МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ ІМЕНІ П.Л. ШУПИКА

Владимирова Інна Миколаївна

УДК:615.322:635.356:615.243:615.451.16:615.453

Фармакогностичне вивчення капусти брокколі та створення на її основі лікарських засобів

15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі хімії природних сполук Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

КИСЛИЧЕНКО ВІКТОРІЯ СЕРГІЇВНА

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри хімії природних сполук

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

ЦУРКАН ОЛЕКСАНДР ОЛЕКСАНДРОВИЧ

ДУ «Інститут фармакології та токсикології»

АМН України, завідувач Державної лабораторії

з контролю якості лікарських засобів

кандидат фармацевтичних наук, доцент

ТОДОРОВА ВІОЛЕТА ІВАНІВНА

Національна медична академія післядипломної

освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України,

доцент кафедри фармацевтичної хімії

і фармакогнозії

Захист відбудеться „--_” ___червня____ 2008 р. о __14.00__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Національній медичній академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика за адресою: 04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9).

Автореферат розісланий „__3__”__травня______ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Л.Б. Пилипчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важливим завданням фармації є розробка нових лікарських засобів рослинного походження, які мають ряд переваг перед синтетичними препаратами: максимально наближені до організму людини за біологічною природою вони практично не мають побічної дії, відрізняються низькою алергенністю і токсичністю, можливістю тривалого застосування без формування звикання та залежності. Актуальним питанням при вирішенні даної задачі є визначення пріоритетних напрямків наукових досліджень фармацевтичної галузі, одним з яких є розробка лікарських засобів для лікування захворювань шлунково-кишкового тракту (ШКТ), а саме виразкової хвороби гастродуоденальної зони. Важливою при цьому залишається проблема розширення арсеналу лікарських засобів рослинного походження, а саме засобів з противиразковою, антимікробною та протизапальною дією. Особливої уваги заслуговують рослини, які мають багатовіковий досвід використання у народній медицині. До таких рослин відносяться види роду Brassica, які широко культивуються на всій території України і мають достатню сировинну базу.

У зв'язку з цим нашу увагу привернула капуста брокколі (Brassica oleracea L. var. italica Plenck родини капустяних Brassicaceae), яка широко використовується в народній медицині при захворюваннях ШКТ як дієтичний продукт, входить до складу біологічно активних добавок, що випускаються за кордоном. Тому капуста брокколі є перспективним джерелом одержання субстанцій для отримання фітозасобів вітчизняного виробництва з широким спектром фармакологічної дії при захворюваннях ШКТ.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету за темою “Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження” (номер державної реєстрації 0103U000476) і проблемної комісії “Фармація” МОЗ України.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було вивчення різних груп біологічно активних речовин (БАР) трави капусти брокколі (Brassica oleracea L. var. italica Plenck) сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда, отримання субстанцій, встановлення їх фармакологічної активності, вивчення можливості створення на їх основі лікарських засобів, стандартизація сировини та отриманих фітозасобів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

- провести аналіз сучасних літературних даних з питань ботанічних ознак, поширення, хімічного складу капусти брокколі і застосування її в медицині;

- провести попереднє дослідження хімічного складу трави Brassica oleracea L. var. italica Plenck сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда;

- виділити в індивідуальному стані БАР з трави Brassica oleracea L. var. italica Plenck і встановити їх структуру;

- отримати субстанції з трави брокколі (сухий екстракт 1:5 спиртовий, сухий екстракт 1:10 водний, біологічно активну рідину);

- визначити кількісний вміст основних груп БАР в траві Brassica oleracea L. var. italica Plenck сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда та отриманих субстанціях;

- розробити лікарську форму з екстрактом капусти брокколі (таблетки);

- провести вивчення анатомічної будови і встановити діагностичні ознаки трави брокколі;

- провести стандартизацію трави Brassica oleracea L. var. italica Plenck, сухих екстрактів та таблеток та розробити проекти аналітичної нормативної документації (АНД);

- підтвердити перспективність створення лікарських засобів на основі капусти брокколі шляхом вивчення її фармакологічних властивостей.

Об’єкти дослідження. Трава Brassica oleracea L. var. italica Plenck сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда, культивованих в Україні, сухий екстракт 1:5 спиртовий, сухий екстракт 1:10 водний, біологічно активна рідина з трави брокколі та таблетки з екстрактом капусти брокколі.

Предмет дослідження. Виявлення, виділення та ідентифікація БАР трави капусти брокколі сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда; показники якості трави Brassica oleracea L. var. italica Plenck сортів, що досліджувались, сухого екстракту 1:5 спиртового, сухого екстракту 1:10 водного, біологічно активної рідини та таблеток з екстрактом капусти брокколі; створення на їх основі нових лікарських засобів та вивчення їх фармакологічної активності.

Методи дослідження. Якісний склад і кількісний вміст БАР визначали з використанням тонкошарової хроматографії (ТШХ), паперової хроматографії (ПХ), високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), газорідинної хроматографії (ГРХ) та хромато-мас-спектрометрії (ХМС), специфічними якісними реакціями, титриметричними, гравіметричним та спектрофотометричним методами. Для розділення БАР використовували адсорбційну хроматографію на поліаміді, целюлозі, силікагелі, рехроматографію, препаративну хроматографію та дробну кристалізацію. Хімічну будову виділених сполук встановлювали на основі їх хімічних перетворень, даних УФ-, ІЧ-, ПМР-спектрів та температури плавлення. Елементний склад вивчали атомно-адсорбційною спектрометрією, амінокислотний – за допомогою амінокислотного аналізатора LKB 4151 „Альфа Плюс”, жирнокислотний – на хроматографі "Chrom-5". Фармакологічні дослідження проводили in vivo та in vitro: антимікробну активність вивчали методом серійних розведень, протизапальну активність – на моделі зимазанового набряку, мембраностабілізуючу – за методикою визначення спонтанного гемолізу, перистальтичну активність кишечника – за методом Sticknay V.S., противиразкову – на моделі спирто-преднізолонової виразки шлунка у щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведене систематичне порівняльне вивчення якісного складу та кількісного вмісту БАР (ізотіоціанатів, тіоціанатів, сірковмісних глікозидів, полісахаридів, пектинових речовин, вільних та зв’язаних амінокислот, макро- та мікроелементів, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, кумаринів, органічних кислот, ліпофільних речовин – хлорофілів, каротиноїдів, жирних кислот, стероїдів) капусти брокколі сортів

Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска, Лінда та отриманих субстанцій.

