р < 0,05) зменшує рівень продукції пропіонату лише при підвищених дозах ПХФ (>.100.мкМ). Таке явище можна пояснити високою ефективністю взаємозв’язків синтрофних мікробів рубця, які стійкі до токсиканта, продукують лактат (наприклад, Streptococcus bovis) та утилізують його (наприклад, Megasphаera elsdenii). Це підтверджується зростанням утричі рівня продукції лактату, який далі здатний перетворюватися до пропіонату, бутирату, ізобутирату, валеріату, СО2 і Н2 (Bartoљ S., 1987). У разі утримування тварин на зерноконцентратах пропіонат у рубці може синтезуватися з пірувату і лактату акрилатним шляхом (Войтюк О.А., 1995). Використовуючи цей механізм, окремі токсиностійкі бактерії рубця, очевидно, спроможні постійно підтримувати високий фонд пропіонату та інших важливих інтермедіатів як для всієї мікробної популяції рубця, так і для цілого організму тварини-господаря. Разом із тим, порівняно нижчий рівень продукції лактату при ферментації менш доступних поживних речовин (клітковини) і висока чутливість целюлозолітичних бактерій до дії низьких доз ПХФ значно знижують функціональну активність змішаної мікробної популяції. Адже за умов збільшення вмісту клітковини в раціоні з 11 до 21 % молярний відсоток пропіонату в сумі кислот бродіння зменшується вдвічі, а втрати енергії зростають з 17 до 26 %. Вихід енергії АТР за таких умов складає лише 4,8 % енергії зброджених вуглеводів (Танцуров Г.В., 2000).

Зниження токсичної дії біоциду за допомогою Кл. У процесі інкубації рубцевих змішаних мікробних популяцій, сформованих на більш і менш доступних біосубстратах, у змінах динаміки росту мікроорганізмів, сумарної продукції коротколанцюгових карбонових кислот, амонієгенезу і лактатоутворення відмічаються спільні риси (рис. 3). Вони полягають у тому, що у 1 (контрольному) варіанті наведені показники інтенсивності мікробної ферментації перебувають на найвищому рівні (крива – 1). Такі дані відображають нормальний хід метаболічних процесів за звичайних умов інкубації. Вірогідні зміни (р < 0,05) у динаміку мікробного метаболізму вносить введення відносно низької дози (40 мкМ) ПХФ (варіант 2 і крива 2). На стартових годинах інкубації відмінності між вказаними варіантами (криві 1 і 2), залежно від вибору показника, можуть перевищувати багатократний рівень, тоді як на часовому відрізку між 8 і 12 год вони значно зменшуються. Це свідчить про особливу інгібуючу дію ПХФ на життєдіяльність змішаної мікробної популяції, передусім на початкових стадіях lag-фази розвитку й відновлення окремих її різновидів. Згодом менш чутливі до біоциду види мікробів посилюють свій ріст, але досягнути контрольного (крива 1) високого рівня метаболізму в складі змішаної популяції не можуть. Це підтверджується динамікою змін рН та рівнями активності найбільш характерних для рубцевої мікробної екосистеми ензимів, що розщеплюють целюлозу і крохмаль. Целюлозолітична активність (СА) під дією ПХФ знижується в 3 рази, а амілолітична активність ? у 2 рази. Такі зміни узгоджуються з попередніми даними і свідчать про те, що з усіх видів мікроорганізмів особливо чутливими до біоциду є целюлозолітичні мікроби.

Вірогідні зміни (р < 0,05) показників метаболізму змішаної рубцевої мікробної популяції, що перебувають під впливом ПХФ, викликає додавання Кл (крива 3). Сорбуючі, іонообмінні та інші властивості кліноптилоліту, очевидно, здатні зв’язувати не тільки надлишки вже відомих нам токсикантів (N·NH3, важкі метали тощо), але й пентахлорофенол. На це вказують дані про наближення до контрольного варіанта кривої 3, що відображає різні кінетичні зміни рівнів: росту мікрорганізмів-симбіонтів і рН, ЛЖК і N·NH3, лактату та активності ензимів (целюлази й амілази).

