Львівський національний університет ветеринарної

медицини та біотехнологій імені С.З.Ґжицького

ШЕКЕЛЬ ВІКТОР ФЕДОРОВИЧ

УДК 612.128.618.019

ІМУНОФІЗІОЛОГІЧНІ ФАКТОРИ ПРОТИПУХЛИННОГО ЗАХИСТУ

МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ СОБАК

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Львів – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З.Ґжицького Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

Маслянко Роман Петрович,

Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького, завідувач кафедри епізоотології;

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор

Стояновський Володимир Григорович,

Львівський національний університет ветеринарної

медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького,

завідувач кафедри патологічної фізіології;

доктор ветеринарних наук, професор

Коцюмбас Ігор Ярославович,

Державний науково-дослідний контрольний інститут

ветеринарних препаратів і кормових добавок, директор,

завідувач лабораторії імунології.

Захист відбудеться 18 червня 2008 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.826.01. у Львівському національному університеті ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З.Ґжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50, аудиторія №1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського національно-го університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Ґжицького за адресою: 79010, м. Львів, вул. Пекарська, 50.

Автореферат розісланий 14 травня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор | Головач П.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Стан імунної системи, однієї із складової гомеостазу тварин має важливе значення для організму в умовах пухлинного росту. Вивченню питань імунофізіології непластичних процесів у тварин останнім часом надається великого значення. Це зумовлено, з одного боку значними досягненнями у вивченні імунофізіологічних процесів при злоякісній трансформації та причин її виникнення, з іншого – надією і перспективою застосування імунодіагностики та імунотерапії злоякісних новоутворень.

Тепер не виникає сумнівів значення імунної системи при неопластичних процесах в організмі тварин. Проте в міру накопичення знань про стан цієї системи при пухлиноутвореннях, дедалі більше виявляється неоднозначність розуміння її ролі у виникненні, розвитку та лікуванні онкологічної патології.

Тривалий час існувала концепція Ф.Бернета (1971), яка передбачала можливість виникнення злоякісних пухлин внаслідок накопичення мутантних клітин на тлі зниження функціональної активності системи імунітету. Згідно з цією концепцією, що названа “імунологічний нагляд”, роль імунної системи у ссавців полягає у розпізнавані та елімінації чужорідних субстанцій, що виникають в результаті соматичних мутацій або еквівалентних процесів і змінюють антигенну характеристику клітин (Rosenberg S, 2004 ; Terabe M. Berzofsky F.A. 2004). Якщо імунні механізми не спрацьовують, то трансформовані клітини утримують селективну перевагу, що веде до утворення пухлин. Захисна роль у даному випадку відводилась Т-супресорним лімфоцитам.

В даний час концепція протипухлинного нагляду з боку Т–лімфоцитів підтримується численними експериментальними дослідженнями (Білинський Б.Т. зі співат., 1992; Гнатишак А.І., 1988; Conventry B.F., 2004). Клінічно відомо, що імунна недостатність супроводжує пухлину від початку до закінчення її розвитку, а тому вивчення імунофізіологічного стану організму собак різного віку при виникненні, розвитку та лікуванні пухлин залишається актуальним і потребує подальшого дослідження з метою розробки ефективних способів протипухлинного захисту молочної залози даного виду тварин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Робота є фрагментом наукової тематики “Розробка і оцінка ефективності нетрадиційних методів лікування хворих пухлинами тварин”, яка включена до науково – дослідної програми кафедри хірургії ЛНУВМтаБТ імені С.З.Ґжицького (номер держреєстрації 01040000346).

Мета і завдання дослідження. З’ясувати особливості імунофізіологічного статусу організму здорових собак-донорів різного віку, а також їх аналогів у процесі розвитку та лікування пухлин молочної залози із застосуванням методів імунотерапії.

Для реалізації поставленої мети ставились наступні завдання :

– провести оцінку імунобіологічного статусу клінічно здорових собак і пухлиноносіїв різного віку;

– встановити особливості змін гуморального і клітинного механізмів імунного захисту у крові собак-пухлиноносіїв молочної залози в процесі лікування, порівняно з клінічно здоровими тваринами – аналогами;

– дослідити білковий склад сироватки крові здорових собак і пухлиноносіїв;

– вивчити фактори природної резистентності організму здорових собак і пухлиноносіїв;

– оцінити зміни морфологічного складу крові, гомеостазу, ферментної антиоксидантної системи та гемолітичної резистентності еритроцитів у здорових собак і пухлиноносіїв;

– з’ясувати роль імунофізіологічних тестів при виникненні у собак пухлин молочної залози та комплексного їх лікування.

Об’єкт дослідження – фізіолого-біохімічні та імунологічні процеси в організмі здорових собак і пухлиноносіїв молочної залози.

Предмет дослідження – біохімічний, імунологічний і морфологічний склад крові собак.

Методи дослідження: клінічні, імунологічні, фізіологічні, морфологічні, математичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше досліджено імунофізіологічний статус організму собак різного віку та їх зміни за розвитку та лікування пухлин молочної залози.

З’ясовано роль гуморальних і клітинних факторів імунного захисту та їх зв'язок з виникненням, розвитком і лікуванням пухлин молочної залози. Вперше охарактеризовано вплив автовакцин, виготовлених із гомогенних тканин хворих собак, на різні ланки імунофізіологічного статусу організму в процесі проведення післяопераційної імунотерапії. Показано, що протипухлинна та метастатична активність ґрунтується на індукції адаптивної відповіді собак і активації імунного захисту. Вперше розроблено та запропоновано новий спосіб виготовлення специфічної автовакцини на основі тканинних компонентів пухлин молочної залози собак, який підвищує захисний потенціал організму на різних етапах протипухлинного лікування.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розширюють та поглиблюють наявну інформацію щодо участі гуморальних і клітинних факторів імунітету в організмі здорових собак різного віку та їх змін при появі, розвитку та лікуванні пухлин молочної залози. Отримані дані можуть бути використані для підвищення протипухлинного захисту та профілактики рецидивів хвороби за умови своєчасного тотального видалення пухлини молочної залози хірургічним способом з наступним лікуванням автовакциною, згідно методики, описаної у “Деклараційному патенті” №98126325 від 01.12.1998.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто провів аналіз літератури за темою дисертації, виконав весь обсяг запланованих досліджень, самостійно провів статистичну обробку отриманих результатів, їх узагальнення та інтерпретацію й виклав у вигляді наукових положень дисертаційної роботи. Аналіз і обговорення отриманих даних, формулювання висновків і пропозиції за матеріалами дисертації проведено разом з науковим керівником.

