КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ТУКАЛЕНКО Євген Валерійович

УДК .513:612.014.48

УМОВНОРЕФЛЕКТОРНА ІНСТРУМЕНТАЛЬНА

ПОВЕДІНКА ЩУРІВ ЗА ВПЛИВУ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ

03.00.13 – фізіологія людини та тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в | Київському національному університеті імені Тараса Шевченка та Інституті експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор

Макарчук Микола Юхимович

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедрою фізіології людини та тварин біологічного факультету

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Нурищенко Наталія Євгенівна

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

старший науковий співробітник сектора біофізики Науково-дослідного інституту імені академіка Петра Богача

доктор біологічних наук, професор

Кальниш Валентин Володимирович

Українська військово-медична академія,

професор кафедри авіаційної, морської медицини та психофізіології

Захист дисертації відбудеться “23” квітня 2008 року о 14 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215)

Поштова адреса: 01033, Київ – 33 , вул. Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий “20” березня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Цимбалюк О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження фізіологічних ефектів впливу іонізуючого опромінення на поведінку та функціонування центральної нервової системи (ЦНС) проводяться понад сторіччя, проте дискусія щодо радіочутливості нервової системи триває й дотепер. Особливо яскраво протилежні точки зору проявляються у оцінках значущості радіаційного чинника у нейрологічному аспекті медичних наслідків аварії на Чорнобильській АЕС. Від перших експериментів І.Р. Тарханова у 1896 р. до сьогодні проведено велику кількість досліджень на тваринах та спостережень за людьми, які зазнали впливу іонізуючого опромінення. Встановлено, що летальні дози радіації здебільшого пригнічують функціонування різних систем організму, у тому числі ЦНС. Переважна більшість досліджень впливу радіації на вищу нервову діяльність (ВНД) та поведінку стосується саме великих доз та найближчих ефектів опромінення. В той же час поведінкові та церебральні ефекти впливу іонізуючої радіації у нелетальному діапазоні доз залишаються вивченими недостатньо. Як правило, дослідники визначали окремі дозо-часові зрізи постпроменевих нейрофізіологічних та поведінкових змін впродовж декількох годин або діб, водночас більш показовими уявляються результати тривалого вивчення зрушень показників після опромінення. У фізіологічних та радіобіологічних дослідженнях встановлення залежності доза-ефект часто має вирішальне значення для оцінки впливу будь-якого чинника (зокрема, іонізуючого випромінення) на живу систему. При цьому спроби визначення дозової залежності впливу іонізуючої радіації на організм людини за наслідками радіаційних інцидентів або атомних бомбардувань зазвичай мають великі труднощі у реконструкції отриманої дози опромінення. Виходячи з цього, для оцінки наслідків впливу іонізуючої радіації на ВНД слід надати перевагу дослідженням на тваринах. Однак аналіз існуючих на теперішній час строкатих та досить суперечних за своїми результатами експериментальних досліджень, може лише констатувати невивченість феноменології залежності доза-ефект постпроменевих змін поведінки та функціонування ЦНС.

Широке використання атомної енергії, навіть за умов суворого дотримання правил техніки безпеки, завжди супроводжується ризиком опромінення персоналу та населення. Нелетальні дози радіації можуть бути отримані внаслідок аварійних інцидентів на реакторах атомних електростанцій та інших ядерних установках, за використання джерел іонізуючого випромінювання у медицині та промисловості, а також під час космічних польотів, за застосування у військових конфліктах ядерних боєприпасів тощо. Не виключено, що кількість ліквідаторів наслідків аварії на Чорнобильській АЕС, які зазнали впливу іонізуючого опромінення у малих дозах, може збільшитися у процесі зведення нової захисної споруди, що має перетворити об’єкт “Укриття” на екологічно безпечну систему. Необхідність визначення впливу іонізуючої радіації у нелетальних дозах на вищу нервову діяльність та розробка підходів до корекції його наслідків обумовлює актуальність даної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках науково-дослідних робіт Інституту експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України “Вивчення значення оксидантно-стресового компоненту впливу радіації на стан центральної нервової системи” (№ держреєстрації 0100U002770), “Дослідження оксидантних механізмів комбінованого впливу іонізуючої та неіонізуючої радіації на стан вищої нервової діяльності тварин” (№ держреєстрації 0103U001412) та Київського національного університету імені Тараса Шевченка “Дослідити системні, клітинні та молекулярні механізми діяльності нервової системи, внутрішніх органів та рухового апарату організму людини та тварин в нормі та патології“ (№ держреєстрації 0106U005751).

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було вивчити закономірності змін інструментальної умовнорефлекторної діяльності щурів впродовж тривалого часу після впливу іонізуючої радіації у нелетальних дозах та обґрунтувати можливість і напрямки корекції постпроменевих поведінкових ефектів.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Встановити залежність доза-ефект змін умовнорефлекторної інструментальної діяльності щурів впродовж двох місяців після впливу іонізуючої радіації у широкому діапазоні нелетальних доз.

2. Дослідити умовнорефлекторним методом можливість корекції антиоксидантними засобами штучного або природного походження змін вищої нервової діяльності щурів після впливу іонізуючої радіації у дозах 0,05, 0,5 та 5,0 Гр.

3. Оцінити значущість внеску оксидантного компоненту дії іонізуючої радіації у нелетальних дозах на вищу нервову діяльність за результатами досліджень застосування антиоксидантних засобів штучного та природного походження для попередження постпроменевих змін умовнорефлекторної поведінки.

