МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

КРИМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. С.І. ГЕОРГІЄВСЬКОГО

ШИШКІН МАКСИМ АНДРІЙОВИЧ

УДК 616.36-002.1 – 091.8-076

ПАТОГІСТОЛОГІЧНІ І ІМУНОГІСТОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ПРОГРЕСІЇ ХРОНІЧНИХ ВІРУСНИХ ГЕПАТИТІВ В ТА С ЗА ДАНИМИ ТРЕПАНОБІОПСІЙ ПЕЧІНКИ

14.03.02 – патологічна анатомія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Сімферополь – 2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Запорізькому державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Туманський Валерій Олексійович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри патологічної анатомії і судової медицини з основами права.

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Загорулько Олександр Кімович, Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, завідувач кафедри патологічної анатомії;

- доктор медичних наук, професор Сорокіна Ірина Вікторівна, Харківський національний медичний університет МОЗ України, професор кафедри патологічної анатомії.

Захист дисертації відбудеться 14.05.2008 р. о 15годині, на засіданні вченої ради Д 52.600.02 при Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського (95006, м. Сімферополь, б. Леніна, 5/7).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського (95006, м. Сімферополь, б. Леніна, 5/7).

Автореферат розісланий 12.03. 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Г. О. Мороз

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Хронічні вірусні гепатити В (ХВГВ) і C (ХВГС) відрізняються малосимптомним перебігом, пізньою діагностикою і терапією, а також безсимптомним розвитком цирозу і раку печінки з нерідкими летальними наслідками (Д.Т. Абдурахманов, 2002; О.Л. Арямкина з співавт., 2004). Орієнтовно у 25% осіб працездатного віку, інфікованих вірусом гепатиту С, визначається мінімальна клінічна симптоматика гепатиту, нормальний рівень трансаміназ в крові та відсутність гіпербілірубінемії (О.О. Знойко, Н.Д. Ющук, Е.А. Климова, 2003; К.В. Жданов з співавт., 2006). В той же час, за даними гістологічних досліджень печінки, у 10-30 % хворих ХВГС з нормальним рівнем амінотрансфераз визначаються ознаки помірного запалення і вираженого фіброзу печінки, а малосимптомний розвиток ХВГС більш ніж у 80% пацієнтів завершується цирозом печінки (И.Г. Никитин, С.Л. Кузнецов, 1998; L.G. Guidotti, F.V. Chisari, 2006).

«Золотим» стандартом діагностики хронічного вірусного гепатиту (ХВГ), разом з ідентифікацією вірусу в крові полімеразною ланцюговою реакцією, є пункційна біопсія печінки, при патоморфологічному дослідженні якої визначається морфологічна активність гепатиту і розвиток фіброзу печінки шляхом розрахунку індексу гістологічної активності (ІГА) гепатиту за Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. (1981), стадії патологічного процесу за Desmet V., з співавт. (1995) і стадії фіброзу печінки за класифікацією METAVIR (G. Caughan, A. Zekry, 2002). Ці визнані гепатологами класифікаційні системи мають безперечні переваги і водночас - обмежену прогностичну цінність в ранньому визначенні прогресії хронічного вірусного гепатиту, на призупинення якої направлені сучасні методи медикаментозного лікування хворих.

На основі сучасних молекулярних досліджень і клінічного досвіду визначені три можливі модальності прогресії ХВГ: вірус-індуковане руйнування гепатоцитів і запалення в печінці, деструкція печінки активованими імунними клітинами та розвиток фіброзу і цирозу печінки. Серед мікроскопічних критеріїв прогресії ХВГВ і ХВГС до теперішнього часу найменш вивченим є морфогенез імунного кілінгу гепатоцитів і деструкції печінки імуноцитами портальних трактів, роль в цьому процесі активованих зірчастих клітин Купфера, а також наслідки імунноклітинної деструкції для прогресії хвороби. Недостатньо досліджений також морфогенез фіброзу і цирозу печінки у хворих на ХВГ. Розвиток цирозу печінки традиційно пов'язували з активацією синтезу колагену фібробластами; останніми роками з'явилися повідомлення про важливу роль в розвитку фіброзу і цирозу у хворих на ХВГ активованих перисинусоїдальних зірчастих клітин Іто, які в нормі накопичують ретиноїди і синтезують обмежений спектр молекул міжклітинного матриксу (G.B. Gabrielli, M. Casaril, A.M. Stanzial, 2003; J.S. Campbell, Riehle, 2006). При розвитку фіброзу печінки недостатньо вивчені взаємовідносини між активованими зірчастими клітинами Купфера, активованими клітинами Іто і фібробластами, не конкретизовані структурні прояви активації клітин Іто і їх колагенсинтезуючих функцій при прогресії фіброзу печінки.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом науково-дослідної роботи Запорізького державного медичного університету: «Нові технології ранньої діагностики онкологічних, нейро-ендокринних, серцево-судинних, цереброваскулярних, аутоімунних і інфекційних захворювань», 2006-2010 р.р. (№ державної реєстрації 0106U003709).

Мета і завдання дослідження:

Удосконалити і доповнити морфогенетичні критерії прогресії хронічного вірусного гепатиту В і С на підставі імуногістохімічних, патогістологічних і комп'ютерно-морфометричних досліджень трепанобіопсій печінки хворих і аналізу їх клініко-біохімічних даних для використання в патологоанатомічній діагностиці і прогнозуванні перебігу хвороби.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані наступні завдання:

1. У трепанобіоптатах печінки хворих на ХВГВ і ХВГС різного ступеня гістологічної активності визначити патогістологічні і імуногістохімічні маркери вірус-індукованих пошкоджень печінки.

2. У трепанобіоптатах печінки хворих на ХВГВ і ХВГС різного ступеня гістологічної активності типувати склад імуноцитів у вогнищах імуноклітинного кілінгу гепатоцитів, в портальних імуноклітинних інфільтратах і в «ступінчастих некрозах», та визначити патогістологічні і імуногістохімічні особливості імуноклітинних пошкоджень печінки.

