УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

Ковтун Світлана Іванівна

УДК 636.2:591.391/392:578.083

ЦИТОГЕНЕТИЧНІ ТА МОРФОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

РАННЬОГО ЕМБРІОГЕНЕЗУ ПРИ ОДЕРЖАННІ ЗАРОДКІВ

ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ IN VITRO

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

с. Чубинське, Київської області

2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук.

Науковий керівник : доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Кузнєцов Валерій Євгенович Інститут розведення і генетики

тварин УААН, с.Чубинське, Київської області, заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Коновалов В’ячеслав Сергійович

Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське, Київської

області, головний науковий співробітник лабораторії генетичних основ селекції

кандидат біологічних наук, старший

науковий співробітник

Стефанович Ганна Володимирівна Український науковий гігієнічний центр МОЗ України, Центр медичної генетики НАН та МОЗ України, м.Київ, завідувач лабораторії генетики раннього

розвитку людини

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м.Київ, відділ біохімічної генетики

Захист відбудеться 1 червня 2000 р. о 10 годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 Інституту розведення і генетики тварин УААН за адресою: 08321, Київська обл., Бориспільський район, с.Чубинське, вул.Погребняка, 1.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин УААН.

Автореферат розісланий “27” квітня 2000р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат сільськогосподарських

наук, старший науковий

співробітник Мільченко Ю.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Методи дозрівання і запліднення in vitro ооцитів корів, культивування ранніх зародків поза організмом, разом з розробленою останнім часом методикою багаторазового вилучення незрілих ооцитів з яєчників живих генетично цінних корів і телиць за допомогою трансвагінальної пункції антральних фолікулів під контролем ультразвуку (ovum pick-up - OPU), дають можливість отримати більше придатних для нехірургічної трансплантації морул-бластоцист великої рогатої худоби та телят від одного донора порівняно з їх одержанням у схемах МОЕТ (multiple ovulation and embryo transfer), суттєво підвищити генетичний прогрес у скотарстві [Lohuis M.M., 1995; Smorag Z. e.a., 1998; Kruip T.A.M., 1998]. Поряд з цим, аналіз літературних даних свідчить, що невисокий рівень одержання бластоцист великої рогатої худоби поза організмом, їх знижене приживлення після пересадки реципієнтам та гірша виживаність таких заморожено-відтанутих зародків порівняно з зародками, отриманими in vivo, обмежують можливість застосування цієї методики у відтворенні тварин [Massip A. e.a.,1994; VanSoom A. e.a., 1997; Thompson J.G.e.a., 1998]. Таким чином, існує ряд проблем, які стосуються раннього доімплантаційного розвитку ссавців і потребують подальшого вивчення.

Велике значення для підвищення ефективності методики одержання зародків ссавців in vitro має розробка нових та удосконалення існуючих молекулярно-цитогенетичних методів аналізу доімплантаційного розвитку зародків [Verlinsky O. e.a., 1998]. Одним із таких підходів є диференційне забарвлення хромосом ооцитів і зародків сільськогосподарських тварин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності з науково-технічними програмами Інституту розведення і генетики тварин УААН по завданнях: “Розробити нові біотехнологічні методи прискореного розмноження високоцінних сільськогосподарських тварин” 1991-1995 рр. (№ держреєстрації UA01001476P); “Вдосконалити і впровадити системи застосування молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних методів у селекції сільськогосподарських тварин” 1996-2000 рр. (№ держреєстрації 019U016325), а також була підтримана грантом Міністерства України в справах науки і технологій № 0198U002131 (1997-1999 рр.).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було удосконалення методів одержання in vitro зародків великої рогатої худоби, здатних до розвитку поза організмом до стадії морули-бластоцисти, дослідження особливостей мейозу у корів та раннього доімплантаційного розвитку зародків в умовах in vitro, вивчення цитогенетичних та морфологічних характеристик ооцитів та зародків у великої рогатої худоби.

Згідно з метою були поставлені наступні завдання:

