ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

ВІЩУР ОЛЕГ ІВАНОВИЧ

УДК 577.27:619:612.176:616-084:636.4

БІОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ФОРМУВАННЯ ТА РЕГУЛЯЦІЇ ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ У ТЕЛЯТ І ПОРОСЯТ У РАННЬОМУ ВІЦІ

03.00.04 – біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

Львів – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий консультант – доктор ветеринарних наук, професор,

академік УААН Влізло Василь Васильович

Інститут біології тварин УААН, директор.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Янович Вадим Георгійович,

Інститут біології тварин УААН,

головний науковий співробітник лабораторії живлення великої рогатої худоби;

доктор ветеринарних наук, професор

Гуфрій Дмитро Федорович,

Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Гжицького МАП України, завідувач кафедри фармакології та токсикології;

доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник

Чумаченко Володимир Володимирович,

Державний науково-контрольний інститут біотех-нології і штамів мікроорганізмів МАП України, завідувач відділу державного контролю та нагляду за якістю ветеринарних імунобіологічних препаратів

Захист дисертації відбудеться “14” травня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. Стуса, 38.

Автореферат розісланий “11” квітня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Федорович Є.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Збереження здоров’я молодняку сільськогосподарських тварин у ранньому віці є однією з найактуальніших проблем тваринництва України. Економічні втрати від захворювань та загибелі продуктивного поголів’я, особливо молодняку в Україні є значними. У господарствах України в перші 8 тижнів життя гине до 25 % отриманого приплоду поросят та біля 15 % телят. Серед незаразної патології 80 % припадає на шлунково-кишкові та респіраторні захворювання тварин. Це зумовлено низьким рівнем їх резистентності внаслідок недостатньої та неповноцінної годівлі, незадовільних умов утримання корів і свиноматок у період вагітності (Карпуть И.М., 1995; Левченко В.І. зі співавт., 2001; Мельничук Д.О. зі співавт., 2001; Butler J.E., 1999; Ramsey P., 2001), що призводить до порушення ембріонального розвитку, зниження вмісту імуноглобулінів, імунокомпетентних клітин, вітамінів, макро- і мікроелементів у молозиві та молоці (Чумаченко В.Ю., 1997; Маслянко Р.П., 2003, Влізло В.В. зі співавт., 2006).

У зв’язку з поліетіологічною природою шлунково-кишкових і респіраторних захворювань новонароджених тварин актуальним є розробка ефективних комплексних препаратів, які володіють імуномодулюючими, антибактеріальними, антитоксичними та протизапальними властивостями (Федоров Ю.Н., 1998).

Застосування імуномодуляторів при вакцинації тварин підвищує напруженість специфічного імунітету до збудників інфекційних захворювань. Проте в Україні спостерігається незадовільний стан з використанням ад’ювантів, оскільки в умовах імунодефіциту тварин, особливо у молодняку з синдромом імунологічної супресії, вони є недостатньо ефективними. Тому застосування телятам і поросятам у ранньому віці імуномодуляторів, що забезпечують прискорене формування повноцінної імунної відповіді, є важливим заходом підвищення резистентності (Головко А.М. зі співавт., 2004; Чумаченко В.В., 2006).

За неповноцінної годівлі та дії різних стрес-факторів на організм тварин, особливо в ранньому віці, разом зі зниженням функції імунної системи, посилюються вільнорадикальні процеси, що сприяє виникненню імунодефіцитів. У зв’язку з цим вивчення біохімічних особливостей формування та регуляції імунної відповіді у телят і поросят раннього віку та розробка ефективних комплексних препаратів для підвищення життєздатності молодняку сільськогосподарських тварин шляхом стимуляції активності імунної та антиоксидантної систем надалі залишається актуальною проблемою.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота входила у науково-технічну програму УААН “Біологічні основи високої продуктивності тварин”, що виконувалася у відповідності з планом науково-дослідних робіт лабораторії імунології Інституту біології тварин УААН на 1997–1999 роки згідно завдання 07.10 “Вивчити вплив імуномодуляторів на формування імунобіологічної реактивності у поросят і телят та розробити тест-систему для оцінки імунного статусу”, державний реєстраційний номер 0198U009010 та завдання 02.01 “Вивчити механізм дії імунотропних засобів на імуногенез у тварин та розробити способи підвищення імунної функції організму” на 2000–2005 роки (№ ДР 0101U003438), згідно яких автор досліджував вплив імунотропних препаратів на формування імунобіологічної реактивності та окремі біохімічні показники у поросят і телят.

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було з’ясувати біохімічні механізми формування та регуляції клітинних і гуморальних факторів імунітету та системи антиоксидантного захисту (АОЗ) у телят і поросят раннього віку, вплив вакцинації та відлучення поросят від свиноматок на вказані функції, розробити на основі одержаних даних нові комплексні імуномодулюючі та антиоксидантні препарати для підвищення збереження молодняку сільськогоспо-дарських тварин.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:–

вивчити вікові особливості формування імунної та антиоксидантної систем у телят і поросят, вплив вакцинації та відлучення поросят від свиноматок на показники цих систем;–

визначити функціональну активність клітин Т-системи імунітету в телят і поросят у рецепторну та проліферативну фази імунної відповіді у ранньому віці, вакцинації та відлученні поросят від свиноматок;–

