ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

ТРУСОВА Валерія Михайлівна

УДК 577.352.335.152

ВЗАЄМОДІЯ ЛІЗОЦИМУ З МОДЕЛЬНИМИ ЛІПІДНИМИ МЕМБРАНАМИ

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, професор

Горбенко Галина Петрівна

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна,

професор кафедри біологічної і медичної фізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Харкянен Валерій Миколайович, Інститут фізики НАН України, завідувач відділу фізики біологічних систем (м. Київ);

доктор фізико-математичних наук, професор Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електроніки імені О.Я. Усикова НАН України, старший науковий співробітник (м. Харків).

Захист відбудеться « 2 » липня 2008 року о 1500 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. .

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий « 2 » червня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Лізоцим, гідролітичний фермент із широким спектром антимікробних, протипухлинних та імуномодулюючих властивостей, відіграє важливу роль у різноманітних фізіологічних процесах. По-перше, лізоцим каталізує гідроліз в(1>4) – глікозидного зв’язку між N-ацетилглюкозаміном та мурамовою кислотою в полісахаридах клітинної стінки бактерій, що призводить до агрегації клітин та втрати їх життєздатності. По-друге, в останні роки встановлено, що фібрилізація лізоциму та послідуюча акумуляція патологічних агрегатів в тканинах організму є ключовим фактором в етіології цілої низки так званих конформаційних хвороб, зокрема, системного амілоїдозу. Все більшого поширення набуває точка зору, згідно з якою бактерицидні та амілоїдогенні властивості білка обумовлені його мембранотропною дією. Загальноприйнятою стає гіпотеза про те, що вбудовування лізоциму в клітинну мембрану призводить до порушення її цілісності та загибелі бактеріальної клітини. У свою чергу, роль ліпідів у формуванні амілоїдоподібних агрегатів лізоциму полягає у створенні мікрооточення, енергетично сприятливого для самозбирання білка у протофібрилярні та фібрилярні структури. Більш того, є підстави вважати, що мембрани являють собою пряму мішень для токсичних пре-фібрилярних агрегатів, які викликають пошкодження мембрани шляхом утворення неспецифічних іонних каналів та/чи вбудовування ліпідів у білкові фібрили. З огляду на вищесказане, встановлення молекулярних механізмів процесу утворення лізоцим-ліпідних комплексів є визначальним фактором у розумінні природи біологічної дії білка. Незважаючи на значні успіхи, досягнуті у з’ясуванні загальних принципів взаємодії лізоциму з ліпідами, цілісна система уявлень про механізми цього процесу відсутня. До числа питань, які до цього часу залишаються невирішеними, відноситься, перш за все, характеризація адсорбційної поведінки лізоциму. Теоретичним підґрунтям наявних літературних даних про параметри зв’язування лізоциму з ліпідним бішаром є моделі адсорбції, які не враховують електростатичні ефекти та статистичні особливості білок-ліпідних систем, а також можливість самоасоціації адсорбованого білка та латерального перерозподілу ліпідів. Таким чином, актуальним напрямком подальших досліджень термодинамічних аспектів лізоцим-ліпідних взаємодій є розвиток моделей, які б враховували зазначені властивості мембранних систем, та визначення у рамках цих моделей параметрів асоціації лізоциму з ліпідним бішаром. Свого вирішення потребує також проблема впливу ліпідів на агрегаційний стан білка та його здатність до утворення патологічних фібрилярних агрегатів. Наступним відкритим питанням є залежність характеру модифікації фізико-хімічних та структурних властивостей білка та ліпідних молекул від співвідношення електростатичних і гідрофобних лізоцим-ліпідних взаємодій, а також від ступеня проникнення білкової молекули в ліпідний бішар. Зокрема, представляє інтерес встановлення кореляції між інтегральними характеристиками мембрани та конформаційним станом лізоциму. Крім того, маловивченою є проблема структурної організації лізоцим-ліпідних комплексів. На цей час практично відсутні надійні кількісні оцінки глибини занурення білка в бішар, а також інформація щодо наявності специфічної орієнтації молекули лізоциму відносно поверхні розділу ліпід-вода. Ефективним шляхом вирішення цих питань є дослідження модельних систем на основі лізоциму та ліпідних везикул (ліпосом), які моделюють ліпідний бішар біомембран. Варіювання ліпідного складу таких систем забезпечує реалізацію основних типів взаємодій, характерних для комплексів лізоциму з ліпідами. Спільність принципів структурно-динамічної організації ліпосомальних та клітинних мембран дозволяє знайти пояснення складним та багатогранним явищам, спостережуваним у природних мембранних системах.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась на кафедрі біологічної і медичної фізики Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна у відповідності з планом науково-дослідних робіт кафедри за темою «Дослідження молекулярних механізмів дії високочастотного електромагнітного випромінювання на структурно-функціональний стан біологічних систем» (№ держреєстрації 0107U000691).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було встановлення молекулярних механізмів утворення комплексів лізоциму з модельними фосфоліпідними мембранами. Для досягнення даної мети були поставлені та вирішені такі задачі:

– розвинути континуальні моделі зв’язування білкових молекул з ліпідним бішаром з урахуванням електростатичних факторів та ефекту самоасоціації адсорбованого білка;

– отримати ізотерми зв’язування лізоциму з модельними мембранами різного складу, визначити параметри асоціації лізоциму з ліпідним бішаром та з’ясувати, як ці параметри залежать від вмісту та хімічної природи аніонних фосфоліпідів;

– методами гасіння власної флуоресценції білка та часороздільної флуоресцентної спектроскопії дослідити механізми конформаційних переходів лізоциму при зв’язуванні з ліпідами;

– з’ясувати особливості впливу лізоциму на структурно-динамічний стан ліпідного бішару, встановити кореляцію між поверхневим потенціалом мембрани та характером модифікуючої дії білка;

– методом індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) дослідити просторову організацію комплексів лізоциму з ліпідами, визначити глибину занурення білка у ліпідний бішар та оцінити здатність білка до ініціювання латерального перерозподілу ліпідів у негативно заряджених модельних мембранах.