3. На підставі даних патогістологічних, комп'ютерно-морфо-метричних і імуногістохімічних досліджень вивчити взаємозв'язок між активацією фібробластів в портальних трактах, перисинусоїдальних клітин Іто і макрофагів Купфера із ступенем розвитку фіброзу печінки у хворих на ХВГС.

4. Визначити патогістологічні і імуногістохімічні показники прогресії фіброзу печінки і вивчити кореляційні взаємозв'язки між вираженістю фіброзу печінки і клініко-біохімічними проявами ХВГВ і ХВГС.

5. Співвіднести результати патоморфологічного дослідження біоптатів печінки з клініко-біохімічними даними хворих ХВГВ і ХВГС різного ступеня гістологічної активності.

6. Впровадити для використання в патологоанатомічній діагностиці найбільш значущі мікроскопічні показники прогресії ХВГВ і ХВГС.

Об'єкт дослідження: морфогенез хронічного вірусного гепатиту В і С.

Предмет дослідження: патоморфологічні особливості прогресії хронічних вірусних гепатитів В і С за даними трепанобіопсій печінки.

Методи дослідження: гістологічні, імуногістохімічні і комп'ютерно-морфометричні дослідження трепанобіоптатів печінки для визначення молекулярно-клітинних критеріїв прогресії ХВГВ і ХВГС, порівняльний аналіз морфологічних і клініко-біохімічних даних хворих на ХВГВ і ХВГС різного ступеня активності; варіаційний статистичний і кореляційний аналіз отриманих результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. На підставі комплексного патогістологічного, гістохімічного, імуногістохімічного і комп'ютерно-морфометричного дослідження трепанобіоптатів печінки хворих і аналізу їх клініко-біохімічних показників вперше одержані нові дані про мікроскопічні критерії прогресії хронічного вірусного гепатиту В і С. В печінці хворих на ХВГВ і ХВГС вперше типовано склад імуноцитів у вогнищах імуноклітинного кілінгу гепатоцитів, в зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів», а також в портальних імуноклітинних інфільтратах.

Вперше визначено, що так звана «запальна лімфоцитарна інфільтрація часточок печінки» у вигляді скупчень імунокомпетентних клітин навколо гепатоцитів, є вогнищами імунного кілінгу інфікованих вірусом гепатоцитів з наявністю CD8+ Т-лімфоцитів і CD68+ макрофагів, а так звані «ступінчасті некрози» є зонами імуноклітинної деструкції гепатоцитів периферії печінкових часточок, в яких швидко активується колагеноутворення активованими клітинами Іто і фібробластами. Встановлено, що найбільш значущими мікроскопічними додатковими ознаками прогресії ХВГ є: значна кількість внутрішньочасточкових вогнищ імуноклітинного кілінгу гепатоцитів, збільшення кількості CD8+ Т-лімфоцитів і CD68+ макрофагів у вогнищах імуноклітинного кілінгу і в крайових зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів», збільшення в часточках печінки числа CD68+ клітин Купфера з ознаками фагоцитоза, прогресуюча колагенізація внутрішньочасточкових синусоїдів, розширення площі лімфоцитарної інфільтрації і фіброзу портальних трактів.

На підставі імуногістохімічних досліджень встановлено, що надмірну продукцію колагену в печінці хворих на ХВГС здійснюють активовані A-SMA (антиген до гладком’язового актину) позитивні зірчасті перисинусоїдальні клітини Іто і A-SMA позитивні фібробласти портальних трактів. Вперше доведено, що поява нових поколінь клітин Іто фіброгенного типу пов'язана з лімфоцитарною інфільтрацією портальних трактів, із збільшенням числа і площі імуноклітинних «ступінчастих некрозів», а також з наростанням фагоцитарної активності клітин Купфера.

Вперше встановлено, що експресія A-SMA клітинами Іто і фібробластами є раннім прогностичним маркером вірогідності розвитку фіброзу печінки у хворих на ХВГС з нормальним рівнем трансаміназ в крові або з помірною гіперферментемією, тоді як розвитку важкого фіброзу печінки передує значне зростання числа активованих клітин Іто в перисинусоїдальних просторах печінки.

За результатами гістохімічних і гістологічних досліджень визначені основні складові важкого фіброзу печінки у хворих хронічним вірусним гепатитом С: збільшення числа перисинусоїдальних клітин Іто, поширена колагенізація стінок внутрішньочасточкових синусоїдів і розширення їх отворів, виражений фіброз в зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів» і в портальних трактах.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі зіставлення вивчених патогістологічних і імуногістохімічних змін в печінці з клініко-біохімічними показниками доведено, що хворим на ХВГВ і ХВГС, навіть при мінімальних симптомах хвороби і при мінімальних відхиленнях лабораторних показників гепато-біліарних функцій, показана пункційна трепанобіопсія печінки, результати якої найадекватніше відображують ступінь виразності вірус-індукованих і імуноклітинних уражень печінки, ступінь активації колагеноутворення і прогресії фіброзу печінки. Встановлено, що найточніше ступінь вірусного інфікування гепатоцитів вірусом гепатиту В визначається при імуногістохімічному виявленні HBsAg і HBсAg.

Показано, що найбільш достовірні діагностичні і прогностичні результати патоморфологічного дослідження трепанобіоптатів печінки хворих на ХВГ забезпечує паралельне забарвлення серійних зрізів гематоксиліном і еозином, трибарвним методом Масона і методом ван-Гизон; при уточненні ступеня активності хронічного гепатиту істотні додаткові дані дає імуногістохімічне виявлення HBsAg в гепатоцитах, CD8+ Т-лімфоцитів і CD68+ клітин Купфера, для прогнозування вірогідності розвитку важкого фіброзу печінки, окрім методик Масона і ван-Гизон, необхідно використовувати імуногістохімічне виявлення А-SMA позитивних клітин Іто і фібробластів, а також колагену 4 типу.