В траві брокколі було ідентифіковано і встановлено структуру 83 речовин: 5 похідних коричної кислоти, 6 кумаринів, 9 флавоноїдів, 2 тритерпеноїдів, 1 стероїду, 2 хлорофілів, 2 органічних кислот, 4 цукрів, 16 амінокислот, 13 жирних кислот, 15 макро- та мікроелементів, 5 ізотіоціанатів, включаючи сульфорафан, 1 меркаптосполуки, 1 сесквітерпеноїду типу гвайану, 1 похідного аліфатичних кислот та 1 похідного індолу – індол-3-карбінол. Методами колонкової та препаративної хроматографії було виділено в індивідуальному стані 27 речовин. Винна кислота, умбеліферон, скополетин, дафноретин, лютеолін, астрагалін, кемпферол, кверцетин, мірицетин, азулен, 3-меркаптобензиловий ефір пропіонової кислоти та метиловий ефір 2,6-нонадієнової кислоти виділені з трави брокколі вперше.

Визначено оптимальні умови і розроблено способи одержання сухого екстракту 1:5 спиртового (новизна розробленого оригінального фітозасобу підтверджена поданою заявкою до Укрпатенту на корисну модель № u 200713316 від 06.12.2007 (Рішення про видачу патенту на корисну модель від 14.01.2008) та заявкою на винахід № a 200713298 від 06.12.2007), сухого екстракту 1:10 водного, біологічно активної рідини (внутрішньо- і міжклітинна вода рослини з розчиненими в ній БАР), розроблено технологію отримання таблеток з екстрактом капусти брокколі.

Вперше вивчено анатомічну будову сировини – надземної частини капусти брокколі і визначено діагностичні ознаки.

Вперше встановлено, що сухий екстракт 1:5 спиртовий має антимікробну, протизапальну та мембраностабілізуючу дію, сухий екстракт 1:10 водний – противиразкову, антимікробну, протизапальну дію, біологічно активна рідина – стимулює перистальтику та моторику кишечника, таблетки з екстрактом капусти брокколі – противиразкову дію.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено технологію отримання з трави брокколі сухого екстракту 1:5 спиртового з антимікробною, протизапальною та мембраностабілізуючою активністю, сухого екстракту 1:10 водного з противиразковою, антимікробною, протизапальною активністю, біологічно активної рідини зі стимулюючою активністю ШКТ та таблеток з екстрактом капусти брокколі з противиразковою активністю. Розроблено проекти АНД "Трава брокколі", "Сухий екстракт спиртовий з трави брокколі", "Сухий екстракт водний з трави брокколі" та ТУ У 15.8-31062507-010:2008 "Таблетки з екстрактом капусти брокколі".

Результати досліджень впроваджено в навчальний процес та науково-дослідну роботу кафедри якості, стандартизації та сертифікації ліків Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації Національного фармацевтичного університету; кафедри фармакогнозії з медичної ботанікою Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського; кафедри фармакогнозії Запорізького державного медичного університету; кафедри фармакогнозії Медичного інституту Української асоціації народної медицини.

Технології одержання сухого екстракту 1:5 спиртового, сухого екстракту

1:10 водного та таблеток з екстрактом капусти брокколі апробовано на обладнанні

ТОВ «ДЗ «ДНЦЛЗ», технологія одержання біологічно активної рідини апробовано на обладнанні Науково-виробничого центру натуральних продуктів ТОВ «Даніка».

Особистий внесок здобувача. Безпосередньо автором здійснено:

·

·

·

·

·

·

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладено та обговорено на науково-практичних конференціях різного рівня:

Міжвузівська студентська наукова конференція «Наукові основи створення лікарських засобів» (14-15 квітня 2005 р., м. Харків); I Міжнародна науково-практична конференція «Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів» (6-7 квітня 2006 р., м. Тернопіль); Х Международный съезд Фитофарм 2006 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов растительного происхождения» (27-30 июня 2006 г., Санкт-Петербург); ІІ Міжнародна науково-практична конференція «Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок» (12-13 жовтня 2006 р., м. Харків); Міжнародний медико-фармацевтичний конгрес «Ліки та життя 2007: Фармакотерапія та розробка лікарських засобів» (6-9 лютого 2007 р., Київ); Міжнародна науково-практична конференція «Віддалені наслідки впливу іонізуючого випромінювання» (23-25 травня 2007 р., Київ); ІІ Міжнародна науково-практична конференція «Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів» (11-12 жовтня 2007 р., Тернопіль); VII Международный симпозиум по химии природных соединений (16-18 октября 2007 г., Ташкент, Узбекистан); VII Международная конференция «Студенческая медицинская наука XXI века» (1-2 ноября 2007 г., Витебск); VII Всеукраїнська науково-практична конференція «Клінічна фармація в Україні» (15 листопада 2007 р., Харків).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових праць, з них 9 статей (у тому числі 7 у наукових фахових виданнях) та 9 тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, 5 розділів, загальних висновків, списку літературних джерел та 13 додатків. Загальний обсяг дисертації складає 212 сторінок машинописного тексту. Робота ілюстрована 41 рисунком та 46 таблицями. Обсяг основного тексту дисертації складає 153 сторінки. Список використаних літературних джерел містить 191 найменування, з них 129 кирилицею та 62 латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Ботанічна характеристика, хімічний склад представників роду Brassica і застосування в офіційній та народній медицині