дослідити активність факторів неспецифічної резистентності та вміст окремих класів імуноглобулінів у крові телят і поросят при застосуванні імунотропних засобів;–

з’ясувати біохімічні механізми активації системи фагоцитуючих мононуклеарів у поросят при відлученні від свиноматок та при застосуванні розроблених препаратів “Антоксан” і “Ліпоген”;–

дослідити вікову динаміку показників пероксидного окиснення ліпідів та активність глутатіонової ланки антиоксидантної системи в організмі телят і поросят і вплив на них вакцинації та відлучення поросят від свиноматок; –

розробити нові комплексні імуномодулюючі препарати для підвищення функції імунної і антиоксидантної систем у телят і поросят; –

вивчити ефективність застосування розроблених імунотропних засобів для стимуляції імунної та антиоксидантної систем у поросят і телят раннього віку;–

вивчити вплив тимогену, левамізолу та антоксану на напруженість поствакцинального імунітету у телят і поросят та дослідити їх ад’ювантні властивості.

Об’єктом досліджень було формування імунної та антиоксидантної систем у телят і поросят у ранньому віці, вплив на активність цих систем вакцинації та відлучення поросят від свиноматок.

Предметом досліджень були показники імунної (клітинні й гуморальні) та антиоксидантної (ферментної та неферментної ланок) систем, білкового і ліпідного обмінів у телят і поросят при застосуванні імунотропних засобів (“Тимоген”, “Левамізол”, “Антоксан”, “Ліпоген”, “Імукор”).

Методи дослідження: клінічні, біохімічні (спектрофотометричні, хроматогра-фічні), фізіологічні (дослідження росту та розвитку телят і поросят), імунологічні (радіальна імунодифузія, визначення клітинних і гуморальних показників імунітету), гематологічні, цитоморфометричні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено комплексне дослідження біохімічних та імунологічних показників, що характеризують функціональний стан клітинних і гуморальних факторів імунітету, активність ферментної та неферментної ланок антиоксидантної системи, метаболізм білків та ліпідів в організмі телят і поросят у ранньому віці, при вакцинації, відлученні поросят від свиноматок та вплив імунотропних засобів (“Тимоген”, “Левамізол”, “Антоксан”, “Ліпоген”, “Імукор”) на вказані показники. З’ясовано вплив тимогену і левамізолу на формування імунобіологічної реактивності та активність системи АОЗ у телят і поросят при вакцинації. Обґрунтовано склад і технологію одержання імунопротекторного та імуномодулюючого препарату з антиоксидантною дією – “Антоксан”, встановлено його корегувальну дію при посиленні вільнорадикального окиснення та при формуванні повноцінної імунної відповіді.

Встановлено взаємозв’язок між інтенсивністю пероксидного окиснення ліпідів в організмі телят і поросят та активністю антиоксидантного захисту й імунним потенціалом тварин, визначеним за показниками трансформаційної та функціональної активності гематогенних попередників макрофагів. Вперше доведено стимулювальний вплив препарату “Антоксан” на функціональну активність Т- і В-систем імунітету, бактерицидну і лізоцимну активності сироватки крові та фагоцитарну активність нейтрофілів крові. Доведено нормалізуючий вплив антоксану на показники антиоксидантного та імунного захисту й еритроцитопоез у поросят при імунодефіциті.

Показано імуносупресивний вплив вакцинації та відлучення поросят від свиноматок на гуморальну ланку імунітету та стимулювальний – на процеси вільнорадикального окиснення в організмі телят і поросят. Вперше доведено підвищення напруженості поствакцинального імунітету при введенні разом з вакциною антоксану, тимогену й левамізолу.

Розроблено препарат “Імукор”, що містить гамма-глобуліни сироватки крові та селен, встановлено його стимулювальний вплив на показники імунної системи та інгібуючу дію на пероксидне окиснення ліпідів в організмі телят. Встановлено корегувальний вплив розробленого комплексного ліпосомального препарату “Ліпоген” на вказані функції у телят і поросят.

Практичне значення одержаних результатів. На основі теоретичних узагальнень та проведених досліджень розроблено та запатентовано ряд нових ефективних комплексних препаратів: “Імукор”, “Ліпоген”, “Антоксан” для підвищення імунобіологічної реактивності та антиоксидантного захисту у поросят і телят раннього віку, при вакцинації й відлученні поросят від свиноматок. Розроблено Технічні умови України та настанови із застосування препаратів “Ліпоген” і “Антоксан”, які затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини МАП України (2003 р.). Розроблені препарати застосовуються у ветеринарній практиці для профілактики імунодефіцитного стану в окремі періоди постнатального розвитку тварин. У 2006 році препарат “Ліпоген” визнаний кращим винаходом року у Львівській області.

Розроблено та затверджено СОУ 1.42-37-668:2007 “Велика рогата худоба. Метод визначення Т-клітинного імунітету” і СОУ 1.42-37-668:2007 “Ветеринарна медицина. Біологічні рідини. Нефелометричний метод визначення вмісту імуноглобулінів”.

Запатентовано метод визначення концентрації окремих класів імуноглобулінів у біологічних рідинах та метод визначення імунного потенціалу тварин за показниками макрофагальної трансформації мононуклеарів, які включено у довідник “Фізіолого-біохімічні методи досліджень у біології, тваринництві та ветеринарній медицині” (2004 р.).