При прогнозуванні вірогідності розвитку значного фіброзу печінки у хворих на ХВГВ і ХВГС слід враховувати зростання числа активованих А-SMA позитивних клітин Іто в перисинусоїдальних просторах печінки, а також сегментарну колагенізацію стінок внутрішньочасточкових венозних синусоїдів, наявність А-SMA позитивних фібробластів в імуноклітинних «ступінчастих некрозах» і в портальних трактах, проникнення тонких фіброзних септ з портальних трактів в часточки печінки, зростання числа портальних трактів з фіброзом різного ступеня. Разом з науковим керівником проф. Туманським В.О. розроблений і запатентований спосіб прогнозування розвитку фіброзу печінки у хворих на ХВГС в трепанобіопсіях печінки.

Результати проведених досліджень впроваджені в роботу КУ «Дніпропетровське обласне патологоанатомічне бюро», КУ «Запорізьке обласне патологоанатомічне бюро» і КУ «Одеське обласне патологоанатомічне бюро», в патологоанатомічне відділення Донецького обласного клінічного територіального медичного об’єднання, в відділ патоморфології центральної наочно-дослідної лабораторії Донецького національного медичного університету ім. М. Горького.

Нові теоретичні і практичні положення дисертаційної роботи використовуються в навчальному процесі на кафедрі патологічної анатомії і судової медицини з основами права Запорізького державного медичного університету (ЗДМУ), на кафедрі патологічної анатомії Харківського національного медичного університету, на кафедрі патологічної анатомії, патологічної фізіології, внутрішніх хвороб №1, внутрішніх хвороб №2, інфекційних хвороб Донецького національного медичного університету ім. М. Горького.

Особистий внесок дисертанта. Ідея, мета і завданяя дисертаційного дослідження розроблені науковим керівником д.мед.н., проф. Туманським В.О. Дисертаційна робота є самостійно виконаним дослідженням автора. Дисертант особисто виконав патентно-інформаційний пошук і аналіз літератури з даної проблеми, самостійно виконав патогістологічні, гістохімічні, імуногістохімічні і комп'ютерно-морфометричні дослідження біоптатів печінки хворих на ХВГВ і ХВГС, провів статистичний аналіз одержаних даних, інтерпретував і систематизував отримані результати. Для імуногістохімічних досліджень використано 13,8% трепанобіоптатів печінки з архіву кафедри. Дисертант самостійно написав всі розділи дисертації, сформулював висновки і рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені і обговорені на науково-практичній конференції морфологів «Роль імунної, ендокринної і нервової систем в процесах морфогенезу і регенерації» (Запоріжжя, 2003), на Всеукраїнських наукових конференціях молодих вчених «Сучасні аспекти медицини і фармації» (Запоріжжя, 2004; 2005; 2006; 2007), на міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених (Донецьк, 2007), на науково-практичній конференції з міжнародною участю «Захворювання печінки в практиці клініциста» (Харків, 2007), на Всеукраїнській науково-практичній конференції «Патологоанатомічна діагностика хвороб людини: здобутки, проблеми, перспективи» (Чернівці, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць: з них 4 статі - у виданнях, рекомендованих ВАК України (з них 1 стаття – без співавторів), а також 2 статті і 4 тез в матеріалах Всеукраїнських науково-практичних конференцій. Одержаний 1 деклараційний патент України.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена державною мовою на 160 сторінках. Складається з введення, огляду літератури, розділу матеріалу і методів дослідження, 3-х розділів власних досліджень, аналізу і обговорення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій і списку використаних джерел (59 вітчизняних і 182 зарубіжних авторів). Робота ілюстрована 59 рисунками і 14 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи досліджень. Визначення діагностично-патоморфологічних маркерів вірусного і імуноклітинного пошкодження печінки, а також морфогенезу важкого фіброзу печінки проведено в трепанобіопсіях печінки у 180 хворих на ХВГВ і ХВГС, які склали 2 групи спостережень: 1-а група - 40 хворих ХВГВ (11 жінок і 29 чоловіків), 2 група - 140 хворих ХВГС (41жінка і 99 чоловіків); групу умовного контролю склали 10 осіб (4 жінки і 6 чоловіків), хворих на транзиторні гепатози без клініко-біохімічних і патогістологічних ознак вірусного ураження печінки.

Вік обстежених хворих 1-ї групи спостережень коливався від 16 до 65 років, вік обстежених хворих 2-ї групи спостережень коливався від 19 до 68 років, вік групи умовного контролю коливався від 23 до 45 років. Середній вік хворих ХВГВ склав 37 років, середній вік хворих ХВГС - 39 років. Слід зазначити, що серед обстежених хворих на ХВГС і ХВГВ частіше зустрічалися пацієнти чоловічої статі, які склали 70,71 % і 72,5% відповідно.

У групи спостереження відібрані тільки пацієнти, яким для верифікації діагнозу у відповідності до сучасного протоколу було проведене комплексне клінічне, лабораторне та патоморфологічне дослідження трепанобіоптатів печінки.

Клінічне і лабораторне обстеження хворих проводилося в гепатологічному центрі Запорізької обласної інфекційної клінічної лікарні. Етіологія вірусного гепатиту і фаза інфекційного процесу визначалися за допомогою імуноферментного методу і методу ампліфікації з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Вираженість синдрому цитолізу визначалась на підставі рівня в крові активності аланін – і аспартат-амінотрансферази (АлАТ, АсАТ).