В розділі наведено ботанічну характеристику видів капусти родини капустяних Brassicaceae, дані про хімічний склад і застосування в медицині капусти брокколі Brassica oleracea L. var. italica Plenck. Дані літератури свідчать, що капуста брокколі широко культивується на всій території України та застосовується в народній медицині як дієтичний продукт, у харчовій промисловості, у складі біологічно активних добавок іноземних фірм виробників. Наведені літературні дані свідчать, що трава капусти брокколі є перспективною для фармакогностичного і фармакологічного дослідження з метою створення лікарських засобів.

Дослідження хімічного складу трави капусти брокколі з виділенням і встановленням структури біологічно активних речовин

Об’єктами наших досліджень були трава брокколі сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда. Сировина була отримана при сприянні Науково-дослідного аграрного інституту овочівництва та баштанництва (м. Мерефа, Харківська обл.).

За допомогою якісних реакцій, ТШХ, ПХ в сировині сортів, що досліджувались, було виявлено полісахариди, пектинові речовини, флавоноїди, окиснювальні поліфеноли, органічні та гідроксикоричні кислоти, амінокислоти, сапоніни, кумарини, хлорофіли, стероїди, фосфоліпіди, сірковмісні сполуки.

Для вивчення якісного складу ліпофільних фракцій методом тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в ультрафіолетовому та видимому діапазонах спектра отримали тривимірні спектри флуоресценції. Аналіз одержаних спектрів дозволив зробити висновок щодо наявності хлорофілів А і В, ліпідів, поліфенолів і агліконів деяких флавоноїдів.

Методами адсорбційної хроматографії на поліаміді, целюлозі, силікагелі, рехроматографії, препаративної хроматографії та дробної кристалізації з трави брокколі сорту Тонус було виділено в індивідуальному стані 27 речовин (табл. 1). На основі фізико-хімічних властивостей речовин та продуктів їх хімічних перетворень, даних УФ, ІЧ-, ПМР-спектроскопії, порівняння з вірогідними зразками встановлено їх структури. З трави брокколі були виділені 5 похідних коричної кислоти, 6 кумаринів, 1 флавон, 4 флавонолові аглікони, 4 глікозиди флавонолів, 2 тритерпеноїди, 1 стероїд, 2 хлорофіли, 2 органічні кислоти (див. табл. 1). Винна кислота, умбеліферон, скополетин, дафноретин, лютеолін, астрагалін, кемпферол, кверцетин, мірицетин, азулен, 3-меркаптобензиловий ефір пропіонової кислоти та метиловий ефір 2,6-нонадієнової кислоти виділені з трави

брокколі вперше.

Гідроксикоричні кислоти. Речовини 2.1-2.5 давали позитивні реакції на фенольний гідроксил (з заліза (III) хлоридом, діазотованою сульфаніловою кислотою). Кислотні властивості виявлені на підставі утворення синіх плям на ПХ з бромтимоловим синім. При обробці хроматограм реактивом барбітурової кислоти плями речовин 2.4, 2.5 давали блакитне забарвлення, що свідчило про наявність у їх складі хінної кислоти. На підставі проведених досліджень з вірогідними зразками речовини 2.1-2.5 відповідно ідентифіковані як кофейна, п-кумарова, ферулова, хлорогенова та неохлорогенова кислоти (див. табл. 1).

Похідні кумарину. Речовини 2.7-2.11 на підставі якісних реакцій, флуоресценції в УФ-світлі були віднесені до гідроксикумаринів. Речовини 2.7-2.11 розщеплювалися в середовищі рідкого фенолу та оцтового ангідриду до кумарину, що дозволило віднести їх до похідних бензо-б-пірону. На підставі фізико-хімічних властивостей, УФ- та ІЧ-спектрів, а також порівняння з вірогідними зразками речовини 2.6, 2.7-2.11 ідентифіковані як кумарин, умбеліферон, скополетин, дафноретин, скополін та скимін (див. табл. 1).

Флавоноїди. З флавоноїдних сполук нами було виділено 9 речовин, які представлені агліконами та глікозидами. Речовина 2.12 є флавоновим агліконом – лютеолін, речовини 2.13-2.16 – флавоноловими агліконами – кемпферол, кверцетин, мірицетин та ізорамнетин, 2.17 та 2.18 – глікозиди кверцетину – ізокверцитрин та рутин, 2.19 – глікозидом кемпферолу – астрагалін, 2.20 – глікозидом ізорамнетину - ізорамнетин-3-О-в-D-глюкопіранозид, про що свідчили якісні реакції, хроматографічна поведінка в різних системах розчинників, дані УФ-, ІЧ- та ПМР-спектрів та результати хімічних перетворень (див. табл. 1).

Тритерпеноїди. Речовини 2.21 та 2.22 за результатами якісних реакцій і хроматографічного аналізу були віднесено до тритерпеноїдів. В ІЧ-спектрі спостерігалися смуги поглинання при 3300, 2750, 2200 см-1, які характерні при наявності гідроксильних груп, 1700 см-1, що вказує на наявність –С=О, 1600- 1620 см-1, які характерні для С=С зв’язків. При ацетилюванні та метилюванні речовини 2.21 отримували ацетати та метилати, які не давали депресії температури плавлення з відповідними ацетатами та метилатами урсолової кислоти. При ацетилюванні речовини 2.22 отримано ацетильне похідне, яке давало депресію температури плавлення проби змішування з ацетатом урсолової кислоти. В ІЧ-спектрі речовини 2.22 мають місце смуги поглинання, характерні для олеанолової кислоти. Різниця смуг поглинання, характерна для коливань СН- і СН3-груп, підтверджує, що речовина 2.21 є ізомером речовини 2.22 і відрізняється розташуванням метильних груп в кільці Е. За результатами фізико-хімічних властивостей, даних ІЧ-спектрів, у порівнянні з вірогідними зразками речовини 2.21 та 2.22 були ідентифіковані як урсолова та олеанолова кислоти (див. табл. 1).