Об'єкт дослідження – поведінка та вища нервова діяльність за впливу іонізуючої радіації у нелетальних дозах.

Предмет дослідження – умовнорефлекторна інструментальна діяльність та спонтанна поведінка щурів після одноразового тотального впливу г-опромінення у нелетальних дозах, оксидантний компонент впливу низькоінтенсивної іонізуючої радіації на вищу нервову діяльність щурів.

Методи дослідження – поведінкові, біохімічний, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено закономірності змін умовнорефлекторної поведінки щурів після впливу іонізуючої радіації за нової постановки задачі та вдосконаленого методологічного підходу. Визначено та формально описано нелінійну залежність доза-ефект змін показників інструментальної діяльності з позитивним та негативним підкріпленням, які оцінювалися впродовж двох місяців після радіаційного впливу у широкому діапазоні нелетальних доз. Показано провідну роль оксидантного компоненту впливу низькоінтенсивної іонізуючої радіації на вищу нервову діяльність щурів.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дослідження розширюють існуючі уявлення про вплив низькоінтенсивного іонізуючого опромінення на вищу нервову діяльність та визначають перспективні напрямки подальших досліджень феноменології та механізмів реалізації пострадіаційних поведінкових ефектів. При цьому застосований методологічний підхід може використовуватися як для подальшої розробки даної наукової проблеми, так і для визначення ефективності засобів корекції поведінкових зрушень, спричинених радіацією або іншими стресорними чинниками. Отримані дані у певній мірі підкреслюють роль чинника додаткового стресу у реалізації постпроменевих змін поведінки та можуть стати підґрунтям для досліджень ролі цього фактору у медичних наслідках аварії на Чорнобильській АЕС. Доведена можливість запобігання антиоксидантними засобами штучного або природного походження змін вищої нервової діяльності, обумовлених дією зовнішнього іонізуючого опромінення у малих та сублетальних дозах, що обґрунтовує підходи до подальшої розробки питання попередження постпроменевих поведінкових наслідків. Результати дисертації впроваджено в навчальний процес біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка при читанні курсу “Фізіологія ВНД з основами психофізіології”.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок дисертанта в роботу полягає у визначенні разом з науковим керівником актуальності, мети та завдань роботи, формулюванні основних положень та висновків. Автором здійснювалося написання огляду літератури, проведення експериментів, статистична обробка результатів, їх узагальнення та науковий аналіз.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на 3-тій Міжнародній конференції “Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи: підсумки 15-річних досліджень” (Київ, 2001), Науково-практичній конференції “Парадигми сучасної радіобіології. Радіаційний захист персоналу об’єктів атомної енергетики” (Київ-Чорнобиль, 2004), Міжнародній конференції “Радіобіологічні ефекти: ризики, мінімізація, прогноз” (Київ, 2005), Конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми радіаційної медицини та радіобіології” (Київ, 2005), 10-тій Ювілейній міждисциплінарній міжнародній конференції з біологічної психіатрії “Стрес та поведінка” (Санкт-Петербург, 2007). Дисертаційна робота була обговорена та отримала позитивну оцінку на засіданні Вченої ради Інституту експериментальної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України від 27 березня 2007 року.

Публікації. Результати досліджень опубліковано в 3 статтях у фахових виданнях та 5 збірках тез наукових національних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 140 сторінках машинописного тексту та складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 2 глав з результатами досліджень з їх обговоренням, узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел. Робота ілюстрована 28 рисунками, містить 24 таблиць. Бібліографія включає 370 джерел, у тому числі 232 іноземних видань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Експериментальні тварини та обсяг досліджень. Дослідження проведені на 505 білих нелінійних щурах самцях віком від 2 до 4 місяців з масою тіла на початку дослідження 160-220 г у одинадцяти  експериментах (у кожному експерименті щури були одного віку з майже однаковою масою тіла). Тварини утримувалися у віварії за природного режиму освітлення та стандартного харчового раціону. Експерименти над тваринами проводились у відповідності з існуючими міжнародними та національними вимогами до використання експериментальних тварин [Конвенція Ради Європи від 18.03.1986; Закон України вiд 21.02.2006 № 3447-IV].

Залежність доза-ефект постпроменевих змін умовнорефлекторної діяльності визначали шляхом узагальнення результатів вивчення активного уникання, проведеного на 414 щурах, з яких 146 також тестували у камері Скіннера (загалом 4480 дослідів) (табл. ). Вивчення можливості модифікації пострадіаційних поведінкових ефектів антиоксидантними засобами проведено у трьох експериментах на 145 щурах (загалом 1914 дослідів).

Загальна схема окремих експериментів була однаковою в усіх випадках. Спочатку здійснювали навчання тварин. За результатами вихідних тестувань у човниковій камері щурів розподіляли на врівноважені за об’ємом та рівнем досліджуваних показників групи (вибіркові середні показників статистично не відрізнялися). Після опромінення щотижнево впродовж двох місяців проводили тестування тварин у човниковій та скіннерівській камерах.

Антиоксиданти використовували як засіб вивчення принципової можливості модифікації постпроменевих поведінкових ефектів та визначення в такий спосіб значущості оксидантного компоненту дії радіації на вищу нервову діяльність. Тварини отримували антиоксидантні комплекси (табл.2) per os щоденно впродовж 3-4 тижнів до опромінення та протягом всього подальшого часу експерименту.