Отримані результати мають важливе теоретичне значення для з’ясування біохімічних механізмів формування і регуляції імунітету у тварин в період постнатальної адаптації. Їх можна рекомендувати для введення у навчальні програми ряду дисциплін на ветеринарних та біологічних факультетах вищих навчальних закладів третього і четвертого рівнів акредитації.

Особистий внесок здобувача. Автором було обгрунтовано концепцію дисертаційної роботи та розроблено стратегію і методологію досліджень. Усі результати отримані автором особисто або за безпосередньої участі, самостійно зроблено пошук та аналіз літературних даних, аналіз та оформлення результатів експериментів, підготовлено до друку наукові публікації, оформлена нормативна документація на препарати “Антоксан”, “Ліпоген” та “Імукор”. Основні положення і висновки дисертаційної роботи обговорювали із науковим консультантом, д.вет.н., професором, академіком УААН В.В.Влізлом. Окремі результати експериментів були отримані за участю співавторів публікацій, які були співвиконавцями науково-дослідних тем, участь яких задекларована у списку літератури.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися та обговорювалися, отримали загальне схвалення на Міжнародних науково-практичних конференціях: до 100-річчя від дня народження академіка С.З. Гжицького (Львів, ЛДАВМ ім. С.З. Гжицького, 2000); “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2000); “Animal Sciences in the XX1 century” (Краків, 2001); “Біологічні основи підвищення продуктивності тварин” (Львів, ІБТ, 2002); “Молекулярні механізми клітинної активації” (Вроцлав, 2002); “Біотехнологія у ветеринарній медицині” (Київ, 2002); пам’яті професора І.В. Шостаковської (Львів, 2002); 4-й Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and their Target Enzymes” (Вроцлав, 2002); “Актуальні проблеми розвитку тваринництва” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2003); “Стан та розвиток агропромислового виробництва в межах Єврорегіону Верхній Прут” (Чернівці, 2003); “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2004); “Актуальні проблеми та інновації в тваринництві, ветеринарній медицині і харчових технологіях” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2004); “Біологічні основи підвищення продуктивності та здоров’я тварин” (Львів, ІБТ УААН, 2005); “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (Львів, ДНДКІ ветпрепаратів і кормових добавок, 2005); “Інноваційний розвиток сучасного аграрного виробництва” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2005); “Сучасні проблеми ветеринарної медицини в свинарстві” (Київ, ІВМ УААН, 2006); “Сучасність і майбутнє аграрної науки та виробництва” (Львів, ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького, 2006); “Пріоритетні напрями та наукові основи розвитку галузей землеробства, рослинництва і тваринництва” (с. Холоднянське, Черкаська область, ЧІАПВ УААН, 2006); IV Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (Київ, НАУ, 2006); “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (Львів, ДНДКІ ветпрепаратів і кормових добавок, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 52 наукових праці, у тому числі 13 одноосібних, із яких 33 статті, один посібник, методичні рекомендації, два ТУ України, 6 патентів, два СОУ, 7 тез.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методики досліджень, результатів власних досліджень, їх обговорення, висновків, пропозицій виробництву, додатків та списку використаної літератури, який включає 1157 джерел, з них українською і російською мовами – 777, іншими мовами – 380. Дисертація викладена на 403 сторінках комп’ютерного тексту, містить 83 таблиці, які становлять 42 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Загальна методика та методи досліджень. Експериментальна частина роботи виконана в лабораторії імунології Інституту біології тварин УААН (1997–2005 рр.). Наукові досліди проводили у дослідному господарстві “Оброшино”, а також у господарствах Львівської області. Дослідження проведені на клінічно здорових телятах чорно-рябої молочної породи та поросятах великої білої породи. Апробацію і впровадження отриманих результатів досліджень проведено в Інституті епізоотології УААН, у господарствах Львівської, Волинської, Хмельницької, Черкаської, Рівненської, Донецької, Запорізької та Київської областей.

У процесі виконання дисертаційної роботи проведено дев’ять дослідів. Досліди проведено на поросятах-сисунах, а також до та після відлучення і телятах з 3- до 60-денного віку. У кожній серії дослідів за принципом аналогів (вік, маса тіла, стать, фізіологічний стан) формувалися дослідні групи поросят: поросята-сисуни 3–5-денного віку, поросята перед відлученням, яке проводили у 45-денному віці, через 3, 5 і 14 днів після відлучення, які знаходилися в однакових умовах годівлі та утримання. Зразки крові для досліджень брали від поросят в один і той же час зранку шляхом пункції краніальної порожнистої вени. Групи піддослідних телят формували за принципом аналогів. Усі втручання та забій тварин проводили з дотриманням вимог “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та наукових цілей” (Страсбург, 1985) та ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2001). Комісією з біоетики Інституту біології тварин УААН (протокол № 4 від 14 листопада 2007 р.) не виявлено порушень морально-етичних норм при виконанні науково-дослідної роботи.

З метою вивчення вказаних питань проведено дві серії досліджень. У першій серії проведено п’ять науково-виробничих дослідів на телятах.