Порівнюючи з контрольним варіантом (кривою 1), слід зазначити, що динаміка інтенсивності метаболізму першої рубцевої змішаної мікробної популяції (сформованої на менш доступних біосубстратах) загалом відрізняється від другої (рис. 4) більш видовженою lag-фазою мікроорганізмів- симбіонтів і набагато пізнішим виходом на плато кінетичних кривих усіх досліджуваних показників. Передусім це стосується кривих, що відзеркалюють динаміку змін росту й розвитку мікробної популяції, рівня рН, утворення сумарної кількості ЛЖК, процесів амонієгенезу і лактатоутворення. Тут є вірогідно (р < 0,01) вищою целюлозолітична активність, що вказує на кращу пристосованість цієї мікробної популяції до утилізації клітковини, і саме дана (перша) популяція виявилась більш чутливою до ПХФ, ніж друга, що видно з чітко вираженого зниження (р.<.0,001) метаболічних процесів, які віддзеркалюються кривими змін рівнів росту мікробів, рН, ЛЖК і N·NH3, лактату та активності ензимів (целюлази й амілази). Це узгоджується з висновком про те, що більш розвинуті у даній популяції целюлозолітичні мікроби найбільш чутливі до дії токсиканта. Додавання кліноптилоліту в таке ж культуральне середовище посилює відновлення метаболічних процесів і навіть наближає їх до контрольного варіанта. Однак швидкість і рівень зняття депресуючої дії токсиканта все-таки чіткіше відмічаються при використанні другої мікробної популяції (сформованої на більш доступних біосубстратах), де, безперечно, домінують ті види мікроорганізмів, які є менш вразливими біоцидом.

Зміни активності інтрацелюлярних ензимів бактеріального комплексу рубця за дії біоциду та сорбенту. Активність всіх досліджуваних внутрішньоклітинних ензимів рубцевого бактеріального комплексу під дією ПХФ (40 мкМ) вірогідно (р.<.0,01) знижується. Причому активність малатдегідрогенази й ізоцитратдегідрогенази зменшується на 20?30 %, форміатдегідрогенази, малік-ензиму, аконітази й фумарази ? загалом у 2 рази, а лактатдегідрогенази – приблизно у 3 рази. Отже, такий сильний токсикант, як ПХФ, у дозі 40 мкМ гальмує всі реакції, які каталізуються вище переліченими ензимами, але не однаковою мірою. Це пояснюється тим, що бактеріальний комплекс рубця містить значну кількість різновидів бактерій, що по-різному реагуюють на біоцид, який інгібує не тільки екзоцелюлярні, але й внутрішньоклітинні ензиматичні реакції. Звідси випливає потреба у вивченні токсичної дії ПХФ на окремі чисті штами бактерій, які містяться в рубцевій екосистемі, зокрема на їх ензиматичні властивості.

При цьому важливо те, що додавання Кл вірогідно знижує (на 19?47 %, р.<.0,05) інгібуючу дію ПХФ на активність всіх досліджуваних ензимів рубцевого бактеріального комплексу. Однак повного повернення до початкового контрольного варіанта не спостерігається навіть у стійкіших бактерій, які сформувалися на більш доступних біосубстратах.