В 1-му хірургічному відділенні 3-ої клінічної лікарні Запоріжжя лікарем хірургом виконувалась черезшкірна трепанобіопсія печінки голками Uni-Cut і BioCut 14-16G під контролем апарату УЗД Conbizon-320-5 Ultima-Pro-30 з використанням секторального і конвексного датчиків з ультразвуковою частотою випромінювання першого датчика 3-4 Мгц, і 3,5Мгц – другого датчика. В результаті пункції одержували стовпчик тканини печінки, завдовжки не менше 1,5 см, що відповідало стандарту для подальшого повного і інформативного морфологічного дослідження трепанобіоптата.

Для патоморфологічного і імуногістохімічного дослідження стовпчики трепанобіоптатів печінки фіксували в забуференному 10% формаліні і заливали в парафін. На прецезіонному ротаційному мікротомі НМ 3600 (фірми «MICROM Laborgerate GmbH» - Німеччина) виготовляли серійні зрізи завтовшки 3 м, які поміщали на предметні скельця для стандартного патогістологічного фарбування або на адгезивні предметні скельця «SUPER FROST PLUS» і «SUPER FROST GOLD» (фірми «DAKO» - Данія) - для імуногістохімічних досліджень.

Для мікроскопічного дослідження парафінові зрізи трепанобіоптатів печінки фарбували гематоксиліном і еозином (для виявлення основних патогістологічних змін), а також трибарвним методом Масона і методом ван-Гизон (для оцінки вираженості фіброзу печінки).

Ступінь активності і прогресії хронічного вірусного гепатиту в біоптатах печінки хворих оцінювали шляхом розрахунку ІГА за Knodell R.G. з співавт. (1981); виразність фіброзу печінки визначали в градації METAVIR і Desmet V. з співавт. (1995) в серійних парафінових зрізах, забарвлених за ван-Гизон і за Масон. Відповідно до вказаних вище градацій в біоптатах печінки розрізняли гепатит з мінімальною активністю (ІГА 1-3 бали), із слабкою активністю (ІГА 4-8 балів), з помірною активністю (ІГА 9-12 балів) і з вираженою активністю (ІГА 13-18 балів), а також різний ступінь фіброзу печінки [F0 - відсутність фіброзу, F1 – слабкий фіброз портальних трактів, F2 - портальний фіброз з рідкісними септами в часточках (помірний фіброз), F3 - множинні септи в часточках без цирозу (важкий фіброз), F4 – цироз печінки]. Для визначення ступеня виразності фіброзу аналізувалася ступінь розвитку і гістотопографія сполучнотканинних волокон в печінці: наявність цих волокон в портальних трактах, наявність і ступінь виразності фіброзу стінок центролобулярних вен, наявність внутрішньочасточкових фіброзних септ і порто-портальних фіброзних септ.

Наявність інфікування гепатоцитів вірусом гепатиту В визначали в парафінових зрізах непрямим імунопероксидазним методом з використанням антитіл до HBsAg і HBсAg і систем візуалізації DAKO EnVision. Для визначення кількості гепатоцитів, інфікованих вірусом гепатиту В, підраховували число HBsAg позитивних гепатоцитів в умовному стандартному полі зору мікроскопа при збільшенні 400.

Імуногістохімічне дослідження активованих зірчастих клітин Іто проводилося в парафінових зрізах з використанням моноклональних антитіл до А-ізоформи гладком'язового актина (А-SMA) і системи візуалізації DAKO EnVision.

Імуногістохімічне дослідження клітин Купфера проводилося в парафінових зрізах з використанням моноклональних антитіл до CD-68-антигену і системи візуалізації DAKO EnVision.

Активовані CD45R0+ Т-лімфоцити і CD8+ Т-кілери маркували в парафінових зрізах з використанням антитіл до CD45R0 і CD8 антигенам, а також системи візуалізації DAKO EnVision.

Імуногістохімічне дослідження колагену проводилося імунопероксидазним методом за допомогою моноклональних антитіл до колагену 4-го типу, а також системи візуалізації DAKO EnVision.

Методом прямої комп'ютерної морфометрії в мікроскопі Axioplan 2 («Carl Zeiss» - Німеччина) з відеокамерою DXC-151A («Sony» - Японія) і пакетом програм KS 200 («Kontron Elektronik» - Німеччина) оцінювали площі лімфоцитарної інфільтрації і фіброзу портальних трактів в 4 групах хворих ХВГВ і хворих ХВГС (з мінімальним, слабковираженим, помірним та вираженим ступенем гістологічної активності гепатиту), а також в 3 групах хворих з ознаками слабкого, помірного і важкого фіброзу печінки (F1, F2, F3 відповідно). Для морфометричних вимірювань використовувалося не менше 5 портальних трактів в 1-му біоптаті печінки.

Площі, займані в часточках печінки активованими зірчастими клітинами і клітинами Купфера, визначали методом комп'ютерного аналізу цифрового зображення в мікроскопі Axioskop («Carl Zeiss» - Німеччина) з використанням системи VIDAS («Kontron Elektronik» - Німеччина) в Центральній науково-дослідній лабораторії ЗДМУ (за що – щира вдячність д.мед.н., проф. Абрамову А.В.).

Отримані кількісні результати оброблялися методом варіаційного статистичного аналізу середніх величин на персональному комп'ютері «Sempron 2800», з використанням програмного пакету STATISTICA 6.0 for Windows з подальшим аналізом одержаних матеріалів. Обчислювалася середня арифметична величина (М), середнє квадратичне відхилення (б) і стандартна помилка середньої арифметичної (m). Достовірність відмінностей порівнюваних величин визначалася за допомогою критерію Стьюдента (Т). За достовірну мінімальну вірогідність відмінностей бралася р <0,05. Проводився також кореляційний аналіз з використанням коефіцієнта кореляції Пірсона (r). Значення коефіцієнта r кореляції Пірсона від 0,1 до 0,29 свідчило про слабкий зв'язок ознак; значення r від 0,3 до 0,69 підтверджувало середній ступінь сполучення ознак; значення r від 0,7 і вище свідчило про наявність сильного зв'язку між ознаками, що вивчалися.

Результати дослідження та їх обговорення.