У першому досліді з’ясовано вікові особливості становлення імунобіологічної реактивності та вплив розробленого нами комплексного препарату “Імукор”, який містить гамма-глобуліни сироватки крові та селен, на формування імунітету і показники обміну речовин у крові телят та їх ріст у ранньому віці. Дослід проведено у приватній агрофірмі “Опілля” Сокальського району Львівської області на двох групах телят 3-денного віку, по 5 тварин у кожній. Тваринам першої (контрольної) групи у вказаний період внутрішньом’язово вводили 5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, телятам другої групи (дослідної) – препарат “Імукор” у дозі 10 мл на тварину. Для імунологічних та біохімічних досліджень у телят брали кров з яремної вени: перед введенням препарату в 3-денному віці, а також у 10-, 20- і 30-денному віці.

Метою другого досліду було дослідити вплив розробленого нами комплексного імуномодулюючого препарату “Антоксан”, що містить селен, в-каротин та інтерферон, на формування імунної відповіді та окремі біохімічні показники в крові телят раннього віку. В дослідному господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області було підібрано десять телят 3-денного віку, розділених за принципом аналогів на дві групи, по 5 тварин у кожній. Тваринам дослідної групи у 3-, 10- і 20-денному віці внутрішньомязово вводили імуномодулятор з антиоксидантною дією – антоксан у дозі 1 мл/10 кг маси тіла, а тваринам контрольної групи – ізотонічний розчин натрію хлориду. Для досліджень від телят одержували кров з яремної вени перед введенням антоксану на 3-й день та у 10-, 20- і 30-денному віці.

У третьому досліді вивчали імунну відповідь та окремі показники обміну речовин у крові телят та їх ріст у ранньому віці під впливом розробленого нами комплексного препарату в формі ліпосомальної емульсії “Ліпоген”, що містить гентаміцин і вітаміни А, D3, Е. Дослід проведено у приватній агрофірмі “Опілля” Сокальського району Львівської області, на двох групах телят 3-денного віку, по 5 тварин у кожній. Тваринам першої групи (контрольної) у вказаний період одноразово внутрішньом’язово вводили ізотонічний розчин натрію хлориду, тваринам другої групи (дослідної) – препарат “Ліпоген” у дозі 0,2 мл/кг маси тіла. Для біохімічних та імунологічних досліджень від телят обох груп одержували кров з яремної вени: у 3-денному віці перед уведенням препарату та у 10-, 20- і 30-денному віці.

У четвертому досліді вивчали вплив імуномодуляторів тимогену і левамізолу на показники імунобіологічної реактивності у телят після вакцинації. Дослід проведено у господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області. За принципом аналогів було сформовано три групи телят тритижневого віку, по 4–5 тварин у кожній. Перша група телят – контрольна, друга і третя групи – дослідні. Телятам другої групи у 3-тижневому віці внутрішньом’язово вводили тимоген у дозі 100 мг на тварину, телятам третьої групи внутрішньом’язово – левамізол у дозі 3 мкг/кг маси тіла. Телятам контрольної групи при цьому вводили стерильний ізотонічний розчин натрію хлориду. У 30-денному віці телят усіх груп вакцинували полівалентною гідроокис алюмінієвою формол-тіомерсаловою вакциною проти колібактеріозу, згідно настанови з її застосування. Через чотирнадцять днів після вакцинації проводили другу імунізацію телят цією ж вакциною. Разом з вакциною телятам другої та третьої груп вводили вказані імуномодулятори у тих же дозах.

Для досліджень від телят одержували кров з яремної вени перед застосуванням імуномодуляторів у 3-тижневому віці (1 період), після їх введення (2 період), після першої вакцинації на 14-й день (3 період) і на 7-й день після другої імунізації (4 період).

У п’ятому досліді вивчали вплив препарату “Антоксан” на формування імунобіологічної реактивності телят при вакцинації. Дослід проведено на трьох групах телят 30-денного віку, аналогів за віком, масою тіла та фізіологічним станом, у дослідному господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області. У 30-денному віці телятам контрольної групи внутрішньо-м’язово вводили вакцину проти колібактеріозу, згідно настанови з її застосування. Телятам 1- і 2-ї (дослідних) груп при цьому разом з вакциною вводили імуномодулятор антоксан у дозі 1 мл/10 кг маси тіла. Через 14 днів проводили другу імунізацію тварин контрольної та 1-ї дослідної груп. При цьому телятам 1-ї дослідної групи разом з вакциною вводили антоксан у вказаній дозі, а телятам 2-ї дослідної групи – тільки антоксан. Для досліджень від телят одержували кров з яремної вени перед вакцинацією у 20-денному віці, після вакцинації – у 30-денному віці та після другої імунізації – у 50-денному віці.

У другій серії досліджень, проведено чотири досліди на поросятах.

Метою першого досліду було з’ясувати вплив розробленого нами препарату “Антоксан” на формування імунної відповіді та обмін речовин в організмі поросят у ранньому віці. Дослід проведено у дослідному господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області на двох групах поросят 3-денного віку (контрольна і дослідна), які утримувались зі свиноматками, по 5-6 тварин у кожній. Поросятам дослідної групи в 3-, 10- і 20-денному віці внутрішньом’язово вводили препарат “Антоксан” у дозі 0,1 мл/кг маси тіла, поросятам контрольної групи – ізотонічний розчин натрію хлориду. Для досліджень від поросят одержували кров з краніальної порожнистої вени у 3- і 10-денному віці перед уведенням препаратів. У 30-денному віці по 3 поросят з кожної групи піддавали евтаназії з дотриманням правил біоетики. Одержані від них зразки тканин і кров використовували для проведення імунологічних, біохімічних та гістоморфометричних досліджень. Гістоморфометричними методами досліджували мікроскопічну структуру шийних лімфатичних вузлів у поросят у 30-денному віці.

