МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

САХАРОВА ТЕТЯНА СЕМЕНІВНА

УДК 615.322:577.38:547.983

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ФАРМАКОДИНАМІКИ ТА МЕХАНІЗМУ ДІЇ НОВОЇ ГРУПИ ПРИРОДНИХ АНТИОКСИДАНТІВ НА ОСНОВІ ЕЛАГОТАНІНІВ

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фармацевтичних наук

Харків – 2008

Робота виконана у Центральній науково-дослідній лабораторії Національного фармацевтичного університету МОЗ України, м. Харків

Науковий консультант: доктор фармацевтичних наук,

заслужений діяч науки і техніки України, професор

ЯКОВЛЄВА Лариса Василівна,

Національний фармацевтичний університет,

завідувачка Центральної науково-дослідної лабораторії,

завідувачка кафедри фармакоекономіки

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

МАСЛОВА Наталія Федорівна,

ДП “ДНЦЛЗ” МОЗ України,

завідувачка лабораторії біохімічної фармакології

доктор медичних наук, професор

КИРИЧОК Людмила Трохимівна,

Харківський державний медичний університет
МОЗ України, професор кафедри фармакології з медичною рецептурою

доктор медичних наук, професор

СТЕПАНЮК Георгій Іванович,

Вінницький національний медичний університет
ім. М.І.Пирогова,

завідувач кафедри фармакології

Захист відбудеться « 20 » червня 2008 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м.Харків, вул.Пушкінська,53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4)

Автореферат розісланий « 16 » травня 2008 р.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук, професор Л.М.Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За останні десятиріччя теорія вільнорадикального генезу різноманітних патологічних станів у організмі людини значно збагатилась новими вагомими даними, що підкреслюють її коректність та актуальність. Наведене підтверджується появою поняття “вільнорадикальна патологія”, яка лежить на засадах розвитку близько 60% найбільш поширених захворювань (Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков, 1997; О.Я. Янковский, 2000; Г.С. Шаповал, В.Ф. Громовая, 2003, О.Н. Воскресенский и соавт., 2006). Загальним для патогенезу цих захворювань є прогресування процесу некерованого вільнорадикального окиснення (ВРО), зниження буферної ємності антиоксидантної системи (АОС) і порушення мобілізації її у відповідь на підвищення активності прооксидантної системи (ПОС). За сучасними уявленнями саме зменшення співвідношення прооксиданти/антиоксиданти вважається найбільш суттєвим фактором, який протистоїть ініціації процесу ВРО і виникненню кисневої токсичності (“окисного стресу”) (Н.К. Зенков и соавт., 2001). З цих позицій можна обговорювати універсальність дії природних антиоксидантів, а, отже, можливість їхнього застосування як засобів патогенетичної терапії при будь-якій вільнорадикальній патології (I.A. Gamaley, I.V. Klyubin, 1999; S. Cuzzocrea et al., 2001; О.Ю. Дубініна, 2002, А.П. Левицкий и соавт., 2006). Не викликає сумнівів і медична значущість антиоксидантів як засобів превентивної терапії. Проблема набуває соціальної ваги у нашій країні в умовах несприятливого довкілля (екологічного стану) та незбалансованості харчування. Перспективність використання облігатних антиоксидантів зумовлюється тим, що ці біологічно активні сполуки виступають природними агентами обміну речовин, не порушують хімічний гомеостаз організму, характеризуються низькою токсичністю.

Найпоширеніша у природі група екзогенних антиоксидантів представлена фенольними сполуками, антиоксидантні властивості яких детерміновані хімічною будовою (В.А. Барабой, Ю.В. Хомчук, 1998; A. Hassig et al., 1999; Е.И. Шкарина и соавт., 2001; K.T. Сhung et al., 2001, L.R. Ferguson, 2001; Т.Г. Сазонтова, 2002; В.Г.Зайцев, О.В. Островский, В.И. Закревский, 2003). Серед природних поліфенольних сполук нашу увагу привернули рослинні дубильні речовини з групи елаготанінів. Різноманітний спектр біологічної активності та безпечність елаготанінів, достатність та доступність вітчизняних рослинних джерел для промислового отримання стали обгрунтуванням пошуку, розробки та створення на їх основі нової групи антиоксидантних лікарських засобів (О.П. Хворост и соавт., 1998).

Представлена робота присвячена фармакологічному вивченню оригінальних вітчизняних елаготаніновміщуючих препаратів альтану і елгацину у порівнянні з відомими флавоноїдними антиоксидантами кверцетином і силібором, які на сьогодні широко використовуються у медичній практиці.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України “Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, у тому числі продуктів бджільництва, для дорослих та дітей” (№ Державної реєстрації 0198U007008).

Мета і завдання дослідження. Експериментальне обгрунтування доцільності впровадження у медичну практику нової групи антиоксидантних засобів природного походження на основі елаготанінів. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

І. З’ясувати складові механізму фармакологічної дії альтану та елгацину у порівнянні з відомими флавоноїдними препаратами кверцетином і силібором.
Для цього:

1) дослідити вплив альтану і елгацину на ініціативні ланки ВРО, які зумовлюються генерацією радикальних форм кисню, зокрема супероксиданіоном та гідроксильним радикалом, а також каталітичною активністю іонів двовалентного заліза, у адекватних модельних системах;

2) визначити регулюючий вплив альтану і елгацину на функціональний стан ферментних систем, задіяних у окисних процесах радикального характеру , а саме, на активність ферменту ксантиноксидази, перебіг ліпооксигеназного шляху катаболізму арахідонової кислоти, на активність глутатіонзалежного поліферментного комплексу;

3) дослідити мембранотропні ефекти альтану і елгацину: мембраномодулювальні властивості за допомогою методу ЕПР та мембраностабілізувальну активність на моделях пероксидного ушкодження плазматичної і мікросомальної мембран.

