НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ імені О.В. ПАЛЛАДІНА

ЙОЛКІНА Наталія Маратівна

УДК 577.112 : 577.121 : 612

СТРУКТУРНИЙ СТАН ГЕМОГЛОБІНУ ТА МЕТАБОЛІЧНІ ЗМІНИ

В ЕРИТРОЦИТАХ ЗА УМОВ ПОСИЛЕНОГО ПЕРЕБІГУ ОКИСНЮВАЛЬНИХ РЕАКЦІЙ ЗА УЧАСТЮ АКТИВНИХ

ФОРМ КИСНЮ

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії Таврійського національного університету ім. В.І.Вернадського МОН України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук, доцент

Казакова Віра Валентинівна.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, головний науковий співробітник;

доктор медичних наук, професор Лановенко Іван Іванович,

Інститут гематології та трансфузіології АМН України, завідувач лабораторії.

Захист відбудеться " 14 " квітня 2008 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий " 14 " березня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема окиснювального стресу є однією з найважливіших у сучасній біології та медицині [Лю Б.Н., 2001; Лущак В.І., 2001; Турпаєв К.Т., 2002; Шаповал Г.С. та ін., 2003; Владимиров Ю.А., 2004; Доманський А.В. та ін., 2005; Плетюшкіна О.Ю. та ін., 2006].

Розвиток окиснювального стресу виявляється при багатьох захворюваннях та патологічних станах організму, до яких належать онкологічні, серцево-судинні, нервово-психічні та інші [Меньщиков Є.Б. та ін., 1997; Bostwick D.G., et al., 2000; Сутковой Д.А. та ін., 2002; Овсяннікова Л.М. та ін., 2002; Шведова А.А. та ін., 2004; Тищенко М.В., 2005].

Відомо, що розвиток окиснювального стресу здійснюється за участю активних форм кисню (АФК) внаслідок порушення прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу [Турпаєв К.Т., 2002; Шаповал Г.С. та ін., 2003; Владимиров Ю.А., 2004].

Підвищені концентрації АФК пошкоджують, перш за все, клітинні мембрани, ініціюють процеси перекисного окиснення ліпідів, здійснюють окиснювальну модифікацію білків та нуклеїнових кислот, їх деструктивні зміни [Владимиров Ю.А. та ін., 1972, Пескін А.В., 1997; Luxford C. et al., 2000; Ullrich O. et al., 2000; Дубініна Є.Є. та ін., 2001, 2002].

Існує погляд, що на відміну від процесів перекисного окиснення ліпідів окиснювальна модифікація білків може мати вибірковий та специфічний характер [Дубініна Є.Є. та ін., 2002]. Проте ті дані, які є в літературі відносно впливу АФК на білкові молекули, недостатні для того, щоб сформувати повне уявлення про механізми ушкоджувальної дії активних форм кисню на різні за структурою та функцією білки. Недостатньо вивченим у цьому аспекті залишається гемоглобін, який виконує свою біологічну функцію за умов постійно високого вмісту кисню.

Разом з тим, незважаючи на велику кількість робіт, присвячених вивченню процесів пероксидації (головним чином, ліпідів) при різних станах організму, що призводять до розвитку окиснювального стресу, дотепер немає цілісного уявлення про вплив АФК на внутрішньоклітинний метаболізм, зокрема, на метаболізм еритроцитів.

У зв’язку з проблемою окиснювального стресу важливо зрозуміти не тільки механізми гіперпродукції вільних радикалів у клітинах різного типу, але й характер регуляції в них метаболізму за екстремальних умов, формування захисних реакцій, спрямованих на нейтралізацію пошкоджувального фактора й активацію тих метаболічних шляхів, що ведуть до відновлення гомеостазу [Каліман П.А., 1998, 2001, 2002; Ganea E. et al., 2000; Ullrich O. et al., 2000].

Враховуючи, що еритроцити людини та інших ссавців позбавлені апарата синтезу білка й, отже, можливості за його допомогою репарувати виниклі пошкодження, проте самі можуть генерувати АФК внаслідок високої концентрації кисню, є важливим комплексне вивчення характеру біохімічних змін у цих клітинах за умов окиснювального стресу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках держбюджетної науково-дослідної проблеми кафедри біохімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського "Молекулярно-клітинні механізми дії факторів різної природи на живі системи" (№ держреєстрації 0101U005237; I кв. 2002 р. – IV кв. 2006 р.).

Мета дослідження. Метою дисертаційної роботи було вивчення структурного стану гемоглобіну та метаболічних особливостей еритроцитів за умов посиленого перебігу окиснювальних реакцій з участю активних форм кисню.

Для досягнення вказаної мети були поставлені такі завдання:

1. Вивчити окиснювальну модифікацію гемоглобіну А людини (HbА) з рядом показників: утворення метгемоглобіну (MtHb), внутрішньо-молекулярної гідрофобності, утворення полімерних структур та рівнем глікозильованої форми в динаміці інкубації еритроцитів донорів у середовищі Фентона, що генерує АФК.

2. Вивчити вплив середовища, що генерує АФК, на окремі показники метаболізму глюкози в еритроцитах та ферментну активність, пов’язану з формуванням відновлювального потенціалу клітин, транспортом K+ і Na+ через мембрану.

3. Виявити характер окиснювальної модифікації HbА, утворення MtHb і його глікозильованої форми при захворюваннях, що супроводжуються розвитком окиснювального стресу (жовчнокам'яна хвороба і цироз печінки).

4. Визначити рівень внутрішньомолекулярної гідрофобності та можливість полімеризації HbА за умов патології.