При мікроскопічному дослідженні серійних гістологічних зрізів біоптатів печінки хворих 1-ї групи спостережень були виявлені характерні патогномонічні мікроскопічні ознаки ХВГВ: «пісочні» і вакуолізовані ядра гепатоцитів, «матово-склоподібні» гепатоцити, рідкісні і малоінтенсивні внутріклітинні холестази, тільця Каунсілмена і вогнища імуноклітинного кілінгу гепатоцитів, імуноклітинні інфільтрати в портальних трактах, а також так звані імуноклітинні «ступінчасті некрози» - імуноклітинні інфільтрати в портальних трактах, які проникали через прикордонну пластинку в часточки печінки.

Відповідно до індексу гістологічної активності ХВГВ з мінімальною активністю (ІГА 1-3 бали) був ідентифікований в біоптатах печінки у 26,0% пацієнтів, гепатит із слабко вираженою активністю (ІГА 4-8 балів) виявлений у 47% хворих, гепатит з помірною активністю (ІГА 9-12 балів) виявлений у 8,6% осіб, гепатит з вираженою активністю (ІГА 13-18 балів) визначений у 8,6% хворих. В середньому індекс гістологічної активності ХГВ у обстежених хворих склав 10,10,41 балів.

Встановлено, що в печінці хворих на ХВГВ тільця Каунсілмена за морфологією є гепатоцитами в стані апоптозу. В гістологічних зрізах трепанобіоптатів печінки спостерігаються різні етапи апоптозу гепатоцитів: конденсація хроматину, пікноз ядра і формування виступів каріолеми (ядро у вигляді тутової ягоди) при збереженому ядерці; конценсація і еозинофілія цитоплазми, каріорексис з формуванням внутриклітинних апоптотичних тілець розтрощеного ядра, оточення зморщеного гепатоциту (тільця Каунсилмена) відростками макрофагів.

Встановлена позитивна кореляція між ІГА і площею імуноклітинної інфільтрації портальних трактів, коефіцієнт кореляції склав (r= + 0,76, р<0,05); водночас визначено переважання площі імуноклітинної інфільтрації портальних трактів над площею їх фіброзу (р<0,05).

При зіставленні виразності морфологічних змін в печінці у хворих на ХВГВ з нормальним рівнем АлАТ і у хворих з підвищеним її рівнем виявлено, що середній показник ІГА у хворих з нормальним рівнем ферментів склав 6,870,09 балів, а у хворих з гіперферментемією він склав 7,410,1 балів. При цьому достовірних відмінностей між середніми показниками ІГА хронічного гепатиту у хворих основної і контрольної груп не виявлено (коефіцієнт кореляції Пірсона r склав + 0,21, р<0,05). При зіставленні ступеня виразності фіброзу печінки у хворих на ХВГВ з нормальним та підвищеним рівнем АлАТ також не виявлено достовірних відмінностей (коефіцієнт кореляції Пірсона r склав + 0,35, р<0,05). Отримані результати свідчать про те, що рівень амінотранфераз в крові хворих на ХВГВ не відзеркалює виразність ушкоджень печінки; ступінь виразності вирус-індукованих і імуноклітинних уражень печінки, ступінь активації колагеноутворення і прогресії фіброзу у хворих на ХВГВ адекватніше відображають результати патоморфологічного дослідження пункційної трепанобіопсії печінки.

При морфологічному визначенні ступеню інфікування гепатоцитів вірусом гепатиту В у хворих на ХВГВ шляхом паралельного кількісного аналізу наявності «матово-склоподібних» гепатоцитів у гістологічних зрізах печінки, забарвлених гематоксиліном і еозином, та кількості гепатоцитів з наявністю імуногістохімічно визначеним HBsAg, виявлений високий кореляційний зв'язок між індексом гістологічної активності ХВГВ і ступенем інфікування гепатоцитів з наявністю HBsAg (коефіцієнт кореляції Пірсона r склав + 0,81, р>0,05), що дозволяє використовувати імуногістохімічну маркіровку HBsAg на ранніх етапах діагностики для прогнозування можливої прогресії ХВГВ у хворих з нормальним рівнем трансаміназ в крові.

При мікроскопічному дослідженні серійних гістологічних зрізів біоптатів печінки хворих 2-ї групи спостережень виявлені характерні патогномонічні мікроскопічні ознаки ХВГС: поліморфізм ядер гепатоцитів і пошкодження у вигляді «пісочних» ядер і ядер з вакуолями; жирова дистрофія гепатоцитів; внутріклітинні холестази, вогнища імуноклітинного кілінгу гепатоцитів; тільця Каунсилмена і поодинокі гепатоцити з ознаками цитолізису; ланцюжки імуноцитів уподовж внутрішньочасточкових синусоїдів печінкі, а також так звані імуноклітинні «ступінчасті некрози»; у окремих випадках виявлялися так звані імуноклітинні «мостоподібні некрози» - імуноклітинні інфільтрати, які розповсюджувалися від одного портального тракту – через часточку печінки – до іншого портального тракту.

В біоптатах печінки хворих ХВГС гепатит з мінімальною активністю (ІГА 1-3 бали) ідентифікований у 24,2% пацієнтів, гепатит з слабкою активністю (ІГА 4-8 балів) виявлений у 40% хворих, гепатит з помірною активністю (ІГА 9-12 балів) виявлений у 23,5% осіб, гепатит з вираженою активністю (ІГА 13-18 балів) визначений у 12,1% хворих. Середнє значення індексу гістологічної активності ХВГС у обстежених хворих склало 9,340,1 балів.