Опромінення тварин проводили у відділенні дистанційної променевої терапії Інституту онкології АМН України з використанням установки “Рокус” (джерело – 60Cо; потужність поглинутої дози 0,73-1,5 Гр/хв). За описаних у роботі використаних доз радіації (табл.1) не спостерігали жодного випадку радіаційної загибелі тварин. Установка знаходилася під плановим дозиметричним контролем. Також у чотирьох випадках нами здійснювалася власна контрольна дозиметрія з використанням термолюмінісцентних дозиметрів типу Harshaw 8814 (Termo, США). Похибка фактично отриманої дози у порівнянні з очікуємою становила не більше 5-10

Методи та методики дослідження. Як основний використовували умовнорефлекторний метод дослідження (інструментальні методики човникової та скін-нерівської камери); в окремих експериментах використовували методику відкритого поля та флуориметричний метод визначення концентрації кортикостерону у плазмі крові.

У човниковій камері за модифікованою методикою [В.В. Варецький та ін., 2004] досліджували двостороннє активне уникання негативного аверсивного підкріплення (електричний струм 0,8 мА). Використовували два умовних подразника: звуковий та світловий, один з яких був основним (на який тварина мала здійснити реакцію уникнення), а другий – додатковим (локомоторна реакція тварини на який негативно підкріплювалася). Параметри застосування сигналів: кількість спроб (циклів поєднання умовного та безумовного подразників) у сесії – 100, тривалість дії умовного сигналу до початку дії безумовного подразника – 4 с, тривалість одночасної дії умовного та безумовного подразників – 10 с, міжсигнальний період – 25,0±22,5 с. Подання основного та додаткового умовних стимулів відбувалося рандомізовано, у 100 спробах сесії кожний з них діяв приблизно у половині випадків. Кожне наступне тестування проводили за умов зміни значущості умовних подразників (використання як основного чи додаткового). Визначали та аналізували показники кількості умовних реакцій (УР) активного уникання у % до максимально можливої, середньої кількості умовних реакцій у серіях (УРС), кількості спроб до реалізації першої умовної реакції (1УР), середньої тривалості латентного періоду (ЛП) умовного реакції, кількості міжсигнальних реакцій (МР), кількості спроб до реалізації першої міжсигнальної реакції (1МР).

У камері Скіннера (Rhema Labortechnik, Німеччина) досліджували оперантну діяльність з позитивним підкріпленням (молоко) у режимі фіксованого співвідношення. Такий режим підкріплення було обрано як більш чутливий у порівнянні з режимом фіксованого інтервалу [P.C. Mele et al., 1990]. Для запобігання зменшення мотивації тварин фіксоване співвідношення кожні два тижні збільшували на одиницю. Визначали впродовж 30 хв та аналізували показники загальної кількості реалізованих інструментальних умовних реакцій (кількість взяття підкріплення) та оперантної активності (кількість натиснень на педаль). У окремому експерименті вираховували також ефективність поведінки тварин (відсоток зайвих натиснень на педаль) згідно [А. Dekeyne et al., 2002].

У відкритому полі досліджували спонтанну локомоторну поведінку щурів впродовж 5 хв. Визначали та аналізували показники рухової та дослідницької активності (кількість відвіданих центральних та пристінкових квадратів, вертикальних стійок; загальну тривалість завмирання, рухової та дослідницької активності; латентний період виходу з центрального квадрату та першого відвідування центральних квадратів), а також вегетативні показники (інтенсивність дефекації та уринації) та параметри грумінгу (латентний період, загальну тривалість та кількість актів грумінгу та їх мікроструктуру) [A.V. Kalueff, 2003].

Визначення вмісту кортикостерону у плазмі крові щурів (мкг/100 мл) проводили флуориметричним методом у модифікації [Ю.Г. Балашов, 1990] із застосуванням спектроскопічного флуориметру MPF-4 (Hitachi, Японія). Використовували речовини: хлористий метилен, етанол, сірчану кислоту (всі Sigma, США), стандартний розчин кортикостерону (Koch-Light, Великобританія).

Методи статистичного аналізу результатів. Залежність доза-ефект визначали узагальненням результатів окремих експериментів (у відсотках до відповідного контролю). Поєднання параметрів вибірок однакових доз та обраних діапазонів доз із врахуванням їх ваги та розрахунок узагальненої оцінки стандартної помилки середнього проводили згідно [В.Ю. Урбах, 1964].

Значущість змін оцінювали за параметрами узагальнених контрольних та опромінених вибірок (з використанням t-критерію Стьюдента після нормалізації розподілу варіант). У дослідженнях з використанням антиоксидантів кумулятивні дані обробляли дисперсійно-регресійним аналізом. Рівняння множинної регресії мало наступний загальний вигляд: Y = a0 + а1X1 + а2X2 + ... + аiXi, де Y – залежна змінна (показник поведінки), а0 – вільний член (константа), X1…Xi – незалежні змінні: час (доба після опромінення), чинники опромінення, застосування антиоксидантів тощо (наявність чи відсутність – відповідно 1 або 0), а1…аі – відповідні кутові коефіцієнти. Наявність зв’язку між показниками поведінки, які було отримано у човниковій та скіннерівській камерах та відкритому полі за відсутності впливу досліджуваних чинників (до розподілу тварин на експериментальні групи), встановлювали шляхом проведення непараметричного кореляційного аналізу за Спірменом. Критичний рівень значущості статистичних методів (ймовірність помилкового відхилення нульової гіпотези) був менше 5При розрахунках використовували комп’ютерні програми Microsoft Office Excel та Statistica .0.