5. Вивчити окремі показники обміну глюкози в еритроцитах, ферментну активність, пов’язану з формуванням відновлювального потенціалу еритроцитів і з мембранним транспортом при захворюваннях, що характеризуються розвитком окиснювального стресу.

Об'єкт дослідження: еритроцити людини за умов окиснювального стресу.

Предмет дослідження: структурний стан HbА, його окиснювальна модифікація, метаболізм глюкози, ферментна активність еритроцитів, пов’язана з підтримкою відновлювального потенціалу та мембранного транспорту еритроцитів людини за умов посиленого перебігу окиснювальних реакцій з участю активних форм кисню.

Методи дослідження. Для розв’язання поставлених завдань були використані такі методи дослідження: фізико-хімічні (електрофорез, флуоресцентна спектрофотометрія), спектрофотометричні методи біохімічного аналізу (вміст продуктів окиснювальної модифікації гемоглобіну, його форм; ферментна активність), колориметричні методи (концентрація гемоглобіну, вміст метаболітів), статистичні.

Математичну обробку результатів досліджень проводили за допомогою стандартних методів статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше досліджено вплив окиснювального стресу на структурні властивості HbА, співвідношення його окремих форм, а також на показники метаболізму глюкози в еритроцитах, їх ферментну активність при інкубації еритроцитів здорових людей у середовищі Фентона, що продукує АФК, та й за умов патології.

Встановлено, що інтенсифікація окиснювальної модифікації HbА корелює зі зменшенням його внутрішньомолекулярної гідрофобності та з метгемоглобіноутворенням; виникає можливість полімеризації гемоглобіну.

За умов ініціації окиснювальних реакцій in vitro спостерігається пригнічення гліколітичного шляху перетворення глюкози в еритроцитах і разом з тим ферментна активність еритроцитів змінюється в напрямку стабілізації їх відновлювального потенціалу. При захворюваннях, що супроводжуються розвитком окиснювального стресу (цироз печінки та жовчнокам’яна хвороба), збільшення рівня глюкози в еритроцитах супроводжується більш вираженим переходом еритроцитарних клітин на використання глюкози в гліколітичному шляху.

Встановлений характер змін ферментної активності еритроцитів за умов окиснювального стресу свідчить про можливість реалізації в еритроцитах людини різноспрямованих компенсаторних механізмів, необхідних для підтримки клітинного гомеостазу.

Теоретичне значення дослідження. Одержані результати розширюють уявлення про вплив окиснювального стресу на різні за структурою та функцією білки, на клітинний метаболізм і свідчать про можливість реалізації в еритроцитах людини різноспрямованих компенсаторних механізмів.

Практичне значення дослідження. Результати досліджень свідчать про можливість використання окремих біохімічних показників еритроцитів у клінічній практиці як додаткових тестів при лікуванні хворих з відповідною патологією (є акт впровадження отриманих результатів у клінічній практиці).

Матеріали дисертації використовуються при викладанні спецкурсів: "Біохімія крові", "Структурно-функціональні властивості білків", "Біохімія вуглеводів і ліпідів" на кафедрі біохімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно виконано експериментальну частину дисертації, проведено статистичну обробку отриманих даних, здійснено аналіз відповідних даних літератури, написані всі розділи дисертації. Обговорення й аналіз результатів досліджень проведено за участю наукового керівника. У працях, написаних у співавторстві, дисертанту належать експериментальна частина і низка теоретичних положень.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідалися на: щорічних наукових конференціях професорсько-викладацького складу Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського (2005-2007 рр.), на XII і XIX Міжнародних симпозіумах "Нетрадиційне рослинництво. Еніологія. Екологія та здоров'я" (м. Алушта, 2004, 2005 рр.), 77-й науково-практичній конференції Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського (м. Сімферополь, 2005 р.), VIII Міжнародній науково-практичній конференції "Наука і освіта, 2005" (м. Дніпропетровськ, 2005 р.), III і IV Міжнародних науково-практичних конференціях "Динаміка наукових досліджень" (м. Дніпропетровськ, 2004, 2005 рр.), ІІ Міжнародній науково-практичній конференції "Науковий потенціал світу – 2005" (м. Дніпропетровськ, 2005 р.), ІІ Міжнародній конференції студентів і аспірантів "Молодь та поступ біології" (м. Львів, 2006 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 18 наукових праць, у тому числі 9 статей у виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 160 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, 3 основних розділів, висновків, списку літератури, що містить 339 джерел. У роботі наведено 17 таблиць та 9 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Включає п’ять підрозділів, в яких розглядаються питання про структурні властивості і кисневотранспортну функцію гемоглобіну, структурну організацію еритроцитів і роль обміну глюкози в їх функціонуванні, а також про утворення активних форм кисню, їх участь у розвитку окиснювального стресу, сучасні уявлення про молекулярні системи захисту організму від дії активних форм кисню.

Матеріали і методи досліджень. Матеріалом для досліджень були еритроцити 40 донорів станції переливання крові та хворих на жовчнокам’яну хворобу (35 осіб) і цироз печінки (30 осіб) віком від 45 до 50 років. Кров хворих брали на базі 7-ї міської лікарні та Республіканської лікарні ім. М. Семашко м. Сімферополя.

З метою вивчення реакції еритроцитів донорів на безпосередню дію активних форм кисню їх інкубували у середовищі Фентона, що генерує АФК, протягом 2, 4 та 24 годин. Середовище Фентона містило 10 мM FeSО4 * 7 H2O і 3 мM H2O2 у співвідношенні 1:1 (готували на фізіологічному розчині).