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Наукова новизна роботи. Показана можливість використання вибракуваної (за концентрацією та рухливістю сперматозоїдів) нативної сперми бугаїв-плідників для одержання зародків великої рогатої худоби in vitro. Доведено, що видалення сім’яної плазми перед заморожуванням сперматозоїдів бугая значно покращує ефективність запліднення поза організмом. Вперше проведено порівняльний аналіз ефективності запліднення і дроблення яйцеклітин, розвитку зародків поза організмом до стадії морули-бластоцисти при використанні епідидимальних (свіжоотриманих, таких, що короткочасно зберігались при +4C, та кріоконсервованих) та заморожено-відтанутих еякульованих сперматозоїдів бугаїв, отримана тільність після попарної пересадки реципієнтам десяти ембріонів, одержаних in vitro з використанням епідидимальних сперматозоїдів. Встановлено, що середовище Менезо Б2 забезпечує більш повноцінний розвиток зародків великої рогатої худоби in vitro порівняно з середовищем 199. Доведено, що культивування зародків великої рогатої худоби на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів можна здійснювати у середовищі 199 без додавання фетальної сироватки теляти або бичачого сироваткового альбуміну. Встановлено, що для отримання придатних для цитогенетичного аналізу метафазних пластинок 2-6-клітинних зародків та морул-бластоцист великої рогатої худоби, одержаних in vitro, більш доцільно застосовувати різні концентрації колхіцину. Вперше отримано С-забарвлені хромосоми ооцитів корів на різних стадіях мейозу, показано, що всі аутосоми та Х-хромосома ооцитів та зародків великої рогатої худоби містять С-сегменти центромерного гетерохроматину, Y-хромосома зародків майже повністю складається із гетерохроматину. Доведено, що вітрифікаційний розчин ЕФС40 забезпечує високу життєздатність заморожено-відтанутих 8-16-клітинних зародків кроля.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена та удосконалена методика одержання морул і бластоцист великої рогатої худоби in vitro, в тому числі при використанні епідидимальних сперматозоїдів бугаїв, може бути використана на племпідприємствах України. Визначення статі ембріонів з допомогою диференційного C-забарвлення мітозних хромосом може бути використано для отримання потомства бажаної статі. Заморожування ембріонів ссавців методом вітрифікації може бути застосовано для створення кріобанків зародків.

Особистий внесок здобувача. Особиста участь С.І.Ковтун в одержанні наукових результатів, викладених в дисертації, становить близько 85% і полягає в зборі матеріалу за тривалий період, обробці і аналізі першоджерел літератури і власних експериментальних даних. Зокрема автором удосконалено метод диференційного забарвлення (С-метод) препаратів мейозних та мітозних хромосом, самостійно виконано аналіз цитогенетичних препаратів ооцитів і зародків, дослідження з вітрифікації зародків кролів і великої рогатої худоби, проведено статистичний аналіз, виготовлені мікрофотографії. Дисертант приймала участь у проведенні частини дослідів в лабораторії трансплантації ембріонів МП “Біосервіс” (м.Харків) та у відділі фізіології розмноження тварин Інституту зоотехніки м.Краків (Польща).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень викладені в доповідях на науково-виробничій конференції “Нові методи селекції і відтворення високопродуктивних порід і типів тварин” (Київ, 1996), міжнародній науково-практичній конференції “Теория и практика племенного дела в животноводстве” (Харків, 1996), міжнародній науково-виробничій конференції “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогоспо-дарських тварин” (Асканія Нова, 1997), міжнародній конференції “Проблеми індивідуального розвитку сільськогоспо-дарських тварин” (Київ, 1997), міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва” (Львів, 1997), науково-виробничій конфе-ренції “Біотехнологічні, селекційні та організаційні методи відтво-рення, зберігання і використання генофонду тварин” (Київ, 1997), на ІІ і ІІІ міжнародних конференціях “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998, 1999), міжнародній науково-виробничій конференції “Селекційно-генетичні та біотехнологічні методи консолідації новостворених порід і типів сільськогоспо-дарських тварин” (Київ, 1999).

Публікації. Результати досліджень за темою дисертації опубліковано в 4 статтях в наукових журналах, 2 збірниках наукових праць та 9 матеріалах і тезах конференцій. Всього опубліковано 15 друкованих праць.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалу та методики досліджень, результатів власних досліджень та їх обговорення, висновків і практичних пропозицій. Роботу викладено на 152 сторінках. Ілюстративний матеріал представлений 8 таблицями і 26 рисунками. Список літератури містить 183 джерел, з яких 136 іноземних.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Ооцит-кумулюсні комплекси (ОКК), одержували із яєчників забитих корів і культивували in vitro на протязі 24 годин. Капацитовані поза організмом сперматозоїди бугая та ооцити корів спільно інку-бу-вали в модифікованому середовищі Tіроде протягом 18 годин. Капа-цитацію сперматозоїдів викликали за допомогою розчину гепарину (10 мкг/мл). Культивування зародків до стадії морули-бластоцисти прово-дили у середовищі на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів.

Для дослідження стану та перетворень хроматину ооцитів і ембріонів при їх культивуванні in vitro готували сухоповітряні препарати за модифікованим нами методом А.Тарковського [Tarkowski A.K., 1966] з наступним фарбуванням препаратів розчином барвника Гімза. Частину зародків культивували в середовищі з додаванням розчину колхіцину.