Результати досліджень та їх обговорення

Залежність доза-ефект змін показників поведінки активного уникання після опромінення. Зміни усіх показників поведінки уникання у човниковій камері в цілому мали однотипний нелінійний характер. Так, кількість умовних реакцій за доз радіації менших 1,0 Гр була меншою порівняно з контролем: опромінення вірогідно зменшувало показник кількості УР на 23±9за діапазону доз від 0,05 до 0,15 Гр (р<0,05) та на 16±5за доз від 0,375 до 0,875 Гр (р<0,05). У діапазоні доз від 1,75 до 3,5 Гр кількість умовних реакцій збільшувався на 47±10(р<0,05), а за більших доз зменшувалася та становила 78±8від контролю у діапазоні доз від 5,5 до 7,0 Гр (р<0,05) (рис.1).

Залежність доза-ефект змін показника кількості умовних реакцій у серії виявилася подібною. Як це показано на рис.1, за доз опромінення менших 1,0 Гр цей показник зменшувався та становив від контролю 88±5за діапазону доз від 0,05 до 0,15 Гр (р<0,05) та 92±3за доз від 0,375 до 0,875 Гр (р<0,05). Проте за більших доз радіації вірогідні зміни кількості УРС було визначено лише для діапазону доз від 1,75 до 3,5 Гр, де вона становила 119±5у порівнянні з контролем (р<0,05). Зменшення показника кількості УРС після опромінення у піддіапазоні від 5,5 до 7,0 Гр на 9±5порівняно з контролем було на рівні статистичної тенденції .

Вірогідне зменшення кількості спроб до першої умовної реакції (тобто збільшення швидкості навчання) у опромінених щурів у порівнянні з неопроміненими спостерігалося лише за діапазону доз від 1,75 до 5,5 Гр. Так, показник кількості 1УР становив порівняно з відповідним контролем 68±6за доз від 1,75 до 3,5 Гр та 77±8за доз від 3,5 до 5,5 Гр (р<0,05) (рис.1).

Дозова залежність змін показника середньої тривалості ЛП реакції уникнення за характером досить подібна до такої у попереднього показника. Так, за доз опромінення менше1,0 Гр тривалість латентного періоду реакції уникнення збільшувалася (вірогідно для піддіапазону від 0,05 до 0,15 Гр) або не відрізняється від значень у контролі. За діапазону доз від 0,875 до 3,5 Гр ЛП умовнорефлекторної реакції зменшувався та ставав коротшим, ніж у контролі (р<0,05), а за доз вищих ніж 3,5 Гр, не відрізнявся від контрольних значень.

Зміни загальної кількості міжсигнальних реакцій – показника, який характеризує збудливість центральної нервової системи, – також мали нелінійний характер, як це можна бачити на рис.1. Кількість МР після опромінення за діапазонів доз менших за 0,875 Гр та більших за 3,5 Гр була вірогідно меншою, ніж у неопромінених тварин. У першому з зазначених піддіапазонів доз показник кількості МР максимально зменшувався до 54±6(р<0,05), а у другому – до 33±12від відповідного контролю (р<0,05). В той же час у діапазоні від 0,875 до 3,5 Гр, тобто за доз, які відповідають підвищеному рівню умовнорефлекторної діяльності, були зареєстровані мінімальні, статистично невірогідні зрушення показника кількості міжсигнальних реакцій у порівнянні з контролем.

Отже, отримані результати свідчать про нелінійну залежність змін усіх показників умовнорефлекторної поведінки уникання від дози іонізуючого опромінення. За постпроменевими поведінковими ефектами функцію доза-ефект умовно можна поділити на три дозових діапазони: до 1,0 Гр, від 1,0 до 4,0-5,0 Гр та 5,0-7,0 Гр. Ці діапазони мають характерні стабільність, вираженість та спрямованість зрушень рівнів показників інструментальної поведінки. У межах першого діапазону доз до 1,0 Гр здебільшого спостерігалося зниження рівня умовнорефлекторної діяльності у опромінених тварин у порівнянні з контролем. У діапазоні від 1,0 до 4,0-5,0 Гр поведінкові показники стабільно збільшувалися відносно контролю з максимумом за доз 2,0-3,0 Гр. Водночас останній дозовий діапазон (дози більше 5,0 Гр) характеризувався зниженням рівня умовнорефлекторної діяльності опромінених тварин у порівнянні з відповідним контролем.

Оцінка стресового компонента та гіпотеза про його значущість у постпроменевих змінах інструментальної поведінки. Можна вважати, що вивчення умовнорефлекторної діяльності щурів проводилося в наших експериментах за стресових умов. Адже само по собі тестування щурів у човниковій камері було сильним стресовим фактором для тварин, що обумовлено використанням як негативного больового підкріплення електричного струму [M.L.et al., 2004; Q.et al., 2005] та наявністю постійної проблемної ситуації внаслідок певної етологічної неадекватності методики двосторонньої човникової камери [А.В. Савоненко и др., 1998]. Навіть за успішного закріплення навички активного уникання щури виявляють ознаки емоційного напруження до закінчення тестування [Ю.С. Дмитриев, А.А. Бачманов, 1992]. Для підтвердження припущення про стресовий вплив процедури дослідження поведінки уникання ми визначали вміст у плазмі крові кортикостерона у інтактних тварин та щурів, які впродовж двох місяців тестувалися у човниковій камері. У інтактних тварин цей показник становив 41,3±4,8 мкг/100 мл, а у щурів, які зазнавали впливу чиннику тестування він був більшим на 70та становив 70,3±6,9 мкг/100 мл (р<0,001), що свідчило про стресовий вплив процедури тестування щурів у човниковій камері. Вплив низькоінтенсивного випромінення може розглядатися як неспецифічний стресовий фактор [R.et al., 2005; L. Lebaron-Jacobs et al., 2004], а враховуючи можливість взаємодії впливів різних стресових факторів [X.et al., 2004; D.et al., 2005], ми припустили, що зміни поведінки активного уникання після опромінення пов’язані з модифікованою радіацією відповіддю на додатковий стрес, який обумовлюється процедурою тестування тварин. Виходячи з гіпотези про додатковий вплив стресового чинника, уявлялося цікавим дослідити дозову залежність змін показників умовнорефлекторної поведінки після опромінення у разі застосування іншої інструментальної методики з меншим стресовим навантаженням. Таким вимогам певною мірою відповідає методика камери Скіннера за використання позитивного підкріплення умовнорефлекторної діяльності.