Апробація результатів. Матеріали дисертації доповідались і схвалені на: науково – теоретичних конференціях і звітах факультету ветеринарної медицини ЛНАВМ імені С. З. Ґжицького (1998–2005), ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції «Проблем ветеринарної медицини» 8–9 жовтня 1998 р. м. Київ; Міжнародній науково-практичній конференції з проблем ветеринарної імунології та патології. – Мінськ, 2005 р., Міжнародних конференціях «Актуальні проблеми розвитку сучасної зооветеринарної науки» - Львів – 2001, 2002 рр.; наукових конференціях аспірантів і молодих вчених «Молоді вчені у вирішені проблем аграрної науки і практики» – Львів – 2003 – 2004 рр.

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи та отримані результати досліджень опубліковані в 14 наукових працях, із них 11 – у фахових виданнях, означених переліком ВАК України.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методики досліджень, результатів власних досліджень, їх обговорення, висновків, пропозицій виробництву і списку використаної літератури. Робота викладена на 144 сторінках комп’ютерного тексту, містить 13 таблиць, 10 рисунків. Список використаної літератури включає 386 джерел, з них українською та російською мовами – 158, іншими мовами – 228.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи досліджень. Дослідження проводилось на кафедрі хірургії та епізоотології ЛНУВМтаБТ імені С.З. Ґжицького протягом 2000–2005 років на собаках-аналогах різних порід, віком 5–10 років. Тварини поступали в клініку кафедри хірургії та дрібних домашніх тварин для надання профілактичної та лікувальної допомоги, зокрема – діагностики та терапії новоутворень молочної залози.

При постановці діагнозу враховували дані анамнезу та результати клінічних, гістологічних і імунофізіологічних досліджень. Для дослідження підібрали 3 групи собак-аналогів у кількості 25 голів. До першої групи увійшли клінічно здорові собаки – контроль (К), другу групу (п=8) дослідну (Д1) складали тварини з наявними пухлинами молочної залози, комплекс лікування яких проводили з використанням оперативного втручання з наступною терапією цитостатиком; до третьої групи (Д2) увійшли собаки-пухлиноносії післяоперативне лікування яких проводилось за допомогою розробленої у нашому університеті автовакцини.

Застосована в роботі схема оперативно-консервативних методів лікування собак ґрунтується на результатах попередніх досліджень (Завірюха В.І., Шекель В. Ф., 1998), а також включає власні розробки по використанню імунотерапії для підвищення імунобіохімічного статусу організму тварин і попередження рецидивів і метастазів.

Принцип лікування полягав у тому, що за 2–3 доби до оперативного втручання хворим собакам внутрішньом’язово вводили 5 мл 0,5% розчину новокаїну та підшкірно специфічну протипухлинну автовакцину в дозі 0,5 мл на кг маси тіла. Після цього тварину оперували. Після оперативного втручання, для запобігання рецидивів, собакам 2 групи вводили циклофосфан, внутрішньо-м’язово в дозі 20 мг на кг маси тіла. Курс лікування включав 5 ін’єкцій з інтервалом 3 доби впродовж 14 діб. Тваринам 3 групи двічі підшкірно вводили автовакцину в дозах 1–3 мл/гол. з інтервалом 14 діб. Впродовж досліджень проводили клінічне обстеження собак: вимірювали температуру тіла, частоту пульсу і дихання, враховуючи їх психічний стан та поведінку.

Матеріалом для вивчення імунофізіологічних показників були: плазма, сироватка та цільна кров, яку отримали з підшкірної вени передпліччя собаки.

В периферичній крові визначили вміст гемоглобіну, еритроцитів на еритрогемометрі, лейкоцитів і тромбоцитів в камері Горяєва, фагоцитарну активність лейкоцитів, загальну кількість субпопуляції Т- і В-лімфоцитів – методом розеткоутворення з використанням еритроцитів вівці за методикою, описаною Маслянком Р.П. та ін. (2001). Співвідношення Т-гелперів - індукторів до Т-супресторів – кілерів визначали за чутливістю клітин до теофіліну з наступною оцінкою розеткоутворення. Виділення лімфоцитів з крові для дослідження проводили в градієнті густини фікол–верографіну за Вонт А. (1968). Реакцію бласт--трансформації лімфоцитів (РБТЛ) на фітогемаглютинін (ФГА) визначали за Savel H. 1978. Гемолітичну резистентність еритроцитів оцінювали за Брильянт М.Д. і Воробйовим А. І. (1967), вміст малонового диальдигіду (МДА) за Ми-рон-чиком В.В. (1998), вміст дієнових кон’югатів (ДК) за Стальною І. Д. (1977), активність супероксиддисмутази (СОД) за Дубиніною Е.Е (1983), каталази – за Антоняк Г.Л. (1998).

У сироватці крові визначали вміст загального білка за методом Делекторської Л.М. (1971), співвідношення білкових фракцій – методом електрофорезу в агаровому гелі на ацетат – целюлозі, за Маслянком Р.П. (2001). Імуноглобуліни основних класів визначали за допомогою простої радіальної імунодифузії за Манчіні в модифікації Favey і Mc. Kalvey (1965) з використанням моноспецифічних антисироваток до окремих класів імуноглобулінів.