Для проведення зазначеної вище інкубації еритроцитів використовували стерилізований хімічний посуд, пастеризований фізіологічний розчин та розчин FeSО4.

Реакція Фентона є пусковою у генеруванні активних форм кисню:

Fe+2 + H2O2 > Fe+3 + OH- + .OH

Гемоліз еритроцитів проводили за методом Драбкіна (Drabkin, 1949), але без толуолу, щоб попередити можливе утворення MtHb. Концентрацію гемоглобіну в гемолізатах визначали уніфікованим геміглобінціанідним методом. HbA виділяли за допомогою препаративного електрофорезу в блоках 7% поліакриламідного гелю (ПААГ) (Ажицький Г.Ю., Багдасар'ян С.М., 1975). Аналіз гомогенності препаративно виділеної фракції проводили методом аналітичного електрофорезу в 7% ПААГ (Davis, 1964). Окиснювальну модифікацію HbА вивчали за методом, описаним в літературі (Дубініна Є.Є. та ін., 1995) і виражали в одиницях оптичної густини. Можливість полімеризації HbА оцінювали за молекулярною масою, використовуючи метод гель-хроматографії у тонкому шарі сефадексу G-75 (Superfine). Внутрішньомолекулярну гідрофобність HbА оцінювали за інтенсивністю флуоресценції зонда N-фенілнафтіламіну (ФНА) за раніше описаним методом (Остоловський Є.М. та ін., 1988) і виражали в умовних одиницях. Інтенсивність флуоресценції зонда у розчинах білка визначали на спектрофлуориметрі Shimadzu RF-5000 (Японія). Кількісний вміст MtHb визначали ціанметгемоглобіновим методом (Кушаковський М.С., 1970). Кількісний вміст глікозильованої форми гемоглобіну визначали спектрофотометричним методом (Данилова Л.А., Лопатіна Н.І., 1986) і виражали в % від загального вмісту гемоглобіну. Вміст глюкози оцінювали уніфікованим орто-толуїдиновим методом (виражали в ммоль/ л). Вміст фосфоенолпірувату і АТФ у гемолізаті еритроцитів визначали за описаними методами (Алейнікова Т.А., Рубцова М.В., 1988) і виражали за вмістом неорганічного фосфору (ммольФн/л). Гексокіназну і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну активність гемолізатів еритроцитів визначали спектрофотометричними методами (Кочетов М.А., 1980). Глутатіонредуктазну активність визначали спектрофотометричним методом (Агабелі Р.А., 1989). Гексокіназну активність еритроцитів оцінювали за окисненням інкубаційного середовища, що зв’язано з утворенням глюкозо-6-фосфату і виражали в нмоль окисненої глюкози на 1 мл еритроцитів за 1 хвилину (нмоль/мл?хв). Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназну активність оцінювали за утворенням відновленого НАДФ і виражали в нмоль/мл?хв. Глутатіонредуктазну активність оцінювали за утворенням окисненої форми НАДФ і виражали в нмоль на 1 мл еритроцитів за хвилину (нмоль/мл?хв). Каталазну активність визначали описаним спектрофотометричним методом (Королюк М.А. та ін., 1988), яку оцінювали за кількістю зруйнованої Н2О2 і виражали в ммоль/л?с. Активність K+, Na+–АТФ-ази у мембранах еритроцитів визначали спектрофотометричним методом (Толстухіна Т.І., 1982), оцінювали за кількістю відщепленого неорганічного фосфату і виражали в мікромолях Фн на 1 мл суспензії еритроцитів за 1 хвилину (мкмоль Фн/ мл?хв).

Цифрові дані, які одержували в результаті досліджень, обробляли з використанням стандартних методів статистики (Лакін Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Структурний стан гемоглобіну та метаболічні особливості

ізольованих еритроцитів за умов ініціації окиснювальних реакцій

Вміст MtHb і глікозильованого гемоглобіну в гемолізатах еритроцитів. Окиснювальна модифікація HbА. При інкубації еритроцитів донорів у середовищі Фентона, що генерує АФК, було відмічено збільшення вмісту MtHb: на 21,6 % через 2 години інкубації, на 34,0 % – через 4 години і на 146,0 % – через 24 години порівняно з контролем. Зміни вмісту глікозильованої форми гемоглобіну мали протилежний характер (рис. 1.).

Вивчення окиснювальної модифікації HbА показало, що зі збільшенням часу інкубації еритроцитів у середовищі Фентона закономірно зростає вміст альдегідних і кетонних продуктів окиснювальної модифікації нейтрального та основного характеру (табл. 1.).

Таблиця 1

Вміст альдегідних і кетонних продуктів в HbА за умов ініціації окиснювальних реакцій в ізольованих еритроцитах

Об’єкт дослідження | Продукти нейтрального характеру, од. опт. густ. | Продукти основного характеру, од. опт. густ.

Альдегідні

356 нм | Кетонні

370 нм | Альдегідні

430 нм | Кетонні

530 нм

Контроль (еритроцити без інкубації у середовищі Фентона) | 0,205 ? 0,007 | 0,230 ? 0,009 | 0,250 ? 0,01 | 0,055 ? 0,004

Інкубація еритроцитів у середовищі Фентона протягом:

2-х годин; | 0,223 ? 0,014 | 0,250 ? 0,013 | 0,270 ? 0,011 | 0,068 ? 0,003*

4-х годин; | 0,263 ? 0,01* | 0,277 ? 0,008* | 0,280 ? 0,013* | 0,079 ? 0,004*

24-х годин | 0,514 ? 0,01* | 0,594 ? 0,008* | 0,615 ? 0,01* | 0,212 ? 0,006*

* – вірогідність різниці порівняно з контролем (Р < 0,05).