Особливості мікробного метаболізму в сліпій кишці свиней та кролів за дії екзогенних факторів. У товстій кишці ростучих свиней мікробна ферментація переважно складає приблизно 15 % від загального перетравлення органічної речовини, тоді як у свиноматок цей рівень може досягати навіть 50 % (Drochner W., 1993). Тут метаболізуються полісахариди і нітрогеновмісні сполуки, що надходять із тонкої кишки. В їх складі переважають незруйновані харчові протеїни, в тому числі рослинні білки низької розчинності (проламіни й глютеліни), протеїни ендогенного походження (ензими, секрети муцину й продукти деградації апоптозних клітин епітеліального й бактеріального походження тощо). Додатковими джерелами нітрогену є протеїни й нуклеїнові кислоти, що вивільняються з лізованих бактеріальних клітин. Загалом знання про процеси мікробного метаболізму в ШКТ, передусім у сліпій кишці свиней, кролів та інших тварин, за дії екзо- й ендогенних чинників залишаються недостатніми й суперечливими. Нами встановлено, що з багатьох досліджуваних джерел нітрогену й карбону в сліпій кишці свиней найменше метаболізується зеїн кукурудзяного зерна. Основним продуктом ферментації цих джерел є ацетат. Молярні відсотки розгалужених ЛЖК є нижчими у культурах, що містять субстрати муцин і РНК. Продукція лактату й метану також є нижчою при ферментації зеїну. Внесення у культуральне середовище ПХФ (40 мкМ) вірогідно знижує мікробний метаболізм при використанні всіх досліджуваних субстратів. Передусім про це свідчать характерні зміни рівнів продукції сумарної кількості ЛЖК та СН4. Додавання в інкубаційне середовище Кл вірогідно знижує (р.</0,05) інгібуючу дію біоциду. Очевидно, сорбент, зв’язуючи певну частину ПХФ та маючи багато інших властивостей сприяє частковому відновленню метаболічних процесів.

Поряд із цим, відмічаються певні його корективи у загальний процес становлення змішаної мікробної популяції. Найшвидше починають домінувати оцтовокислі та пропіоновокислі різновиди мікробів. Пропіонатпродукуючі мікроорганізми найкраще проявляють свою активність на таких субстратах, як глюкоза, РНК й муцин, а найгірше – на зеїні.

Роль мікробної популяції сліпої кишки у кролів вважається суттєво більшою, ніж у свиней, адже їх відносять до травоїдів. У наших експериментах виявлено, що на досліджуваних субстратах сумарна продукція ЛЖК є найбільшою при ферментації муцину, казеїну й глюкози, а найменшою – на зеїні. Гліадин та глютен займають проміжне місце. Тому за цим показником та продукцією N·NH3 і СН4 ми судили про доступність і поживну цінність досліджуваних біосубстратів для мікробів і тварини-господаря. А за спектром утворення індивідуальних коротколанцюгових карбонових кислот (С2?С5) можна отримати уявлення про життєдіяльність окремих різновидів мікробної популяції. Було виявлено, що ацетатпродукуючі мікроби є найбільш активними при ферментації усіх досліджуваних біосубстратів, але найактивніші вони за умов метаболізації РНК і муцину. Пропіонатпродукуючі мікроорганізми порівняно краще розвиваються на глюкозі, казеїні, муцині й глютені, а найгірше – на зеїні. За присутності останнього та глюкози порівняно краще функціонують бутиратутворюючі мікроби. Розгалужені жирні кислоти не утворюються у поживному середовищі з РНК.

Під впливом низьких доз ПХФ вірогідно (р <.0,01) зменшується сумарна продукція ЛЖК при зброджуванні усіх досліджуваних біосубстратів, але інгібування метаболізму стає значнішим при використанні менш доступних джерел вуглецю, нітрогену й енергії (зеїну, гліадину й глютену). При внесенні в інкубаційне середовище кліноптилолітового борошна гальмівна дія біоциду послаблюється, передусім на легкодоступних субстратах (муцині, глюкозі, казеїні й ріпаковому шроті). На різних біосубстратах по-різному відновлюють свою життєдіяльність ацетат-, пропіонат- і бутиратпродукуючі мікроорганізми. У середовищі з Кл концентрація N·NH3 на глюкозі навіть знижується у 2 рази. Таке явище пояснюється сорбційною та іонообмінною здатністю природного туфу щодо амоніаку і ПХФ. Тут слід вбачати подвійну позитивну роль Кл за присутності біоциду, адже при цьому біохімічні перетворення супроводжуються вірогідним (р </0,05) зростанням суми ЛЖК.

Метаболічні особливості клітин чистих штамів бактерій за дії екзогенних факторів. Основними мономерними одиницями вуглеводних компонентів рослинного світу є альдози – глюкоза (С5Н12О6; М.м.=180,16) і ксилоза (С5Н10О5; М.м.=150,14), а серед мікробів однією з найпоширеніших у ШКТ ссавців є цукролітична бактерія Butyrivibrio fibrisolvens. Кінетика утилізації глюкози і ксилози за умов дії ПХФ окремо та у присутності Кл у культуральному середовищі показана на рисунку 5.