Результати патогістологічних досліджень показали, що однією з ознак зростання гістологічної активності ХВГ є наявність руйнування гепатоцитів шляхом апоптозу, цитокаріолізису і «балонного» цитолізису. В часточках печінки хворих на ХВГС з різним індексом ІГА визначається різна кількість поодиноких тілець Каунсилмена, які є однією з прикінцевих фаз апоптозу гепатоцитів, а також гепатоцитів в стані «балонного» цитолізису (збільшення гепатоциту зі спустошеною цитоплазмою і перетворення в шароподібну клітину з дрібним пікнотичним ядром без ядерця). Руйнування гепатоцитів шляхом апоптозу і цитокаріолізису відбувається також в вогнищах імуноклітинного кілінгу, в яких гепатоцит оточується імунокомпетентними клітинами, а також в краєвих зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів».

Як показало імуногістохімічне дослідження, вогнища імуноклітинного кілінгу гепатоцитів в часточках печінки складають CD8+Т-лімфоцити, CD45RO+ лімфоцити і CD68+ макрофаги, в складі клітин «ступінчастих некрозів» переважають CD8+Т-лімфоцити і CD45RO+лімфоцити, на периферії «ступінчастих некрозів» виявляються CD68+ макрофаги. Імуногістохімічні дослідження показали, що наявність CD8+ Т-лімфоцитів і CD68+ макрофагів у вогнищах імуноклітинного кілінгу в часточках печінки і в краєвих зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів» свідчить про вірус-індуковане імуноклітинне пошкодження печінки і одночасно відображає участь цих клітин в елімінації гепатоцитів, інфікованих гепатотропними вірусами. У імуноклітинних інфільтратах портальних трактів печінки хворих на ХВГС в значній кількості присутні CD45RO+ лімфоцити, тоді як у вогнищах імуноклітинного кілінгу визначалися рідкісні поодинокі CD45RO+ лімфоцити.

Встановлено, що однією з характерних ознак прогресії ХВГС є розвиток фіброзу печінки з її надмірною колагенізацією. При гістологічному дослідженні трепанобіоптатів печінки хворих ХГС виявлені основні мікроскопічні ознаки розвитку фіброзу печінки: фіброз портальних трактів, фіброз центральних часточкових вен, а також колагенізація стінок внутрішньочасточкових венозних синусоїдів печінки різного ступеня виразності.

При вивченні залежності між індексом гістологічної активності ХГС, площею імуноклітинних інфільтратів і площею фіброзу портальних трактів встановлена позитивна кореляція між ІГА і площею імуноклітинного інфільтрату портального тракту, коефіцієнт кореляції Пірсона r склав + 0,83 (р<0,05).

При зіставленні виразності морфологічних змін в печінці у хворих на ХВГС з нормальним рівнем АлАТ і у хворих з підвищеним її рівнем виявлено, що середній показник ІГА у хворих з нормальним рівнем ферментів склав 7,450,105 балів, а у хворих з гіперферментемією він склав 7,980,11 балів. При цьому достовірних відмінностей між середніми показниками ІГА хронічного гепатиту у хворих цих підгруп не виявлено (коефіцієнт кореляції Пірсона r= + 0,22, р<0,05) При зіставленні ступеня виразності фіброзу печінки у хворих на ХВГС з нормальним і підвищеним рівнем АлАТ, також не виявило достовірних відмінностей у виразності фіброзу печінки у хворих цих підгруп (коефіцієнт кореляції Пірсона r= + 0,33, р<0,05).

Вивчення морфогенезу фіброзу печінки при ХВГС показало, що основними структурними одиницями печінки, з якими пов'язаний розвиток фіброзу є венозні синусоїди часточки печінки, центральна часточкова вена і портальний тракт. Встановлено, що метод Ван-Гизон і трибарвний метод Масона а також імуногістохімічне дослідження колагену 4 типу, дозволяють диференціювати в гістологічних препаратах печінки хворих з мінімальною і слабковираженою активністю ХВГС, початкові етапи колагенізації стінок внутрішньочасточкових синусоїдів за відсутності значущого фіброзу в портальних трактах.

При імуногістохімічному дослідженні біоптатів печінки встановлено, що у хворих ХВГС з різним ступенем ІГА перисинусоїдальні А-SMA-позитивні клітини в часточках печінки за гістологічною будовою відповідали клітинам Іто, вони в основному локалізувалися в зонах пошкоджених гепатоцитів і в зонах лімфоцитарних інфільтратів. Відмічена позитивна кореляція між ІГА ХВГС і площею, займаною активованими клітинами Іто в часточці, коефіцієнт кореляції Пірсона r склав + 0,65 (p < 0,05).

Водночас в трепанобіоптатах печінки хворих на ХВГС різного ступеню ІГА в портальних трактах також визначалися А-SMA позитивні клітини, які мали типову структуру фібробластів.

Встановлено, що прогностичними ознаками вірогідності розвитку значного фіброзу печінки у хворих на ХВГВ і ХВГС є: гіперплазія активованих А-SMA позитивних клітин Іто в перисинусоїдальних просторах часточок печінки і сегментарна колагенізація стінок внутрішньочасточкових венозних синусоїдів, наявність А-SMA позитивних фібробластів в імуноклітинних «ступінчастих некрозах» і в портальних трактах, проникнення тонких фіброзних септ з портальних трактів в часточки печінки, збільшення числа портальних трактів з фіброзом різного ступеня виразності.

При імуногістохімічній детекції активованих макрофагів Купфера встановлено, що CD-68 активовані макрофаги (клітини Купфера) мали ознаки фагоцитозу: неправильну форму, збільшену за рахунок фагоцитованого матеріалу цитоплазму, овальне ядро і декілька тонких або трохи потовщених відростків. Активовані CD68-позитивні клітини Купфера в часточках печінки локалізувалися поряд з пошкодженими гепатоцитами і по периферії лімфоцитарних інфільтратів, а також по периферії імуноклітинних «ступінчастих некрозів». При вивченні взаємовідносин між клітинами Купфера і клітинами Іто в часточках печінки у хворих з різним значенням ІГА встановлена позитивна кореляція між площею, займаною активованими клітинами Купфера з ознаками фагоцитозу, і активованими клітинами Іто в часточках печінки (коефіцієнт кореляції Пірсона r склав + 0,76, p < 0,05).