Для отримання диференційного С-забарвлення хромосом ооцитів корів використовували обробку сухоповітряних препаратів розчином гідроксиду барію за модифікованою нами методикою А.Т.Самнера [Samner А.Т., 1972], С-забарвлення метафазних пластинок мітозних хромосом зародків великої рогатої худоби, одержаних поза організмом, проводили за модифікованою нами методикою В.Ейвері та інш. [Avery B. e.a., 1991]. Препарати хромосом ооцитів та зародків великої рогатої худоби після 1-тижневого “старіння” послідовно обробляли 0,2М розчином соляної кислоти, 5%-ним розчином Ва(ОН)2 та розчином 2хSSC (0,3М хлорид натрію та 0,003М цитрат натрію, рН - 7,0). Фарбування препаратів проводили 4%-ним розчином барвника Гімза.

Надшвидке заморожування 8-16-клітинних зародків кролів, одер-жаних in vivo, та 7-денних бластоцист великої рогатої худоби, отриманих in vitro, проводили у вітрифікаційному розчині ЕФС40 (40% етилен-гліколю, 18% фіколу 70 і 0,3 М сахарози у PBS з 20% фетальної сироват-ки теляти).

Матеріали документували мікрофотографіями. Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критеріїв Ст’юдента та Хі-квадрат [Лакін Г.Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вплив деяких факторів на повноцінне дозрівання ооцитів корів in vitro

Відомо, що хромосоми незрілих ооцитів корів перебувають на різних стадіях диплотени мейозу: дифузної, фібрилярної та видимих бівалентів [Стефанович Г.В., 1988; Смирнова Т.А., 1991]. У наших дослідах найбільша кількість незрілих ооцитів корів перебувала на стадії видимих бівалентів (58,3 - 65,0%, 76/121), на дифузній стадії диплотени знаходилось найменше ооцитів (11,1 - 15,0%, 16/121), кількість ооцитів із дегенерацією хромосом (в залежності від морфологічних характеристик ооцит-кумулюсних комплексів) складала 7,5 - 55,6% (35/121).

Відомо, що при культивуванні in vitro ооцитів корів часто відбувається більш швидке ядерне дозрівання порівняно із цито-плазматичним [Yang X. e.a., 1993]. Деякі дослідники показали, що ефективним є дозрівання ооцитів корів in vitro протягом 22-24 годин [Galli C., Moor R.M., 1991]. З метою більш повноцінного цитоплазматичного дозрівання ми аналізували стадії мейозу ооцитів після 24 годин та після більш тривалого (26 годин) часу культивування (табл.1). Результати наших досліджень показали, що ефективнішим є 24-годинне культивування ОКК in vitro, так як така тривалість дозрівання дала можливість одержати крім високого відсотку ооцитів на метафазі ІІ нижчий загальний рівень хромосомних порушень (над-лишкова деспіралізація і дегенерація хромосом, часткове нероз-ход-ження бівалентів на уніваленти в метафазі І мейозу, блок анафази І).

Таблиця 1

Вплив тривалості культивування ОКК на дозрівання

ооцитів корів in vitro

Час | Всього | Кількість (%) ооцитів на стадії | Кількість

культи- | ооци- | діакінезу | метафа- | блоку | тело- | метафази ІІ | (%)

вування ОКК

(год) | тів, n | пізнього | зи І | ана-фази І | фази І | всього | із хромосомними аберація-ми | ооцитів із хромосомними порушен-нями

24 | 173 | 17a(9,8) | 9b(5,2) | 6с(3,5) | 11-d(6,4) | 130e (75,1) | 13f(7,5) | 30g(17,3)

26 | 141 | 19a(13,5) | 2b(1,4) | 7c(5,0) | 9d(6,4) | 104e (73,7) | 15f(10,6) | 39h(27,7)

g:h - p < 0,05, критерій 2. В цій та наступних таблицях різні суперскрипти у межах однієї колонки вказують на вірогідну різницю між показниками (Р не більше 0,05).

Не встановлено значної різниці за частотою ядерного дозрівання до метафази ІІ та за кількістю клітин з хромосомними абераціями на метафазі ІІ при культивуванні ооцитів з додаванням гормональних добавок (0,5 мкг/мл ФСГ, 2 мкг/мл естрадіолу 17 та 6 Од/мл лХГ) (1 група) або клітин гранульози (3-5 х106 кл/мл) (2 група), проте у групі 2 спостерігався вдвічі менший загальний рівень хромосомних порушень (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив гормональних добавок та клітин гранульози на

дозрівання ооцитів корів в умовах in vitro

Група | Всього | Кількість (%) ооцитів на стадії | Кількість (%)

ооцитів | ооци- | діакінезу | метафа- | блоку | тело- | метафази ІІ | ооцитів

тів,

n | пізнього | зи І | ана-фази І | фази І | всього | із хромо-сомнимипору-шен-нями | із хромо-сомними порушен-нями

1 | 173 | 17a(9,8) | 9b(5,2) | 6с(3,5) | 11-d(6,4) | 130d (75,1) | 13e(7,5) | 30f(17,3)

2 | 124 | 12a(9,7) | 6b(4,8) | 5c(4,0) | - | 101d (81,5) | 7e(5,6) | 10g(8,1)

f:g - P < 0,05, критерій 2.