Об’єкт дослідження – комплекси лізоциму з ліпосомальними мембранами, що складалися із цвіттеріонного ліпіду фосфатидилхоліну (ФХ) та його сумішей з аніонними ліпідами фосфатидилгліцерином (ФГ), фосфатидилсерином (ФС) та кардіоліпіном (КЛ), а також антрілвініл-міченими ліпідами (АВ-ФХ та АВ-ФГ).

Предмет дослідження – процес взаємодії лізоциму з модельними фосфоліпідними мембранами.

Методи дослідження – флуоресцентна спектроскопія та спектрофотометрія, чисельне моделювання. Для обробки експериментальних даних використовували нелінійну оптимізацію, чисельні розрахунки та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше в рамках континуальних моделей адсорбції, що враховують електростатичні ефекти та можливість агрегації адсорбату, проведено термодинамічний аналіз процесу зв’язування лізоциму з модельними мембранами, які складалися з ФХ та його сумішей з ФГ, ФС чи КЛ. Вперше виявлено зміну форми ізотерм адсорбції з гіперболічної на сигмоїдну при підвищенні поверхневого електростатичного потенціалу ліпідного бішару. Доведено, що в основі цього ефекту лежить утворення агрегатів мембранозв’язаного лізоциму. Отримані кількісні оцінки ступеня олігомеризації білка.

2. Методом часороздільної флуоресцентної спектроскопії визначені часи життя та обертальної кореляції триптофанових залишків лізоциму в розчині та у комплексі з ліпідами. Отримані докази на користь безпосередньої участі залишку триптофану у положенні 62 (Trp62) в утворенні агрегатів білка.

3. Протестовані нові сквараїнові зонди К1350 та SQ-1 щодо їх чутливості до змін фізико-хімічних властивостей ліпідного бішару. Вперше проведене дослідження спектральних параметрів цих зондів у ліпідних та лізоцим-ліпідних системах.

4. Методом індуктивно-резонансного переносу енергії отримано кількісну оцінку локалізації лізоциму відносно поверхні розділу ліпід-вода.

5. Вперше методом ІРПЕ отримані докази на користь латерального перерозподілу ліпідних молекул при сорбції лізоциму. Визначено розмір області із підвищеною концентрацією аніонних ліпідів.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи можуть бути застосовані для подальшої деталізації молекулярних механізмів біологічної дії лізоциму та загальних закономірностей білок-ліпідних взаємодій. Висновок стосовно агрегації лізоциму у ліпідному оточенні важливий у контексті амілоїдогенних властивостей білка, тому що детекція самоасоціації мономерів у критичне олігомерне ядро та ідентифікація інгібіторів цього процесу є необхідною передумовою для запобігання розвитку конформаційних хвороб та створення новітніх методів їх діагностики та лікування. Отримані дані щодо викликаної лізоцимом реорганізації структури ліпідного бішару дозволяють більш повно охарактеризувати молекулярні механізми антимікробної дії білка, та можуть бути використані при розробці антибактеріальних лікарських препаратів на основі лізоциму.

Нові сквараїнові зонди рекомендовані як флуорофори, високочутливі до змін фізико-хімічних властивостей ліпідного бішару. Результати аналізу розподілу цих барвників у ліпідних та білок-ліпідних системах можуть бути застосовані при розробці нових оптичних сенсорів на основі К1350 та SQ-1.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає:

у роботах [1,2,9,13,14,21] – отримання та аналіз експериментальних даних, розробка моделі дифузійно-контрольованої ексимеризації пірену; в роботах [3,8,15] – участь в обговоренні результатів та написанні статей і тез; [4-7,17,18] – постановка задачі, проведення експериментів, інтерпретація експериментальних даних, написання статей; у роботах [10-12,16,20,22] – отримання та інтерпретація експериментальних даних, написання статей та тез; у роботі [19] – обробка та обговорення результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені та доповідались на: I Українській науковій конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики» (Харків, 2004), IV Харківській конференції молодих вчених і науковців «Радіофізика та НВЧ електроніка» (Харків, 2004), Науково-технічній конференції «Від фундаментальних досліджень до прогресу в медицині» (Харків, 2005), XV Міжнародній конференції з хімічної термодинаміки, (Москва, 2005), V Харківській конференції молодих вчених і науковців «Радіофізика та НВЧ електроніка» (Харків, 2005), 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress (Montpellier, France, 2005), II Всеукраїнській науково-технічній конференції «Актуальні питання теоретичної та прикладної фізики та біофізики. Фізика. Біофізика – 2006» (Севастополь, 2006), IV З’їзді Українського Біохімічного товариства (Харків, 2006), IV З’їзді Українського Біофізичного товариства (Донецьк, 2006), International Symposium on Organic Chemistry (Sofia, Bulgaria, 2006), VI European Biophysics Congress (London, UK, 2007), 10th Conference on Methods and Applications in Fluorescence (Salzburg, Austria, 2007), III Всеукраїнській науково-технічній конференції «Актуальні питання теоретичної та прикладної фізики та біофізики. Фізика. Біофізика – 2007» (Севастополь, 2007), Keystone Symposium «Molecular Basis for Biological Membrane Organization» (Big Sky, Montana, USA, 2008).