Стероїди. Речовину 2.23 за результатами якісних реакцій, хроматографування в різних системах розчинників, значенням температури плавлення, у порівнянні з вірогідним зразком було віднесено до стероїдів та ідентифіковано як в-ситостерин (див. табл. 1).

Таблиця 1

Основні фізико-хімічні властивості речовин, виділених та ідентифікованих в траві брокколі сорту Тонус*

№ п/п | Речовина, її структурна характеристика | Джерело отримання сполуки | Тпл, °С | , град | УФ-спектр, л нм | Rf у системах розчинників

Система | Rf

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8

Похідні коричної кислоти

1. | 2.1 Кофейна кислота

(3,4-дигідроксикорична кислота) | Т | 194-195 | - | 325

300

235 | 1

3 | 0,8

0,5

2. | 2.2 п-Кумарова кислота

(4-гідроксикорична кислота) | Т | 212-214 | - | 310

228

217 | 1

3 | 0,9

0,6

3. | 2.3 Ферулова кислота

(4-гідрокси-5-метокси-корична кислота) | Т | 168-170 | - | 320

290

234 | 1

3 | 0,88

0,55

4. | 2.4 Хлорогенова кислота

(5-О-кофеїл-D-хінна кислота) | Т | 203-205 | -32 (метанол) | 325

300

245 | 1

3 | 0,62

0,7

5. | 2.5 Неохлорогенова кислота

(3-О-кофеїл-D-хінна кислота) | Т | Аморф. | +2,6 (етанол) | 325

300

243 | 1

3 | 0,64

0,75

Похідні кумарину

6. | 2.6 Кумарин | Т | 67-69 | - | - | 14 | 0,2

7. | 2.7 Умбеліферон

(7-гідроксикумарин) | Т | 228-230 | - | 231

258

327 | 4 | 0,36

8. | 2.8 Скополетин

(6-метоки-7-гідроксикумарин) | Т | 202-204 | - | 230

255

296

346 | 4 | 0,58

9. | 2.9 Дафноретин

(2-метокси-6-окси-3,7’-дикумариновий ефір) | Т | 254-256 | - | - | 4 | 0,85

10. | 2.10 Скополін

(6-метокси-7-(0-(-D-глюкопіранозил)-кумарин) | Т | 218–220– | 8,5 ДМФА | 231

330 | 18 | 0,24

11. | 2.11 Скимін (7-(0-(-D-глюкопіранозил)-кумарин) | Т | 218-220 | -80 (метанол) | 220

252

325 | 4 | 0,38

Флавони

12. | 2.12 Лютеолін (5,7,3’,4’-тетрагідроксифлавон) | Т | 232-241 | - | 255

350

410 | 1

3 | 0,82

0,11

Продовж. табл.1

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8

Флавоноли

13. | 2.13 Кемпферол (3,5,7,4'-тетрагідроксифлавон) | Т | 273-274 | - | 366

266 | 1

5 | 0,83

0,55

14. | 2.14 Кверцетин

(3,5,7,3',4'-пентагідроксифлавон) | Т | 310-312 | - | 375

268

256 | 1

5 | 0,69

0,32

15. | 2.15 Мірицетин

(3,5,7,3’,4’,5’-гексагідроксифлавон) | Т | 350-354

разл. | - | 374

272

254 | 5 | 0,18

16. | 2.16 Ізорамнетин

(3,5,7,4'-тетрагідрокси-3'-метоксифлавон) | Т | 167-170 | - | 370

265

254 | 1

5 | 0,85

0,73

Глікозиди кверцетину

17. | 2.17 Ізокверцитрин

(кверцетин-3-О-в-D-глюкопіранозид) | Т | 227-229 | -12,5

(метанол) | 355

267

256 | 1

3 | 0,52

0,36

18. | 2.18 Рутин (кверцетин-3-О-в-D-рутинозид) | Т | 189-192 | -32,3 (метанол) | 362

268

258 | 1

3 | 0,46

0,54

Глікозиди кемпферолу

19. | 2.19 Астрагалін (кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозид) | Т | 196-198 | -6,8

(етанол) | 375

270 | 1

3 | 0,69

0,37

Глікозиди ізорамнетину

20. | 2.20 Ізорамнетина 3-О-в-D-глюкопіранозид | Т | 317-319 | -30 (ДМФА) | 357

302

255 | 1

3 | 0,46

0,59

Тритерпеноїди

21. | 2.21 Урсолова кислота | Т | 280-283 | +62,5

(хлороф.) | - | 1 | 0,89

22. | 2.22 Олеонолова кислота | Т | 300-303 | +79,0 (хлороф.) | - | 1

19 | 0,9

0,44

Стероїди

23. | 2.23 в-сітостерин | Т | 134-136 | +37,5 (хлороф.) | - | 1

19 | 0,95

0,54

Хлорофіли

24. | 2.24 Хлорофіл А | Т | 117-120 | - | - | 10

11 | 0,55

0,85

25. | 2.25 Хлорофіл В | Т | 120-130 | - | - | 10

11 | 0,6

0,95

Органічні кислоти

26. | 2.26 Винна кислота | Т | 170-191 | +11,9 (етанол) | - | 7

21 | 0,78**

0,35**

Продовж. табл.1

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8

27. | 2.27 Щавлева кислота | Т | 189-190 | - | - | 7

20 | 0,80**

0,10**

Примітка: Т – трава брокколі сорту Тонус; Т – речовина з сировини виділена вперше;

* - представлені в табл. 1 речовини також виділені та ідентифіковані з трави брокколі сортів Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда; ** - плями з'явилися на хроматограмі після обробки їх реактивом бромфеноловим синім.