Функціональний стан згортаючої системи крові визначали за показниками коагулограми: тромбобластичну активність (П.Д Улітіна, Б.А. Кудряшов, 1958), показник часу рекальцифікації за методом Бергергофа, Рока (Д.П.Павловський, 1965); протробіновий індекс, активність гепарину за методом Сірясян Е. (1957), із заміною толуїдинового синього на протамін сульфат, кількість фібриногену та фібринолітичну активність – за методом Куна, Рочна (В.П.Балуда, 1962), активність рефракції згустку – за методом Токантиса (В.П.Балуда 1962).

Всі отримані результати оброблялися статистично з визначенням середніх величин вірогідного інтервалу при Р менше 0,05 та різниці між показниками за загальноприйнятими методиками.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження показали, що вміст загального білка та окремих його фракцій в сироватці крові собак за умов розвитку та лікування пухлин молочної залози зазнавав змін. Зокрема, у тварин обох дослідних груп порівняно з контролем, до оперативного втручання відмічається виражена диспротеїнемія з достовірним зниженням загального білка, альбумінів і гама-глобуліну, з одночасним зростанням альфа-глобулінів. (табл.1).

Таблиця 1

Білковий склад крові здорових собак і пухлиноносіїв (M±m)

Термін

дослідження | Загальний

білок, г/л | Альбу-

мі-ни, г/л | Глобуліни, г/л

б1 | б2 | в | г

До операції (Д1) | 46,2±2,9 | 26,1±1,3* | 6,3±0,4* | 5,1±0,3 | 5,7±0,3 | 3,0±0,1

Після операції (Д1) – 7 доба | 52,4±2,21 | 30,2±1,1 | 5,1±0,2 | 4,7±0,2 | 7,5±0,4 | 4,9±0,2

Після курсу

лікування (Д1) | 52,6±1,5 | 32,7±1,2 | 4,4±0,1 | 4,1±0,1 | 5,6±0,2 | 5,8±0,3

До операції (Д2) | 45,9±2,1 | 25,6±1,1 | 6,2±0,4 | 5,2±0,3 | 5,6±0,3 | 3,3±0,1

Після операції (Д2) – 7 доба | 52,6±2,2 | 29,7±1,2 | 5,4±0,3 | 4,9±0,2 | 7,6±0,3 | 5,0±0,3

Після курсу

лікування (Д2) | 53,2±2,1 | 31,9±1,2 | 4,7±0,2 | 4,3±0,2 | 5,5±0,2 | 6,8±0,3

Контроль,

(здо--рові собаки) | 52,8±1,2 | 32,2±1,1 | 4,1±0,1 | 4,6±0,3 | 5,8±0,3 | 6,1±0,3

Із таблиці видно, що вже на 7-му добу після хірургічного видалення пухлини молочної залози у собак обох груп зростає вміст загального білка і альбумінів і гемоглобіну, а після завершення курсу лікуванні їх рівень наближається до показників здорових тварин, або навіть перевищує їх (імуноглобуліни собак Д2 групи).

Аналіз співвідношення окремих класів імуноглобулінів показав, що у клінічно здорових собак вміст IgM є меншим, ніж IgG1 і IgG2 відповідно у 5 і 6 разів. Таке приблизно співвідношення спостерігається серед імуноглобулінів хворих тварин в процесі їх комплексного лікування (табл. 2).

Підвищений рівень імуноглобуліну у собак другої групи після повного курсу імунотерапії проявлявся явищами регресії пухлин, відсутністю метастазів і продовженням життя тварин.

При дослідженні С-реактивного білка (С-РБ) встановлено, що він у сироватці крові клінічно здорових собак відсутній, а у хворих змінюється залежно від способу лікування (табл. 3).

Таблиця 2

Концентрація імуноглобулінів у сироватці крові

здорових собак і пухлиноносіїв (М±m;n=16)

Імуно-глоб., мг/мл | Клініч-но здорові | До операції | Після операції | Після повного

курсу лікування

І | ІІ | І | ІІ | І | ІІ

IgG1 | 2,21±0,1 | 1,16±0,07 | 1,18±0,07 | 1,55±0,08 | 1,72±0,09 | 2,16±0,1 | 2,47±0,1

IgG2 | 3,42±0,1 | 2,67±0,1 | 2,71±0,1 | 2,73±0,1 | 2,96±0,1 | 3,27±0,2 | 3,51±0,2*

IgM | 0,46±0,02 | 0,33±0,01 | 0,34±0,01 | 0,44±0,01 | 0,45±0,01 | 0,42±0,02 | 0,42±0,02

Таблиця 3

С-реактивний білок у сироватці крові здорових собак

і пухлиноносіїв (M±m)

Група

тварин | Термін

дослідження | Процент пози-тивних реакцій | Середній по-казник С-РБ | Вираженість

реакцій на С-РБ

І | До операції

Після операції

Після лікування | 67,6±2,3

72,4±2,9

56,5±3,5 | 1,12±0,1

1,27±0,1

1,05±0,1 | збільшилась

ІІ | До операції

Після операції

Після лікування | 68,6±3,2

66,4±3,8

52,4±2,1 | 1,13±0,1

1,12±0,1

0,94±0,1 | зменшилась

ІІІ | Контроль

Здорові тварини | 0

0––––

Аналіз таблиці показує, що у собак другої групи з вираженим захисним протипухлинним ефектом відмічається зниження С–РБ у сироватці крові але вилікувані тварини не повністю позбавлені цього білка. Можна припускати, що наявність С–РБ є ознакою токсичного впливу зруйнованої пухлиною тканини.

Протипухлинний захист організму проявляється також у вигляді складних клітинних реакцій, характер який залежить від виду неоплазми та здійснюється різними імунокомпетентними клітинами, зокрема лімфоцитами.

Досліджуючи популяційний склад лімфоцитів собак пухлиноносіїв ми відмітили, що вже при поступленні тварин до клініки, ще перед хірургічним втручанням, відбувається зниження загального вмісту Т-клітин (СД3+) за рахунок Т-гелперів-індукторів (СД4+) і Т– супресорів-кілерів (СД8+) порівняно з контролем.