У другому досліді з’ясовано вплив препаратів “Тимоген” і “Левамізол” на процеси імуногенезу у поросят після вакцинації. Дослідження проводили у дослідному господарстві “Оброшино” Пустомитівського району Львівської області. Було відібрано три групи поросят-аналогів 10-денного віку: контрольна і дві дослідні групи, по 4 тварини у кожній. У 14-денному віці тваринам дослідних груп внутрішньом’язово вводили імуномодулятори: поросятам другої групи – тимоген у дозі 100 мг на тварину, поросятам третьої групи – левамізол у дозі 3 мкг/кг маси тіла. Тваринам контрольної групи вводили ізотонічний розчин натрію хлориду. У 20-денному віці поросят контрольної та дослідних груп внутрішньом’язово вводили вакцину проти колібактеріозу, згідно настанови з її застосування. Поросятам дослідних груп разом з вакциною вводили відповідно тимоген і левамізол. Через чотирнадцять днів після вакцинації проводили другу імунізацію тварин цією ж вакциною. Для досліджень використовували кров, яку одержували з краніальної порожнистої вени поросят: перед введенням імуномодуляторів (1 період), після їх введення – перед вакцинацією (2 період), на 15- (3 період) і 22-й дні після імунізації (4 період).

У третьому досліді вивчено дію розробленого нами препарату “Антоксан” на імунний потенціал та біохімічний профіль крові поросят після відлучення від свиноматок. Дослід проведено у господарстві “Західний Буг” Буського району Львівської області на поросятах 45-денного віку, розділених на дві групи (контрольну і дослідну), по 5 тварин у кожній. Поросятам дослідної групи за день до відлучення внутрішньом’язово вводили препарат “Антоксан” з розрахунку 0,1 мл/кг маси тіла, а контрольної – аналогічно ізотонічний розчин натрію хлориду. Для імунологічних і біохімічних досліджень від поросят одержували кров з краніальної порожнистої вени за день до відлучення та на 5-, 10- і 14-й дні після відлучення.

У четвертому досліді досліджено вплив розробленого нами препарату “Ліпоген” на імунний статус і біохімічний профіль крові поросят після відлучення від свиноматок. Дослід проведено у господарстві “Імпекс” Буського району Львівської області на двох групах відлучених поросят 30-денного віку (контрольна і дослідна), по 5–7 тварин у кожній. Поросятам дослідної групи в день відлучення внутрішньом’язово одноразово вводили препарат “Ліпоген” з розрахунку 0,2 мл/кг маси тіла, а контрольної – ізотонічний розчин натрію хлориду. Кров досліджували у день відлучення, а також на 3-, 5- і 14-й дні після відлучення.

У крові (плазмі та в гемолізатах еритроцитів) визначали: активність глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9; Моин В.М., 1986), активність каталази (КФ 1.11.1.6; Королюк М.А. зі співавт., 1988), вміст відновленого глутатіону (Баталер Э., Дюбон О., Келли Б., 1963), гідроперекисів ліпідів (ГПЛ; Мирончик А.К., 1982), малонового діальдегіду (МДА; Коробейникова Е.Н., 1989), неетерифікованих жирних кислот (НЕЖК; Прохоров М.И. с соавт., 1977), вільних амінокислот у плазмі крові – на амінокислотному аналізаторі ААА-339М фірми “Мікротехна” (Чехія).

У стабілізованій крові підраховували кількість лейкоцитів і еритроцитів, визначали вміст гемоглобіну, середній вміст гемоглобіну в одному еритроциті, гематокрит, співвідношення окремих видів лейкоцитів (лейкограма крові) – за загальноприйнятими методами (Кондрахин И.П., с соавт., 1985); загальну кількість Т-лімфоцитів (Е-РУЛ) – визначали в реакції спонтанного розеткоутворення з еритроцитами вівці та кози (Jondal M. et al., 1972), їх субпопуляції – Т-хелпери (ТФР Т-лімфоцити; Суровас В.М. с соавт., 1980); кількість “активних” РУЛ (Wansbrough-Jones М. et al., 1979); кількість Т-клітин з переважно супресорною активністю (ТФЧ Т-лімфоцити) – шляхом віднімання числа теофілінрезистентних Т-клітин (ТФР) від загальної кількості Т-лімфоцитів, імунорегуляторний індекс (ІРІ) розраховували за співвідношенням ТФР/ТФЧ Т-лімфоцитів, В-лімфоцити (ЕАС-РУЛ) – в реакції комплементарного розеткоутворення з еритроцитами вівці (Чернушенко Е.Ф. с соавт., 1979). При підрахунку кількості Т- і В-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій на фіксованих і фарбованих мазках крові визначали лімфоцити із низькою, середньою і високою щільністю рецепторів, функціональну активність Т-лімфоцитів – за реакцією бластної трансформації з фітогемаглютиніном (ФГА; Болотников И.А. с соавт., 1987), фагоцитарну активність та інтенсивність полінуклеарних клітин до добової культури Staphilоcoccus aureus (штам 209-Р; Гостєв В.С., 1950); бактерицидну активність нейтрофілів, використовуючи 0,1 % розчин нітросинього тетразолію (НСТ-тест; Маянський А.Н., 1989); макрофагальну трансформацію мононуклеарів (Собко А.И., Квачов В.Г., 1987) у нашій модифікації (Віщур О.І. зі співавт., 2006); лімфокінсинтезуючу активність лейкоцитів крові у реакції гальмування міграції лейкоцитів (Передерий В.Г. с соавт., 1995).