Системи розчинників:

№ 1 – н-бутанол-кислота оцтова-вода (4:1:2);

№ 3 – 15 % кислота оцтова;

№ 4 – хлороформ (формамід 25 %);

№ 5 – хлороформ - кислота оцтова - вода (13:6:2);

№ 7 – етилацетат-кислота мурашина-вода (3:1:1);

№ 10 – гексан-ацетон (8:2);

№ 11 – гексан-ацетон (8:4);

№ 14 – гексан (формамід 25 %);

№ 18 – толуол -н-бутанол (3:1)-вода (35;

№ 19 – н-бутанол-етилацетат (9:1);

№ 20 – н-бутанол - кислота мурашина - вода (5:0,5:2);

№ 21 – н-пропанол - концен-трований розчин аміаку (6:4).

Хлорофіли. Речовини 2.24 та 2.25, виділені з хлороформних фракцій, були визначені за допомогою фізичних, фізико-хімічних властивостей та даних хроматографічного аналізу та ідентифіковані як хлорофіли А і В відповідно (див. табл. 1).

Органічні кислоти. На підставі фізико-хімічних властивостей та хроматографічного аналізу з вірогідними зразками речовини 2.26 та 2.27 були ідентифіковані як винна та щавлева кислоти (див. табл. 1).

Хромато-мас-спектрометричне визначення речовин. Для дослідження БАР брокколі використовували газову хромато-мас-спектроскопію (ГХМС). Аналіз хроматограми та мас-спектрів основних компонентів водної витяжки з трави брокколі свідчив, що при використанні капілярної колонки з 5% феніл-95%диметилполісилоксаном спостерігалось чітке розділення багатьох компонентів брокколі – хроматограма містила більше 30 піків, що виходили з колонки протягом 15 хв. Для одержання мас-спектрів був використаний режим іонізації «електронний удар», тому молекули вихідних речовин були достатньо сильно дефрагментовані, ідентифікацію проводили за осколковими іонами і за часом утримання піків маркерів та сполук екстракту.

В траві капусти брокколі визначено 8 речовин: 4 ізотіоціанати, включаючи сульфорафан, 1 сесквітерпеноїд типу гвайану, 1 похідне аліфатичних кислот, 1 меркаптосполука та 1 похідне індолу – індол-3-карбінол (табл. 2).

Таблиця 2

Результати визначення компонентів трави брокколі

Номер піку на хроматограмі | Час утримання, хв | Молекуляр-

ний іон, М+ | Загальна формула | Ідентифіковані компоненти

1 | 3.9 | М+ 91 | C10H12O2S | пропіонова кислота, 3-меркапто-, бензиловий ефір

2 | 4.3 | М+ 100 | C10H16O2 | 2,6-нонадієнова кислота, метиловий ефір

3 | 5.7 | М+ 113 | C5H8NS | бут-3-єніл-ізотіоціанат

4 | 6.1 | М+ 128 | C10H8 | азулен

5 | 7.2 | М+ 177 | C6H11NОS2 | 4-метилсульфінілбутил ізотіоціанат

6 | 12.5 | М+ 130 | C9H9NО | 3-гідроксиметиліндол (індол-3-карбінол)

7 | 13.4 | М+ 229 | C11H21NO2S2 | 9-метилсульфонілноліл

ізотіоціанат

8 | 14.2 | М+ 231 | C11H21NS2 | 9-метилтіонолілізотіоціанат

Визначення кількісного вмісту БАР в траві брокколі

Визначено кількісний вміст полісахаридів за фракціями після знежирення сировини хлороформом: водорозчинні полісахариди (ВРПС), пектинові речовини (ПР), геміцелюлози (ГЦ) (табл. 3).

Таблиця 3

Кількісний вміст полісахаридних фракцій в траві брокколі сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда

Трава брокколі сорту | Фракції полісахаридів, %

ВРПС | ПР | ГЦ

Романеска | 10,85±0,04 | 3,10±0,02 | 31,67±0,02

Лінда | 7,04±0,03 | 4,25±0,04 | 23,22±0,04

Тонус | 3,57±0,04 | 9,99±0,03 | 7,86±0,02

Калабрайзе | 2,33±0,02 | 8,75±0,04 | 6,89±0,03

Вітамінна | 13,50±0,02 | 6,11±0,02 | 34,18±0,04

З метою порівняльного вивчення трави брокколі сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда, а також стандартизації трави брокколі проведено вивчення кількісного вмісту основних груп БАР (табл. 4).

Методом атомно-абсорбційної спектрометрії було визначено елементний склад суцвіття, листя та ґрунту брокколі сортів, що досліджувались. В сировині брокколі було виявлено 15 макро- та мікроелементів. Визначення елементного складу показало майже для всіх об’єктів таку закономірність вмісту елементів: калій>натрій>кальцій>кремній>фосфор>магній>залізо>алюміній>марганець. Крім того, в сировині брокколі, в межах можливостей виявлення методом емісійної спектрометрії, були відсутні арсен, ртуть, кобальт, сурма, ванадій та германій, що актуально у зв’язку з впливом техногенних факторів та забруднення навколишнього середовища і при розробці проектів АНД на траву брокколі.