Із табл. 4 видно, що у хворих собак, загальна кількість Т-лімфоцитів знизилась після операції на 16,9% (Р<0,01) , після лікування цитостатиком на 13,6% (Р<0,05), а після імунотерапії лише на 11,1% і наблизилася до показників здорових тварин. Подібна динаміка відмічена з боку числа Т-гелперів–індукторів.

Таблиця 4

Субпопуляційний склад лімфоцитів здорових собак

і пухлиноносіїв (M±m)

Показники | Здорові собаки | До

операції | Після

операції

(14 доба) | Після

хіміоте--рапії | Після

імуноте-рапії

СD3+Т-лімфоцити, % | 5,6±2,1 | 41,8±2,1* | 39,4±1,1* | 41,6±1,2* | 49,8±1,6

СD4+Т-гелпер-індуктор, % | 36,8±1,4 | 30,2±1,4* | 29,2±1,1* | 30,1±1,1* | 35,4±1,2

СD8+Т-супре-

сор-кілер, % | 29,4±1,1 | 29,8±1,1 | 28,2±1,1 | 29,6±1,1 | 24,2±1,1**

СD19+ В-

лімфоцити, % | 0,8±0,6 | 8,9± 0,3 | 10,2±0,5 | 10,6±0,6 | 14,4±0,6**

Регуляторний

індекс СD4+/СD8+ | 1,25±0,1 | 1,0±0,1 | 1,04±0,1 | 1,0±0,1 | 1,35±0,1

Динаміка СД8+ Т-супресорів-кілерів і СД19–В-лімфоцитів була дещо іншою. Якщо в перші три етапи досліджень кількість цитотоксичних клітин (СД8+) і антитілоутворюючих (СД19 В-лімфоцитів) істотно не змінилась по відношенню до нормальних величин, то застосуванням собакам у після операційний період імунотерапії забезпечило зменшення в крові числа Т-супресорів на 12,2% (Р<0,05) і збільшення В- лімфоцитів на 13,3% (Р<0,01). Відповідно змінювався імунорегуляторний індекс (Тг/Тс), який досягав верхньої межі фізіологічної норми.

Якщо тести резеткоутворення дозволяють судити про кількісні зміни популяцій Т- і В-лімфоцитів і їх співвідношення у крові, то бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) характеризують їх функціональну активність. Нами встановлено, що максимальна кількість бластів у культурі лімфоцитів усіх собак виявляється через 3–4 доби після внесеного мітогену (ФГА).

Результати показали, що зміни в лімфоцитах собак під впливом ФГА не залежали від наявності та локалізації пухлини в молочній залозі. У собак з пухлинами молочної залози до хірургічного втручання РБТЛ коливалися в межах 8–13%, в середньому 10,2±1,2% при нормі (клінічно здорові тварини) – 53,4±2,7% (табл. 5).

Таблиця 5

Реакція бластної трансформації лімфоцитів крові

здорових собак та пухлиноносіїв (M±m)

Показники | Здорові

(n=8) | До

операції | Після

операції,

14 доба | Після

хіміоте--рапії | Після

імуноте-рапії

Лімфоцити, Г/л | 2,6±0,1 | 2,9±0,2 | 2,2±0,2 | 2,3±0,2 | 2,6±0,2

Бласти, % | 53,4±2,7 | 10,2±1,2 | 40,4±2,7** | 31,6±2,2* | 38,8±2,6*

Клітин на

100 бластних | Мітози | 19,8±0,8 | 1,8±0,1 | 2,4±0,2 | 2,1±0,2 | 3,2±0,2*

Еозино--

філи | 1,1±0,1 | 1,2±0,1 | 1,1±0,1 | 1,6±0,1 | 0,5±0,1

Із табл. 5 видно, що у хворих собак до операції кількість бластів знизилась більше ніж у 5 разів і лише після проведеної операції та комплексного лікування число бластних клітин зросло, особливо після імунотерапії. Це свідчить про те, що імунотерапія може забезпечувати підвищений протипухлинний лікувальний ефект.

Інформативним показником протипухлинного захисту тварин є фагоцитарна активність лейкоцитів крові. Результати наших досліджень показали, що ця неспецифічна реакція клітинного імунітету, яку можна оцінювати за різними тестами, піддається значним змінам і знаходиться в залежності з пухлинним ростом і способом лікування їх носіїв (табл. 6).

Результати досліджень показали, що у хворих собак до хірургічного втручання фагоцитарна активність нейтрофільних гранулоцитів крові по відношенню до золотистого стафілококу була у 4–5 разів нижчою, ніж у клінічно здорових тварин – аналогів. На 14-ту добу після оперативного видалення пухлин, вона ще більше знизилась у собак обох груп, а після повного курсу лікування зросла на неоднаковий рівень. Якщо у собак другої групи (після лікування цитостатиком ) активність фагоцитозу зросла на 17,4%, то у тварин третьої групи – більше ніж у 2 рази. Одночасно фагоцитарний індекс у собак-пухлиноносіїв після лікування був у 2–3 рази нижчим, ніж у здорових тварин.

Таблиця 6

Фагоцитарна активність лейкоцитів крові здорових собак

і пухлиноносіїв (M±m)

Група

Тварин | Фагоцитарна активність | Фагоцитарний індекс

При

поступленні | Після

операції | Після

лікування | При

Поступ--ленні | Після

операції | Після

лікування

Здорові | 57,2±0,3–– | 7,32±0,3––

ІІ* | 41,8±0,1* | 41,2±0,1 | 42,2±0,2 | 1,67±0,1 | 1,24±0,1 | 2,16±0,1

ІІІ* | 41,7±0,1* | 41,6±0,1 | 52,3±0,2* | 1,76±0,1 | 1,51±0,1 | 3,58±0,1*

ІІ* – післяопераційне лікування тварин цитостатиком

ІІІ* – післяопераційне лікування тварин аутовакциними

Отже, собаки третьої групи вигідно відрізнялися від тварин другої групи за обома параметрами цього важливого фактору неспецифічного протипухлинного захисту.