Наведені та інші дані свідчать про те, що під впливом низької дози токсиканта гальмується ріст клітин і тільки на 5-7ій годинах ініціюється інтенсифікація їх накопичення. Але додавання Кл у середовище з ПХФ прискорює вказаний процес майже у 2 рази. Подібне спостерігається і при утилізації ксилози, однак це відбувається вірогідно повільніше (у 2,5 раза). Тут і дія ПХФ була сильнішою і протекторний вплив сорбенту – менш ефективним.

Дослідження стехіометрії метаболізму глюкози й ксилози клітинами B. fibrisolvens показали спільні ознаки та певні відмінності в кінцевому ефекті їх ферментації. На обох моноцукрах клітини цього штаму не проявляли фосфокетолазної активності, тоді як у нього та у контрольного штаму Lactobacillus plantarum 185 активність специфічної внутрішньоклітинної лактатдегідрогенази була відносно високою, а продукція кінцевих метаболітів задовільною. В окремих дослідженнях нами було встановлено, що у клітинах B. fibrisolvens 787 ще функціонують і такі специфічні ключові ензими, як 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза (КДФГА), завдяки якому мікроорганізми ефективно використовують метаболічний шлях Ентнера-Дудорова, та фруктозодифосфатальдолаза (ФДФА), за допомогою якої клітина здатна включати і напрям перетворень шляхом Ембдена-Мейєргофа-Парнаса.

Внесення в культуральне середовище навіть малих доз ПХФ вірогідно гальмує (р < 0,01) активність вищезгаданих ензимів та загальний метаболізм у клітинах B. fibrisolvens на досліджуваних субстратах. Однак, порівняно з глюкозою, на ксилозі та пектині таке гальмування є вірогідно (р.<.0,01) більшим. Відновлення активності досліджуваних ензимів та загального метаболізму в клітинах під впливом добавок сорбенту Кл відбувається значно ефективніше на глюкозі, ніж на ксилозі й пектині.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та отримано нові дані стосовно внутрішньоклітинного метаболізму мікробних популяцій шлунково-кишкового тракту тварин, а також показано особливості інгібуючої дії пентахлорофенолу та можливості підвищення ефективності використання протекторних властивостей природних сорбентів – кліноптилолітів з метою нормалізації ензиматичних реакцій на рівні внутрішньоклітинного метаболізму й утворення кінцевих продуктів катаболізму як у змішаних асоціаціях мікрорганізмів-симбіонтів, так і в окремих комплексах їх різновидів та чистих штамах бактерій.

1. Різні дози антимікробної сполуки ПХФ проявляють неоднакову інгібуючу дію на внутрішньоклітинний метаболізм змішаних рубцевих мікробних популяцій, сформованих на різних за поживною доступністю біосубстратах. Навіть низькі дози токсиканта (10?40 мкМ) інгібують на 80?90.% внутрішньоклітинний метаболізм мікробних популяцій, сформованих на менш доступних джерелах поживних речовин, а середні (100?150 мкМ) й високі (300 мкМ) – зовсім зупиняють функціонування клітин. У мікробних популяціях, сформованих на більш доступних біосубстратах, вказані низькі дози ПХФ інгібують метаболізм на 5?15 %, середні – на 40?50 % і тільки високі паралізують його зовсім.

2. Внесення природних сорбентів у культуральне середовище за умов дії низьких доз ПХФ (до 40 мкМ) вірогідно (р < 0,05) знижує інгібуючий вплив цієї токсичної сполуки на мікробний метаболізм порівнюваних популяцій, але кліноптилоліти проявляють у 2 рази вищий протекторний ефект там, де асоціації мікроорганізмів-симбіонтів були сформовані на більш доступних біосубстратах.

3. Активність інтрацелюлярних ензимів бактеріального комплексу вірогідно знижується навіть за дії ПХФ у малих дозах, а застосування природних сорбентів підвищує ензиматичну здатність його клітин на 19?47 %.