ІІ. Визначити терапевтичну ефективність альтану і елгацину на експериментальних моделях патологій органів шлунково-кишкового тракту, печінки, серцево-судинної системи у порівнянні з кверцетином і силібором:

1) дослідити лікувальний ефект альтану і елгацину при експериментальних виразкових ураженнях шлунка і товстого кишечника у білих щурів;

2) визначити гепатопротекторну дію альтану і елгацину на моделях токсичних гепатитів з гострим і субхронічним характером перебігу у білих щурів;

3) дослідити гіполіпідемічний ефект альтану і елгацину при експериментальній гіперліпідемії у білих щурів та експериментальному атеросклерозі у кролів;

4) визначити кардіопротекторну дію альтану і елгацину на моделях токсичного міокардиту та міокардіодистрофії у білих щурів;

5) провести вивчення кардіопротекторної активності лікарської форми елгацину (таблетки елгацину, 0,007 г) на моделях гострих та хронічних експериментальних кардіопатологій у порівнянні із субстанцією елгацину та кверцетином.

Об'єкт дослідження – фармакологічна активність препаратів, створених на основі рослинних поліфенольних сполук.

Предмет дослідження – антиоксидантна дія елаготаніновміщуючих препаратів альтану і елгацину та флавоноїдних референс-препаратів – кверцетину і силібору у адекватних модельних системах, що відтворюють зрушення окисного метаболізму вільнорадикального ґенезу in vitro та in vivo.

Методи дослідження. Фармакологічні, біохімічні, фізико-хімічні, фізичні, електрофізіологічні, токсикологічні, гематологічні, гістологічні методи дослідження та методи математичної статистики. Усього використано 55 методів і 12 експериментальних моделей дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Робота є першим різнобічним фармакологічним дослідженням альтану і елгацину - представників нової групи лікарських засобів метаболічної дії, створених на основі рослинних елаготанінів. Вперше в експериментальних умовах досліджений широкий спектр фармакологічної активності альтану і елгацину. Доведена виражена терапевтична ефективність елаготаніновміщуючих препаратів при виразкових ураженнях органів ШКТ, гострих та хронічних токсичних гепатитах, гіперліпідемії/атеросклерозі, кардіопатологіях дисметаболічного характеру. Встановлені органотропні особливості фармакологічної дії альтану і елгацину. Визначені переваги запропонованих елаготаніновміщуючих антиоксидантів перед відомими флавоноїдними препаратами кверцетином і силібором, які знайшли застосування у медичній практиці. Експериментально обґрунтована доцільність впровадження у практичну кардіологію елгацину як засобу кардіопротекторної терапії. Вперше висвітлені найважливіші молекулярно-біологічні механізми реалізації фармакологічної активності оригінальних вітчизняних елаготаніновміщуючих препаратів. Встановлено, що складовими механізму дії альтану і елгацину є наявність прямого і опосередкованого антирадикального ефекту щодо реактивних форм кисню, здатності до пригнічення каталітичної активності іонів заліза – каталізаторів ВРО, захисту ферментативних та неферментативних компонентів АОС, наявність мембраномодулювальних/мембраностабілізувальних властивостей. Вперше проведене співставлення характеру інгібіторного впливу на процес ВРО препаратів на основі елаготанінів і флавоноїдних препаратів кверцетину і силібору та визначені особливості механізму їхньої дії. Одержані експериментальні дані виступають вагомим обґрунтуванням доцільності створення нової групи оригінальних лікарських засобів метаболічної дії на основі рослинних елаготанінів.

Наукова новизна роботи підтверджена патентом України на винахід № 64074 «Кардіопротекторний антиоксидантний засіб «Елгацин» від 15.06.2005 р.

Практичне значення роботи. Робота є фрагментом доклінічного дослідження субстанції та таблеток “Елгацин” 0,007 г”, пакет НТД за результатами якого представлений до ДФЦ МОЗ України. Промислове виробництво таблеток елгацину здійснює ЗАТ НВЦ „БХФЗ” (м. Київ, Україна).

Впровадження елгацину у практику охорони здоров‘я обумовить поповнення арсеналу вітчизняних лікарських засобів природного походження, які характеризуються високою лікувальною ефективністю та нешкідливістю.

Застосування елгацину у практичній кардіології як препарату вибору сприятиме оптимізації фармакотерапії ішемічної хвороби серця у хворих на стабільну стенокардію ІІ і ІІІ функціональних класів, а також хворих на атеросклероз.

Узагальнення щодо фармакологічної активності оригінальних препаратів на основі елаготанінів, залежності "структура-фармакологічна дія" у ряду рослинних поліфенольних сполук впроваджені у навчальний процес кафедр фармакології, клінічної фармакології з фармацевтичною опікою, фармакотерапії, ботаніки, фармакогнозії, хімії природних сполук НФаУ, кафедри фармакології, клінічної фармакології та технології лікарських засобів Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри фармакології з клінічними фармакологією та фармакотерапією Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, кафедри фармакології з медичною рецептурою Харківського державного медичного університету МОЗ України, використовуються у науковій роботі лабораторії біохімічної фармакології ДП “ДНЦЛЗ”, ЦНДЛ НФаУ.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею. Особисто здобувачем проведені патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки. Разом з науковим консультантом розроблено програму, визначені мета і завдання дослідження, методичні підходи до експериментального вивчення механізмів дії і фармакодинаміки елаготаніновміщуючих препаратів. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом наведені результати власних експериментальних досліджень. Вивчення впливу альтану і елгацину на структурно-динамічний стан плазматичної мембрани з використанням методу ЕПР проведене на базі Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАНУ (м. Харків), електронно-мікроскопічні дослідження проведені на базі НДІЗІНХ (м.Харків).