При дослідженні морфологічного складу крові встановлено, що кількість еритроцитів у хворих собак обох груп в процесі розвитку та лікування порівняно з клінічно здоровими тваринами вірогідно зменшується на 35,5% і 35,3% відповідно (Р < 0,01). У собак третьої групи у відповідь на імунотерапію, кількість еритроцитів у крові зростала інтенсивніше і наблизилась до показників здорових тварин ( табл. 7).

Із даних табл. 7 видно, що в організмі хворих собак розвивається прелатентний стан анемії, оскільки вміст еритроцитів і гемоглобіну у їх крові в різні періоди лікування достовірно знижуються.

Загальне число лейкоцитів у крові хворих собак до хірургічного втручання зростає майже у 2 рази порівняно з здоровими тваринами. Після хірургічного видалення пухлин у собак обох дослідних груп кількість лейкоцитів знизилась майже на однакову величину, проте не була вірогідною. Зниження кількості лейкоцитів у крові собак обох дослідних груп продовжувалось і протягом післяоперативного лікування, проте не опускалось до величини здорових тварин.

Стійкий лейкоцитоз, який розвивається у собак у відповідь на наявну пухлину молочної залози та в подальші періоди лікування тварин, свідчить про виникнення істинного, а не перерозподільного його походження. Це підтверджується також нашими даними про підвищену функціональну активність окремих форм лейкоцитів в процесі лікування пухлин.

Що стосується тромбоцитів, то ці формені елементи крові виконують важливу роль у системі збереження гемостазу. Результати наших дослідів показують, що тромбоцити у крові собак-пухлиноносіїв молочної залози в процесі їх лікування істотних змін не зазнають, їх кількість коливається у межах фізіологічних норм.

Таблиця 7

Морфологічний склад крові здорових собак і пухлиноносіїв (M=m)

Група

тварин | Еритроцити,

Т/л | Гемоглобін,

Г/л | Лейкоцити,

Г/л | Тромбоцити,

Т/л

А*

І Б*

В* | 4,5±0,2*

4,7±0,2

4,8±0,2 | 107,4±5,1*

116,2±5,3

121,1±5,3 | 18,6±1,2*

17,1±1,1*

16,3±1,1* | 421,6±18,0*

416,4±17,2

402,6±16,8

А

ІІ Б

В | 4,6±0,2*

4,8±0,2

5,9±0,2* | 107,4±5,1*

116,3±5,1

138,4±6,1 | 18,6±1,2*

17,3±1,2*

14,1±1,8* | 428,1±17,6

418,2±16,9

404,2±16,2

ІІІ А Здорові

Норма | 6,1±0,2

(5,5–8,5) | 144,6±6,6

(120–170,0) | 9,5±0,5

(8,5–10,5) | 378,4±24,2

(250–550)

А* – При поступленні до ветеринарної клініки

Б* – Після оперативного втручання і лікування цитостатиками

В* – Після оперативного видалення пухлини і лікування аутовакциною

При дослідженні функціонального стану згортаючої системи крові ми відмітили різний характер змін коагулограми у собак – пухлиноносіїв в процесі лікування (табл. 8).

Таблиця 8

Коагулограма крові здорових собак і пухлиноносіїв (M±m)

Група

Тварин | Фібриноліз,

% | Час рекаль-

цифікації, с | Протромбі-

новий

індекс, % | Толерант-

нісь до

гепарину, % | Гепаринова

активність,

% | Фібриноген,

мг/%

А*

І Б*

В* | 6±0,4**

9±0,5

10±0,6 | 86±3,4*

88±4,2*

91±4,7 | 76±2,7

74±2,9

74±2,7 | 72±6,2

75±6,3

72±6,1 | 136±5,2**

136±5,1**

146±5,8 | 362±12,4*

254±14,1

236±13,5

А

ІІ Б

В | 6±0,4*

9±0,5

11±0,5 | 86±3,4*

88±4,2*

97±4,1 | 76±2,7

74±2,9

73±2,2 | 72±6,2

75±6,3

66±4,1 | 136±5,2**

136±5,1**

157±3,1* | 362±12,4*254±14,1

262±12,1

ІІІ А

Здорові | 12±1,2 | 104±2,8 | 73±3,0 | 62±4,3 | 167±3,8 | 266±8,9

А* – при поступленні до ветеринарної клініки хворі та здорові собаки

Б* – після оперативного видалення пухлини і лікування цитостатиком

В* – після оперативного видалення пухлини та імунотерапії

Аналіз таблиці показує, що у хворих собак до хірургічного втручання рівень фібринолізу був у два рази нижчий, ніж у здорових тварин, а після комплексного лікування він поступово зростав, але не наблизився до контрольних величин. Подібні зміни відмічено при оцінці часу рекальцифікації та гепаринової активності, хоча відповідного їх зниження у хворих собак обох груп достовірних змін не відмічено.

Особливої уваги заслуговує аналіз змін фібриногену. Із табл. 8 видно, що значне зростання вмісту фібриногену в крові хворих собак відбувається лише до хірургічного втручання. В процесі післяопераційного лікування рівень цього білка зменшився до величин, які є характерними для здорових тварин.

Останнім часом важливого значення надається явищам відкладання фібрину, що утворюється з фібриногену крові, навколо циркулюючих пухлинних клітин. Вчені припускають, що він може відкладатися на злоякісно трансформованих клітинах, маскуючи їх поверхневі антигени, захищаючи ці клітини від атаки імунної системи організму. Звідси можна зробити висновок, що фібрин активує ріст новоутворень та процеси приживлення пухлинних клітин, які дають початок новим бластомним вузлам.

При дослідженні інших показників коагулограми суттєвих змін у крові хворих собак в процесі їх комплексного лікування порівняно із здоровими тваринами виявити нам не вдалося.