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковані у 22 наукових працях, у тому числі в 8 статтях у наукових фахових журналах та в 14 тезах доповідей на міжнародних і національних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, п’яти основних розділів, висновків, списку використаних джерел та чотирьох додатків. Загальний обсяг дисертації складає 178 сторінок. Додатки займають 16 сторінок. Дисертація містить 47 рисунків (з них два займають повну сторінку), 11 таблиць. Список використаних джерел (239 найменувань) займає 25 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету досліджень та задачі, які необхідно вирішити для її досягнення, визначено наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів, наведено загальну структуру дисертаційної роботи.

Розділ 1 присвячений аналізу літературних даних, які відображають сучасні уявлення про молекулярні механізми взаємодії лізоциму з мембранами. Наведено загальну характеристику лізоциму. Описані структура та фізико-хімічні властивості ліпідного бішару. Детально проаналізовані результати досліджень, спрямованих на з’ясування молекулярних механізмів зв’язування лізоциму з ліпідними мембранами. Відзначається, що стабілізація лізоцим-ліпідних комплексів забезпечується електростатичними та гідрофобними взаємодіями, відносні внески яких залежать від поверхневої густини заряду ліпідного бішару, іонної сили та рН середовища, молярного співвідношення ліпід:лізоцим, тощо. Зроблено висновок, що мембранотропні властивості лізоциму можуть відігравати важливу роль у реалізації різноманітних біологічних функцій білка. Окреслене коло невирішених або спірних питань, що стосуються проблеми лізоцим-ліпідних взаємодій.

У розділі 2 наведена загальна характеристика матеріалів та методів дослідження. Об’єктом дослідження були комплекси лізоциму з уніламелярними ліпідними везикулами. Ліпосоми отримували методом екструзії із ФХ та його сумішей з ФГ, ФС та КЛ, а також АВ-ФХ та АВ-ФГ. Діаметр везикул складав 100 нм. Молярну частку ФГ та ФС варіювали від 5 до 40 %, а КЛ – від 2.6 до 25 %. Для приготування розчину лізоциму та суспензії ліпосом використовували 5 мМ натрій-фосфатний буфер чи 20 мМ HEPES буфер. Концентрацію білка визначали спектрофотометричним методом.

Вимірювання флуоресценції проводили при температурі 24 єС на спектрофлуориметрі LS-50B (Perkin-Elmer, Великобританія) та спектрофлуориметрі/спектрофотометрі CM (ЗАО «SOLAR», Бєларусь), обладнаних термостатованими кюветодержателями та магнітними мішалками.

Для оцінки рівноважних параметрів лізоцим-ліпідного комплексоутворення – константи асоціації () та стехіометрії (, числа ліпідних молекул, що утворюють контактну ділянку в білок-ліпідних комплексах) – використовували континуальні моделі нелокалізованої адсорбції, які враховують перекривання потенційних мембранних ділянок зв’язування білка, ефект виключеної площі, а також можливість самоасоціації зв’язаного ліганду: а) мономодальна модель – припускає, що конформаційний та агрегаційний стан лізоциму не змінюється при адсорбції, б) мультимодальна модель – враховує можливість переходів між різними конформаційними станами адсорбованого ліганду чи адсорбції ліганду на гетерогенній поверхні, що містить центри зв’язування, які відрізняються за розміром та вільною енергією адсорбції, в) модель двох станів – базується на припущенні, що адсорбований білок може знаходитись тільки в двох станах – мономера та za-мера, г) кластерна модель – розглядає високогетерогенну популяцію агрегованого білка (кластери білка довільної форми та розміру). Ці моделі були розвинуті з урахуванням електростатичних ефектів, обумовлених зниженням поверхневої густини заряду ліпідного бішару при сорбції лізоциму, наслідком чого є зменшення електростатичної компоненти константи асоціації.

Обробку отриманих результатів, чисельне моделювання та нелінійну оптимізацію проводили у середовищі MathCad 2001 на персональному комп’ютері. Для графічної ілюстрації експериментальних даних та результатів моделювання використовували середовище OriginPro 7.0 (OriginLab Corp., США). Візуалізацію та аналіз структури лізоциму здійснювали у середовищі WebLab Viewer Pro3.5 (Accelrys Inc., США).

У розділі 3 наведені результати досліджень процесу зв’язування лізоциму з модельними ліпідними мембранами. При цьому використовували одну з модифікацій методу флуоресцентної спектроскопії, яка ґрунтується на ковалентному міченні білка флуоресцеїном (Fl) по залишкам лізину. Ізотерми адсорбції отримували, вимірюючи ліпід-індуковане зменшення інтенсивності флуоресценції Fl на довжині хвилі 514 нм () в залежності від концентрації ліпіду.

Рис. 1. Зменшення інтенсивності флуоресценції флуоресцеїн-міченого лізоциму (Lz-Fl) на довжині хвилі 514 нм () як функція загальної концентрації ліпіду. Концентрація білка – 0.15 мкМ. Безперервними лініями представлені теоретичні криві, розраховані в рамках мономодальної моделі адсорбції (, ефективний заряд лізоциму (А) та (Б)).

Криві зв’язування лізоциму з модельними мембранами, що складались із сумішей ФХ та ФГ (5 та 10 мол. %), ФС (5 та 10 мол. %) чи КЛ (2.6 та 5.3 мол. %) мали типову гіперболічну форму (рис. 1) та були описані мономодальною моделлю електростатично-контрольованої адсорбції. Як проілюстровано на рис. 2, зростає із підвищенням концентрації ліпіду, тобто зі зниженням поверхневої густини сорбованого білка.