Залежність доза-ефект змін показників оперантної діяльності щурів з позитивним підкріпленням у камері Скіннера також виявилася нелінійною та мала три характерні ділянки. Після опромінення у мінімальній з використаних доз (0,25 Гр) рівень умовнорефлекторної діяльності знижувався та становив 80±4від контролю (р<0,05), проте за дози 0,5 Гр він зростав і вірогідно не відрізнявся від відповідного контролю. Ділянка дозової залежності, яка відповідала дозам опромінення 1,0 та 2,0 Гр, характеризувалася зростанням показника кількості реалізованих умовних реакцій у тварин опромінених груп, де він становив 1145 у порівнянні з контролем (p<0,05). Зі збільшенням дози опромінення показник кількості умовних реакцій зменшувався. Так, після опромінення у дозі 3,0 Гр рівень цього показника не відрізнявся від значень у контрольній групі, а за дози 6,25 Гр – вірогідно знижувався та становив 736відносно значень у контролі (p<0,05) (рис. 2).

Залежність доза-ефект змін показника оперантної активності, як це можна бачити на рис. 2, мала аналогічний характер, однак визначені зрушення не були статистично значущими внаслідок неврівноваженості вихідного рівня цього показника. Навіть за дози опромінення 6,25 Гр спостерігали лише тенденцію до зниження рівня показника кількості натиснень на педаль у порівнянні з контролем (p<0,1).

Таким чином, дослідження інструментальної діяльності тварин після впливу іонізуючої радіації з використанням камери Скіннера з позитивним підкріпленням виявили нелінійну дозову залежність змін показників дуже подібну до такої, що її визначено для показників активного уникання. Рівень умовнорефлекторної діяльності з позитивним підкріпленням у опромінених тварин відносно контролю знижувався за дози 0,25 Гр, зростав за діапазону доз від 0,5 до 2,0 Гр та знижувався в міру подальшого збільшення дози опромінення. Менша виразність зрушень оперантної діяльності у камері Скіннера у порівнянні зі змінами поведінки уникання підтверджує висунуту гіпотезу про значущість стресового компонента у постпроменевих змінах інструментальної діяльності.

Узагальнення результатів вивчення залежності доза-ефект постпроменевих змін умовнорефлекторної діяльності. Результати досліджень інструментальної діяльності у човниковій та скіннерівській камерах свідчать про нелінійну залежність змін показників оперантної поведінки від дози іонізуючої радіації. Визначена функція доза-ефект формально описується поліномом третього ступеня та має три дозових інтервали, що характеризувалися певними стабільністю, вираженістю та напрямком зрушень. У межах доз до 1,0 Гр після опромінення рівень показників поведінки уникання знижувався. Подібний ефект отримано й для умовнорефлекторної діяльності у камері Скіннера після опромінення у дозі 0,25 Гр. Другий діапазон доз (від 1,0 до 4,0-5,0 Гр для поведінки уникання та від 0,5 до 3,0 Гр для інструментальної діяльності у камері Скіннера) характеризувався стабільними ефектами підвищення рівня оперантної діяльності у порівнянні з контролем. За доз більше 3,0-4,0 Гр спостерігали зниження рівня показників інструментальної діяльності, які вивчали обома використаними методиками дослідження. За результатами, отриманими як у човниковій, так і у скіннерівській камерах також було виявлено, що чинники часу, який сплинув після опромінення, та сезону, в який проводилися дослідження, модифікували вид дозової залежності, проте принципово не змінювали її характеру. Подібність залежностей доза-ефект змін умовнорефлекторної поведінки після опромінення отриманих різними методиками підтверджує знайдену закономірність виявлених зрушень, а знайдені відмінності (менша виразність ефекту за використання камери Скіннера) – свідчать на користь висунутої гіпотези про значущість додаткового компоненту стресу у реалізації постпроменевих поведінкових ефектів. З огляду на зазначене вище, умови проведеного дослідження певною мірою моделюють реальні радіаційні інциденти, за яких вплив іонізуючого випромінення дуже часто поєднується з дією різних стресових чинників, що може суттєво модифікувати радіаційні ефекти.