Рис. 1. Динаміка зміни вмісту MtHb і глікозильованого гемоглобіну при інкубації еритроцитів у середовищі Фентона: 1 – контроль; 2 – 2 години інкубації; 3 – 4 години інкубації; 4 – 24 години інкубації.

Виявлено досить виражену узгодженість у динаміці змін вмісту альдегідних та кетонних продуктів нейтрального характеру. Через 2 години інкубації еритроцитів у середовищі Фентона рівень цих продуктів зростав на 8,8% (альдегідні) і на 8,7% (кетонні), через 4 години інкубації – на 28,3 % і 20,4 % і через 24 години інкубації – на 150,7 % і 158,3 % відповідно. Заслуговує на увагу той факт, що динаміка збільшення вмісту кетонних продуктів основного характеру була більш вираженою, це може бути зв’язано зі збільшенням доступу певних, можливо, більш „захованих”, амінокислотних залишків для окиснювальної дії АФК.

Простежується також тісна позитивна кореляція у змінах вмісту продуктів окиснювальної модифікації гемоглобіну й утворення його метформи. Коефіцієнти кореляції визначено в межах (+) 0,9 – (+) 0,96 (Р < 0,05), що свідчить про тісний взаємозв’язок окиснювальної модифікації гемоглобіну і метгемоглобіноутворення. Цілком імовірно, що генерування О2. при переході гемоглобіну в MtHb сприяє окиснювальній модифікації білкової компоненти і ця залежність може мати зворотню спрямованість.

Внутрішньомолекулярна гідрофобність і можливість полімеризації HbА. Застосування методу флуоресцентної спектрофотометрії з використанням високогідрофобного зонда ФНА показало, що за умов генерування АФК знижується внутрішньомолекулярна гідрофобність HbА. Про це свідчить зниження рівня флуоресценції зонда, здатного проходити у найбільш гідрофобні ділянки білкових глобул (табл. 2.).

За даними літератури, інтенсивність флуоресценціі зонда ФНА в розчинах білка свідчить про ступінь гідрофобності ділянок, які займає зонд у білковій молекулі (Добрецов Г.Є., 1989).

Таблиця 2

Інтенсивність флуоресценції (Fmax) зонда ФНА у розчинах HbА

за умов ініціації окислювальних реакцій в ізольованих еритроцитах

Об’єкт дослідження | Fmax (ум. од.)

Контроль | 109,50 ? 5,0

Інкубація еритроцитів у середовищі Фентона протягом:

2-х годин; | 100,50 ? 2,1

4-х годин; | 85,70 ? 2,17*

24-х годин | 73,61 ? 2,7*

Примітка: позначення для * те ж, що і в табл. 1.

Найбільш виражене зниження інтенсивності флуоресценції зонда зазначено через 4 години (на 21,7 %) та через 24 години (на 32,7 %) порівняно з контролем. Простежується добре виражений зворотний зв’язок у змінах рівня флуоресценції зонда і вмісту продуктів окиснювальної модифікації гемоглобіну. Найбільш високі значення коефіцієнта кореляції показано для альдегідних і кетонних продуктів нейтрального характеру (r = – 0,95).

Цілком імовірно, що більша частина таких продуктів може бути наслідком окиснювальної модифікації гідрофобних амінокислотних залишків.

Інкубація еритроцитів у середовищі Фентона протягом 24 годин супроводжувалася полімеризацією гемоглобіну, про що свідчать дані вивчення молекулярної маси відповідних зразків HbА. Контрольний зразок гемоглобіну характеризувався молекулярною масою 67400 ? 510 Да; зразки гемоглобіну, що були отримані при інкубації еритроцитів у середовищі Фентона, мали такі значення молекулярної маси: 67700 ? 535 Да (2 години інкубації), 67500 ? 500 Да (4 години інкубації), 67300 ? 436 Да та 136000 ? 707 Да (24 години інкубації). Ідентифіковані продукти полімеризації гемоглобіну характеризувались у 2 рази більшою молекулярною масою, що свідчить про можливість утворення полімерних форм типу Нв-Нв.

Вміст глюкози, фосфоенолпірувату і АТФ в гемолізатах еритроцитів за умов ініціації окиснювальних реакцій. Інкубація еритроцитів у середовищі, що генерує АФК, супроводжувалася зниженням рівня глюкози, особливо через 24 години інкубації (табл. 3.).

Поряд із цим знижувався вміст ФЕП і АТФ (табл. 3.). Слід зазначити, що зниження рівня АТФ мало більш виражений характер: в 1,7 разу через 2 години інкубації еритроцитів (порівняно з контролем), на 2,2 разу – через 4 години і в 5,5 разу через 24 години інкубації порівняно з попереднім значенням показника, відповідно.

Таблиця 3

Вміст глюкози, фосфоенолпірувату (ФЕП) і АТФ у гемолізатах

еритроцитів за умов ініціації окиснювальних реакцій

Об’єкт

дослідження | Глюкоза, ммоль/л | ФЕП,

ммоль Фн/л | АТФ,

ммоль Фн/л

Контроль | 4,51 ? 0,3 | 0,13 ? 0,005 | 0,144 ? 0,0027

Інкубація еритроцитів у середовищі Фентона протягом:

2-х годин; | 3,84 ? 0,2* | 0,11 ? 0,006* | 0,087 ? 0,0024*

4-х годин; | 2,71 ? 0,11* | 0,07 ? 0,005* | 0,066 ? 0,0024*

24-х годин | 0,25 ? 0,02* | 0,054 ? 0,002* | 0,012 ? 0,0006*

Примітка: позначення для * те ж, що і в табл. 1.