Рис. 2. Константи асоціації, отримані за результатами апроксимації даних, представлених на рис. 1, моделлю мономодальної адсорбції.

При підвищенні вмісту аніонних ліпідів спостерігалася зміна форми кривих зв’язування з гіперболічної на сигмоїдну (рис. 3, А, Б). Однією з можливих інтерпретацій нетипової форми ізотерм адсорбції може бути електростатично-контрольоване зростання константи асоціації при підвищенні концентрації ліпіду (рис. 3, В, Г). Однак цей ефект навряд чи лежить в основі зміни форми ізотерм з гіперболічної на сигмоїдну при зростанні поверхневої густини заряду ліпідного бішару, оскільки ні мономодальною, ні мультимодальною моделями адсорбції не вдалося апроксимувати отримані криві зв’язування. Тому масиви даних були проаналізовані в рамках моделі двох станів та кластерної моделі, які враховують можливість самоасоціації зв’язаного білка.

Рис. 3. А, Б: Ізотерми адсорбції Lz-Fl на поверхні модельних ліпідних мембран. Концентрація білка – 0.15 мкМ. Безперервними лініями представлені теоретичні криві, розраховані в рамках моделі двох станів (, , (А), (Б), константа утворення -мерів (А), (Б)). В, Г: Залежність константи асоціації від концентрації ліпіду для ліпосом з підвищеним вмістом аніонних ліпідів.

Виявилося, що тільки модель двох станів придатна для опису сигмоїдної форми ізотерм адсорбції. Це означає, що лізоцим, сорбований на поверхні мембрани, утворює самоасоціати. Встановлено, що мінімальний ступінь олігомеризації лізоциму (), необхідний для забезпечення сигмоїдної форми ізотерм адсорбції, становить 4, вказуючи на те, що переважною формою агрегатів білка є тетрамери. Необхідно також відзначити, що сигмоїдна форма кривих зв’язування була виявлена тільки для мономерів лізоциму. Це дозволяє припустити, що в основі спостережуваного зниження інтенсивності флуоресценції флуоресцеїну при утворенні білок-ліпідних комплексів лежить адсорбція мономерів лізоциму на поверхні мембрани та перенос мітки в примембранне оточення зі зниженим значенням рН.

Розділ 4 присвячено вивченню структурних змін лізоциму та модельних мембран при утворенні білок-ліпідних комплексів методами флуоресцентних зондів, гасіння власної флуоресценції білка та часороздільної флуоресцентної спектроскопії.

Рис. 4. Профілі гасіння власної флуоресценції вільного (А) та зв’язаного з КЛ25 везикулами (Б) лізоциму акриламідом. Концентрація білка – 0.39 мкМ, ліпіду – 49.5 мкМ.

Власна флуоресценція лізоциму визначається шістьма залишками триптофану. Домінантними флуорофорами є Trp62 та Trp108. Гасіння триптофанової флуоресценції лізоциму акриламідом супроводжується короткохвильовим зсувом максимума спектру флуоресценції (~ 6 нм), що обумовлено різною доступністю окремих залишків Trp гаснику.

Таблиця 1. Константи Штерна-Фольмера для гасіння флуоресценції лізоциму акриламідом (, М-1)

Система | Довжина хвилі випромінювання, нм

320 | 330 | 340 | 350 | 360 | 370

Буфер | 4.8±0.1 | 5.5±0.11 | 6.8±0.07 | 7.2±0.06 | 7.6±0.06 | 7.8±0.05

ФХ | 2.3±0.02 | 2.7±0.16 | 3.4±0.02 | 3.6±0.02 | 4.1±0.03 | 4.0±0.03

ФГ5 | 3.9±0.11 | 4.5±0.09 | 5.5±0.08 | 5.8±0.08 | 6.0±0.09 | 6.0±0.08

ФГ10 | 3.7±0.08 | 4.2±0.08 | 5.2±0.06 | 5.3±0.05 | 5.5±0.06 | 5.7±0.07

ФГ20 | 2.5±0.02 | 2.7±0.02 | 3.3±0.03 | 3.6±0.04 | 3.9±0.03 | 4.2±0.05

ФГ40 | 1.9±0.14 | 2.1±0.02 | 2.5±0.02 | 2.7±0.02 | 2.8±0.02 | 3.0±0.01

ФС5 | 3.6±0.08 | 4.2±0.08 | 5.0±0.06 | 5.4±0.06 | 5.6±0.07 | 5.6±0.08

ФС10 | 3.4±0.06 | 4.0±0.07 | 4.9±0.04 | 5.1±0.05 | 5.3±0.04 | 5.5±0.05

ФС20 | 2.6±0.03 | 2.9±0.02 | 3.4±0.02 | 3.7±0.02 | 3.9±0.03 | 4.1±0.02

ФС40 | 1.9±0.01 | 2.2±0.01 | 2.6±0.02 | 2.8±0.02 | 3.0±0.01 | 3.1±0.01

КЛ2.6 | 3.9±0.09 | 4.6±0.09 | 5.6±0.08 | 5.8±0.07 | 6.0±0.08 | 6.3±0.08

КЛ5.3 | 2.9±0.04 | 3.5±0.04 | 4.2±0.03 | 4.5±0.03 | 4.6±0.03 | 4.7±0.04

КЛ11 | 2.0±0.01 | 2.3±0.01 | 2.7±0.01 | 2.9±0.02 | 3.0±0.03 | 3.0±0.02

КЛ25 | 1.7±0.01 | 1.9±0.01 | 2.3±0.01 | 2.3±0.02 | 2.5±0.01 | 2.5±0.02

Як наслідок, графіки Штерна-Фольмера характеризуються залежністю від довжини хвилі випромінювання (рис. 4). На основі аналізу набору кривих гасіння, отриманих у присутності різних видів ліпосомальних мембран, були визначені константи Штерна-Фольмера () (таблиця 1). Як слідує з таблиці 1, асоціація лізоциму з ліпідними везикулами викликає помітне зниження , причому величина цього ефекту зростає з підвищенням заряду ліпосомальних мембран.