Виявлену дозову залежність постпроменевих змін поведінки тварин можна пояснити тим, що кожному діапазону доз відповідає різний рівень променевих пошкоджень й компенсаторних механізмів, та (або) різне співвідношення між ними. Згідно уявлень [Е.Б. Бурлакова и др., 1999] наявність декількох точок перетину функцією доза-ефект рівня контролю може вказувати на існування порогів та включення різних механізмів відповіді на опромінення. Постпроменеві зміни у ЦНС можуть бути наслідком ушкоджень нейрональної ДНК – ядерної [А.Ф. Протас, 1997; P.J.J.R. Fike, 2000] та мітохондріальної [H. Korr, 2001], зниження нейронального метаболізму та змін у синаптичній передачі мембранних потенціалів [Б.И. Давыдов, И.Б. Ушаков, 1987], демієлінізації [А.К. Гуськова, 1989], змін у нейроглії [R.G. Steen et al., 2001; R.K. Mulhern et al., 2001], радіаційно-індукованого апоптозу [P.J.J.R. Fike, 2000], аутоімуних реакцій [Ю.П. Зозуля та ін., 1998] тощо. У Публікації Міжнародної комісії з радіологічного захисту, детерміновані радіоцеребральні ефекти названі “функціональними”, оскільки вони не призводять до загибелі клітин та смерті організму, проте при цьому існують радіаційні пошкодження на клітинному та субклітинному рівнях організації нервової системи. Усі перелічені вище механізми реалізації радіаційного впливу є наслідком первинних процесів, які відбуваються при взаємодії випромінення з матерією живої системи. Саме тому вивчення можливості корекції постпроменевих ефектів шляхом застосування антиоксидантів та оцінка в такий спосіб ролі оксидантно-стресового компоненту дії іонізуючої радіації уявлялося необхідною частиною дисертаційної роботи.

Дослідження можливості корекції змін вищої нервової діяльності щурів після опромінення у дозі 0,05 Гр комплексом антиоксидантів штучного походження. Регресійним аналізом кумулятивних значень показника кількості умовних реакцій (табл. ) показано негативний вплив опромінення на досліджуваний показник. Чинники отримання аскорбінової кислоти та -каротин збільшували, а -токоферол зменшував показник кількості УР у неопромінених тварин. Взаємодія речовин у комплексі як за відсутності, так і за наявності чинника опромінення, виявилася невірогідною (У аi відповідно 32,2 та 27,5), тому позитивну дію комплексу слід розглядати як атрибутивний вплив його окремих компонентів. У опромінених тварин -токоферол (У аi ,0) та аскорбінова кислота (У аi ,0) дещо збільшували кількість умовних реакцій, хоча повної корекції впливу опромінення не досягалося. Комплекс антиоксидантів, як і -каротин (У аi відповідно 27,5 та 17,8) попереджав постпроменеві ефекти (рис. 3).

Результати регресійного аналізу впливу досліджуваних чинників на показники поведінки уникання наведені у табл.3. Значення відповідних коефіцієнтів регресії свідчили про збільшення рівня показників швидкості навчання, стабільності набутого стереотипу поведінки та збудливості у опромінених тварин, які отримували комплекс антиоксидантів у порівнянні як з опроміненими щурами, які не отримували антиоксидантів, так і з контрольною групою тварин.

Отже, опромінення у дозі 0,05 Гр негативно впливало на функціональний стан ЦНС, знижуючи рівень показників поведінки уникання. Застосування комплексу антиоксидантів у опромінених тварин попереджувало постпроменеві зміни поведінки уникання. Дослідження ефектів нарізного застосування складових комплексу антиоксидантів виявило, що дія токоферолу недостатня для корекції наслідків опромінення та, навіть, спричиняла негативний вплив на неопромінених тварин. Це можна пояснити проявом прооксидантної дії токоферолу, оскільки за надлишкової кількості антиоксиданти можуть чинити прооксидантний вплив [В.А. Барабой, Д.А. Сутковий, 1997; Ю.А. Зозуля и др., 2000; A.A., 2000]. Відомо, що на результати застосування токоферолу впливають багато факторів: доза опромінення, режим застосування антиоксиданту, харчова дієта, рівень стресованості тварин та інше [J.F.M.R., 2003].

Дослідження можливості корекції змін вищої нервової діяльності щурів після опромінення у дозі 5,0 Гр комплексом антиоксидантів штучного походження. Середня кількість умовних реакцій уникнення у тестуванні складала у тварин контрольної групи – 27±3від максимально можливих, у опромінених тварин – 21±2а у опромінених тварин, які отримували антиоксиданти – 29±3(рис. 4). Регресійним аналізом показано негативний вплив опромінення на показник кількості УР (аi = ,4; p<0,01). Визначена взаємодія впливів чинників опромінення та отримання антиоксидантів (аi  = ,9; p<0,01), як і визначена різниця параметрів вибірок, свідчили про позитивний вплив застосованого комплексу антиоксидантів, який запобігав зниженню рівня умовнорефлекторної діяльності у опромінених тварин.

Не було виявлено впливу чиннику опромінення на показники стабільності набутого стереотипу поведінки та швидкості навчання, проте тривалість латентного періоду реакції уникнення у опромінених тварин збільшувалася до 3,80±0,02 с (аi = ,73; p<0,01) у порівнянні з рівнем контролю, де цей показник становив 3,72±0,04 с. У опромінених тварин, які отримували антиоксиданти показник тривалості ЛП становив 3,66±0,04 с, при цьому взаємодія впливів антиоксидантів та опромінення була вірогідною (аi  = ,8; p<0,01).

Кількість міжсигнальних реакцій у тестуванні становила у контрольних тварин 12,8±2,6, тоді як у опромінених тварин цей показник зменшувався до 6,1±0,8 (аi = ,5; p<0,01). Натомість у опромінених тварин, які одержували антиоксиданти, кількість МР збільшувалася до 16,6±3,0, а взаємодія впливів досліджуваних чинників була вірогідною (аi  = ,3; p<0,001) (рис. 4).