Апробація результатів дисертації. Результати наукових досліджень, що увійшли до дисертації, оприлюднені на науково-практичній конференції “Вчені України – вітчизняній фармації” (м.Харків, 2000 р.), VII, VIIІ, IX Російському національному конгресі "Человек и лекарство" (м. Москва, 2000, 2001, 2002 рр.), ІІІ, ІV Всеукраїнській науково-практичній конференції “Новое в клинической фармакологии и фармакотерапии заболеваний внутренних органов” (м.Харків, 2000, 2002 рр.), Республіканській науковій конференції “Научные направления в создании лекарственных средств в фармацевтическом секторе Украины” (м.Харків, 2000), XV, XVІ, XVІІ науково-практичній конференції “Ліки – людині” (м.Харків, 2000, 2001 рр.), ІІ Національному з‘їзді фармакологів України “Фармакологія 2001 – крок у майбутнє” (м. Дніпропетровськ, 2001 р.), ІІ науково-практичній конференції з міжнародною участю “Прискорене старіння та шляхи його профілактики” (м.Одеса, 2001 р.), Республіканській науково-практичній конференції “Досягнення і перспективи розвитку у клініці внутрішніх хвороб” (м.Харків, 2001 р.), VІІІ Українському біохімічному з‘їзді (м. Чернівці, 2002 р.), Міжрегіональній науково-практичній конференції “Здобутки клінічної і експериментальної медицини” (м. Тернопіль, 2002 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Фармація ХХІ століття” (м.Харків, 2002 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Нові вітчизняні розробки лікарських засобів для гастроентерології” (м. Харків, 2004 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Терапевтичні читання пам‘яті академіка Л.Т.Малої” (м. Харків, 2004 р.), VI Національному з’їзді фармацевтів України (м. Харків, 2005 р.), IV, VІ, VІІ Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології (м. Вінниця, 2004, 2006, 2007 рр.), V – VІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції “Клінічна фармація в Україні” (м. Харків, 2005, 2007 рр.), Conference on Polyphenols applications is Nutrition and Health (St Julian, Malta, 2006), І Міжнародній науково-практичній конференції “Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів” (Тернопіль, 2006 р.), Всеукраїнському симпозіумі з міжнародною участю “Растительные полифенолы и неспецифическая резистентность» (м. Одеса, 2006 р.), наукових семінарах ЦНДЛ НФаУ.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковані: 1 монографія, 27 наукових статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 15 тезів доповідей на науково-практичних конференціях та конгресах, отримано 1 патент України на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, п‘яти розділів експериментальних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків і списку використаних джерел. Загальний обсяг дисертації складає 325 сторінок друкованого тексту. Робота ілюстрована 35 таблицями, 109 рисунками. Перелік використаних джерел містить 477 найменувань (197 кирилицею, 280 латиницею).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Об’єктами досліджень обрані альтан і елгацин - оригінальні лікарські засоби, діючі субстанції яких представлені сумою елаготанінів. Обидві субстанції вперше отримані із суплідь (шишок) вільхи клейкої і сірої (Alnus glutinosa L., Alnus cinerea L.) род. Березових (Betulaceae) на кафедрі ботаніки НФаУ (автори-розробники: доцент О.П. Хворост, професор А.Г.Сербін). У дослідженнях використані субстанція альтану (сер. вип. 291100), субстанція (сер. вип. 011105) і таблетки (сер. вип. 000105) елгацину, виготовлені на ЗАТ НВЦ “Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод”.

Субстанція альтану містить суму елаготанінів, умовно названих альнітанінами І, ІІ, ІІІ, ІV, які уявляють собою продукти глікозування елагової кислоти (рис. 1а), а також елагову, галову кислоти, етилгалат. Субстанція елгацину представлена комплексом продуктів гідролізу елаготанінів у складі елагової (рис. 1б), валонової кислот та продуктів їхньої взаємодії. Базовими референс-препаратами обрані кверцетин (сер. вип. 070505/13, виробництва ЗАТ НВЦ “БХФЗ”, м. Київ, Україна) і силібор (сер. вип. 010100, виробництва ТОВ “ФК Здоров‘я”, м.Харків, Україна) – вітчизняні лікарські засоби на основі рослинних флавоноїдів, особливості фармакологічної дії яких широко висвітлені у науковій літературі (В.Б. Ковалев и соавт.,1999; Н.П. Скакун, 2000; А.П. Левицкий и соавт., 2006).

а б

Рис. 1. Хімічна будова переважаючих компонентів у складі альтану і елгацину: а – узагальнена формула альнітанінів – глікозидів гексагідроксидифенової кислоти (R- вуглеводний залишок); б – елагова кислота (лактон гексагідроксидифенової кислоти).

У дослідах in vitro ефективні концентрації альтану, елгацину, кверцетину і силібору визначались скринінговим шляхом. В усіх експериментах in vivo препарати досліджувались в умовнотерапевтичних дозах, попередньо визначених за антиоксидантною активністю. Для альтану і елгацину означена доза становила – 1 мг/кг (Л.В. Яковлєва зі співавт., 2002; І.В. Карбушева, 2003), для кверцетину – 5 мг/кг (О.К. Івахненко зі співавт.,1999), для силібору – 25 мг/кг (С.В. Мисюрева, 2001).

Фармакологічні дослідження виконані на 645 стандартизованих тваринах (560 щурах, 60 мишах, 25 кролях), вирощених у розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ відповідно до вимог GLP, згідно з методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (“Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації)”, 2001). Усі втручання та знеживлення тварин здійснювали з дотриманням принципів “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей” (Страсбург, 1985) та ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2001). Комісією з біоетики НФаУ порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено (протокол № 4 від 15.11.2003 р.). Фармакологічні дослідження проводили у ЦНДЛ НФаУ, яка сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення № 34 від 29.12.2005 р.).