Гексокіназна і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназна активність еритроцитів за умов ініціації окиснювальних реакцій. Вивчення ферментної активності, пов’язаної з обміном глюкози, показало, що за умов інкубації еритроцитів у середовищі Фентона гексокіназна активність помірно знижується. Через 2 години інкубації зниження гексокіназної активності мало характер тенденції; але через 4 години інкубації активність вже знижувалась на 15,2 %, через 24 години – на 21,2 % порівняно з контролем (табл. 4.).

Динаміка зміни глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активності мала інший характер. Простежувалося збільшення відповідного показника через 2 години інкубації еритроцитів (в 1,5 разу порівняно з контролем), а в подальшому – помірне зниження активності до рівня, що перевищує значення показника в контролі на 29,8 % (табл. 4.).

Глутатіонредуктазна і каталазна активність еритроцитів, активність мембранної K+, Na+ – АТФ-ази за умов ініціації окиснювальних реакцій. Як показали дослідження (табл. 4.), глутатіонредуктазна активність збільшувалась на 51,0 % порівняно з контролем через 2 години інкубації еритроцитів у середовищі Фентона, а в подальшому знижувалась, досягаючи через 24 години рівня, що був на 16,9% нижчим від рівня контролю.

Простежується добре виражена узгодженість у змінах глутатіонредуктазної і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активності в перші години інкубації еритроцитів у середовищі Фентона, що можна з’ясувати метаболічним взаємозв’язком обох ферментів.

Більш помітне зниження глутатіонредуктазної активності через 24 години інкубації еритроцитів, можливо, зумовлено більшою „чутливістю” молекул цього ферменту до дії АФК або продуктів окиснювальних реакцій, що йдуть за їх участю.

Таблиця 4

Показники ферментної активності еритроцитів

за умов ініціації окиснювальних реакцій

Показники | Контроль | Інкубація еритроцитів у середовищі Фентона протягом:

2-х годин | 4-х годин | 24-х годин

Гексокіназна активність, нмоль/ мл. хв. | 0,66 ? 0,027 | 0,62 ? 0,012 | 0,56 ? 0,013* | 0,52 ? 0,012*

Глюкозо-6-фос-фатдегідрогена-зна активність, нмоль/ мл.хв. | 0,047 ? 0,0015 | 0,070 ? 0,0024* | 0,063 ? 0,0018* | 0,061 ? 0,0013*

Глутатіон-

редуктазна активність,

нмоль/ мл. хв. | 0,590 ? 0,026 | 0,891 ? 0,030* | 0,800 ? 0,017* | 0,490 ? 0,022*

Каталазна активність,

ммоль/ л.с. | 0,065 ? 0,0056 | 0,054 ? 0,002* | 0,038 ? 0,002* | 0,035 ? 0,002*

Активність мембранної K+, Na+ – АТФ-ази, мкмоль Фн/

мл. хв. | 0,044 ? 0,006 | 0,056 ? 0,008 | 0,070 ? 0,01* | 0,079 ? 0,006*

Примітка: позначення для * те ж, що і в табл. 1.

Каталазна активність за цих умов знижувалася: на 16,9 % через 2 години інкубації еритроцитів і на 29,6 % через 4 години інкубації. Через 24 години інкубації еритроцитів каталазна активність практично не змінювалася порівняно із попереднім значенням показника.

Водночас простежувалося збільшення активності мембранної K+, Na+ – АТФ-ази (табл. 4.).

Отже, за умов ініціації окиснювальних реакцій за участю активних форм кисню ізольовані еритроцити відповідають змінами у стані ферментної активності і показників метаболізму глюкози. Зміни ферментної активності мають неоднозначний характер, що може бути зв’язано зі специфікою організації молекулярних систем в еритроцитах, а також зі специфікою реакції різних ферментів на окиснювальну дію АФК. Не є винятком вплив на активність ферментів поліненасичених жирних кислот, зокрема, представників родин w3 та w6, біоефекторні функції яких обговорюються у деяких працях останніх років (Дятловицька Є.В., Безуглов В.В., 1998; Попічев М.І., 2001; Коржов В.І. та ін., 2003).

Зазначені зміни вивчених біохімічних показників можуть бути зумовлені не тільки ушкоджувальною дією активних форм кисню, але також функціонуванням певних компенсаторних механізмів, спрямованих на підтримку відновлювального потенціалу і функціонального стану еритроцитів.

Структурний стан гемоглобіну і метаболічні

особливості еритроцитів за умов посиленого перебігу

окиснювальних реакцій за патологією

Вміст MtHb і глікозильованого гемоглобіну в еритроцитах за жовчнокам’яної хвороби та цирозу печінки. Розвиток окиснювального стресу виявляється при багатьох патологіях (Менщиков Є.Б. та ін., 1997; Bostwick et al., 2000; Медведєва Л.В. та ін., 2000; Шведова А.А. та ін., 2004; Тищенко М.В., 2005). До таких патологій належать жовчнокам’яна хвороба та цироз печінки, оскільки при даних захворюваннях інтенсифікуються реакції перекисного окиснення ліпідів, зокрема в мембрані еритроцитів (Толкачьова Н.В., 1991; Коношенко С.В., Йолкіна Н.М., 2004). Показником інтенсивності окиснювальних реакцій за участю АФК є також вміст в еритроцитах MtHb.

Одержані дані свідчать про більш високий вміст MtHb в еритроцитах хворих на жовчнокам’яну хворобу і цироз печінки: у 1,5 та 2,0 рази, відповідно, порівняно з контрольною групою донорів (табл. 5.).