Наступні дослідження показали, що завдяки продукуванню клітинами гранульози специфічних білків, естрогенів, простагландинів, а також паракринних факторів росту [Кузнєцов В.Є., 1999], їх присутність дозволила отримати досить високий рівень розвитку поза організмом отриманих in vitro зародків великої рогатої внаслідок забезпечення кращого цитоплазматичного дозрівання ооцитів корів in vitro.

Ефективність запліднення ооцитів корів поза організмом в залежності від використання різних груп сперматозоїдів

та методів обробки сперміїв

Нами показано, що вибракувана за концентрацією і рухливістю сперміїв нативна сперма бугаїв, не придатна (за вимогами ГОСТу 26030-83) для заморожування, може бути використана для запліднення in vitro ооцитів корів. Частота отримання зигот (58,5%, 72/123 проти 31,8%, 27/85, Р < 0,001, критерій 2 ) та 2-4-клітинних зародків (26,0%, 32/123 проти 12,9%, 11/85, Р < 0,05, критерій 2) у дослідній групі (вибракувана сперма бугаїв з концентрацією сперматозоїдів не менше 0,5 млрд./мл та рухливістю гамет не нижче 6 балів) була значно вище ніж у контролі (заморожено-розморожена сперма, яка відповідала за якістю за вимогами ГОСТу 26030-83 і була придатна для штучного осіменіння). Це пов’язано з тим, що застосовуваний нами метод відбору найбільш рухливих чоловічих гамет (“swim-up”), а також безпосереднє додавання сперматозоїдів до ооцитів при заплідненні in vitro дають можливість використовувати для осіменіння великої кількості яйцеклітин значно менше рухливих чоловічих гамет порівняно із осіменінням in vivo.

Доведено, що плазма сперми містить фактори (глікопротеїни), що перешкоджають капацитації та акросомної реакції сперматозоїдів внаслідок стабілізації їх мембран [Katska L. e.a., 1996]. Ми вивчали вплив видалення сім’яної плазми із еякульованої сперми бугая перед заморожуванням на одержання зародків великої рогатої худоби in vitro (табл. 3). Досліди показали, що використання таких заморожено-відтанутих сперматозоїдів дало можливість одержати значно вищий відсоток ранніх зародків порівняно із сперматозоїдами, які були кріоконсервовані без попереднього центрифугування (у дослідній та конрольній групах використовували сперму одного і того ж бугая).

Таблиця 3

Вплив сім’яної плазми на отримання зародків

великої рогатої худоби in vitro

Центрифугуван- | Кількість | Кількість (%)

ня сперми до | осіменених | 2-6-клітинних | пізніх морул-бластоцист

заморожування |

ооцитів | зародків | від осіменених ооцитів | від 2-6-клітинних зародків

+ | 254 | 155a (61,0) | 41c (16,1) | 41d (26,5)

258 | 128b (49,6) | 36c (13,6) | 36d (28,1)

a:b - P < 0,05, критерій 2.

Нещодавно показано, що гіпотаурин і епінефрин підвищують рухливість сперматозоїдів, пеніциламін в присутності епінефрину підвищує кількість сперміїв, які здійснюють акросомну реакцію, кофеїн разом з епінефрином підвищують здатність сперматозоїдів до капацитації та акросомної реакції [Lim J.M. e.a., 1993; Miller G. F.e.a., 1994]. Ми оцінювали вплив на запліднення і дроблення яйцеклітин та розвиток ембріонів великої рогатої худоби in vitro додавання до середовища запліднення 20 мкМ пеніциламіну, 10 мкМ гіпотаурину та 1 мкМ епінефрину (суміш РНЕ, І група) та 5мМ кофеїну і 1 мкМ епінефрину (ІІ група). Встановлено (табл. 4), що додавання РНЕ значно підвищує рівень пенетрованих яйцеклітин (кількість зигот) порівняно із застосуванням кофеїну та епінефрину.

Таблиця 4

Вплив добавок до середовища запліднення на одержання

ембріонів великої рогатої худоби in vitro

Добавка | Кількість | Кількість (%)

до середо- | осіме- | заплідне- | 2-4-клітинних зародків | морул-

вища зап- | нених | них яйце- | відразу після | всього | бласто-

ліднення | ооцитів | клітин | осіменіння | цист

РНЕ | 244 | 200a(82,0) | 21c(8,6) | 174e(71,3) | 17f(7,0)

кофеїн, епінефрин | 191 | 128b(67,0) | 6d(3,1) | 119e(62,3) | 11f(5,8)

a:b - P < 0,01; c:d - P < 0,05, критерій 2.