Таблиця 4

Визначення кількісного вмісту основних груп БАР в суцвіттях та листі капусти брокколі

Група БАР | Вміст біологічно активних речовин, %

Сорт Тонус | Сорт Калабрайзе | Сорт Вітамінна | Сорт Романеска | Сорт Лінда

суцвіття | листя | суцвіття | листя | суцвіття | листя | суцвіття | листя | суцвіття | листя

Флавоноїди | 1,20±

0,01 | 1,17±

0,01 | 1,05±

0,01 | 0,41±

0,02 | 0,93±

0,03 | 0,57±

0,02 | 2,32±

0,02 | 1,91±

0,01 | 1,21±

0,01 | 1,65±

0,02

Сума окис-

нювальних поліфенолів | 14,29±

0,13 | 13,90±

0,10 | 8,11±

0,12 | 5,23±

0,13 | 12,53±

0,13 | 12,39±

0,12 | 11,83±

0,10 | 9,13±

0,12 | 12,01±

0,10 | 10,75±

0,10

Аскорбіно-ва кислота | 0,13±

0,03 | 0,11±

0,03 | 0,13±

0,02 | 0,12±

0,01 | 0,15±

0,04 | 0,13±

0,02 | 0,12±

0,02 | 0,10±

0,01 | 0,11±

0,01 | 0,10±

0,02

Гідроксикорич

ні кислоти | 4,52±

0,04 | 2,93±

0,03 | 2,31±

0,02 | 2,22±

0,03 | 3,37±

0,02 | 1,25±

0,01 | 0,66±

0,01 | 1,49±

0,02 | 1,12±

0,01 | 1,63±

0,02

Органічні кислоти | 6,43±

0,04 | 3,06±

0,03 | 6,75±

0,04 | 2,69±

0,02 | 6,50±

0,03 | 2,32±

0,02 | 5,08±

0,04 | 4,64±

0,03 | 3,94±

0,02 | 4,66±

0,01

Полісахариди | 8,76±

0,12 | 13,65±

0,15 | 12,15±

0,11 | 18,30±

0,13 | 6,24±

0,12 | 10,15±

0,14 | 5,04±

0,13 | 13,11±

0,13 | 4,80±

0,12 | 12,77±

0,14

Пектинові речовини | 24,54±

0,15 | 22,50±

0,15 | 19,12±

0,14 | 18,06±

0,13 | 20,01±

0,14 | 18,75± 0,13 | 25,51±

0,13 | 17,23± 0,12 | 16,95±

0,13 | 18,23±

0,12

Ізотіоціанати | 0,41±

0,09 | 0,39±

0,08 | 0,40±

0,08 | 0,38±

0,07 | 0,40±

0,09 | 0,39±

0,07 | 0,39±

0,08 | 0,38±

0,08 | 0,40±

0,09 | 0,39±

0,07

Тіоціанати, мг/100г | 0,94±

0,02 | 0,95±

0,01 | 0,93±

0,01 | 0,94±

0,02 | 0,91±

0,02 | 0,93±

0,01 | 0,92±

0,02 | 0,93±

0,01 | 0,91±

0,01 | 0,92±

0,02

Сірковмісні глікозиди, мг/100г | 3,49±

0,01 | 3,51±

0,02 | 3,48±

0,01 | 3,50±

0,01 | 3,47±

0,02 | 3,49±

0,02 | 3,49±

0,01 | 3,50±

0,01 | 3,48±

0,01 | 3,50±

0,02

В траві брокколі виявлено та визначено вміст 16 вільних та зв'язаних амінокислот, вісім з яких є незамінними (треонін, валін, ізолейцин, лейцин, фенілаланін, метионін, лізин і аргінін) (табл. 5). Встановлено, що в траві брокколі в найбільших кількостях містяться аспарагінова та глутамінова кислоти, пролін, гліцин, аргінін, лізин, гістидин, фенілаланін, треонін та серин. Отримані в такому обсязі дані експерименту є новими і доповнюють відомості про хімічний склад об’єктів сировини, що вивчались. Крім того, проведені дослідження дають змогу передбачити вміст амінокислот у субстанціях, отриманих на основі даної сировини.

Таблиця 5

Вміст вільних та зв’язаних амінокислот в траві брокколі

Амінокислота | Вміст вільних амінокислот | Вміст зв’язаних амінокислот

мкм/100мг | мкг/100мг | мкм/100мг | мкг/100мг

1 | 2 | 3 | 4 | 5

Аспарагінова

кислота | 2,85 | 375 | 8,0 | 1050

Треонін* | 1,3 | 155 | 3,85 | 460

Серин | 2,2 | 220 | 4,8 | 505

Глутамінова кислота | 12,2 | 1795 | 12,2 | 1795

Пролін | 4,2 | 480 | 3,85 | 440

Гліцин | 2,95 | 232 | 6,0 | 440

Продовж. табл. 5

1 | 2 | 3 | 4 | 5

Аланін | 1,0 | 90 | 5,5 | 500

Валін* | 1,1 | 120 | 4,5 | 490

Метионін* | 0,95 | 140 | 2,55 | 380

Ізолейцин* | 0,22 | 30 | 3,0 | 390

Лейцин* | 0,9 | 120 | 3,7 | 480

Тирозин | 0,7 | 130 | 0,95 | 175

Фенілаланін* | 1,9 | 310 | 2,0 | 330

Гістидин | 2,2 | 335 | 1,45 | 225

Лізин* | 4,0 | 600 | 4,2 | 610

Аргінін* | 5,7 | 990 | 4,0 | 700

Сума амінокислот | 44,59 | 6152 | 70,55 | 8970

Сума незамінних амінокислот* | 16,07 | 2465 | 27,8 | 3840

Вміст незамінних амінокислот від загальної суми кислот, % | 38,06 | 40,93

Примітка: * - незамінні амінокислоти.