Окремий фрагмент роботи був присвячений з‘ясуванню потенційних механізмів реалізації фармакологічної дії альтану і елгацину у порівнянні з кверцетином і силібором. Визначення сумарної антиоксидантної активності (САОА) здійснювали в умовах in vitro за методом Г.И. Клебанова и соавт. (1988). Внесок у антиоксидантну активність прямої антирадикальної дії (відносно активних форм кисню (АФК) оцінювали in vitro: щодо супероксиданіону (СОА) у “адреналін-адренохромовій” та “ксантин-ксантиноксидазній” модельних системах, щодо ОН-радикалів – з використанням дезоксирибозного методу (А.В. Арутюнян и соавт., 2000). Визначали також залежність антиоксидантної активності препаратів від концентрації екзогенного заліза на моделі аскорбатзалежного ПОЛ у мікросомах печінки, що опосередковано свідчить про їхню здатність до вилучення іонів Fe2+ – каталізаторів ВРО (Ю.В. Никитченко и соавт., 1997). Наявність непрямої антирадикальної активності констатували за модулюючим впливом препаратів на функціональну спроможність найбільш відомих радикалоутворюючих ферментативних систем – ксантиноксидази і ліпооксигенази. Антиксантиноксидазну дію реєстрували в умовах in vitro за впливом на перебіг реакції перетворення ксантину на сечову кислоту (А.В. Арутюнян и соавт., 2000). Можливе втручання препаратів у ліпооксигеназний шлях катаболізму арахідонової кислоти визначали на моделях зимозанового набряку стопи у білих щурів та декстранового запалення вуха у білих мишей, у механізмах розвитку яких провідну роль відіграють лейкотрієни (K. Gado, G. Gigler, 1991; J.P. Wauwe, J.G. Goossens, 1989). Опосередкована антиоксидантна активність досліджуваних об’єктів засвідчувалась їхнім впливом на функціональний стан ферментативного антиперекисного захисту: визначали сумарну глутатіонпероксидазну активність та долю участі селенозалежного та селенонезалежного ізоферментів, активність глутатіонредуктази (ГР) (В.З. Ланкин, С.И. Гуревич, 1976), глутатіон-S-трансферази (ГT) (В.В. Лемешко и соавт., 1987), глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ) (Г.А. Кочетов, 1980).

Потенційні мембраномодулювальні ефекти альтану і елгацину вивчали за допомогою методу електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) з використанням спін-мічених аналогів мембранних ліпідів. Реєстрували термоіндуковані структурно-динамічні перебудови плазматичної мембрани еритроцитів крові білих щурів, які у профілактичному режимі отримували перорально субстанції альтану та елгацину в умовнотерапевтичних дозах (M. Minetti et al., 1984; Л.В. Цымбал, В.А. Моисеев, 1985). Підсумково мембранопротекторну здатність альтану та елгацину порівняно з силібором і кверцетином вивчали на моделях перекисного ушкодження плазматичної мембрани за методом Jager F.S. (Л.М. Вороніна зі співавт., 1996) та мікросомальної мембрани – за активністю мембраносполученого фермента цитохрома Р-450 (В.В. Лемешко, 1980).

Вивчення різновидів фармакологічної активності досліджуваних об’єктів здійснювалось з використанням загальноприйнятих моделей експериментальної патології, рекомендованих ДФЦ МОЗ України (“Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації)”, 2001). Для вивчення антиульцерогенної активності використовували моделі оцтовокислої виразки шлунка та оцтовокислого коліту у білих щурів (L.R. Fitzpatrick et al., 1990; І.В. Карбушева, 2003). Вплив препаратів на структурно-функціональний стан слизової органів ШКТ на тлі дії фактору агресії визначали за результатами макро- і мікроскопічного обстеження (Г.А. Меркулов, 1964). Оцінку ступеня активності перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) здійснювали на підставі даних біохімічного аналізу тканини шлунка (або кишечника) та крові тварин. Маркерними показниками були обрані наступні: вміст дієнових кон‘югатів (ДК), ацилгідроперекисів (АГП), ТБК-активних продуктів (ТБК-АП) (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977; В.Б. Гаврилов зі співавт., 1983), вміст відновленого глутатіону (ВГ), активність ферменту супероксиддисмутази (СОД) (А.В. Арутюнян и соавт., 2000). Крім наведеного, вираженість запального процесу під час моделювання експериментального коліту оцінювали, зважаючи на дані гематологічного аналізу: визначали концентрацію гемоглобіну з використанням тест-діагностикумів фірми “Lachema”, вміст еритроцитів, лейкоцитів та лейкоцитарну формулу – за уніфікованими методами лабораторної діагностики (В.В. Меньшиков и соавт.,1987).

Вивчення гепатопротекторної активності здійснювали на моделях гострого тетрахлорметанового та субхронічного тетрациклінового гепатитів. Для оцінки впливу препаратів на метаболічні процеси в організмі тварин при гепатопатології визначали у сироватці крові показники ліпідного обміну – вміст загальних ліпідів і холестерину за наборами фірми "Laсhema" (Чехія), вміст фосфоліпідів –з використанням діагностикумів фірми "Sentinel СН." (Італія); показники білкового обміну – вміст загального білка та сечовини за допомогою біохімічних тест-систем фірми "Laсhema"; з показників вуглеводного обміну – вміст глікогену у тканині печінки за методом Кемпа і Кітца (М.И. Прохорова, З.Н. Тупикова, 1965). Ензимологічні дослідження включали визначення активності ферментів аланінамінотрасферази (АлАТ), лужної фосфатази (ЛФ) з використанням тест-діагностикумів фірми "Laсhema". Інтенсивність процесу ПОЛ оцінювали за комплексом вищенаведених показників, що визначались у крові і гомогенатах печінки. Зовнішньосекреторну функцію печінки досліджували за методикою Н.П. Скакуна, А.Н. Олейник (”Доклінічні дослідження лікарських засобів” (методичні рекомендаціі)”, 2001), визначаючи показники інтенсивності жовчовиділення, концентрації жовчних кислот і холестерину у жовчі (В.П. Мірошниченко зі співавт., 1978). Лікувальна ефективність досліджуваних препаратів підтверджувалась гістоморфологічним аналізом за допомогою вищезгаданих уніфікованих методів світлової мікроскопії.