Однією з умов нормального перебігу фізіологічних процесів в організмі всіх видів тварин, в тому числі собак, є регуляторний стан перебігу їх адаптації на клітинному та мембранному рівнях. Від інтенсивності метаболічної модифікації мембран, їх здатності до швидкої перебудови при різних патологіях у значній мірі залежить функціональний стан органів і систем організму.

Таблиця 9

Активність ферментів АОЗ і вміст продуктів ПОЛ у крові здорових собак і пухлиноносіїв (M±m)

Показники | Здорові

собаки | Х в о р і

До операції | Після

операції | Після

хіміотерапії | Після

імунотерапії

Дієнові ко-н’ю-гати ДК, мкмоль/л | 62,7±2,4 | 81,6±2,4* | 87,8±5,1* | 75,2±4,6 | 63,4±3,2

МДА, мкмоль/л | 93,1±3,1 | 182,3±6,2** | 154,2±4,6** | 121,7±3,5** | 142,0±5,1

СОД, ум.один.мг. | 22,17±1,2 | 13,8±0,7* | 15,1±0,3* | 15,6±0,7* | 21,4±1,1

Каталаза, у.од./хв.мг.б | 382±21,1 | 269±16,7* | 292±18,3* | 298±18,2* | 346±20,2

Результати наших досліджень показали (табл. 9), що в організмі собак –пухлиноносіїв до хірургічного втручання порівняно із здоровими тваринами зростав вміст продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і достовірно знижувалась активність ферментів антиоксидантного захисту (АОЗ). Так, активність СОД знизилася на 37,4±1,8 (Р<0,01), а каталази на 29,6±1,7 (Р<0,01) відсотків. Після комплексного лікування із застосуванням аутовакцини вміст продуктів ПОЛ у крові собак знижувався значно більше, ніж у тварин, лікування яких завершувалось цитостатиком. Щодо СОД і каталази, то їх активність у крові собак другої дослідної груп також вірогідно змінилась по відношенню аналогів лікування, які завершували хіміотерапію.

Згідно з сучасними даними, які узгоджуються з нашими результатами, системна хіміотерапія пухлин цитостатиками повинна бути обмеженою і науково обґрунтованою, оскільки найчастіше уражаються швидко проліферуючі клітини організму. За даними багатьох авторів вимушене призупинення введення препаратів часто веде до відновлення росту пухлин, що може бути причиною загибелі їх носіїв. В цьому відношенні імунотерапія показує шлях поліпшення результатів післяоперативного лікування хворих на рак молочної залози тварин, тому подальші дослідження імунофізіологічного статусу на інших, в тому числі, модельних тваринах, залишається актуальним завданням сучасної ветеринарної онкології.

ВИСНОВКИ

У дисертації на основі проведених комплексних досліджень розкрито нові аспекти імунофізіологічного стану організму здорових собак і носіїв злоякісних пухлин молочних залоз.

Встановлено, що основні показники протипухлинного захисту у хворих собак, порівняно із здоровими тваринами-аналогами за віком і породою, є зниженими. Для отримання стійкого клінічного видужання собак-пухлиноносіїв і для посилення імунного захисту їх організму слід поєднувати оперативне видалення пухлини з імунотерапією у післяопераційний період.

1. У собак-пухлиноносіїв, ще до хірургічного втручання, вірогідно знижується вміст загального білка в сироватці крові на 12% (Р<0,05), альбумінів на 19% (Р<0,01), гама-глобулінів на 52,0% (Р<0,01), за рахунок зростання альфа1- і альфа2- і бета-глобулінових фракцій. У всіх хворих собак в сироватці крові виявлено високий відсоток С-реактивного білка (52,4–72,4%), тоді як у клінічно здорових тварин цей білок був відсутній.

2. У крові хворих собак до хірургічного втручання достовірно знижується рівень клітинних факторів імунітету, зокрема, загальна кількість Т-лімфоцитів (СD3+) – на 13,2% (Р<0,05), Т-гелперів-індукторів (СD4+) – на 12,1% (Р<0,05) і В-лімфоцитів (СD19+) – на 4%, при незмінності числа Т-супресорів-кілерів (СD8+). У хворих собак-носіїв пухлин молочних залоз знижується у 5 разів кількість бластних клітин у відповідь на фітогемаглютинін (ФГА), число мітозів – в 11 разів, фагоцитарна активність лейкоцитів на 22,4% (Р<0,01).

3. У крові хворих собак до хірургічного видалення пухлин молочної залози вірогідно знижується рівень клітинних факторів природного імунітету, зокрема фагоциторна активність лейкоцитів на 27,4% (Р<0,01), а фагоцитарний індекс – у 4–5 разів. Одночасно достовірно зменшується кількість еритроцитів, гемоглобіну та активність каталази і супероксиддисмутази (СОД). Натомість вміст дієнових кон’югатів (ДК) і малонового діальдегіду (МДА) достовірно зростає відповідно на 24,3 і 26,7% (Р<0,01).

4. Після хірургічного видалення пухлин молочної залози в організмі хворих собак посилюється імуносупресивний стан, який супроводжується подальшим вірогідним зниженням у крові загальної кількості лейкоцитів на 48,2±2,6% (Р<0,001), лімфоцитів на 21,2±1,1% (Р<0,01), популяцій СD3+, СD4+ і СD8+ Т-клітин відповідно на 12,6±0,3%; 16,7±0,4% і 10,2±0,2% (Р<0,05), рівня фібриногену на 32,3±1,6% (Р<0,01), ферментів антиоксидантної системи (каталази і СОД), без суттєвих змін числа СD19+-В-лімфоцитів. Вміст основних продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) – ДК при цьому продовжує зростати на 6,2±0,2 мкмоль/л.