Суттєво, що при застосуванні РНЕ було отримано у 2,8 рази більше ранніх 2-4-клітинних зародків відразу після спільної інкубації гамет - доведено, що ембріони, які розпочали перший поділ дроблення раніше, є більш компетентними до подальшого розвитку [Єлізарова І.Б., 1995]. Отже, додавання РНЕ до середовища запліднення сприяє більш швидкій пенетрації сперматозоїдів у ооцити і тому прискорює початок дроблення зигот.

Нами показано (табл. 5), що епідидимальні свіжоотримані (ЕпС), короткочасно збережені при +4С (ЕпЗб) та заморожено-розморожені (ЕпЗ) сперматозоїди бугаїв можуть бути ефективно використані для одержання морул-бластоцист in vitro. При цьому не спостерігалось вірогідної різниці за частотою запліднення та отримання зародків поза організмом між ЕпЗ-сперматозоїдами та заморожено-відтанутими еякульованими (ЕяЗ) гаметами. Після попарної трансплантації десяти морул і бластоцист, одержаних після запліднення in vitro ооцитів корів ЕпЗб-сперматозоїдами, п’яти телицям-реципієнтам, у одного реципієнта була зареєстрована тільність, яка була перервана на сьомому місяці в зв’язку з актиномікозом нижньої щелепи.

Таблиця 5.

Ефективність одержання зародків великої рогатої худоби in vitro

при використанні епідидимальних сперматозоїдів

Група | Кількість | Кількість (%) зародків

досліду | осіменених

ооцитів | зигот | 2-6-клі-тинних | 12-16-клі-

тинних | морул-

бластоцист

ЕпС-сперма- | 127 | 109a(85,8) | 99de(78,0) | 39h(30,7) | 34j(26,8)

тозоїди

ЕпЗб-сперма- | 99 | 80ab(80,8) | 72df(72,7) | 21hi(21,2) | 17jkl(17,2)

тозоїди

ЕпЗ-сперма- | 286 | 193c(67,5) | 180f(62,9) | 63hi(22,0) | 5k/49*

тозоїди | (10,2)

ЕяЗ-сперма- | 252 | 168c(66,7) | 118g(46,8) | 38i(15,1) | 23kl(9,1)

тозоїди

* - культивування до стадії морули-бластоцисти проводилось в 1 досліді

a:c, e:g, d:g, f:g, h:i, j:l - P < 0,001

e:f - P < 0,01

b:c, j:k - P < 0,05 (критерій Ст’юдента).

Дослідження впливу ряду факторів на ефективність культивування

ембріонів великої рогатої худоби in vitro

З метою подолання блоку дроблення зародків великої рогатої худоби in vitro використовують різні моношари соматичних клітин. Ми порівнювали ефективність розвитку зародків великої рогатої худоби, отриманих in vitro, на моношарі клітин яйцепроводів корів (ЕКЯК), яєчники яких мали ознаки свіжої овуляції, та на моношарі клітин кумулюсу. Більш високий рівень дроблення запліднених яйцеклітин спостерігався при культивуванні зигот на моношарі клітин яйцепроводів корів (75,2%, 100/133 проти 52,3%, 80/153, Р < 0,001, критерій ?2). При цьому частота розвитку до стадії 12-16 клітин на цих моношарах (18,0 і 25,5% відповідно) вірогідно не відрізнялась. Нещодавно встановлено, що клітинами яйцепроводу та гранульози продукуються фактори росту, які підтримують розвиток зародків, зокрема епідермальний фактор росту, тромбоцитарний фактор росту та ін. [Yang B.K.e.a., 1993; Van Inren W.G. e.a., 1995].

Нами показано, що при застосуванні моношару епітеліальних клітин яйцепроводів корів середовище Менезо Б2 забезпечує більш високий рівень дроблення зигот і формування морул-бластоцист порівняно із середовищем 199 (табл. 6), хоча ця різниця була невірогідна. Важливим є факт, що наявність ранніх бластоцист спостерігалась раніше при використанні середовища Менезо Б2 (на 6 день) порівняно із середовищем 199 (на 7 день), що свідчить про більш повноцінний розвиток зародків in vitro до стадії бластоцисти у середовищі Менезо Б2.