Дослідження гіполіпідемічної активності проведене на моделях експериментальної гіперліпідемії у білих щурів і експериментального атеросклерозу у кролів. Для оцінки стану ліпідного обміну в організмі тварин визначали наступні показники: вміст загальних ліпідів (ЗЛ), загального холестерину (ЗХ), ефірів холестерину (ЕХС) і холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ), ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ) із застосуванням наборів фірми “Laсhema”(Чехія), триацилгліцеринів (ТАГ) за допомогою набору фірми “Eagle Diagnostics” (США). Показники вмісту ДК, АГП, ТБК-АП, ВГ, активності СОД, каталази визначали у крові кролів, а у щурів – у крові та у гомогенаті печінки згідно з вищеописаними методиками. У дослідах на щурах по завершенні експерименту оцінювали стан холеекскреторної функції печінки, вміст у жовчі холестерину та жовчних кислот так, як зазначалось вище. Після евтаназії у кролів вилучали аорту, морфоструктуру якої досліджували з використанням методів світлової та електронної мікроскопії (Г. Гайдер, 1974).

У серії експериментів з дослідження кардіопротекторної активності використані моделі експериментального гострого ізадринового міокардиту і експериментальної міокардіодистрофії, спричиненої доксорубіцином. Доклінічне випробування таблеток елгацину, який пропонується для впровадження як кардіопротекторний засіб, передбачало додаткове вивчення його специфічної фармакологічної дії на моделі хронічної етанол-фуразолідонової кардіоміопатії (Л.В. Яковлева и соавт., 1999). Для оцінки ступеня ушкодження серцевого м’язу кардіотоксинами, а також кардіопротекторних властивостей препаратів здійснювали електрокардіографічне (ЕКГ) обстеження тварин з використанням електрокардіографа ЕК1Т 03М у ІІ стандартному відведенні. Ступінь дистрофічно-некротичного ушкодження міокарду оцінювали за активністю ферментів аспартатамінотрансферази (АсАТ), лактатдегідрогенази (ЛДГ), креатинфосфокінази (КФК) з використанням діагностичних наборів фірми “Lachema” (Чехія). Оцінку інтенсивності перекисних катаболічних перетворень структурних ліпідів у організмі білих щурів здійснювали на підставі біохімічного аналізу крові і гомогенату серця. У сироватці крові за допомогою тест-набору фірми “Sentinel CH ” (Італія). визначали вміст загальних фосфоліпідів, у крові та тканині серця визначали вміст ДК, АГП, ТБК-АП, вміст ВГ, активність ферментів СОД і каталази (М.А. Королюк зі співавт., 1988). Гістоморфологічне дослідження серцевого м‘язу здійснювали за допомогою методів світлової мікроскопії.

Обробка одержаних результатів здійснювалась за допомогою методів варіативної статистики з використанням коефіцієнту Стьюдента з поправкою Бонфероні та непараметричними методами (Г.В. Гублер, А.А. Генкен, 1973; Ю.И. Иванов, Р.Н. Погорелюк, 1990; С.В. Глянц, 1998). Розрахунки проводили за допомогою спеціальної програми Statistica 5.0 for Windows на Pentium 200.

Дослідження окремих механізмів реалізації фармакологічної активності альтану та елгацину. Передбачуване втручання елаготаніновміщуючих препаратів у перебіг аномального ВРО досліджене з використанням цілої низки експериментальних методик, які відтворюють ключові етапи згаданого процесу.

Узагальнена характеристика механізмів реалізації антиоксидантної активності альтану та елгацину у порівнянні з кверцетином і силібором наведена у табл. 1.

За результатами визначення сумарної антиокисної активності встановлено, що елаготаніновміщуючі препарати виявляють виражену здатність (на 50% і вище) до пригнічення індукованої ліпопероксидації, але при ІС50, які значно перевищують такі у референс-препаратів (для альтану ІС50 становила 60 мкг/мл, для елгацину – 100 мкг/мл, кверцетину – 1,6 мкг/мл, силібору – 8 мкг/мл). Очевидно, інтенсивне витрачання елаготанінів обумовлюється їхніми властивостями як речовин з “активними радикалами” та участю у знешкодженні не лише АФК, але й перекисних радикалів ліпідів (Е.И. Шкарина и соавт., 2001).

Таблиця 1

Складові механізму антиоксидантної дії альтану і елгацину
у порівнянні з кверцетином і силібором

Показник | Альтан | Елгацин | Кверцетин | Силібор

Антирадикальна дія щодо СОА | +++ | ++ | ++ | +

Антирадикальна дія щодо ОН-R | ++++ | +++ | ++ | ++

Інактивація каталізаторів ПОЛ (Fe2+) | +++ | ++ | ++–

Антиксантиноксидазна активність | ++ | +++ | + | ++

Антиліпооксигеназна активність | ++ | ++ | ++ | ++

Протекція антиперекисних глутатіонових ферментів | +++ | + | ++–

Протекція ферментів рециклювання глутатіону | + | +++ | ++ | +++

Стабілізація плазматичної мембрани | ++++ | +++ | +++ | +++

Стабілізація мікросомальної мембрани | ++++ | +++ | +++ | +

Примітка. “–“- відсутність ефекту; “+”, “++”- вираженість ефекту до 50%; “+++”, “++++” –вираженість ефекту понад 50%.