У сироватці крові визначали бактерицидну активність (БАСК) до мікробної культури Esherichia coli (штам ВКМ-125; Марков Ю.М., 1968); лізоцимну активність (ЛАСК) до добової культури Micrococcus lysodeikticus (штам ВКМ-109) – фотонефелометричним методом (Дорофейчук В.Г., 1968), вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) середньої молекулярної маси (Чернушенко Е.Ф., Когосовой П.С., 1981), кількість імуноглобулінів G і М класів методом радіальної імунодифузії (Mancini G. et al., 1965), а також запатентованим нами методом (Кичун І.В., Віщур О.І., 2003), концентрацію загального білка біуретовою реакцією, вміст молекул середньої маси (Николайчик В.В. с соавт., 1989), титри специфічних антитіл – в реакції аглютинації та пасивної гемаглютинації з використанням відповідних діагностикумів, концентрацію глюкози, сечовини, активність ферментів АсАТ (КФ 2.6.1.1), АлАТ (КФ 2.6.1.2), вміст HS- і SS-груп, вітамін С за допомогою стандартних наборів фірм “LACHEMA” (Чехія) та НВП “Біос” (Україна).

Жирнокислотний склад загальних ліпідів плазми крові та досліджуваних органів і тканин визначали методом газорідинної хроматографії (Немировський В.І. зі співавт., 1984). Ліпіди з тканин екстрагували сумішшю хлороформ-метанол у відношенні 2:1 за методом Фолча (Folch J., 1957), метилові ефіри жирних кислот одержували шляхом прямої переетерифікації та визначали відносну їх кількість на газорідинному хроматографі “Chrom – 4” (Чехія).

Гістоморфометричні дослідження структури шийних лімфатичних вузлів проводили шляхом мікроскопії після фарбування їх гематоксиліном за допомогою мікроскопу “Біолам” та окуляр-мікрометра АМ 9-2.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному комп’ютері за ліцензованою програмою MS Excel 97. Оцінку вірогідності здійснювали за критерієм Стьюдента (t). Вірогідною вважали різницю при р<0,05–0,001 у порівнянні з контрольною групою тварин, а в окремих дослідах з вихідними даними.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Особливості формування клітинних та гуморальних факторів імунітету телят раннього віку. Проведені дослідження показали, що у телят до 20-денного віку є низькою функціональна активність імунокомпетентних клітин, про що свідчить менша, ніж у тварин 30–35-денного віку, кількість Т-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій і В-лімфоцитів (рис. 1, 2). Встановлено велику кількість (60 %) у крові недиференційованих (нульових) Т-лімфоцитів (рис. 2), а також зниження показників бластної трансформації Т-клітин під впливом ФГА. В-клітини в крові телят, за даними R.A. Miller (1995), у перші 20 днів постнатального періоду не відповідають на специфічні антигени проліферацією та збільшенням синтезу антитіл.

Аналіз клітинних та гуморальних факторів імунітету у телят свідчить, що з віком їх функціональна активність підвищується. Стан рецепторного апарату плазматичної мембрани Т-лімфоцитів вказує на зростання їх функціональної активності, особливо у 20-денному віці, що зумовлено збільшенням на 7–12 % кількості низькоавідних та середньоавідних форм клітин. Аналогічних змін зазнають і В-лімфоцити. З віком у периферичній крові телят кількість 0 (нульових) малодиференційованих клітин зменшується в 1,8 раза (p<0,05), що зумовлено переходом клітин у зріліші, функціонально повноцінні лімфоцити (Т- або В-клітини).

Стан показників антигеннеспецифічного імунітету (комплемент) та бактерицидна і лізоцимна активність сироватки крові телят свідчать про їх зростання впродовж росту тварин. Водночас цей період характеризується розвитком поширених метаболічних порушень в організмі телят, серед яких важливе місце займає дисбаланс окиснювально-антиоксидантних процесів.

Отже, в цей період виникає необхідність введення телятам комплексних препаратів, які будуть володіти імуномодулюючими і антиоксидантними властивостями.

Імунна відповідь та метаболічний профіль крові телят раннього віку за дії препарату “Імукор”. Встановлено, що після введення імукору вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у плазмі крові телят спочатку збільшується, а пізніше знижується до рівня тварин контрольної групи. Така динаміка ЦІК у крові телят свідчить про стимуляцію імунобіологічної реактивності у тварин дослідної групи та про наступну елімінацію ЦІК. Зростання вмісту ЦІК у плазмі крові телят дослідної групи у 10- і 20-денному віці (p<0,05; p<0,01) можна пояснити впливом фрагментів молекул імуноглобулінів, що утворюються в організмі за умов часткового їх протеолізу після парентерального введення. При цьому, вміст молекул середньої маси у плазмі крові телят дослідної та контрольної груп на всіх стадіях досліду суттєво не відрізнявся між собою, що свідчить про відсутність негативного впливу досліджуваного препарату на деструктивні процеси в їхньому організмі.