Таблиця 6

Ефективність використання двох середовищ для культивування ембріонів великої рогатої худоби in vitro

Середовище для | Кількість | Кількість (%)

культивування | осіменених | 2-6-клітин- | морул-бластоцист

зародків | ооцитів | них зародків | від осіменених

ооцитів | від 2-6-клітинних

зародків

199 | 218 | 99a (45,4) | 22b (10,1) | 22c (22,2)

Менезо Б2 | 609 | 312a (51,2) | 79b (13,0) | 79c (25,3)

Результати наших досліджень показали, що культивування ембріонів великої рогатої худоби поза організмом на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів можна успішно проводити в середовищі 199 без фетальної сироватки теляти (ФСТ) та бичачого сироваткового альбуміну (БСА), що свідчить про те, що моношар ЕКЯК забезпечує достатні умови для розвитку зародків (рис.1).

Рис.1. Розвиток зародків великої рогатої худоби in vitro в середовищі з ФСТ, з БСА або без ФСТ та БСА, a:b - P < 0,05, критерій ?2.

Аналіз цитогенетичних препаратів зародків великої рогатої худоби, одержаних in vitro, на різних стадіях розвитку (від стадії двох бластомерів до стадії бластоцисти) показав, що ембріони, які прижиттєво були оцінені як морфологічно нормальні (n=380), містили лише морфологічно нормальні ядра із ядерцями. У зародків, які були оцінені візуально як дегенеровані (n=82), всі ядра або переважна їх частина були пікнотичними. Зародки (n=14), які за прижиттєвими морфологічними характеристиками мали незначні ознаки дегенерації (відставання у розвитку одного бластомера, лізис окремих бластомерів), поряд із морфологічно нормальними ядрами мали пікнотичні ядра (від 6,7% до 40% ядер). Таким чином, між прижиттєвими цитоморфологічними характеристиками зародків, отриманих in vitro, та станом хроматину ядер існує чітко виражений взаємозв’язок.

Відомо, що ефективність цитогенетичних досліджень ембріонів обмежена кількістю клітин та низьким мітотичним індексом у доімплантаційних зародків. Тому особливо важливе значення має удосконалення методики одержання придатних для аналізу препаратів хромосом зародків на різних стадіях розвитку. В наших дослідженнях ми вивчали вплив додавання рiзної концентрацiї колхiцину на ефективнiсть формування метафазних пластинок у 2-6-клiтинних ембрiонiв та у морул і бластоцист великої рогатої худоби, одержаних in vitro.

Рис.2. Рiвень формування метафазних пластинок в 2-6-клiтинних зародках та морулах-бластоцистах ВРХ, одержаних in vitro |

Рис.3. Частота формування придатних для пiдрахунку хромосом метафазних пласти-нок у 2-6-клiтинних зародкiв та морул-блас--то-цист великої рогатої худоби, одержаних in vitro, a:b - P < 0,05, критерій 2.

Нами встановлено, що культивування 2-6-клiтинних зародкiв (протягом 10 годин) та у морул-бластоцист (протягом 5 годин) із 0,05 мкг/мл колхiцину є однаково ефективним для формування метафазних пластинок у (рис. 2). При цьому бiльше половини одержаних метафазних пластинок 2-6-клiтинних зародкiв були придатними для пiдрахунку хромосом, тоді як пiзнi ембрiони мiстили лише 18,8% таких пластинок (рис. 3). Після культивування 2-6-клiтинних зародків протягом 10 годин у середовищі з більш високою концентрацією мітостатика (0,1 мкг/мл колхіцину) спостерігалось незначне зростання частоти формування метафазних пластинок (рис. 2) і частоти формування пластинок, придатних для підрахунку хромосом (рис.3) порівняно із 0,05 мкг/мл колхіцину (P > 0,05).

При 5-годинному культивуванні морул-бластоцист із 0,1 мкг/мл колхiцину рівень формування метафазних пластинок був подiбним до цього показника для 2-6-клiтинних ембрiонiв (рис. 2). Кiлькiсть морул-бластоцист, в яких сформувались метафазнi пластинки пiсля культивування iз 0,1 мкг/мл або 0,05 мкг/мл колхiцину, не відрізнялась вірогідно, але за частотою формування метафазних пластинок, придатних для пiдрахунку хромосом, бiльш ефективним виявилось 5-годинне культивування морул-бластоцист iз 0,1 мкг/мл колхіцину.

Цитогенетичний аналіз показав, що деякі 2-6-клітинні зародки (5,1%, 3/59) містили гаплоїдний набір хромосом, тобто походили від незапліднених активованих яйцеклітин. Серед морул-бластоцист гаплоїдних зародків не спостерігалось. Частина метафаз мiтозу мала 53-59 хромосом. Однiєю iз причин вiдсутностi в наборi окремих хромосом може бути викидання їх за межi метафазної пластинки при фіксації. Таким чином, для одержання метафазних пластинок 2-6-клітинних зародків можна використовувати 10-годинне культивування як із 0,05 мкг/мл колхіцину, так і з 0,1 мкг/мл мітостатика, тоді як для ембріонів 6-го дня розвитку (з більш високим мітотичним індексом) більш ефективним є 5-годинне культивування із 0,1 мкг/мл колхіцину.