Той факт, що величини змін константи гасіння відносно буферу практично не залежать від довжини хвилі вказує на те, що в основі виявлених ефектів лежить модифікація мікрооточення двох головних довгохвильових флуорофорів лізоциму, розташованих в активному центрі білка – Trp62 та Trp108. Було зроблено висновок, що найбільш імовірною причиною зменшення ефективності гасіння триптофанової флуоресценції є формування міжмолекулярних контактів між мономерними молекулами лізоциму, які утворюють агрегати при зв’язуванні білка з мембраною.

Для отримання більш детальної інформації про характер конформаційних змін лізоциму при утворенні білок-ліпідних комплексів використовували метод часороздільної флуоресцентної спектроскопії. Дослідження кінетики затухання флуоресценції та анізотропії флуоресценції лізоциму показали, що взаємодія білка з везикулами індукує зменшення усередненого часу життя (<ф>) та зростання часів обертальної кореляції ( та ) і залишкової анізотропії () (таблиця 2).

Аналіз можливих причин виявлених ефектів дозволив припустити, що в основі спостережуваних змін параметрів власної флуоресценції лізоциму лежать міжмолекулярні контакти, в яких приймає участь Trp62, розташований в активному центрі білка.

Для з’ясування молекулярних механізмів модифікуючої дії лізоциму на структурно-динамічні властивості модельних ліпідних мембран використовували мембранні зонди пірен і діфенілгексатрієн (ДФГТ) та два нові сквараїнові зонди SQ-1 і К1350.

Таблиця 2. Параметри затухання флуоресценції та анізотропії флуоресценції триптофанових залишків лізоциму на довжині хвилі 340 нм

Концентрація

лізоциму, мкМ | <ф>, нс | , Ч10-2

У розчині

0.08 | 2.29±0.31 | 0.18±0.02 | 5.91±0.73 | 3.2±0.51

У присутності ФГ20 ліпосом

0.08 | 1.92±0.12 | 0.27±0.03 | 6.21±0.79 | 4.7±0.62

0.17 | 1.74±0.19 | 0.29±0.03 | 8.3±0.93 | 6.1±0.71

0.25 | 1.46±0.11 | 0.36±0.06 | 10.4±1.2 | 7.3±0.94

0.33 | 1.39±0.09 | 0.39±0.05 | 13.1±2.0 | 9.8±1.33

Встановлено, що утворення лізоцим-ліпідних комплексів ініціює зменшення ступеня ексимеризації пірену (рис. 5, А), який визначається відношенням інтенсивності флуоресценції ексимерів до інтенсивності флуоресценції мономерів зонду (Е/М). Зміни цього параметру відображають зміни вільного об’єму мембрани, що характеризує різницю між ефективним та ван-дер-ваальсовим об’ємами ліпідних молекул. З огляду на те, що пірен локалізується в неполярній зоні ліпідного бішару, отримані дані свідчать про проникнення молекули білка в гідрофобну область мембрани. Це призводить до зниження вільного об’єму бішару, молекулярною основою якого є обмеження різних видів рухливості ліпідних молекул, зростання щільності їх пакування та гальмування транс-гош-ізомеризації ацильних ланцюгів. Виявлено, що величина конденсуючої дії лізоциму зростає при підвищенні поверхневого електростатичного потенціалу ліпідного бішару.

Докази на користь зменшення вільного об’єму модельних мембран при утворенні білок-ліпідних комплексів були отримані також при дослідженні анізотропії флуоресценції ДФГТ (рис. 5, Б, В). Асоціація лізоциму з нейтральними ліпосомами та везикулами, які містили <10 мол. % аніонних ліпідів, не призводила до змін анізотропії зонду. Однак для мембран з більш високим вмістом аніонних ліпідів додавання білка ініціювало значне підвищення анізотропії ДФГТ, що відображає зменшення вільного об’єму мембрани при вбудовуванні лізоциму.

Рис. 5. А: Вплив лізоциму на ступінь ексимеризації пірену в ліпосомах із різним вмістом КЛ. Концентрація ліпіду – 1.6 мМ, пірену – 13 мкМ. Б, В: Зміни анізотропії флуоресценції ДФГТ при утворенні комплексів лізоциму з фосфоліпідами. Концентрації ліпіду та ДФГТ складали 24 та 0.06 мкМ, відповідно.

Необхідно також відзначити, що порівняння значень молярного відношення ліпід:білок, при яких здогадно відбувається агрегація (5-80), із тими, при яких лізоцим викликає зменшення вільного об’єму мембрани (40-300), дозволяє зробити важливий висновок – занурення білка в бішар передує його самоасоціації.

Для подальшої ідентифікації чинників, відповідальних за вплив лізоциму на молекулярну організацію ліпідного бішару, були залучені два нових сквараїнових зонда – SQ-1 та К1350.