З метою комплексного вивчення капусти брокколі були отримані ліпофільні фракції з трави капусти брокколі сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда, кількісний вміст яких наведений в табл. 6. Одержані ліпофільні екстракти - це парафіноподібні маси темно-зеленого кольору зі специфічним запахом. Всі ліпофільні екстракти добре розчиняються у хлороформі, гексані, ефірі, погано у спирті і не розчиняються у воді. Найбільший вміст ліпофільних речовин мав сорт Вітамінна – 5,39 %.

Таблиця 6

Вміст ліпофільних речовин у траві капусти брокколі

Назва рослинної сировини | Вміст ліпофільних речовин, %

Трава брокколі сортів | Тонус | 3,45±0,08

Калабрайзе | 3,89±0,07

Вітамінна | 5,39±0,11

Романеска | 4,62±0,10

Лінда | 3,93±0,09

В результаті дослідження жирнокислотного складу було встановлено наявність 13 жирних кислот. У траві брокколі сортів Тонус, Калабрайзе, Вітамінна, Романеска та Лінда переважали ненасичені жирні кислоти, а серед них в найбільших кількостях містились поліненасичені – лінолева та ліноленова з домінуванням останньої. Найбільший вміст ненасичених жирних кислот мав сорт Романеска (78,33 мг%). Вміст насичених жирних кислот найбільший в сорті Лінда (39,20 мг%), серед яких пальмітинова кислота переважала в усіх сортах брокколі (табл. 7).

Таблиця 7

Якісний склад та кількісний вміст жирних кислот в ліпофільних фракціях з трави брокколі

Жирна кислота | Індекс | Вміст, мг% від суми в надземних частинах сортів

Тонус | Калабрайзе | Вітамінна | Романеска | Лінда

Пальмітинова | С16:0 | 22,6702 | 20,2759 | 15,0952 | 15,6452 | 31,1110

Пальмітолеїнова | С16:1n9 | 3,2440 | 2,8478 | 2,1948 | 3,0142 | 3,7899

Маргаринова | С17:0 | 9,5044 | 7,0251 | 12,3945 | 1,7839 | -

Маргаринолеї

нова | С17:1 n 1 | - | - | 1,0566 | - | -

Стеаринова | С18:0 | 4,2882 | 3,1518 | 2,605 | 2,5179 | 4,1588

Олеїнова | С18:1n9 | 3,0809 | 1,8423 | 1,5566 | 1,7335 | 16,0554

Лінолева | С18:2n9,12 | 14,1878 | 15,6321 | 12,9534 | 1,8354 | 11,6582

Ліноленова | С18:3n9-15 | 40,1360 | 43,3066 | 44,2077 | 34,4514 | 16,2826

Арахінова | С20:0 | - | 0,9242 | 1,2469 | - | 1,4941

Гондолієва | С20:1n11 | - | - | - | - | 0,4279

Ейкозадієнова | С20:2n11,13 | - | - | - | 1,7103 | 0,5708

Бегенова | С22:0 | - | - | - | 1,7185 | 2,4337

Ерукова | С22:1 | - | - | - | 3,3597 | -

Визначено кількісний вміст каротиноїдів та хлорофілів у ліпофільних фракціях з трави брокколі сортів, що досліджувались (табл. 8). Як видно з даних табл. 8, найбільший вміст каротиноїдів - у ліпофільній фракції з трави брокколі сорту Лінда – 167,66 мг/г в перерахунку на в-каротин; найбільший вміст хлорофілів мав сорт Калабрайзе – 164,03 мг/г.

Таблиця 8

Кількісний вміст хлорофілів та каротиноїдів у ліпофільних фракціях з трави брокколі

БАР | Вміст у ліпофільних фракціях брокколі (мг/г) сортів

Тонус | Калабрайзе | Вітамінна | Романеска | Лінда

Хлорофіли | 92,91±0,15 | 164,03±0,18 | 154,58±0,17 | 29,27±0,10 | 97,47±0,12

Каротиноїди | 57,97±0,12 | 91,22±0,14 | 91,22±0,15 | 45,91±0,16 | 167,66±0,18

За результатами фітохімічного дослідження сорт Тонус був визначений найперспективнішим за кількісним вмістом груп БАР, тому саме трава брокколі сорту Тонус була обрана як сировина для отримання субстанцій.

Одержання субстанцій та фітозасобів з трави брокколі сорту Тонус, вивчення кількісного вмісту груп БАР та дослідження фармакологічних властивостей

З метою створення нових лікарських засобів рослинного походження з достатньою сировинною базою були розроблені способи одержання сухого екстракту 1:5 спиртового, сухого екстракту 1:10 водного, біологічно активної рідини та таблеток з екстрактом капусти брокколі.

Початковим етапом було визначення технологічних параметрів трави брокколі: втрата у вазі при висушуванні, питома, об’ємна, насипна маси, пористість, порозність, вільний об’єм шару, коефіцієнти поглинання екстрагентів.

Оптимальними умовами виділення БАР з сировини для сухого екстракту 1:5 спиртового є: екстракція сировини 50 % етиловим спиртом при кімнатній температурі протягом 11 годин, оптимальне співвідношення сировина-екстрагент 1:5, вихід екстракту склав 22 % від повітряно-сухої сировини; для сухого екстракту 1:10 водного: екстракція сировини гарячою водою при температурі 70-80 °С протягом 1,5-2 годин, оптимальне співвідношення сировина-екстрагент 1:10, вихід екстракту склав 31 % від повітряно-сухої сировини. Отримані екстракти - це порошки коричневого кольору, однорідного складу, з характерним запахом і специфічним смаком.

Біологічно активну рідину з трави брокколі отримували вакуумно-конденсаційним методом при температурі 36-37 °С. Одержали 80,5 л прозорої, безбарвної рідини з характерним запахом, вихід якої склав 87 % від сирої сировини.