На підставі проведених гістологічних, імуногістохімічних і комп'ютерно-морфометричних досліджень визначено, що найбільш значущими мікроскопічними ознаками прогресії хронічного вірусного гепатиту в трепанобіоптатах печінки є: наявність «балонного» цитолізісу гепатоцитів, значної кількості тілець Каунсілмена (гепатоцитів в стані апоптозу) і вогнищ імуноклітинного кілінгу гепатоцитів, збільшення кількості і протяжності імуноклітинних «ступінчастих некрозів», збільшення кількості CD8+ Т-лімфоцитів і CD68+ макрофагів у внутрішньочасточкових вогнищах імуноклітинного кілінгу і в краєвих зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів», збільшення числа активованих CD68+ клітин Купфера з ознаками фагоцитозу в часточках печінки, наростаюча колагенізація внутрішньочасточкових синусоїдів і центральних часточкових вен, розширення площі лімфоцитарної інфільтрації і фіброзу портальних трактів.

Проведені гістохімічні, імуногістохімічні і комп'ютерно-морфометричні дослідження визначили найбільш значущі прогностичні показники розвитку фіброзу печінки у хворих на ХВГВ і ХВГС: гіперплазія активованих А-SMA позитивних клітин Іто в перисинусоїдальних просторах печінки і сегментарна колагенізація стінок внутрішньочасточкових венозних синусоїдів, наявність А-SMA позитивних фібробластів в імуноклітинних «ступінчастих некрозах» і в портальних трактах, проникнення тонких фіброзних септ з портальних трактів в часточки печінки, зростання числа портальних трактів з фіброзом різного ступеня виразності. За результатами гістохімічних і гістологічних досліджень основними складовими важкого фіброзу печінки у хворих на ХВГС є збільшення числа перисинусоїдальних клітин Іто, поширена колагенізація стінок внутрішньочасточкових синусоїдів і розширення їх отворів, виражений фіброз в зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів» і в портальних трактах.

ВИСНОВКИ

У дисертації приведено теоретичне узагальнення і нове рішення наукової задачі, що полягає в удосконаленні найбільш значущих мікроскопічних критеріїв прогресії хронічного вірусного гепатиту В і С в трепанобіоптатах печінки хворих, а також у визначенні молекулярно-мікроскопічних показників прогнозу розвитку фіброзу печінки для використання в патологоанатомічній діагностиці і оптимізації лікування хворих.

1. Разом з відомими патогістологічними вірус-обумовленими пошкодженнями гепатоцитів («пісочні» і вакуолізовані ядра, жирова дистрофія гепатоцитів при ХВГС і наявність «матово-склоподібних» гепатоцитів при ХВГВ, внутриклітинні холестази, «балонний» цитолізіс та апоптоз гепатоцитів – тільця Каунсілмена), мікроскопічними ознаками прогресії хронічного вірусного гепатиту В і С є наростання імуноклітинної деструкції печінки (велика кількість вогнищ імуноклітинного кілінгу гепатоцитів; значна інфільтрація імуноцитами внутрішньочасточкових синусоїдів і портальних трактів, поширеність або велика кількість імуноклітинних «ступінчастих некрозів»), а також прогресія фіброзу печінки (поширена колагенізація стінок внутрішньочасточкових синусоїдів, фіброз зон «ступінчастих некрозів», значний фіброз портальних трактів і центролобулярних вен).

2. Найточніше ступінь вірусного інфікування гепатоцитів в трепанобіоптатах печінки хворих на ХВГВ визначає імуногістохімічне виявлення в них HBsAg і HBсAg, «матово-склоподібні» гепатоцити, що виявляються при мікроскопії, не повно відображають ступінь інфікування гепатоцитів. Наявність прямого, високого кореляційного зв'язку між кількістю інфікованих гепатоцитів з HBsAg і індексом гістологічної активності гепатиту дає підставу використовувати імуногістохімічне маркування HBsAg на ранніх етапах діагностики для прогнозування можливої прогресії ХВГВ у хворих з нормальним рівнем трансаміназ в крові.

3. В часточках печінки хворих на ХВГ з різним індексом ІГА визначається різна кількість поодиноких тілець Каунсилмена, які є однією з прикінцевих фаз апоптозу гепатоцитів, а також гепатоцитів в стані «балонного» цитолізису. Руйнування гепатоцитів шляхом апоптозу і цитокаріолізису відбувається також в вогнищах імуноклітинного кілінгу, в яких гепатоцит оточується імунокомпетентними клітинами, а також в краєвих зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів».

4. У вогнищах імуноклітинного кілінгу в часточках печінки і в зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів» печінки переважають CD8+ Т-лімфоцити і CD68+ макрофаги, в імуноклітинних інфільтратах портальних трактів, окрім цих клітин, в значній кількості присутні CD45RO+ лімфоцити. Наявність CD8+ Т-лімфоцитів і CD68+ макрофагов свідчить про вірус-індуковане імуноклітинне пошкодження печінки і одночасно відображає участь цих клітин в елімінації гепатоцитів, інфікованих гепатотропними вірусами. CD45RO+ лімфоцити, найімовірніше виконують функції Th2 клітин пам'яті при персистенції гепатотропних вірусів.

5. Найбільш значущими ознаками імуноклітинної прогресії хронічного вірусного гепатиту, що визначаються в трепанобіоптатах печінки є: наявність «балонного» цитолізісу гепатоцитів, значної кількості тілець Каунсілмена і вогнищ імуноклітинного кілінгу гепатоцитів, збільшення кількості і протяжності імуноклітинних «ступінчастих некрозів», збільшення кількості CD8+ Т-лімфоцитів і CD68+ макрофагів у вогнищах імуноклітинного кілінгу гепатоцитів і в крайових зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів», збільшення в часточках печінки числа активованих CD68+ клітин Купфера з ознаками фагоцитозу, розширення площі лімфоцитарної інфільтрації портальних трактів.