4. Мікробний метаболізм у сліпій кишці свиней і кролів значною мірою залежить від складу та природи біосубстратів, які надходять з тонкої кишки. Під дією низьких доз ПХФ метаболічні процеси вірогідно (р < 0,01) знижуються, а застосування кліноптилолітів значно послаблює інгібуючу дію антимікробної сполуки, особливо у культурах із більш доступними джерелами поживних речовин (глюкоза, РНК, муцин тощо).

5. Клітини цукролітичної бактерії Butyrivibrio fibrisolvens 787 метаболізують альдози різної молекулярної маси з неоднаковою швидкістю. Глюкоза використовується у 2,5 раза швидше, ніж ксилоза. Із ксилози утворюється менше клітинної маси, але більше кінцевих продуктів метаболізму (форміату, бутирату, ацетату, лактату), вищий білковий синтез, тоді як на глюкозі – більший вихід сухої клітинної маси за рахунок вуглеводів.

6. За наявності у ростовому середовищі обох альдоз клітинами B. fibrisolvens 787 спочатку використовується глюкоза, а потім ксилоза. На обох мономерах у клітинах цього штаму не проявляється активність фосфокетолази, тоді як у них та у клітинах контрольної бактерії Lactobacillus plantarum 185 активність ЛДГ є досить високою.

7. У клітинах чистих штамів окремих бактерій за умов утилізації глюкози антимікробна сполука у низьких дозах проявляє у декілька разів нижчий інгібуючий ефект, ніж при використанні ксилози. За умов застосування ксилози навіть низькі дози біоциду в декілька разів сильніше (ніж на глюкозі) інгібують внутрішньоклітинні метаболічні процеси.

8. Встановлено, що високий рівень метаболізму в клітинах B. fibrisolvens забезпечується функціонуванням специфічних ензимних реакцій, які каталізуються 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазою (КДФГА, завдяки чому використовується метаболічний шлях Ентнера-Дудорова) та фруктозодифосфатальдолазою (ФДФА, за допомогою якої вуглеводи утилізуються і шляхом Ембдена-Мейєргофа-Парнаса). Виявлені метаболічні шляхи гальмуються під впливом навіть низьких доз ПХФ, а за наявності у культуральному середовищі сорбенту Кл вірогідно (р.<.0,05) послаблюється інгібуюча дія біоциду. Протекція інтрацелюлярного метаболізму, окремих ключових ензимних реакцій та обсяги утворення кінцевих продуктів ферментації перебувають на вірогідно вищому рівні при використанні глюкози, ніж ксилози чи пектину.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Метаболізм рубцевих мікробних популяцій, сформованих на біосубстратах із різною доступністю за дії пентахлорфенолу / Л.Г. Калачнюк, О.Є. Возна, Н.І. Лацік, О.Г. Савка, М. Мароунек, // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 3. – С. 31?41. (Дисертанту належить визначення окремих кінцевих продуктів мікробного метаболізму різних біосубстратів за дії ПХФ)

2. Інгібування ензимів вуглеводного обміну пентахлорфенолом у клітинах пектинолітичних бактерій травного тракту тварин та вплив на цей процес адсорбенту кліноптилоліту / Л.Г. Калачнюк, Н.І. Руснак, Г.І. Калачнюк, М. Мароунек, О.Г. Савка, Д.О. Мельничук // Укр. біохім. журн. ? 2006.? Т. 78, № 5. – С. 144?154. (Дисертант брала участь у визначенні специфічної активності ключових ензимів у клітинах B. fibrisolvens 787 за дії інгібітора й протектора)

3. Руснак Н.І. Активність внутрішньоклітинних ензимів бактеріального комплексу рубця за дії пентахлорфенолу та кліноптилоліту // Наук. вісник ЛНАВМ ім. С.З. Ґжицького. ? Львів, 2003. – Т. 5, № 3, Ч. 2. – С. 86?93.

4. Руснак Н.І., Калачнюк Л.Г. Кінцеві продукти метаболізму різних біосубстратів мікробною популяцією сліпої кишки свиней під впливом біоциду та сорбенту // Наук. вісник ЛДАВМ ім. С.З. Ґжицького. – Львів, 2003. – Т. 5, № 2, Ч. 1. – С.