Вивчення дезактивуючої активності досліджуваних препаратів щодо первинних АФК дозволило висвітлити особливості впливу альтану на процес генерації супероксиданіону (СОА) в залежності від типу модельної системи. В умовах перетворення “адреналін>адренохром” підвищення у середовищі концентрації згаданого препарату понад 6 мкг/мл супроводжувалось поступовим прискоренням реакції. Треба думати, що підвищенню окиснюваності альтану може сприяти вивільнення карбоксильних груп у складі гексагідроксидифенової кислоти (додатково до наявних фенольних гідроксилів) внаслідок гідролізу альнітанінів у сильнолужному середовищі (див. рис. 1а на стор. 6). На відміну від зазначеного у дослідах з окиснення гіпоксантину ксантиноксидазою близькі до фізіологічних (рН=7,8) значення рН виявилися оптимальними для прояву потужної антирадикальної дії альтану. Вираженість антирадикального ефекту елгацину в умовах обох дослідів була помірною і носила сталий характер, проте у концентраціях, вищих ніж у альтану. Такий характер антирадикальної активності елгацину щодо СОА обумовлюється наявністю фенольних гідроксильних угрупувань та стабільністю структури за рахунок лактонізації молекули гексагідроксидифенової кислоти (див. рис. 1б на стор. 6). Пригнічення процесу генерації СОА флавоноїдвміщуючими референс-препаратами, особливо кверцетином, відбувалось лише при високих значеннях рН (у системі “адреналін-адренохром”). У системі “ксантин-ксантиоксидаза” (при рН=7,8) антирадикальна активність як кверцетину, так і силібору, на відміну від альтану і елгацину, швидко втрачала лінійний характер у дуже вузькому діапазоні концентрацій (до 1 мкг/мл).

Дослідження антирадикальної активності елаготаніновміщуючих препаратів стосовно гідроксильного радикалу показало, що альтан і елгацин справляли більш виражений пригнічувальний вплив на процес утворення ОН-радикалів порівняно з флавоноїдними референс-препаратами. На користь наведеного свідчили ізоефективні концентрації (С50%) досліджуваних препаратів у співставленні з манітом – стандартної “пастки” ОН-радикалу (Y. Yonezawa et al., 2001). Антирадикальний ефект на рівні 50% визначався у менших концентраціях, ніж для маніту: для альтану у 5 разів, елгацину – у 2,2 рази, силібору – у 1,8 разів, кверцетину – у 1,5 рази.

Зважаючи на очевидну значимість іонів двовалентного заліза в індукції ВРО здійснювали оцінку впливу альтану і елгацину на каталітичну активність Fe2+ у порівнянні з кверцетином і силібором. Найвиразніша здатність до вилучення іонів двовалентного заліза встановлена для альтану і підтверджувалась явищем повної блокади ПОЛ з підвищенням концентрації препарату у реакційному середовищі до 8 мкг/мл. Очевидно, що активне вилучення каталізатора з реакційного середовища в присутності альтану зумовлюється схильністю фенольних гідроксилів його діючих речовин до комплексоутворення у поєднанні зі здатністю до утворення солей заліза за рахунок карбоксильних груп у складі гексагідроксидифенової кислоти. З іншого боку, висвітлена у попередніх дослідах окисно-відновна “агресивність” альтану може сприяти окисненню заліза до менш реакційноздатної форми – Fe3+ , таким чином стримуючи індукцію ПОЛ. Хелатувальна спроможність елгацину у порівняних з альтаном концентраціях була дещо менш вираженою, хоча за характером (прямо дозозалежним) наближалась до останнього. Для елгацину, як і для препарату порівняння кверцетину, вплив на концентрацію екзогенного заліза може обумовлюватися наявністю лише фенольних гідроксилів. Відсутність будь-яких ознак впливу іншого референс-препарату силібору на пускові механізми ліпопероксидації у ізоефективних концентраціях в умовах аналогічних дослідів виступає свідченням хімічної інертності флаволігнанів відносно іонів металів.

Орієнтовна оцінка гальмівної дії елаготаніновміщуючих препаратів щодо ферментативної генерації АФК здійснювалась у серії дослідів з визначення їхньої антиксантиноксидазної та антиліпооксигеназної активності у порівнянні з обраними референс-препаратами. Узагальнення результатів, отриманих при відтворенні ксантиноксидазної реакції, дозволило заключити, що у прояві анти-СОА активності альтану чільне місце посідають його сквенджерні властивості, які доповнюються помірним дозозалежним пригнічувальним впливом на ксантиноксидазу. У елгацину, навпаки, здатність до пригнічення СОА-продукції у “ксантин-ксантиноксидазній” системі опосередкована першочергово гальмівним впливом на ксантиноксидазу і меншою мірою сквенджерною активністю. Характерним у дії референс-препаратів було поєднання спроможності до інгібіції ферменту, але у дуже вузькому діапазоні концентрацій (для кверцетину – 0,1-0,2 мкг/мл, для силібору – до 4 мкг/мл), з невиразним антирадикальним ефектом у аналогічній модельній системі. Щодо антиліпооксигеназної активності можна зробити висновок, що як альтан, так і елгацин вже у дозі 1 мг/кг виявляють здатність до специфічного пригнічення лейкотрієнзумовленої запальної патології, за силою порівняну з такою кверцетину, відомого своєю антилейкотрієновою дією (В.Б. Ковалев и соавт., 1999).