Таблиця 5

Вміст MtHb і глікозильованого гемоглобіну

в гемолізатах еритроцитів хворих

Обстежені групи | Метгемоглобін, % | Глікозильований гемоглобін, %

Контрольна група | 2,5 ? 0,3 | 3,9 ? 0,30

Хворі на жовчнокам’яну хворобу | 3,8 ? 0,6* | 5,6 ? 0,20*

Хворі на цироз печінки | 5,3 ? 0,8* | 5,75 ? 0,35*

Примітка: * вірогідність різниці порівняно з контрольною групою (Р < 0,05).

Підвищення вмісту MtHb в еритроцитах хворих заслуговує на увагу, як фактор, який створює умови для генерування АФК. Збільшення вмісту метгемоглобіну поєднувалося з підвищенням рівня глікозильованого гемоглобіну, в середньому майже в 1,5 разу порівняно з контрольною групою (табл. 5.).

Окиснювальна модифікація і внутрішньомолекулярна гідрофобність HbА хворих на цироз печінки. Оцінка можливості полімеризації гемоглобіну. Результати досліджень показали (табл. 6.), що за умов цирозу печінки інтенсифікується окиснювальна модифікація HbА. Вміст альдегідних продуктів нейтрального характеру був більшим в 1,7 разу, кетонних продуктів нейтрального характеру – в 1,6 разу, альдегідних і кетонних продуктів основного характеру – в 1,7 і 1,9 разу, відповідно.

Таблиця 6

Вміст продуктів окиснювальної модифікації HbА хворих на цироз печінки

Обстежені групи | Продукти нейтрального характеру, од. опт. густ. | Продукти основного характеру, од. опт. густ.

Альдегідні 356 нм | Кетонні

370 нм | Альдегідні 430 нм | Кетонні

530 нм

Контрольна група | 0,205 ? 0,007 | 0,230 ? 0,009 | 0,250 ? 0,010 | 0,055 ? 0,004

Хворі на цироз печінки | 0,344 ? 0,010* | 0,360 ? 0,010* | 0,427 ? 0,008* | 0,105 ? 0,003*

Примітка: позначення для * те ж, що і в табл. 5.

Вивчення внутрішньомолекулярної гідрофобності HbА хворих із застосуванням флуоресцентної спектрофотометрії показало, що даний структурний параметр гемоглобіну зазнає вірогідних змін. Про це свідчить зменшення інтенсивності флуоресценції зонда ФНА в дослідних розчинах гемоглобіну: на 23,2 % порівняно з контрольною групою (табл. 7.).

Таблиця 7

Інтенсивність флуоресценції (Fmax) зонда ФНА

в розчинах HbА хворих на цироз печінки

Обстежені групи | Fmax (ум. од.)

Контрольна група | 109,5 ? 5,0

Хворі на цироз печінки | 84,05 ? 1,3*

Примітка: позначення для * те ж, що і в табл. 5.

Проте, незважаючи на більш інтенсивну окиснювальну модифікацію і зниження рівня внутрішньомолекулярної гідрофобності гемоглобіну хворих, зберігається його молекулярна маса, не виявлено полімерних форм гемоглобіну.

Вміст глюкози, ФЕП і АТФ в еритроцитах за жовчнокам’яної хвороби та цирозу печінки. Показано, що у випадку обох патологій в еритроцитах збільшується рівень глюкози: на 31,3 % за жовчнокам’яної хвороби та на 93,8 % за цирозу печінки. Водночас зазначено збільшення рівня ФЕП і АТФ. Збільшення рівня ФЕП показано в 5,6 разу (жовчнокам’яна хвороба) і у 8,1 разу (цироз печінки). Рівень АТФ зростає в 1,6 і в 2,7 разу, відповідно (табл. 8.).

Таблиця 8

Вміст глюкози, ФЕП і АТФ в еритроцитах хворих

Обстежені групи | Глюкоза, ммоль/л | ФЕП,

ммоль Фн/л | АТФ,

ммоль Фн/л

Контрольна група | 4,8 ? 0,07 | 0,13 ? 0,005 | 0,144 ? 0,0024

Хворі на жовчнокам’яну хворобу | 6,3 ? 0,25* | 0,73 ? 0,006* | 0,225 ? 0,015*

Хворі на цироз печінки | 9,3 ? 0,5* | 1,05 ? 0,018* | 0,390 ? 0,018*

Примітка: позначення для * те ж, що і в табл. 5.

Збільшення вмісту ФЕП і АТФ в еритроцитах хворих свідчить про інтенсифікацію внутрішньоеритроцитарних гліколітичних реакцій, що може бути зумовлено зростанням рівня глюкози в еритроцитарних клітинах. У зв’язку із цим, заслуговує на увагу збільшення вмісту глюкози в еритроцитах хворих, і цей факт можна пояснити порушенням структурно-функціонального стану еритроцитарних мембран внаслідок інтенсифікації в них реакцій перекисного окиснення ліпідів (Толкачьова Н.В., 1991; Коношенко С.В., Йолкіна Н.М., 2004). Можна припустити, що надмірний рівень глюкози в еритроцитах є одним із чинників, котрий спричиняє метаболічні перебудови, які можуть мати компенсаторне значення.