Зв’язування SQ-1 з ліпосомами призводило до значного зростання інтенсивності флуоресценції та квантового виходу (з 0.19 до 0.57) зонду. Утворення лізоцим-ліпідних комплексів супроводжувалось суттєвим зниженням флуоресценції SQ-1. На основі аналізу розподілу зонду між ліпідною та білковою фазами були визначені спектральні параметри SQ-1 (коефіцієнти розподілу, , та молярна флуоресценція, ) в системах ліпосоми+лізоцим (таблиця 3). Встановлено, що взаємодія білка з везикулами призводить до зростання молярної флуоресценції SQ-1, що може бути результатом дегідратації бішару внаслідок вбудовування лізоциму. У той же час, коефіцієнти розподілу характеризувались неоднозначною поведінкою – додавання лізоциму викликало зменшення в усіх ліпідних системах, окрім КЛ10, де спостерігалося зростання коефіцієнту розподілу. Зниження в білок-ліпідних системах можна пояснити зануренням лізоциму в бішар, яке запобігає проникненню SQ-1 у внутрішній простір мембрани. Висловлено припущення, що зростання у КЛ10 ліпосомах обумовлено латеральним перерозподілом ліпідних молекул при сорбції лізоциму на поверхні протилежно заряджених мембран, який забезпечує мінімізацію електростатичної вільної енергії зв’язування.

Таблиця 3. Параметри розподілу SQ-1 в ліпідних та білок-ліпідних системах

Система | Коефіцієнт розподілу | , Ч10-7 M-1

ФХ | без білка | 2030±325 | 3.3±0.5

+лізоцим | 951±79 | 9.8±0.9

КЛ2.5 | без білка | 939±97 | 7.5±0.6

+лізоцим | 331±23 | 10.1±1.1

КЛ5 | без білка | 1079±147 | 6.4±0.3

+лізоцим | 545±72 | 8.4±0.8

КЛ10 | без білка | 1468±205 | 3.7±0.4

+лізоцим | 1933±187 | 5.9±0.3

Додаткова інформація про характер модифікуючої дії лізоциму на структурний стан модельних мембран була отримана при аналізі розподілу К1350 в ліпідних та білок-ліпідних системах. Виявлене зменшення інтенсивності флуоресценції зонду при утворенні комплексів лізоциму з фосфоліпідами було інтерпретовано в рамках дегідратації бішару та зростання щільності пакування ацильних ланцюгів ліпідних молекул.

У розділі 5 за допомогою методу індуктивно-резонансного переносу енергії охарактеризована просторова організація лізоцим-ліпідних комплексів. Донорами енергії слугували триптофанові залишки лізоциму, а акцепторами – антрілвінільні флуорофори, ковалентно приєднані до ФХ або ФГ (АВ-ФХ та АВ-ФГ).

Рис. 6. Ефективність переносу енергії у ФГ40 ліпосомах як функція молярного відношення акцептор:ліпід при концентрації ліпіду 5 мкМ. Р – загальна концентрація лізоциму.

Ефективність переносу енергії визначали шляхом вимірювання зростання інтенсивності флуоресценції акцептора у присутності донора. На рис. 6 зображено ефективність ІРПЕ при різних значеннях молярного відношення акцептор:ліпід. Аналіз цих кривих в рамках моделі переносу енергії в мембранних системах, яка враховує залежність ефективності переносу від поверхневої концентрації акцептора та залежність орієнтаційного фактору від відстані між донором та акцептором, дозволив оцінити локалізацію донорів відносно центру бішару, (таблиця 4). Отримані значення відповідають зануренню молекули лізоциму у внутрішню область мембрани на глибину ~ 1.7 нм.

Таблиця 4. Локалізація лізоциму в ліпідному бішарі

Концентрація лізоциму, мкМ | Відстань Trp від центру бішару, нм | Глибина проникнення лізоциму в бішар, нм

0.08 | 1.8±0.4 | 1.9±0.4

0.16 | 2.0±0.5 | 1.7±0.5

0.24 | 2.2±0.5 | 1.5±0.5

При такому розташуванні білка відносно поверхні розділу ліпід-вода триптофанові залишки локалізуються у полярній зоні ліпідного бішару. Отримані дані підтверджують гіпотезу, згідно з якою визначальна роль у зв’язуванні лізоциму з мембраною належить структурному мотиву спіраль-петля-спіраль, що охоплює амінокислотні залишки від Asp87 до Arg114. Неполярна частина цього домену (залишки 87-95) вбудовується у бішар та виконує роль якоря, тоді як термінальні позитивно заряджені залишки (Arg112, Arg114) утворюють електростатичні контакти з аніонними фосфоліпідами. Необхідно відзначити, що залучення АВ-ФГ замість АВ-ФХ у якості акцептора енергії у ФГ40 мембранах призвело до зростання ефективності ІРПЕ (рис. 6). Було зроблено припущення, що в основі даного ефекту лежить викликаний лізоцимом латеральний перерозподіл ліпідних молекул, наслідком чого є відхилення локальної концентрації ФГ у зоні сорбції білка від його середньої концентрації. Врахування цього явища в моделі переносу енергії дозволило визначити розмір ділянки із підвищеною концентрацією аніонного ліпіду. Ця величина складала 3.4 нм, що порівнянно із розмірами білка.

Сукупність отриманих у роботі даних дозволяє запропонувати наступну концептуальну модель зв’язування лізоциму з мембранами. Первинною стадією цього процесу є адсорбція білка на поверхні мембрани, яка ініціюється електростатичними білок-ліпідними взаємодіями. Другий етап включає декілька процесів: а) дестабілізацію структури лізоциму, б) модифікацію структурно-динамічного стану ліпідного бішару, в) занурення білка у внутрішній простір мембрани. Останній етап – агрегація мембранозв’язаного лізоциму, що контролюється як електростатичними, так і гідрофобними білок-ліпідними взаємодіями.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі зроблено внесок у вирішення однієї з найважливіших проблем сучасної молекулярної біофізики – встановлення фізико-хімічних закономірностей білок-ліпідних взаємодій. З використанням різних модифікацій методу флуоресцентної спектроскопії проведене комплексне дослідження асоціації лізоциму з модельними ліпідними мембранами. Отримані у роботі дані формують підґрунтя для розуміння молекулярних механізмів, що лежать в основі реалізації біологічних функцій білка.