Під час дослідження модулюючого впливу елаготаніновміщуючих препаратів на функціональну активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів встановлено, що дія альтану спрямована переважно на захист ГПО, зокрема її селенонезалежного ізоферменту та, дещо менше, ГТ. Завдяки вираженій антирадикальній активності щодо АФК і ліпідних перекисів та здатності до інактивації каталізаторів ПОЛ діючі речовини альтану можуть запобігати ініціації механізмів, відповідальних за утворення пероксиду водню і ліпоперекисів – субстратів ГПО і ГТ. Поряд із зазначеним, захисний вплив альтану практично не позначився на функціональному стані глутатіонвідновлюючих ферментів – ГР і Г6ФД. Елгацин, навпаки, показав чітко окреслену здатність до нормалізації функції ГР і Г6ФД, не справляючи коригуючого впливу на активність антипероксидних ферментів. За характером модулюючого впливу на активність глутатіонзалежних ферментів силібор наближався до елгацину, а відновлювальний потенціал кверцетину позначився більшим впливом на Г6ФД та дещо менше стосувався глутатіонпероксидазної активності. Останнє знаходиться у прямій залежності від вираженості антирадикальних властивостей зазначеного флавоноїду. Очевидно діючі речовини як елгацину, так і обраних флавоноїдних препаратів за рахунок рухомих атомів водню у складі фенольних гідроксилів першочергово використовуються як донатори водню для НАДФН-залежних ферментних систем, оскільки рослинні поліфеноли розглядаються як потенційні відновлювальні еквіваленти, що забезпечують глутатіоновий гомеостаз (В.В. Соколовский, 1988; J. Robak, R. J. Gryglewski, 1996; P. Hollman, M. Katan, 1997).

За даними, отриманими при дослідженні структурно-динамічного стану плазматичної мембрани еритроцитів за допомогою методу ЕПР з використанням мембранних зондів АПК і 16-ДС, визначено, що під впливом як альтану, так і елгацину мали місце перебудови у гідрофобній зоні зовнішньої поверхні мембрани внаслідок збільшення її структурної гетерогенності. Останнє можливе внаслідок безпосереднього впливу елаготанінів на структурно-динамічний стан мембран через вбудовування у мембранний бішар. Наведене цілком співпадає з даними літератури про те, що з підвищенням кількості ароматичних кілець, тобто підвищенням гідрофобності, створюються умови для вбудовування молекул поліфенольних сполук у гідрофобну фазу мембрани, де вони можуть функціонувати як сквенджери АФК та ланцюг-перериваючі інгібітори ВРО ліпідів (В.В. Соколовский, 1988; Е. Middleton, 1996; L. Bravo, 1998). Причетність діючих речовин альтану і елгацину до забезпечення стабільності мембрани підтверджена на моделях перекисної деструкції мембран різного рівня організації – плазматичних і мікросомальних. Аналіз наведених результатів обох дослідів дозволив розмірковувати про наявність прямої симбатної залежності вираженості мембранопротекторної дії препаратів від їх прямої антирадикальної активності відносно АФК. Найвиразніше підвищення резистентності еритроцитів до спонтанного гемолізу, зумовленого станом плазматичної мембрани, відзначалось під впливом альтану у дозі 1 мг/кг. Вираженість антигемолітичної дії елгацину в умовах зазначеного досліду порівнювалась з такою флавоноїдних референс-препаратів кверцетину у дозі 5 мг/кг і силібору у дозі 25 мг/кг, мембраностабілізувальна дія яких є відомим фактом (В.А. Барабой, 1984; A. Saija et al., 1995; А.П. Левицкий, 2000, 2006). У наших попередніх дослідженнях аналогічна співставленість ефекту елгацину, кверцетину і силібору визначена за їхнім впливом стосовно пригнічення утворення ОН-радикалу. Останній виступає провідним чинником спонтанного ліпопереокиснення плазматичних мембран, спровокованого впливом атмосферного молекулярного кисню (Г.С. Шаповал, В.Ф. Громовая, 2003). Щодо захисту мікросомальних мембран, як і у попередньому досліді, найефективнішим виявилося використання альтану. Для елгацину визначена певна подібність мембраностабілізувальної дії з кверцетином у діапазоні початкових з обраних концентрацій (1,25-2,5 мкг/мл). У пробах із силібором вміст мікросомального ферменту цитохрому Р-450 залишався практично на рівні ушкоджених мікросом із слабкою тенденцією до підвищення при застосуванні найбільшої із виучуваних концентрацій (5 мкг/мл). Отже, альтан, елгацин, а з флавоноїдних препаратів кверцетин справляють протекторну дію як на рівні плазматичної, так і мікросомальної мембран. Мемраностабілізувальні властивості силібору, визначені у наших дослідах, стосуються переважно плазматичної мембрани.

Експериментально-теоретичні узагальнення щодо особливостей фармакодинаміки альтану і елгацину та обґрунтування доцільності створення лікарських засобів антиоксидантної дії на основі елаготанінів.

Вивчення різновидів фармакологічної активності альтану і елгацину проведене на моделях експериментальної патології, провідним патогенетичним механізмом якої є зрушення окисного метаболізму, індукованих і/або спряжених із гіперактивацією ВРО (S.R.J. Maxwell, G.Y.H. Lip, 1997; А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева, 1999; О.Я. Янковский, 2000; E. Cadenas, K.J.A. Davies, 2000; Г.С. Шаповал, В.Ф. Громовая, 2003; В.Г. Зайцев и соавт., 2003; О.Н. Воскресенский и соавт., 2006). Результати дослідження різновидів фармакодинаміки альтану і елгацину у порівнянні із референс-препаратами проаналізовані у зіставленні з вищенаведеними власними, а також літературними даними, які висвітлюють складові механізму дії виучуваних препаратів.

Результати проведених дослідів констатували наявність вільнорадикальної ланки у патогенезі експериментальних виразкових уражень шлунка і товстої кишки. Оцінюючи виразність деструктивних проявів ПОЛ при виразковому ураженні шлунка та кишечника, варто визнати більш тяжкий перебіг останньої патології. Прогресування виразково-некротичного процесу у товстій кишці тварин з групи контрольної патології підтверджувалось пригніченням функціональної активності кишечника та специфічною для запалення гематологічною картиною. Вищенаведені зрушення макроскопічно виявлялись формуванням виразкових дефектів на слизових оболонках шлунка (СОШ) і кишечника (СОК), дистрофічно-дегенеративними змінами морфоструктури тканин органів, які у шлунку тварин відповідали ознакам хронічної рецидивуючої виразки фундального відділу, а у товстій кишці – виразкового коліту.