Гексокіназна і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназна активність в еритроцитах за жовчнокам’яної хвороби та цирозу печінки. Як показали дослідження (табл. 9.), гексокіназна активність еритроцитів в обох групах хворих була більшою порівняно з контрольною групою: в 4,7 разу за жовчнокам’яної хвороби та в 5,9 разу – за цирозу печінки. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназна активність була нижчою порівняно з контролем: на 27,7 % та на 42,6 %, відповідно до патології. Збільшення гексокіназної активності також, як і зростання рівня ФЕП і АТФ, свідчить про інтенсифікацію гліколітичних реакцій, що пов’язано не тільки з посиленим генеруванням АТФ, але й відновлювальних еквівалентів у формі НАДН, а також 2, 3-дифосфогліцерату, який знижує спорідненість гемоглобіну до кисню. Це може мати певне компенсаторне значення за умов зростання кількості глікозильованої форми гемоглобіну, що характеризується більш високою спорідненістю до кисню (Галенок В.А. та ін., 1989). Зниження глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активності на тлі зростання гексокіназної активності також відображає процеси метаболічної перебудови еритроцитів, їх перехід на використання глюкози значно більшою мірою в гліколітичних реакціях порівняно з реакціями пентозофосфатного шляху.

Глутатіонредуктазна і каталазна активність еритроцитів, активність мембранної K+, Na+ – АТФ-ази за умов патології. Зниження глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активності в еритроцитах хворих поєднувалося зі зменшенням глутатіонредуктазної активності: на 26,3 % за жовчнокам’яної хвороби і на 39,0 % – за цирозу печінки порівняно з контролем (табл. 9.).

Таблиця 9

Показники ферментної активності в гемолізатах еритроцитів хворих

Ферменти | Контрольна група | Патологія

Жовчнокам’яна хвороба | Цироз печінки

Гексокіназна активність,

нмоль/ мл. хв. | 0,66 ? 0,027 | 3,1 ? 0,08* | 3,9 ? 0,09*

Глюкозо-6-фосфат-дегідрогеназна активність,

нмоль/ мл. хв. | 0,047 ? 0,0015 | 0,034 ? 0,0012* | 0,027 ? 0,001*

Глутатіон-

редуктазна активність,

нмоль/ мл. хв. | 0,590 ? 0,026 | 0,435 ? 0,025* | 0,360 ? 0,022*

Каталазна активність,

ммоль/ л.с. | 0,065 ? 0,0056 | 0,198 ? 0,009* | 0,228 ? 0,015*

Активність мембранної K+, Na+ – АТФ-ази, мкмоль Фн/ мл. хв. | 0,044 ? 0,006– | 0,090 ? 0,01*

Примітка: позначення для * те ж, що і в табл. 5.

Водночас простежувалося збільшення каталазної активності: в 3,0 і 3,5 разу за жовчнокам’яної хвороби та цирозу печінки, відповідно (табл. 9.). У літературі також є дані про підвищення активності еритроцитарної каталази за умов патології (хронічна недостатність функції печінки) на тлі зниження в еритроцитах рівня загального глутатіону та активності глутатіонредуктази (Martin-Mateo M.C. et al., 1998). Показане в наших дослідженнях підвищення каталазної активності в еритроцитах хворих може мати компенсаторне значення.

Вивчення активності мембранної K+, Na+ – АТФ-ази проводили у хворих на цироз печінки. Було встановлено, що активність даного ферменту за цією патологією зростає в 2,0 рази порівняно з контрольною групою (табл. 9.). Збільшення активності K+, Na+ – АТФ-ази в еритроцитарній мембрані також може бути частиною загальної системи компенсаторних процесів, які здійснюються в еритроцитах за умов окиснювального стресу в організмі.

Отже, за умов генерування активних форм кисню та посилення окиснювальних реакцій за участю АФК еритроцити людини відповідають змінами в структурному стані гемоглобіну й утворенні його окремих форм, а також змінами у внутрішньоклітинному метаболізмі, зокрема, у метаболізмі глюкози, в стані тих ланок обміну, які забезпечують формування відновлювального потенціалу клітин та їх енергообміну. Враховуючи характер змін ферментної активності та показників обміну глюкози, можна припустити, що еритроцити людини забезпечені можливостями дії різних компенсаторних механізмів, які включаються за умов окиснювального стресу. Вивчення біохімічних змін у клітинах різного типу за умов окиснювального стресу дає можливість краще зрозуміти механізми ушкоджувальної дії АФК, а також механізми компенсаторних реакцій, спрямованих на стабілізацію структурного і функціонального стану клітин, їх молекулярних систем; поширює можливості пошуку засобів керування такими механізмами.

ВИСНОВКИ

1. За умов окислювального стресу в еритроцитах людини відбуваються зміни структурних властивостей гемоглобіну, співвідношення його окремих форм, а також зміни в метаболізмі глюкози, в стані ферментної активності, пов’язаної із забезпеченням формування відновлювального потенціалу еритроцитарних клітин. Це простежується як в модельних дослідах, при інкубації еритроцитів здорових людей у середовищі Фентона, що продукує АФК, так й за умов патології (цироз печінки і жовчнокам’яна хвороба).

2. При інкубації еритроцитів у середовищі Фентона підсилюється окиснювальна модифікація білкового компонента HbА, що тісно пов’язано зі зменшенням внутрішньомолекулярної гідрофобності даної фракції гемоглобіну та метгемоглобіноутворенням. За умов ініціації окиснювальних реакцій зменьшується вміст глікозильованого гемоглобіну та виникає можливість полімеризації HbА.

3. Зниження вмісту глюкози в еритроцитах, інкубованих у середовищі Фентона, супроводжується пригніченням гліколітичного шляху перетворення глюкози. Разом із цим, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназна і глутатіонредуктазна активність еритроцитів змінюється в напрямку стабілізації їх відновлювального потенціалу. Водночас в еритроцитах знижується каталазна активність та підвищується активність мембранної K+, Na+ – АТФ-ази.