5. В процесі післяхірургічного лікування цитостатичним препаратом циклофосфаном порівняно з імунотерапією більшість імунологічних показників зберігається на пониженому рівні. Зокрема, вміст альфа1 і гама-глобулінів знижений відповідно на 6,3±0,2% (Р<0,05) і 14,7±0,7% (Р<0,01), СD3+, СD4+ і СD19+-лімфоцитів відповідно на 16,7±0,7, 14,1±0,5 і 9,6±0,2% (Р<0,05). Кількість СD8+-Т-супресорів та С-реактивного білка при цьому зросли відповідно на 18,1±0,7 і 9,8±0,2% (Р<0,01).

6. При застосуванні імунотерапії впродовж комплексного лікування переважна більшість показників імунофізіологічного стану собак наближається до величин характерних для клінічно здорових тварин. Так, до факторів імунного захисту, які перевищують контрольні показники здорових собак-аналогів відносяться: вміст загального білка в сироватці крові, альфа1-глобуліни, число СD19+В-лімфоцитів, імунорегуляторний індекс (відношення СD4+/СD8+). Решта досліджуваних показників, після завершення курсу комплексного лікування собак, наближалися до контрольних величин.

7. Отримані результати свідчать про те, що застосування специфічної автовакцини в якості імунотерапії собак-пухлиноносіїв молочної залози підвищує захисний потенціал організму, зменшує кількість метастазів і рецидивів хво-роби.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Визначення вмісту імуноглобулінів класу G1 Т-гелперних і Т-цитотоксичних лімфоцитів, активності фагоцитарної та антиоксидантної системи в крові собак може бути використано для діагностики пухлин молочної залози.

2. Для підвищення протипухлинного захисту та профілактики рецидивів хвороби, отримання стійкого клінічного видужання собак при пухлинах молочної залози, рекомендується комплексне лікування, яке включає оперативне видалення бластоми та імунотерапію аутовакциною за методикою описаною нами у «Деклараційному патенті №98126325 від 01.12.1998р.».

3. Теоретичні та клінічні розробки результатів дисертації рекомендується включити у навчальні посібники та програми з підготовки фахівців ветеринарної медицини та вивчення курсу «Ветеринарна імунологія та онкологія».

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Завірюха В.І. Папіломатоз тварин, ефективність консервативно-оперативних методів лікування / В.І.Завірюха, В.Ф.Шекель // Актуал. пробл. мед., біол., вет. і с.-г-ва. Ї 1998. Ї Т. 4. Ї С. 276Ї277.

Дисертант брав участь у проведенні досліду, визначенні гемограми, аналізі отриманих даних результатів і підготовці статті до друку.

2. Онкологічні хвороби тварин і методи їх лікування / [В.І.Завірюха, В.І.Саєвич, В.Ф.Шекель та ін.] // Наук. вісн. ЛДАВМ. Ї 1999. Ї Вип. ІІ. Ї С. 56Ї62.

Дисертант брав участь у проведенні досліду, визначенні клінічних і гематологічних показників, аналізі результатів і написанні статті.

3. Маслянко Р.П. Медіатори системи імунітету тварин / Р.П.Маслянко, Т.С.Матвіїшин, В.Ф.Шекель // Наук. вісн. ЛНАВМ. Ї 2005. Ї Т. 7 (27). Ї С. 142Ї150.

Дисертант проводив аналіз експериментальних досліджень та узагальненні даних, брав участь в обґрунтуванні матеріалів, підготовці їх до друку.

4. Маслянко Р.П. Гемолітична резистентність еритроцитів собак при розвитку та лікуванні пухлин молочної залози / Р.П.Маслянко, В.Ф.Шекель // Сільський господар. Ї 2006. Ї № 9Ї10. Ї С. 18Ї19.

Дисертант організував дослід, брав участь у дослідженні крові, аналізі результатів і написанні статті.

5. Маслянко Р.П. Сучасні аспекти імунології неопластичних процесів у тварин / Р.П.Маслянко, В.Ф.Шекель // Наук. вісн. ЛНАВМ. Ї 2005. Ї Т. 7, Ч. 1. Ї С. 171Ї177.

Дисертант проводив аналіз літературних і експериментальних даних, брав участь в обґрунтуванні положень статті, підготовці матеріалів до друку.

6. Маслянко Р.П. Взаємодія імунокомпетентних клітин з клітинами пухлин / Р.П.Маслянко, В.Ф.Шекель // Біологія тварин. Ї 2005. Ї Т. 7 (2). Ї С. 56Ї61.

7. Мисак А.Р. Морфологія окремих пухлин великої рогатої худоби і собак / А.Р.Мисак, В.Ф.Шекель, В.І.Завірюха // Наук. вісн. ЛНАВМ. Ї 2004. Ї Т. 6. Ї С. 56Ї 60.

Дисертант брав участь у проведенні дослідів, визначенні гемограми, аналізі результатів і підготовці матеріалів до друку.

8. Шекель В.Ф. Особливості антиоксидантного захисту в організмі собак при онкології молочної залози / В.Ф.Шекель // Сільськ. господар. Ї 2006. Ї № 9Ї10. Ї С. 18Ї19.

9. Шекель В.Ф. Пухлини собак і принципи їх лікування / В.Ф.Шекель, В.І.Завірюха // Проблеми вет. обслугов. дрібних тварин : зб. матеріалів наук. конференції. Ї К., 1998. Ї С. 39Ї42.

Дисертант брав участь у проведенні дослідів, визначенні гемограми та показників імунітету, узагальнив дані та підготовив статтю до друку.

10. Шекель В.Ф. Імунотерапія в системі лікування тварин хворих пухлинами / В.Ф.Шекель, В.І.Завірюха, А.Р.Мисак // Наук. вісн. ЛНАВМ. Ї 2004. Ї Т. 6 (3). Ї С. 144Ї149.

Дисертант брав участь у проведенні досліду, визначенні показників гемогами та імунітету, аналізі результатів і написанні статті.

11. Шекель В.Ф. Схема загальних оперативно-консер-вативних заходів при лікуванні собак з пухлинами / В.Ф.Шекель, В.І.Завірюха // Пробл. вет. обслуг. дрібних домаш. тварин : мат. Міжнарод. науков.-практичн. конф. Ї К., 1998. Ї С. 36Ї39.