Парентеральне введення телятам дослідної групи гамма-глобулінів та селену у складі препарату “Імукор” призводить до збільшення в їх крові у 10-денному віці кількості лейкоцитів на 15,5 % (p<0,01), зокрема відносного вмісту Т-лімфоцитів (загальних, активних і теофілін-резистентних СD4+ Т-лімфоцитів-хелперів) та В-лімфоцитів (p<0,05–0,01). Ці зміни, в основному, відбувались за рахунок збільшення кількості Т- і В-лімфоцитів з низькою та середньою щільністю рецепторів (p<0,05–0,01). Одержані дані свідчать про стимулювальний вплив препарату “Імукор” на функціональну активність імунокомпетентних клітин крові телят внаслідок збільшення кількості рецепторів на плазматичній мембрані Т-лімфоцитів, тобто розширення “рецепторного поля” клітин. Оскільки В-лімфоцити є попередниками клітин, що продукують антитіла, то збільшення їх кількості в крові телят у період становлення імунної системи є ознакою підвищеної здатності їх організму до активного синтезу захисних антитіл. У цьому плані заслуговує на увагу виявлений нами більший вміст IgG і IgМ у сироватці крові телят (рис. 3, 4) в усі періоди дослідження після введення імуномодулятора (p<0,05–0,01).

Введення телятам препарату “Імукор” стимулює ранній та інтенсивний синтез імуноглобулінів в організмі телят, про що свідчить збільшення кількості В-лімфоцитів у крові (p<0,05). Ці дані можна пояснити стимулювальним впливом фрагментів молекул імуноглобулінів, які проявляють регуляторний вплив на імунну систему в організмі тварин. Зокрема, Fc-фрагменти імуноглобулінів здатні викликати поліклональну активацію В-лімфоцитів, посилювати антигеннезалежну продукцію антитіл (Bass R.T., 2001). Ці дані заслуговують на увагу в зв’язку з тим, що IgG1 відіграють ключову роль в імунному захисті новонароджених телят, а IgM – першими утворюються у відповідь на антигенну стимуляцію.

З інших результатів, одержаних у цьому досліді, слід відзначити встановлене нами підвищення бактерицидної та лізоцимної активності сироватки крові, а також фагоцитарної активності нейтрофілів крові у телят після введення препарату “Імукор” (р<0,05–0,01). Зростання всіх показників фагоцитозу – фагоцитарної активності, числа та індексу (ФА, ФЧ, ФІ) можна пояснити впливом імуноглобулінів, які є сильними опсонінами.

Показано, що після введення телятам препарату “Імукор” (рис. 5, 6) концентрація гідроперекисів ліпідів і малонового діальдегіду в плазмі крові зменшується (p<0,05–0,01), а вміст відновленого глутатіону й активність глутатіонпероксидази – підвищується (р<0,05) у порівнянні з цими показниками у тварин контрольної групи. Ці дані свідчать про стимулювальний вплив селену, що входить до складу препарату “Імукор” на синтез глутатіонпероксидази, ключового ферменту системи антиоксидантного захисту.

Введення телятам імукору спричиняє збільшення концентрації вітаміну С і HS-груп у плазмі крові, що вказує на позитивний вплив на синтез білків, які містять HS-групи і вітаміну С в організмі телят. При цьому, середньодобові прирости маси тіла телят дослідної групи були на 11,4 % більші, ніж контрольної.

Отже, розроблений нами препарат “Імукор” сприяє підвищенню імунного та антиоксидантного захисту, життєздатності телят раннього віку і є ефективним при профілактиці імунодефіциту.

Показники клітинного і гуморального імунітету та метаболічний профіль крові телят раннього віку за дії препарату “Антоксан”. Наші дослідження показали, що введення телятам у 3-денному віці імуномодулюючого препарату “Антоксан” підвищує киснево-транспортну функцію крові, про що свідчить збільшення в їх крові у 30-денному віці кількості еритроцитів (р<0,05) та вмісту гемоглобіну (р<0,05). Ці дані можна пояснити дією селену, що входить до складу антоксану. За даними Г.Л. Антоняк (2002), введення селеніту натрію поросятам підвищує інтенсивність перетворення вуглеводів гліколітичним шляхом. Однією з ланок механізму регуляції йонами селену метаболізму в еритроцитах, ймовірно, є утворення дифосфогліцерофосфату (2,3-DPG) і, відповідно, вплив на киснево-транспортну функцію гемоглобіну.

Введення телятам антоксану спричиняє збільшення кількості лейкоцитів (p<0,05–0,01) і моноцитів (р<0,05) крові, підвищує функціональну активність Т-клітинної ланки імунітету, а також активує експресію рецепторів на поверхні лімфоцитів, про що свідчить зростання кількості загальних і високоавідних Т-активних лімфоцитів (p<0,05). Водночас у крові телят збільшується на 10–17 % індукція Т-клітин до бластної трансформації з ФГА (p<0,05–0,01), зростає кількість В-лімфоцитів з високою і середньою щільністю рецепторів (р<0,05). Ці дані свідчать про те, що антоксан проявляє стимулювальний вплив на функціональну активність Т- і В-лімфоцитів крові телят.