Результати дослідів з вивчення противиразкової дії альтану і елгацину віддзеркалюють, перш за все, реалізацію мембраностабілізувальних та антиоксидантних властивостей препаратів. Ілюстрацією такого ствердження є регресія накопичення різноманітних продуктів переокиснення мембранних ліпідів та урегулювання дисбалансу ПОЛ/АОС в умовах виразкової патології як шлунка, так і товстої кишки. Водночас пригнічення явищ ліпопероксидації під впливом альтану і елгацину виключало одну з патогенетичних ланок запалення кишечника, забезпечувало відновлення процесів, дієспроможність яких визначається цілісністю та станом плазматичної мембрани епітеліальних клітин. Тому у лікованих щурів простежувалась відчутна нормалізація складу периферичної крові - кількості еритроцитів, лейкоцитів, моноцитарного відсотку. Встановлені у наших дослідах мембраномодулювальні властивості елаготаніновміщуючих препаратів передбачають безпосередню взаємодію елаготанінів із компонентами плазматичної мембрани і зміну її фізико-хімічних властивостей. Накопичуючись у осередку запалення, елаготаніни здатні справляти мембраностабілізувальну дію щодо плазматичних мембран епітеліальних клітин слизової, так і клітин ендотелію мікрокапілярів, зменшуючи таким чином їхню проникність. Завдяки вираженим антирадикальним властивостям елаготаніни беруть участь у знешкодженні АФК, які продукуються нейтрофільними та азурофільними лейкоцитами, а також опосередковано пригнічують генерацію СОА за ксантиноксидазним шляхом, що має вирішальне значення у патогенезі ішемії при виразковому ураженні ШКТ (В.Д. Пасечников и соавт., 1990).

Візуальне обстеження СОШ і СОК дозволило співставити противиразковий ефект елаготаніновміщуючих препаратів (рис. 2), хоча за значеннями окремих біохімічних показників та даними морфологічного обстеження протекторний вплив альтану можна охарактеризувати як більш динамічний. На відміну від елгацину у тварин, лікованих альтаном, відзначались окреслені морфологічні ознаки не лише проліферації, але й диференціації епітеліальних клітин СОШ.

Застосування препаратів порівняння на основі флавоноїдних антиоксидантів в умовах аналогічних дослідів дещо менш виражено, порівняно з елаготаніновміщуючими препаратами, позначилось на перебігу запально-некротичних процесів у органах ШКТ. Звертає на себе увагу висока здатність кверцетину і силібору до відновлення пулу редукованого глутатіону, між тим СОД-протекторний ефект в умовах обох дослідів був властивий лише кверцетину. При експериментальному коліті під впливом референс-препаратів мала місце нормалізація гематологічних показників, хоча у групі щурів, лікованих кверцетином, зберігався лейкоцитоз. За результатами макро- і мікроскопічного аналізу застосування обох препаратів порівняння позначилось певними ознаками регресії запального процесу у СОШ та СОК (рис. 2).

Рис. 2. Противиразкова ефективність альтану, елгацину, кверцетину і силібору (за зменшенням площі виразкового дефекту), %.

Примітка. * –розбіжність вірогідна порівняно з контрольною патологією (р0,05).

За даними літератури відомо, що антиульцерогенна активність кверцетину забезпечується стимуляцією синтезу цитопротекторних простагландинів Е2, антиліпооксигеназним, мембраностабілізувальним і антиоксидантним ефектами (В.Б Ковалев и соавт., 1999). За силою прояву останніх із перелічених ефектів кверцетин у наших дослідах поступався як альтану, так і елгацину, що, очевидно, позначилось меншою виразністю противиразкової дії. Зіставляючи окремі складові механізму дії силібору з ланками патогенезу запальної патології ШКТ можна припустити, що противиразковий ефект препарату визначається мембранопротекторним (на рівні плазматичної мембрани), антиліпооксигеназним ефектами та виразною глутатіонзберігаючою дією, яка опосередковується його безпосередньою участю у функціонуванні ферментного ланцюгу рециклювання глутатіону. Варто звернути увагу на той факт, що у наших дослідах обидва препарати порівняння справляли досить невиразний і несталий вплив на активність ферменту ксантиноксидази. Між тим, активне використання у зонах гіпоксії найважливішого енергетичного джерела клітини АТФ спричиняє накопичення аденілових мононуклеотидів і окиснення їх за участю ксантиноксидази, що супроводжується підвищенням продукції супероксиданіонів. З іншого боку, зменшення АТФ в умовах гіпоксії виключає утворення цАМФ, який разом з іонами кальцію є месенджером синтезу простагландинів групи Е, відповідальних за обмеження ішемічних пошкоджень слизової органів ШКТ.

Аномальна інтенсифікація ВРО є відомим патогенетичним механізмом розвитку токсичних уражень печінки (О.О. Герасимова, 2003, С.М. Дроговоз и соавт., 2005). У наших дослідах мембранна патологія гепатоцитів, опосередкована перекисною деструкцією структурних ліпідів, відзеркалювалась зміною інтегральних показників, які характеризують ключові різновиди обміну речовин. У сироватці крові тварин з гострим тетрахлорметановим і тетрацикліновим гепатитами визначались гіпопротеїнемія, гіпохолестеринемія та різного ступеня вираженості гіпоуремія, а також достовірне зменшення вмісту глікогену у тканині органу. Метаболічна картина при обох гепатитах дещо відрізнялась спрямованістю змін ліпідного спектру. Підвищення вмісту загальних ліпідів у сироватці крові при гострому