Таблетки з екстрактом капусти брокколі (сухий екстракт 1:10 водний) одержували методом вологої грануляції з подальшим пресуванням та нанесенням дражованого покриття.

Проведено вивчення технологічних показників сухих екстрактів і таблеток та встановлено параметри їх стандартизації.

З метою стандартизації одержаних субстанцій проведено вивчення кількісного вмісту БАР (табл. 9).

Таблиця 9

Визначення кількісного вмісту основних груп БАР в субстанціях брокколі, одержаних з сорту Тонус

Група БАР | Вміст БАР, %

Сухий екстракт 1:5 спиртовий | Сухий екстракт 1:10

водний

Флавоноїди | 2,78±0,02 | 1,12±0,01

Сума окиснювальних поліфенолів | 7,84±0,09 | 13,32±0,08

Аскорбінова кислота | 0,65±0,03 | 1,01±0,02

Гідроксикоричні кислоти | 6,99±0,02 | 4,98±0,03

Органічні кислоти | 3,87±0,09 | 6,89±0,07

Полісахариди | 10,55±0,11 | 29,95±0,09

Пектинові речовини | 11,17±0,12 | 17,10±0,10

При визначенні кількісного вмісту груп БАР в отриманих екстрактах брокколі встановлено, що запропонована технологія одержання екстрактів забезпечує майже повну екстракцію БАР, які вивчались.

Методом атомно-абсорбційної спектрометрії було визначено елементний склад сухих екстрактів та біологічно активної рідини та встановлено наявність 15 макро- та мікроелементів. Спостерігався високий вміст заліза, кремнію, фосфору, марганцю, алюмінію, магнію, кальцію, натрію та калію. В результаті дослідження амінокислотного складу за допомогою амінокислотного аналізатора LKB 4151 „Альфа Плюс”в сухих екстрактах брокколі виявлено 16 вільних та зв'язаних амінокислот, вісім з яких є незамінними. Встановлено, що в зразках переважають аспарагінова та глутамінова кислоти, пролін, гліцин, аргінін, лізин, гістидин, фенілаланін, треонін та серин.

Методом ГХМС проведено вивчення біологічно активної рідини брокколі. Встановлено наявність 1 похідного індолу та 6 сірковмісних сполук, з яких 1 похідне аліфатичної кислоти та 5 глюкозинолатів: 4 алкілглюкозинолати та 1 арилглюкозинолат (табл. 10).

Таблиця 10

Результати визначення компонентів у біологічно активній рідині брокколі

Номер

піку на хроматограмі | Час утримання, хв | Молекуляр-

ний іон, М+ | Загальна формула | Ідентифіковані компоненти

1 | 3.9 | М+ 91 | C10H12O2S | пропіонова кислота, 3-меркапто- бензиловий ефір

2 | 5.7 | М+ 113 | C5H8NS | бут-3-єніл-ізотіоціанат

3 | 5.9 | М+ 118 | C8H13N | фенілацетонітрил

4 | 7.2 | М+ 177 | C6H11NОS2 | 4-метилсульфінілбутил ізотіоціанат

5 | 12.5 | М+ 130 | C9H9NО | 3-гідроксиметиліндол (індол-3-карбінол)

6 | 12.7 | М+ 135 | C8H16NS | окт-7-єніл-ізотіоціанат

7 | 13.1 | М+ 169 | C9H19NO2S | 8-метилсульфонілоктил ізотіоцианат

Вивчення гострої токсичності, протизапальної, мембраностабілізуючої активності та перистальтичної активності кишечника сухих екстрактів та біологічно активної рідини проводили на базі кафедри біології, фізіології та анатомії Національного фармацевтичного університету (НФаУ) під керівництвом проф. Малоштан Л.М., вивчення антимікробної активності сухих екстрактів – на базі кафедри мікробіології, вірусології та імунології НФаУ під керівництвом проф. Дикого І.Л., вивчення противиразкової активності сухого екстракту 1:10 водного та таблеток з екстрактом капусти брокколі – на базі кафедри фармакології НФаУ під керівництвом проф. Дроговоз С.М.

При дослідженні гострої токсичності субстанцій встановлено, що вони, відповідно з класифікацією К.К. Сидорова, відносяться до класу практично нешкідливих сполук.

Вивчення протизапальної активності сухих екстрактів проводили на моделі зимазанового набряку кінцівок у щурів. Дослідження проводили в динаміці через 0,5, 1, 2 та 3 год у дозах 10, 25 та 50 мг/кг з препаратом порівняння альтан. Максимальний антиексудативний ефект спостерігався для сухого екстракту 1:5 спиртового у дозі 25 мг/кг – 34,3 % (через 0,5 год); для сухого екстракту 1:10 водного у дозі 25 мг/кг – 34,3 % (через 1 год) та у дозі 50 мг/кг – 35,9 % (через 30 хв).

Вивчення антимікробної активності сухих екстрактів проводили методом послідовних розведень у рідкому живильному середовищі. Відповідно до рекомендацій ВООЗ для оцінки активності препаратів використовували референтні тест-штами мікроорганізмів: Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853F1, Baсillus subtilis АТСС 6633, Candida albicans ATCC 885/653. Екстракти брокколі характеризувались широким спектром антимікробних властивостей, які включають бактерицидну та бактеріостатичну дію у відношенні використаних піогенно утворюючих грампозитивних та грамнегативних бактерій та C. аlbicans. Сухий екстракт 1:10 водний виявився більш перспективним за мікробіологічними ознаками.

Мембраностабілізуючу активність сухих екстрактів вивчали з препаратами порівняння вітамін Е (б-токоферола ацетат) та силібор за методикою