З метою більш детального аналізу структури хромосом у мейозі та мітозі, більш чіткого визначення ряду хромосомних аберацій вивчалась можливість застосування С-забарвлення хромосом ооцитів і доімплантаційних зародків у великої рогатої худоби. Нами доведено, що хромосоми ооцитів корів на різних стадіях мейозу потребують неоднакової тривалості обробки розчином гідроксиду барію при +50С. Перебування препаратів хромосом ооцитів у розчині протягом 2 хвилин дало можливість одержати придатні для аналізу диференційно забарвлені хромосоми ооцитів корів на стадії діакінезу на рівні 70,4% (19/27). Така тривалість обробки препаратів ооцитів також виявилась ефективною для хромосом (рис. 4) на стадії метафази І мейозу (84,9%, 28/33, Р > 0,05).

Рис.4. Одержання придатних для цитогенетичного аналізу препаратів С-забарвлених хромосом ооцитів корів на різних стадіях мейозу в залежності від часу їх обробки розчином гідроксиду барію. a:b, c:d - P < 0,001, e:f - P < 0,05, критерій 2.

При використанні 2-хвилинної обробки розчином гідроксиду барію спостерігався суттєво вищий рівень придатних для аналізу диференційно С-забарвлених препаратів ооцитів корів на стадії метафази І мейозу (рис. 4) порівняно із 5- та 10-хвилинною обробкою (Р < 0,001). 5-хвилинна обробка препаратів розчином Ва(ОН)2 виявилась оптимальною для ооцитів корів на стадії метафази ІІ, тобто саме вона забезпечувала одержання вірогідно вищого рівня придатних для цитогенетичного аналізу препаратів С-забарвлених хромосом порівняно з 2- та 10-хвилинною обробкою (P < 0,001).

Наступні експерименти були спрямовані на отримання придатних для цитогенетичного аналізу С-забарвлених метафазних пластинок ембріонів великої рогатої худоби, отриманих in vitro. Нами встановлено, що для одержання якісних препаратів хромосом зародків, обробку розчином гідроксиду барію доцільно проводити при температурі +38С протягом 20 та 25 хвилин. На одержаних нами диференційно забарвлених препаратах хромосом 2-6-клітинних зародків (n=27) та ранніх морул (n=16) всі аутосоми і Х-хромосома містили С-сегменти центромерного гетерохроматину, а Y-хромосома майже повністю складалась із гетерохроматину. Виходячи з ефективності визначення Y-хромосоми за С-забарвленням, ми вважаємо, що ця методика може успішно використовуватись при розробці методів селекції зародків великої рогатої худоби за статтю та при розробці способів спрямованого одержання зародків in vitro бажаної статі.

Додаткові можливості використання зародків сільськогосподарських тварин у біологічних дослідженнях відкриваються з розробкою надійних методів їх кріоконсервування. У попередніх експериментах ми використовували 8-16-клітинні зародки кролів як модельні, враховуючи те, що ембріони цих тварин добре піддаються кріоконсервуванню за повільним режимом. Після одноступеневої 5-хвилинної еквілібрації у вітрифікаційному розчині ЕФС40 і 48-часового культивування зародків після розморожування в середовищі Менезо Б2 з 20% ФСТ 92,3% зародків кролів досягло стадії вилупленої бластоцисти (12/13). В контролі (некріоконсервовані зародки) ефективність розвитку свіжоотриманих 8-16-клітинних зародків кролів до стадії бластоцисти складала 94,4% (17/18, P > 0,05). При надшвидкому заморожуванні 7-денних бластоцист великої рогатої худоби після їх одноступеневої еквілібрації протягом 1,5; 2; 5 та 10 хвилин в розчині ЕФС40, тільки 1,5-хвилина еквілібрація забезпечила реекспансію порожнини у 42,9% (3/7) бластоцист та розвиток до стадії вилуплення 28,5% (2/7) бластоцист in vitro. Після 2-хвилинної еквілібрації у 28,5% (2/7) заморожено-відтанутих бластоцист відбулась реекспансія порожнини і вони розвинулись до стадії експандованої бластоцисти, але розвитку до стадії вилупленої бластоцисти при цьому не спостерігалось; після 5- та 10-хвилинного перебування бластоцист у розчині ЕФС40 розвитку зародків не спостерігалось. Можливо, для вітрифікації отриманих поза організмом бластоцист великої рогатої худоби більш оптимальною була б багатоступенева еквілібрація у менш концентрованих розчинах етиленгліколю.

ВИСНОВКИ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1.

1.

1.