6. Надмірну продукцію колагену в печінці хворих на хронічний вірусний гепатит С здійснюють активовані A-SMA позитивні зірчасті перисинусоїдальні клітини Іто і A-SMA позитивні фібробласти портальних трактів. За даними комп'ютерної морфометрії активація зірчастих клітин Іто і поява їх нових клітинних поколінь фіброгенного типу корелює із лімфоцитарною інфільтрацією портальних трактів, із збільшенням числа і площі імуноклітинних «ступінчастих некрозів», а також з наростанням фагоцитарної активності клітин Купфера.

7. Експресія А-ізоформи гладком'язового актину клітинами Іто і фібробластами є раннім прогностичним маркером вірогідності розвитку фіброзу печінки у хворих на хронічний вірусний гепатит С з нормальним рівнем трансаміназ в крові або з помірною гіперферментемією, розвитку важкого фіброзу печінки передує значне збільшення кількості активованих клітин Іто в перисинусоїдальних просторах печінки.

8. Прогностичними ознаками вірогідності розвитку значного фіброзу печінки у хворих на хронічні вірусні гепатити В або С є: гіперплазія активованих А-SMA позитивних клітин Іто в перисинусоїдальних просторах печінки і сегментарна колагенізація стінок внутрішньочасточкових венозних синусоїдів, наявність А-SMA позитивних фібробластів в імуноклітинних «ступінчастих некрозах» і в портальних трактах, проникнення тонких фіброзних септ з портальних трактів в часточки печінки, зростання числа портальних трактів з фіброзом різного ступеня виразності. Основними складовими важкого фіброзу печінки у хворих на ХГС є збільшення числа перисинусоїдальних клітин Іто, поширена колагенізація стінок внутрішньочасточкових синусоїдів і розширення їх отворів, значна колагенізація центральних часточкових вен, виражений фіброз в зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів» і в портальних трактах.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Хворим на хронічні вірусні гепатити В або С навіть при мінімальних симптомах хвороби і при мінімальних відхиленнях лабораторних показників гепато-біліарних функцій показана пункційна трепанобіопсія печінки, результати якої найадекватніше відображають ступінь виразності вірус-індукованих і імуноклітинних уражень печінки, ступінь активації колагеноутворення і прогресії фіброзу.

2. Найбільш достовірні діагностичні і прогностичні результати патоморфологічного дослідження трепанобіоптатів печінки хворих на хронічні вірусні гепатити забезпечує паралельне забарвлення серійних зрізів гематоксиліном і еозином, трибарвним методом Масона і методом ван-Гизон; при уточненні ступеня активності хронічного гепатиту істотні додаткові дані надає імуногістохімічне виявлення HBsAg в гепатоцитах, CD8+ Т-лімфоцитів і CD68+ клітин Купфера; для прогнозування вірогідності розвитку важкого фіброзу печінки, окрім методик Масона і ван-Гизон, доцільно використовувати імуногістохімічне виявлення А-SMA позитивних клітин Іто і фібробластів, а також колагену 4 типу.

3. При визначенні прогресії хронічного вірусного гепатиту в трепанобіоптатах печінки слід враховувати наявність значної кількості гепатоцитів в стані «балонного» цитолізису, тілець Каунсілмена і вогнищ імуноклітинного кілінгу гепатоцитів, збільшення кількості і протяжності імуноклітинних «ступінчастих некрозів», збільшення кількості CD8+ Т-лімфоцитів і CD68+ макрофагів у внутрішньочасточкових вогнищах імуноклітинного кілінгу і в крайових зонах імуноклітинних «ступінчастих некрозів», збільшення числа CD68+ клітин Купфера з ознаками фагоцитозу в часточках печінки, розширення площі лімфоцитарної інфільтрації портальних трактів.

4. При прогнозуванні вірогідності розвитку значного фіброзу печінки у хворих на хронічний вірусний гепатит В або С слід враховувати гіперплазію активованих А-SMA позитивних клітин Іто в перисинусоїдальних просторах печінки, а також сегментарну колагенізацію стінок внутрішньочасточкових венозних синусоїдів, наявність А-SMA позитивних фібробластів в імуноклітинних «ступінчастих некрозах» і в портальних трактах, проникнення тонких фіброзних септ з портальних трактів в часточки печінки, зростання числа портальних трактів з фіброзом різного ступеня.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Туманский В.А., Шишкин М.А., Живица С.Г. Морфогенез перестройки печени при хроническом гепатите–циррозе по данным трепанобиопсий // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики. – Запоріжжя: вид. ЗДМУ. - 2003. - Вип. XI. С. 305-310. (Автор забезпечив морфологічне дослідження матеріалу.)

2. Туманский В.А., Шишкин М.А. Некоторые молекулярно-клеточные механизмы развития фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С // Патологія. - 2006. - Т 3, № 2. - С 60-66. (Автор забезпечив морфологічне дослідження матеріалу, аналіз та обговорення результатів, формулювання висновків).

3. Туманский В.А., Шишкин М.А. Роль клеток Ито в развитии фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики. – Запоріжжя: вид. ЗДМУ. - 2006. - Вип. XVII. - С. 207-210. (Автор забезпечив морфологічне дослідження матеріалу, аналіз та обговорення результатів).

4. Шишкин М.А. Определение степени инфицирования гепатоцитов при хроническом вирусном гепатите В по данным трепанобиопсий печени // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2007. Вип. 11 (2/1). - С. 668-670. (Автор забезпечив морфологічне дослідження матеріалу, клініко-морфологічне зіставлення. аналіз та узагальнення результатів, формулювання висновків).

5. Патент № 21679 України, МПК (2006) G01N 21/00, G01N 33/00. Спосіб прогнозування розвитку фіброзу печінки у хворих на хронічний вірусний