В цілому, отримані дані вивчення умовнорефлекторної поведінки уникання щурів свідчать про пригнічення функціонального стану ЦНС тварин після впливу іонізуючої радіації у дозі 5,0 Гр, на що вказувало зменшення показників кількості умовних та міжсигнальних реакцій при подовженні латентного періоду реакції уникнення. Застосування антиоксидантів у опромінених тварин попереджувало проявлення наслідків променевого впливу.

Дослідження можливості корекції змін ВНД щурів після опромінення у дозі 0,5 Гр антиоксидантним засобом природного походження (концентратом плодів чорниці) проводили з використанням методик човникової та скіннерівської камер та відкритого поля. Ці методики відбивають вищу нервову діяльність з різних боків: не було визначено сильної кореляції рівней показників поведінки, отриманих різними методиками до розподілу тварин (n ) на групи.

Середня кількість умовних реакцій уникнення у тестуванні складала 25±2у контролі та 14±1у опромінених щурів. Показник кількості УР у опромінених тварин, які отримували концентрат плодів чорниці становив 22±2а у неопромінених – 23±2(рис. 5А). Регресійний аналіз показав негативний вплив чинника опромінення (аi  = ,6; р<0,001), відсутність впливу чорниці на неопромінених щурів (аi ,6; р>0,05) і вірогідну взаємодію впливів опромінення та використаного антиоксидантного засобу (аi = ,3; р<0,001).

Результати регресійного аналізу впливу досліджуваних чинників на показники поведінки уникання наведені у табл.4. Значення відповідних кутових коефіцієнтів вказують на уповільнення швидкості навчання, зменшення стабільності набутого стереотипу поведінки та збудливості, збільшення ЛП уникнення у опромінених тварин. Водночас у опромінених щурів, які отримували концентрат плодів чорниці, показники поведінки уникання не відрізнялися від рівня контролю, що свідчить про попередження цим засобом постпроменевих змін функціонального стану ЦНС. Отримання концентрату плодів чорниці здебільшого не впливало на поведінкові показники у групі неопромінених тварин.

Вивчення у тих самих тварин умовнорефлекторної поведінки з позитивним підкріпленням у камері Скіннера виявило аналогічний характер змін. Показник кількості реалізованих умовних реакцій у скіннерівській камері в середньому у тестуванні складав від вихідного рівня 60±3у контрольних тварин, 51±2у опромінених щурів, 59±3у щурів, які отримували концентрат плодів чорниці та 64±3у опромінених тварин, які також отримували концентрат плодів чорниці (рис. Б). Значення оцінок середніх усіх груп у відсотках до фону є меншими за вихідний рівень (100внаслідок особливостей застосованого методичного підходу, а саме – поступового збільшення фіксованого співвідношення через кожне тестування. Регресійним аналізом виявлено негативний вплив чиннику опромінення на досліджуваний показник (аi = ,5; р<0,01), тобто зменшення отримання підкріплення у опромінених тварин. Значущих впливів чорниці (аi = ,0; р>0,05) та взаємодії впливів застосованих чинників (аi = ,9; р>0,05; У аi = ,4) не виявлено, тобто у групах тварин які отримували антиоксидантний засіб та не були, або були опромінені, показник кількості умовних реакцій не відрізнявся від рівня контролю.

Опромінення збільшувало кількість натиснень на педаль (аi = ,2; р<0,01), але при цьому збільшувалася кількість зайвих натиснень (аi = ,3; р<0,05), тобто знижувався рівень ефективності оперантної поведінки, яка спрямована на одержання підкріплення. Водночас оперантна активність та показник її ефективності не змінювались при застосуванні концентрату плодів чорниці (аi відповідно 113,6 та -50,2; р>0,05) у неопромінених тварин. У щурів, які були опромінені та отримували антиоксидантний засіб кількість натиснень на педаль була менше ніж у контролі за рахунок взаємодії впливів опромінення та чорниці (аi = ,9; р<0,01; У аi = -6,1), останнє також обумовлює і більший рівень ефективності інструментальної діяльності, тобто тенденція до зменшення кількості натиснень на педаль може бути пояснена зменшенням кількості додаткових (неефективних) натиснень.

Аналіз впливу досліджуваних чинників на спонтанну рухову поведінку тих самих тварин у відкритому полі не виявив вірогідних змін більшості показників. Так, не виявлено наслідків впливу опромінення у дозі 0,5 Гр на показники локомоторної поведінки щурів. В той же час отримання неопроміненими тваринами концентрату плодів чорниці вірогідно збільшувало показник кількості відвіданих центральних квадратів та питому вагу центральної активності в сумарній кількості відвідувань внутрішніх і периферичних квадратів.

Визначений ефект застосування концентрату плодів чорниці при опроміненні, напевно, пов’язаний з наявністю у його вмісті сполук з антиоксидантними властивостями [S. Roy et al., 2002; W. Zheng, S.Y, 2003]. Саме так пояснюють одержані позитивні ефекти застосування плодів цієї рослини за станів, які асоціюються з розвитком оксидативного стресу та призводять до порушень функцій ЦНС під час старіння [J.A. Joseph et al., 1999, 2000; R.L. Galli et al., 2002] або у разі опромінення [B.M. Rabin et al., 2002, 2005].