У крові телят, яким вводили антоксан, встановлено вищу бактерицидну і лізоцимну активність сироватки крові, фагоцитарну активність нейтрофілів та НСТ-тест (p<0,05–0,01). Отже, введення телятам у ранньому віці антоксану спричиняє підвищення неспецифічних факторів захисту організму, що можна пояснити стимулювальною дією в-каротину, селену та інтерферону, які входять до складу препарату, і проявляють версифікований механізм впливу на імунну систему.

Показано також, що під впливом антоксану в сироватці крові телят у 30-денному віці на 5 % підвищується вміст загального білка (p<0,05), а в 20- і 30-денному – вміст IgG на 39 (p<0,01) і 32 % (p<0,05) більший, ніж у тварин контрольної групи, що свідчить про зростання функціональної активності В-системи імунітету.

У забезпеченні імунітету тварин важливу роль відіграють холінергічні процеси. Встановлено, що активність холінестерази в крові телят, яким вводили антоксан, у 10- і 30-денному віці була на 15 (p<0,05) і 24 % (p<0,05) більша, ніж у телят контрольної групи.

Парентеральне введення телятам антоксану впливає на вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів у плазмі крові. Зокрема, концентрація гідроперекисів ліпідів, які є вторинними продуктами пероксидного окиснення ліпідів, у плазмі крові телят дослідної групи після введення антоксану була на 20–30 % менша в усі періоди дослідження (p<0,05). При цьому в крові телят, яким вводили антоксан, порівняно до тварин контрольної групи, зростає вміст загальних ліпідів на 35,7 % (p<0,05), відновленого глутатіону на 15 % (p<0,05) та підвищується активність глутатіонпероксидази на 24,1 % (p<0,05). Ці дані свідчать про зниження інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів в організмі телят, яким вводили антоксан. Підвищення каталітичної активності глутатіонпероксидази в еритроцитах крові телят дослідної групи можна пояснити зростанням інтенсивності синтезу ферменту внаслідок наявності селену в антоксані.

Середньодобові прирости маси тіла телят, яким вводили імуномодулюючий препарат “Антоксан”, були на 16,7 % більші, ніж у контрольній групі.

Імунний і антиоксидантний статус телят за дії комплексного ліпосомального препарату “Ліпоген”. Показано, що введення телятам у ранньому віці ліпогену призводить до збільшення кількості лейкоцитів крові в 10- та 20-денному віці (р<0,05), відносної кількості Т-активних лімфоцитів (р<0,05) за рахунок збільшення малорецепторної субпопуляції (р<0,05) та зменшення неактивних їх форм (р<0,05). Зростання кількості В-лімфоцитів у крові телят після введення ліпогену відбувалось за рахунок збільшення частки субпопуляції з середнім і високим ступенем авідності (р<0,05–0,01) та зменшення кількості низькоавідних лімфоцитів (р<0,05). Збільшення кількості Т-активних лімфоцитів у крові телят вказує на зростання функціональних можливостей імунокомпетентних клітин. Т-хелпери задіяні у розпізнаванні чужорідної генетичної інформації, стимулюють диференціацію та проліферацію В-лімфоцитів. Збільшення функціональної активності імунокомпетентних клітин крові телят можна пояснити комплексною дією ліпогену на експресію рецепторів Т- і В-лімфоцитів на плазматичній мембрані, зокрема, антиоксидантним та імуномодулюючим впливом вітамінів А і Е у складі препарату.

Введення телятам ліпогену призводить до підвищення лізоцимної і бактерицидної активності сироватки крові та фагоцитарної активності нейтрофілів крові на всіх стадіях дослідження (р<0,05–0,01), а також до збільшення у плазмі крові вмісту HS-груп і вітаміну С (р<0,05), що можна пояснити комплексним стимулювальним впливом складників препарату на синтез антитіл. При застосуванні антибіотиків, зокрема тетрациклінового ряду, збільшується кількість мікро- і особливо макрофагів, насичених вітаміном С, та полісахаридів, що веде до утворення великої кількості плазматичних клітин, які синтезують антитіла (Карпуть И.М., 1981). При цьому в сироватці крові телят, яким вводили ліпоген, у 10- і 20-денному віці відзначено збільшення вмісту загального білка і циркулюючих імунних комплексів середньої молекулярної маси (р<0,05–0,01), що, на нашу думку, зумовлено антигенним впливом наявного в ліпогені гентаміцину на синтез антитіл. Підвищення рівня ЦІК у сироватці крові телят дослідної групи у 10- і 20-денному віці та їх наступна елімінація до 30-денного віку свідчить про відсутність імуносупресивного впливу гентаміцину, на що також вказує відсутність збільшення кількості Т-супресорів.

Проведені дослідження показали, що введення телятам дослідної групи препарату “Ліпоген” призводить до зменшення концентрації ГПЛ і МДА у плазмі крові на всіх стадіях дослідження (р<0,05–0,01) внаслідок антиоксидантної дії вітамінів А і Е, що входять до складу препарату.

Імунобіологічна реактивність телят при застосуванні тимогену і левамізолу. У результаті проведених досліджень встановлено, що вакцинація телят проти колібактеріозу проявляє інгібуючий вплив на гуморальну ланку імунітету, про що свідчить зменшення на 17 % абсолютної кількості В-лімфоцитів у крові, зростання на 16 % рівня ЦІК та зниження на 15,3 % лізоцимної активності сироватки крові. Разом