1.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Ковтун С.І. Цитогенетичні та морфологічні дослідження раннього ембріогенезу при одержанні зародків великої рогатої худоби in vitro. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут розведення і генетики тварин УААН, с. Чубинське, Київської обл., 2000.

Розроблені та удосконалені методи дозрівання та запліднення in vitro ооцитів корів (у тому числі при використанні епідидимальних сперматозоїдів бугаїв), а також наступного розвитку зародків поза організмом, спрямовані на одержання великої кількості біологічно повноцінних морул та бластоцист великої рогатої худоби in vitrо. Проведено цитогенетичний аналіз незрілих і зрілих ооцитів корів та зародків великої рогатої худоби, одержаних in vitro, досліджена динаміка мейотичних та мітотичних перетворень хроматину, виявлені частота і типи хромосомних аберацій. З використанням модифікованої нами методики диференційного С-забарвлення мейозних та мітозних хромосом виявлена локалізація центромерного гетерохроматину у аутосомах та статевих хромосомах ооцитів корів на різних стадіях мейозу та отриманих in vitro доімплантаційних зародків великої рогатої худоби різних стадій розвитку. Показана можливість надшвидкого заморожування 8-16-клітинних зародків кролів, отриманих in vivo, та бластоцист великої рогатої худоби, одержаних in vitro.

Ключові слова: велика рогата худоба, ооцити, зародки, запліднення in vitro, диференційне С-забарвлення хромосом, метафазні пластинки, надшвидке заморожування.

Kovtun S.I. Cytogenetic and morphological investigation of early embryogenesis of bovine embryos produced in vitro. - Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.15 - genetics. - The Institute of Animal Breeding and Genetics UAAS, v.Chubinske, Kyiv Region, 2000.

It had been worked out and improved the methods of in vitro maturation and fertilization of cow oocytes (as well with the use of bull epididymal spermatozoa) and following embryo development for the in vitro production of viable bovine morulae and blastocysts. It had been carried out the technique of cytogenetic analysis of immature and mature cow oocytes and bovine embryos produced in vitro; dynamics of meiotic and mitotic reorganizations of chromatin and frequencies and types of chromosome aberrations had been investigated. Localization of centromeric heterochromatin in autosomes and sex chromosomes of different meiotic stage cow oocytes and in vitro produced preimplantation bovine embryos had been revealed with the use of chromosome C-banding technique with our modifications. The possibility of vitrification of 8-16-cell rabbit embryos produced in vivo and bovine blastocysts produced in vitro had been demonstrated.

Key words: cattle, oocytes, embryos, in vitro fertilization, C-banding technique, metaphase plate, vitrification.

Ковтун С.И. Цитогенетические и морфологические исследования раннего эмбриогенеза при получении зародышей крупного рогатого скота in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологи-ческих наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт разведения и генетики животных УААН, с. Чубинское, Киевской обл., 2000.

Диссертация посвящена разработке и усовершенствованию методов созревания и оплодотворения in vitro ооцитов коров, а также развития зародышей вне организма, направленных на получение большого количества полноценных морул и бластоцист крупного рогатого скота in vitro. Выявлено, что 24-часовое культивирование ооцит-кумулюсных комплексов коров in vitro и добавление клеток гранулезы в концентрации 3-5 х 106/мл обеспечивает не только полноценное ядерное и цитоплазматическое созревание ооцитов, но и более низкий уровень хромосомных нарушений. Отмечено, что выбракованную по концентрации и подвижности сперматозоидов нативную сперму быков-производителей, непригодную для замораживания, можно успешно использовать для получения зародышей крупного рогатого скота in vitro. Удаление семенной плазмы перед замораживанием сперматозоидов быков повышает эффективность оплодотворения ооцитов коров вне организма. Показано, что добавление смеси пеницилламина, гипотаурина и эпинефрина в среду оплодотворения значительно повышает уровень оплодотворения яйцеклеток и сокращает время от начала осеменения до пенетрации гамет. В результате отсутствия контакта с секретами придаточных половых желез, использование свежеполученных эпидидимальных сперматозоидов при получении зародышей крупного рогатого скота in vitro дало возможность получить высокий уровень оплодотворения яйцеклеток, дробления зигот и развития зародышей вне организма до стадии морулы-бластоцисты. Показана эффективность использования для оплодотворения in vitro хранившихся 24 часа при +4С и криоконсервированных эпидидимальных сперматозоидов быков. Зарегистрирована одна стельность после попарной пересадки десяти морул-бластоцист, полученных после оплодотворения созревших in vitro ооцитов коров эпидидимальными хранившимися сперматозоидами быков. Установлена высокая способность к развитию зародышей крупного рогатого скота in vitro при использовании среды Менезо Б2 и монослоя эпителиальных клеток яйцеводов коров. Использование этого монослоя дало возможность эффективно культивировать зародыши вне