12. Шекель В.Ф. Застосування імуно- та хіміотерапії при лікуванні собак із новоутвореннями / В.Ф.Шекель, В.І.Завірюха, А.Р.Мисак А.Р. // Вісник Дніпропетровського держ. аграр. у-ту. Ї 2006. Ї № 1. Ї С. 53Ї55.

Дисертант брав участь у проведенні досліду, визначенні імунокомпетентних і фізіологічних показників, аналізі отриманих результатів і підготовці статті до друку.

13. Шекель В.Ф. Роль иммунных реакций при онкологических заболеваниях / В.Ф.Шекель, Р.П.Маслянко // Матер. конф. по иммунологии. Ї Минск, 2005. Ї С. 42Ї48.

Дисертант провів аналіз літератури і власних досліджень, узагальнив дані та підготовив матеріали до друку.

14. Шекель В.Ф. Застосування імуно- та хіміотерапії при лікуванні собак з новоутвореннями / В.Ф.Шекель, В.І.Завірюха, А.Р.Мисак // Вісник Сумського наукового аграрного університету. Серія «Ветеринарна медицина». Ї Вип. 1Ї2. Ї 2006. Ї С. 234Ї235.

Дисертант брав участь у проведенні досліджень гематологічних і імунологічних показників, аналізі результатів і написанні статті.

Шекель В.Ф. Імунофізіологічні фактори протипухлинного захисту молочної залози собак. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин. – Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З.Ґжицького. – Львів, 2008.

В дисертації наведені дані про зміни клітинної та гуморальної ланки природного та набутого імунітету, гематологічних показників, активність антиоксидантного захисту в організмі здорових собак і пухлиноносіїв молочної залози з врахуванням комплексного лікування. Встановлено, що у собак-пухлино-но-сіїв, ще до хірургічного втручання достовірно знижується вміст загального білку в сироватці крові, альбумінів, імуноглобулінів і зростає концентрація альфа-, бета-глобулінів, та С-реактивного білку, тоді як у клінічно здорових собак цей білок відсутній.

У крові собак-пухлиноносіїв достовірно знижується також рівень клітинних факторів природного та набутого захисту, зокрема фагоцитарна активність лейкоцитів, кількість і функціональна активність Т- і В-лімфоцитів при незмінності числа Т-супресорів – кілерів. Одночасно достовірно зменшується кількість еритроцитів, гемоглобіну, активність каталази та супероксиддисмутази. Нато-мість вміст дієнових кон’югатів і малонового діальдегіду достовірно зростає.

З’ясовано, імунофізіологічний вплив розробленої схеми імунотерапії на стан факторів протипухлинного захисту собак. Відзначено, що аутовакцина, виготовлена з гомогенних тканин пухлини молочної залози, виявляла виражений стимулюючий ефект на рівень гуморальних та клітинних механізмів імунітету в організмі собак, що забезпечило прискорення термінів одужання.

З’ясовано позитивну дію імунотерапії на активність антиоксидантної системи захисту, стан гомеостазу та гемолітичної резистентності еритроцитів.

Ключові слова: фізіологія, імунологія, собаки, молочна залоза, пухлини, аутовакцини, імунотерапія.

Шекель В.Ф. Иммунологические факторы противоопухолевой защиты молочной железы у собак. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С.З.Гжицкого. – Львов, 2008.

В диссертации приведены данные об изменениях клеточных и гуморальных факторов естественного и приобретенного иммунитета, гематологических показателей и активность антиоксидантной системы защиты в организме здоровых собак и носителей опухоли молочной железы с учетом комплексного лечения. Установлено, что наличие опухолей в молочной железе собак сопровождается достоверным снижением содержания общего белка в сыворотке крови, альбуминов и иммуноглобулинов, увеличивается концентрация альфа-, бета-глобулинов и С-реактивность белка. У клинически здоровых собак С-реактивный белок отсутствует.

В крови собак-носителей опухоли молочной железы достоверно снижается также уровень клеточных факторов естественной резистентности и приобретенного иммунитета, в частности фагоцитарная активность лейкоцитов, количество и функциональная активность Т - и В-лимфоцитов, при неизменности числа Т-супрессоров – киллеров. Одновременно уменьшается в крови больных собак количество эритроцитов, гемоглобина, активность каталазы и супероксиддисмутазы, а содержание диеновых конъюгатов и малонового диальдегида достоверно возрастает.

При комплексном лечении собак-носителей опухоли молочной железы возрастает коагуляционная способность периферической крови, которая характеризируется ее гепаринингибирующей активностью, повышением свертывающей системы и снижением антикоагуляционного действия. Эти изменения могут способствовать развитию благоприятного фона для процессов малигнизации клеток и дальнейшего развития прогрессии опухоли, поскольку они влияют на пролиферацию и дифференциацию клеток, а также на отложение фибрина крови вокруг циркулирующих опухолевых клеток, защищая их таким образом от иммунной атаки организма.

Активация антикоагуляционной функции повышает резистентность организма больных собак процессами злокачественной трансформации клеток, роста опухолевых узлов, приживлению циркулирующих опухолевых клеток.

Анализ проблемы взаимоотношений опухолевого процесса и системы иммунофизиологического состояния организма собак показал, что появление бластомы сопровождается выраженными изменениями в крови клеточных и гуморальных факторов защиты. Эти изменения оказывают влияние не только на развитие опухоли, но и на процесс комплексного лечения его носителя. При лечении собак-носителей опухоли молочной железы наилучший эффект получен при использовании иммунотерапии.

Разработан способ приготовления аутовакцины и ее применение при комплексном лечении больных собак, включая хирургическое удаление бластом и послеоперационную иммунотерапию для предотвращения рецедивов и метастазов.

Ключевые слова: физиология, иммунология, собаки, молочная железа, опухоли, аутовакцины, иммунотерапия.

Shekel V.F. Immune and physiological factors of antitumor protection of dogs mammary