1. Розвинуті моделі електростатично-контрольованої адсорбції білка на поверхні мембрани, які враховують можливість самоасоціації зв’язаного ліганду. В рамках цих моделей визначені рівноважні параметри зв’язування лізоциму з модельними мембранами різного складу.

2. Вперше виявлено зміни форми ізотерм адсорбції білка з гіперболічної на сигмоїдну при підвищенні поверхневого електростатичного потенціалу ліпідного бішару. Доведено, що це є наслідком агрегації мембранозв’язаного лізоциму. Показано, що хімічна природа фосфоліпідів впливає на кількісні, але не на якісні характеристики адсорбційної поведінки лізоциму.

3. Методом гасіння власної флуоресценції білка та часороздільної флуоресцентної спектроскопії виявлено обмеження внутрішньомолекулярної рухливості лізоциму при зв’язуванні з ліпідним бішаром. Встановлено, що найбільш імовірною причиною цього ефекту є утворення міжмолекулярних контактів між мономерами білка. Отримані аргументи на користь безпосередньої участі Trp62 в олігомеризації лізоциму.

4. З використанням мембранних флуоресцентних зондів пірену та ДФГТ виявлено зменшення вільного об’єму ліпідного бішару та ступеня упорядкування ацильних ланцюгів ліпідів внаслідок занурення лізоциму в гідрофобну область мембрани. Встановлено, що конденсуюча дія білка на ліпідний бішар посилюється при зростанні поверхневого електростатичного потенціалу мембрани.

5. Вперше проведено дослідження спектральних властивостей нових сквараїнових зондів у ліпідних та білок-ліпідних системах. Показано, що цим флуорофорам притаманна висока чутливість до змін фізико-хімічних властивостей ліпідного бішару. На основі аналізу розподілу сквараїнових зондів між ліпідною та білковою фазами охарактеризовано закономірності впливу лізоциму на структурно-динамічний стан ліпідних мембран. Визначені наступні механізми дії білка на молекулярну організацію ліпідного бішару: дегідратація мембрани, упорядкування ацильних ланцюгів, латеральний перерозподіл ліпідних молекул.

6. За допомогою методу індуктивно-резонансного переносу енергії досліджено просторову організацію комплексів лізоциму з ліпідами. Визначена глибина занурення білка у ліпідний бішар. Вперше методом ІРПЕ отримані докази на користь латерального перерозподілу ліпідних молекул при сорбції білка.

7. На основі узагальнення сукупності отриманих даних запропонована концептуальна модель взаємодії лізоциму з ліпідами, яка передбачає таку послідовність подій: адсорбція білка на поверхні ліпідного бішару > дестабілізація структури білка > модифікація структурно-динамічного стану мембрани > вбудовування лізоциму в ліпідний бішар > агрегація мембранозв’язаного білка.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ioffe V.M., Gorbenko G.P. Lysozyme effect on structural state of model membranes as revealed by pyrene excimerization studies // Biophys. Chem. – 2005. – Vol. 114. – P. 199-204.

2. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Cardiolipin effect on the lipid bilayer structure: pyrene excimerization study // Вісник ХНУ імені В.Н. Каразіна № 665, Біофізичний вісник. – 2005. – Т. 15(1). – С. 104-107.

3. Gorbenko G.P., Ioffe V.M., Kinnunen P.K.J. Thioflavin T behavior in lysozyme-lipid systems // Вісник ХНУ імені В.Н. Каразіна № 716, Біофізичний вісник. – 2005. – Т. 16(2). – С. 30-33.

4. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A., Tatarets A.L., Patsenker L.D., Terpetsching E.A., Dyubko T.S. A new fluorescent squaraine probe for the measurement of membrane polarity // J. Fluoresc. – 2006. – Vol. 16 (1). – P. 47-52.

5. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Tatarets A.L., Patsenker L.D., Terpetschnig E.A. Examining protein-lipid interactions in model systems with a new squarylium fluorescent dye // J. Fluoresc. – 2006. – Vol. 16 (4). – P. 547-554.

6. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Kinnunen P.K.J., Tatarets A.L., Kolosova O.S., Patsenker L.D., Terpetschnig E.A. Tracing lysozyme-lipid interactions with long-wavelength squaraine dyes // J. Fluoresc. – 2007. – Vol. 17. – P. 65-72.

7. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Deligeorgiev T., Gadjev N., Vasilev A. Fluorescence study of protein-lipid complexes with a new symmetric squarylium probe // Biophys. Chem. – 2007. – Vol. 128. – P. 75-86.

8. Gorbenko G.P., Ioffe V.M., Kinnunen P.K.J. Binding of lysozyme to phospholipid bilayers: evidence for protein aggregation upon membrane association // Biophys. J. – 2007. – Vol. 93. – P. 140-153.

9. Ioffe V.M., Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Structure of model lipid and protein-lipid membranes as revealed by pyrene excimerization studies // Тези доп. I Української наукової конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики». – Харків. – 2004. – С. 126.

10. Ioffe V.M., Domanov Ye.A. Electrostatically driven lipid demixing in lipid-protein membranes as revealed by resonance energy transfer // Тези доп. IV Харківської конф. молодих вчених і науковців «Радіофізика та НВЧ електроніка». – Харків. – 2004. – С. 32.