Таким чином, результати досліджень інструментальної діяльності з негативним та позитивним підкріпленням у човниковій та скіннерівській камерах вказують на постпроменеве пригнічення функціонального стану ЦНС: опромінення у дозі 0,5 Гр знижувало рівень умовнорефлекторної діяльності, стабільності набутого стереотипу поведінки, швидкості навчання та ефективності оперантної діяльності тварин. Застосування концентрату плодів чорниці попереджало постпроменеві зміни інструментальної поведінки. При цьому нарізний вплив цього антиоксидантного комплексу природного походження на показники умовнорефлекторної діяльності здебільшого не проявлявся. Водночас, тестування тварин у відкритому полі не виявило істотних змін спонтанної поведінки тварин після опромінення у дозі 0,5 Гр, а застосування концентрату плодів чорниці справляло позитивний вплив, підвищуючи рівень деяких показників пошуково-дослідницької активності тварин.

Оцінка значущості внеску оксидантного компоненту впливу іонізуючої радіації у нелетальному діапазоні доз на вищу нервову діяльність. Результати досліджень впливу антиоксидантних засобів та іонізуючої радіації у дозах 0,05, 0,5 та 5,0 Гр на вищу нервову діяльність щурів свідчать про пригнічення функціонального стану ЦНС після радіаційного впливу та можливість ефективного попередження постпроменевих наслідків антиоксидантами штучного або природного походження. Це опосередковано вказує на значущість оксидативного компоненту в реалізації поведінкових пострадіаційних ефектів, що узгоджується з думкою інших авторів про механізми променевого впливу за дії низькоінтенсивної іонізуючої радіації [В.А. Барабой, Д.А. Сутковий, 1997; Ю.А. Зозуля и др., 2000; A.R.K.2001]. Оскільки застосування антиоксидантних засобів попереджувало радіаційно обумовлені порушення, внесок оксидантного компоненту дії іонізуючої радіації у нелетальних дозах у зміни ВНД, що їх визначено за показниками умовнорефлекторної інструментальної поведінки, можна оцінити як провідний. Це обґрунтовує перспективність подальших досліджень використання антиоксидантів для попередження постпроменевих поведінкових наслідків, а також у разі впливу стресових чинників, дія яких опосередковується розвитком оксидантного стресу.

ВИСНОВКИ

В роботі встановлено нелінійну залежність доза-ефект змін умовнорефлекторної інструментальної діяльності щурів впродовж двох місяців після опромінення у широкому діапазоні нелетальних доз та можливість корекції антиоксидантами постпроменевих зрушень вищої нервової діяльності.

1. Дозова залежність змін умовнорефлекторної інструментальної поведінки після опромінення у діапазоні доз 0,05-7,0 Гр може бути формально описана поліномом третього ступеня та має три характерних інтервали. Перший з них (від 0,05 до 1,0 Гр для поведінки активного уникання та 0,25 Гр для оперантної поведінки у камері Скіннера) характеризується зниженням рівня інструментальної діяльності відносно відповідного контролю. У другому інтервалі (від 1,0 до 4,0-5,0 Гр для поведінки активного уникання та 0,5-3,0 Гр для оперантної поведінки у камері Скіннера) рівень інструментальної діяльності підвищується, а у третьому (діапазони 5,0-7,0 Гр для поведінки активного уникання та 3,0-6,5 Гр для оперантної поведінки у камері Скіннера) – знижується відносно відповідного контролю.

2. Порівняння залежностей доза-ефект змін показників інструментальної діяльності після опромінення, які визначено із застосуванням методик як з негативним, так і з позитивним підкріпленням (човникової та скіннерівської камер), свідчить про в цілому однакові постпроменеві зрушення вищої нервової діяльності, а визначена різниця у вираженості ефектів підтверджує висунуту гіпотезу про значущість впливу чиннику додаткового стресу, що його викликано процедурою тестування тварин.

3. Комплекси антиоксидантів штучного походження, до складу яких входять в-каротин, б-токоферол та аскорбінова кислота або в-каротин, б-токоферол, вітаміни групи В, рутин та цинк запобігають пригніченню вищої нервової діяльності щурів, визначеному за показниками поведінки у човниковій камері, після опромінення у дозах відповідно 0,05 та 5,0 Гр. Водночас застосування компонентів комплексу антиоксидантів нарізно для попередження постпроменевих наслідків не завжди виявляється ефективним, а іноді справляє негативний вплив на вищу нервову діяльність у неопромінених тварин.

4. Концентрат плодів чорниці запобігає пригніченню вищої нервової діяльності щурів після опромінення у дозі 0,5 Гр, визначеному за показниками поведінки уникання у човниковій камері та оперантної діяльності у камері Скіннера, тоді як у неопромінених тварин цей антиоксидантний засіб природного походження не призводить до негативних наслідків.

5. Ефективне попередження антиоксидантами штучного та природного походження змін умовнорефлекторної поведінки після опромінення опосередковано дає підстави оцінити роль оксидантно-стресового компоненту дії іонізуючої радіації у нелетальних дозах у змінах вищої нервової діяльності як провідну, що обґрунтовує перспективність подальшої розробки проблеми корекції постпроменевих наслідків застосуванням антиоксидантних засобів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Варецький В.В., Тукаленко Є.В., Ракочі О.Г., Дмитрієва І.Р. Дозова залежність змін вищої нервової діяльності щурів у разі впливу іонізуючого випромінення // Проблеми радіаційної медицини та радіобіології: Зб. наук. праць. – Київ, 2005.– С. –466.

2. Тукаленко Є.В.,