4. При захворюваннях, що характеризуються розвитком окиснювального стресу (цироз печінки і жовчнокам’яна хвороба) в еритроцитах посилюється метгемоглобіноутворення і глікозилювання гемоглобіну. Разом із цим, в еритроцитах хворих на цироз печінки посилюється окиснювальна модифікація HbА, що супроводжується зниженням рівня внутрішньомолекулярної гідрофобності гемоглобіну, але не призводить до його полімеризації.

5. Збільшення вмісту глюкози в еритроцитах хворих на цироз печінки та жовчнокам’яну хворобу супроводжується більш вираженим переходом еритроцитів на використання глюкози в гліколітичному шляху порівняно з контрольною групою донорів.

Зниження глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної і глутатіонредуктазної активності в еритроцитах при відповідних захворюваннях супроводжується підвищенням каталазної активності, а також збільшенням активності мембранної K+, Na+ – АТФ-ази (в групі хворих на цироз печінки), що в цілому свідчить про компенсаторну перебудову внутрішньоеритроцитарного метаболізму як можливий механізм запобігання необоротного ушкодження еритроцитів.

6. Зміни низки показників, що виявлені в еритроцитах хворих на жовчнокам’яну хворобу та цироз печінки, є односпрямованими і більшою мірою виражені за цирозом печінки, що, перш за все, відображає загальну стратегію біохімічної перебудови еритроцитів при даних захворюваннях, а також вказує на зв'язок рівня зазначених змін з видом патології.

7. Характер змін окремих біохімічних показників, що спостерігається при інкубації еритроцитів у середовищі Фентона та за патологією, свідчить про можливість реалізації в еритроцитах людини різноспрямованих компенсаторних механізмів, дія яких пов’язана із розвитком окиснювального стресу.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті

1. Казакова В.В., Ёлкина Н.М. Окислительная модификация и изменения внутримолекулярной гидрофобности гемоглобина А при инкубации эритроцитов человека в среде Фентона / Укр. біохім. журн. – 2007. – Т. 79, № 4. – С. 34-37.

2. Йолкіна Н.М. Окиснювальна модифікація головної фракції гемоглобіну людини за умов генерування активних форм кисню в ізольованих еритроцитах та при патології // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2005, № 4. – С. 28-32.

3. Коношенко С.В., Йолкіна Н.М. Характеристика деяких показників еритроцитарного метаболізму в нормі та за жовчнокам’яної хвороби // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2004, № 1. – С.65-68.

4. Йолкіна Н.М., Казакова В.В., Коношенко С.В. Характеристика окремих показників внутрішньоеритроцитарного метаболізму за умов генерування активних форм кисню in vitro // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2005, № 3. – С. 50-54.

5. Ёлкина Н.М. Изменения отдельных биохимических показателей эритроцитов человека в условиях генерирования активных форм кислорода in vitro // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. – Симферополь. – 2005. – Серия «Биология и химия». – Т. 18(57), № 3. – С. 31-34.

6. Ёлкина Н.М., Казакова В.В. Метаболические изменения в эритроцитах больных циррозом печени // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. – Симферополь. – 2006. – Т. 19(58), №  . – С. 40-42.

7. Ёлкина Н.М. Влияние активных форм кислорода на метаболическое и функциональное состояние эритроцитов // Тематический сборник научных трудов Таврического национального университета им. В.И. Вернадского "Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана". - Симферополь. – 2006. – Вып. 16. – С. 193-196.

8. Йолкіна Н.М., Казакова В.В., Коношенко С.В. Внутрішньомолекулярна гідрофобність і можливість полімеризації головної фракції гемоглобіну людини за умов генерування активних форм кисню в ізольованих еритроцитах // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2007, № 1. – С. 52-55.

9. Сургай Е.Г., Коношенко С.В., Ёлкина Н.М., Бекшанская С.В. Метаболическое состояние эритроцитов при воздействии интенсивной физической нагрузки и при патологии // Труды Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского "Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения". – Симферополь, КГМУ. – 2003. – Т. 139. – С. 146-148.

Матеріали наукових конференцій, з’їздів, тези:

1. Ёлкина Н.М., д.б.н. Коношенко С.В., Ямполь Н.В. Метаболические изменения в эритроцитах при жёлчнокаменной болезни и циррозе печени // Матеріали III Міжнародної науково-практичної конференції "Динаміка наукових досліджень" -2004, м. Дніпропетровськ, 21-30 червня 2004 р: Тези доп. – Дніпропетровськ, 2004. – С. 72-73.

2. Коношенко С.В., Йолкіна Н.М. Метаболічні зміни в еритроцитах в умовах окиснювального стресу за жовчнокам’яної хвороби // Матеріали Установчого з'їзду Українського товариства клітинної біології. м. Львів, 25-28 квітня 2004 р.: Тези доп. – Львів. – 2004. – С. 220.

3. Ёлкина Н.М. Уровень метгемоглобина и активность отдельных внутриэритроцитарных ферментов в условиях генерирования активных форм кислорода in vitro // Матеріали VIII Міжнародної науково-практичної конференції "Наука і освіта 2005", м. Дніпропетровськ, 7-21 лютого 2005 р.: Тези доп. – Дніпропетровськ, 2005, Біологія. – Т. 10. – С. 76-78.

4. Ёлкина Н.М. Изменения в обмене глюкозы в эритроцитах в условиях генерирования активных форм кислорода in vitro // Матеріали II Міжнародної науково-практичної конференції "Науковий потенціал світу – 2005" м. Дніпропетровськ, 19-30 вересня 2005 р.: Тези доп. – Дніпропетровськ, 2005. – Т. 1. – С. 28-30.

5. Ёлкина Н.М. Изменения уровня глюкозы