11. Ioffe V.M., Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Estimation of the creation of liposomal form of the anticeptic preparation of lysozyme // Тези доп. науково-технічної конференції «Від фундаментальних досліджень до прогресу в медицині». – Харків. – 2005. – С. 25.

12. Ioffe V.M., Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Conformational transitions in lysozyme as revealed by fluorescence study // Труды XV Международной конференции по химической термодинамике. – Москва. – 2005. – С. 350.

13. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A. Pyrene lateral diffusion in the lipid bilayer: effect of model membrane composition // Тези доп. V Харківської конф. молодих вчених і науковців «Радіофізика та НВЧ електроніка». – Харків. – 2005. – С. 104.

14. Ioffe V.M., Domanov Ye.A., Gorbenko G.P. Fluorescence study into lysozyme effect on the structure of model membranes // Proc. of the 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress. – Montpellier, France. – 2005. – published in European Biophysics Journal, V. 34. – P. 699.

15. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Kinnunen P.K.J. Pyrene maleimide as a probe for monitoring lysozyme aggregation upon membrane association // Тези доп. II Всеукраїнської науково-технічної конференції «Актуальні питання теоретичної та прикладної фізики та біофізики. Фізика. Біофізика – 2006». – Севастополь. – 2006. – С. 60.

16. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A., Kinnunen P.K.J. Lysozyme forms amyloid-like fibers in lipid environment // Тези доп. IV З’їзду Українського Біохімічного товариства. – Харків. – 2006. – С. 18.

17. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Deligeorgiev T., Vasilev A., Gadjev N. Fluorescence anisotropy studies of lysozyme-lipid interactions // Тези доп. IV З’їзду Українського Біофізичного товариства. – Донецьк. – 2006. – С. 297.

18. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Deligeorgiev T., Vasilev A., Gadjev N. A new squarylium probe for biomedical applications // Proc. of the International Symposium on Organic Chemistry. – Sofia, Bulgaria. – 2006. – P. 84.

19. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Kinnunen P.K.J. Formation of lysozyme aggregates in membrane environment // Proc. of the VI European Biophysics Congress. – London, UK. – 2007. – P. 3.

20. Ioffe V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A., Kinnunen P.K.J. Time-resolved fluorescence probing of lysozyme-lipid association // Proc. of the 10th Conference on Methods and Applications in Fluorescence. – Salzburg, Austria. – 2007. – P. 257.

21. Ioffe V.M., Gorbenko G.P. Cholesterol effect on structural state of model lipid membranes // Тези доп. III Всеукраїнської науково-технічної конференції «Актуальні питання теоретичної та прикладної фізики та біофізики. Фізика. Біофізика – 2007» – Севастополь. – 2007. – С. 77.

22. Trusova V.M., Gorbenko G.P., Domanov Ye.A., Kinnunen P.K.J. Protein-lipid interactions as determinant of lysozyme fibrillization // Proc. of Keystone Symposium «Molecular Basis for Biological Membrane Organization». – Big Sky, Montana, USA. – 2008. – P. 70.

АНОТАЦІЯ

Трусова В.М. Взаємодія лізоциму з модельними ліпідними мембранами. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2008.

Досліджені молекулярні механізми взаємодії лізоциму з модельними ліпідними мембранами різного складу. В рамках континуальних моделей електростатично-контрольованої адсорбції визначені рівноважні параметри зв’язування білка з ліпідами. Отримані докази на користь утворення агрегатів лізоциму при підвищенні поверхневого електростатичного потенціалу ліпідного бішару. Виявлено обмеження внутрішньомолекулярної рухливості лізоциму при зв’язуванні з ліпосомами. Встановлено, що асоціація лізоциму з ліпідами призводить до зменшення вільного об’єму мембрани, дегідратації бішару, упорядкування ацильних ланцюгів ліпідів, латерального перерозподілу ліпідних молекул. Охарактеризовано просторову організацію лізоцим-ліпідних комплексів. Запропоновано концептуальну модель взаємодії лізоциму з мембранами.

Ключові слова: лізоцим, білок-ліпідні взаємодії, моделі адсорбції, конформаційні переходи лізоциму, структурні зміни ліпідного бішару, агрегація білка.

АННОТАЦИЯ

Трусова В.М. Взаимодействие лизоцима с модельными липидными мембранами. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2008.

Исследованы молекулярные механизмы взаимодействия лизоцима с модельными липидными мембранами различного состава. В рамках континуальных моделей электростатически-контролируемой адсорбции определены равновесные параметры связывания белка с липидами. Получены доказательства образования агрегатов лизоцима при повышении поверхностного электростатического потенциала липидного бислоя. Обнаружено ограничение внутримолекулярной подвижности лизоцима при связывании с липосомами. Установлено, что ассоциация лизоцима с липидами приводит к снижению свободного объема мембраны, дегидратации бислоя, упорядочению ацильных цепей липидов, латеральному перераспределению липидных молекул. Охарактеризована пространственная организация лизоцим-липидных комплексов. Предложена концептуальная модель взаимодействия лизоцима с мембранами.

Ключевые слова: лизоцим, белок-липидные взаимодействия, модели адсорбции, конформационные переходы лизоцима, структурные изменения липидного бислоя, агрегация белка.

SUMMARY

Trusova V.M. Lysozyme interactions with model lipid membranes. – Manuscript.

Thesis for a candidate degree by speciality 03.00.02 – Biophysics. – V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2008.

Lysozyme, a hydrolytic enzyme displaying antimicrobial, antitumor and immune modulatory activities, plays an important role in a variety of biological and physiological processes. First, lysozyme catalyzes hydrolysis