НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

На правах рукопису

САВЧЕНКО ВАЛЕНТИНА ЛЕОНТІЇВНА

УДК 612.822

МІКРОГЛІАЛЬНІ КЛІТИНИ МОЗКУ ЩУРІВ В

ОНТОГЕНЕЗІ ТА ПРИ УРАЖЕННІ НЕРВОВОЇ ТКАНИНИ.

03.00.13-Фізологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі цитології

Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Науковий керівник: професор НАН України, доктор медичних наук

Скібо Галина Григорівна

Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

зав. відділом цитології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Луханіна Олена Павлівна,

Інститут фізіологіїї ім.О.О.Богомольця НАН України.

доктор медичних наук Чайковський Юрій Богданович,

Національний медичний

университет ім.О.О.Богомольця, керівник відділом.

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України.

Захист відбудеться “___16__”березня_1999 р. o”___14___”годині на засіданні спеціалізованої вченої ради при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024, м.Київ, вул.Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024, м.Київ, вул.Богомольця 4.

Автореферат розісланий “__08___”_лютого_1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Мікрогліальні клітини є одним із типів гліальних клітин в центральній нервовій системі (ЦНС), вони характеризуються особливою морфологією та виконують трофічну, секреторну, фагоцитарну та інші функції. Протягом життя мікрогліальні клітини мають різні морфологічні характеристики і несуть різне функціональне навантаження в залежності від стану мозку. Вивчення мікрогліальних клітин в процесі онтогенезу показало, що протягом розвитку мозку мікрогліальні клітини зазнають цілий ряд фенотипових перетворень: амебоїдна мікроглія мігрує із субвентрикулярної зони у всі регіони і диференціюється в розгалужену мікроглію, яка розподіляється відносно рівномірно по всій тканині мозку.

Відомо, що в процесі розвитку нервової тканини, мікроглія сприяє виживанню нейронів та інших клітин мозку. При різних патологічних станах мозку мікрогліальні клітини відповідають на ураження активацією і експресією антигенів МНС класів 1 і 2, секрецією цитокінів (IL-1, TNF) (Buttini M. et al.,1996) і факторів росту (NGF, NT-3, TGF-) (Elkabes S. et al., 1996, Dobbertin A. et al., 1997). При дегенерації нейронів та інших клітин мозку мікрогліальні клітини виконують фагоцитарну функцію. Показано, що в процесі розвитку мозку, при його нормальному функціонуванні в зрілому стані та при різних патологічних впливах відбувається взаємодія мікрогліальних клітин з нейронами та іншими гліальними клітинами, але функції мікроглії в такій взаємодії залишаються не до кінця вивченими.

До теперішнього часу мікрогліальні клітини остаються найменьш вивченими в мозку в зв’язку з труднощами в їх ідентифікації. Відбувається постійний пошук специфічного маркера мікрогліальних клітин, який би зміг адекватно виявляти всю клітинну популяцію мікроглії і вивчати походження і функції цих клітин в нормі і при різних патологічних станах нервової тканини. На сьогодняшній день для виявлення мікрогліальних клітин використовують різні маркери, а саме: СR3 (complement type 3 receptor) (Perry V.H., 1994), глікопротеїн F4/80 (Lawson L.J. et al., 1990), ізолектин GSA I-В4 (із Griphonia Simplicifolia (GSA)) (Streit W.J. et al., 1990), фосфотирозин (PT) (Karp H.L. et al., 1994). Завдяки антитілам до цих антигенів є можливість ідентифікувати популяцію мікроглії в ЦНС. Однак, проблема полягяє в тому, що невідомо чи вся популяція мікроглії має ці антигени, або виборочно ідентифікується тільки певна частина мікрогліїальних клітин.

Недавно було виявлено, що ліпокортин 1 (LC1) (М.м. 35000) - глікопротеїн, є маркером мікроглії в мозку (Ahluwalia A. et al., 1996). LC1 зв’язується з фосфатидилсерінами мембран в присутності Са++ і є субстратом рецептора епідермального фактора росту за тирозином, медіатором глюкокортикоїдів. LC1 має протизапальну дію, інгібуючи активність фосфоліпази А і тим самим утворення простагландинів як основного джерела запалення (Raynal P. et al., 1994). Оскільки LC1 був виявлен в мікроглії і антитіла до нього інтенсивно забарвлювали ядро, цитоплазму і відростки, важливо було вивчити чи містить його вся популяція мікроглії, а також чи є цей маркер адекватним для вивчення поведінки мікроглії на різних етапах розвитку мозку крис.

Для більш детального вивчення функціонального значення мікроглії в зрілому мозку необхідно проаналізувати топографічний розподіл мікроглії в різних регіонах, а також одержати кількістні характеристики цих клітин в різних по функціональному значенні нейрональних структур мозку, крім цього черезмірно важливим є відношення мікроглії і астроцитів в цих структурах. Одна із пропонованих гіпотез полягяє в тому, що глія регулює кількість синаптичних контактів, займає певні территорії на поверхні нейронів, які могли бути зайняті лишніми синапсами, глія забеспечує функціональну стабільність синаптичної огранізації і участвує в формуванні нервової діяльності.

В залежності від відповіді мікроглії на ураження різної етиології можна визначити локалізацію осередка ураження та ступінь ураження нейронів. Механізм взаємодії мікроглії, астроцитів та других клітин мозку при різних патологіях не до кінця вивчений, а також причини, що визивають проліферацію глії. Однією із можливих причин активації мікроглії є фосфорилювання білків за тирозином. Слідує підкреслити, що LC1 є субстратом рецептора епідермального фактора росту за тирозином і тому особливо важливо порівняти відповідь LC1-позитивних (LC1+), і РТ+ активованої мікроглії при патології.

На відміну від мікроглії морфологія та функції астроцитів вивчені набагато більше. Астроцити представлені клітинами зірчастої форми, які приймають участь в міграції нервових клітин і підтримують їх гомеостаз, а також у формуванні гематоенцефалічного бар’єру. В залежності від своїх морфологічних характеристик астроцити поділяються на волокнисті та протоплазматичні. До складу проміжних філаментів цитоскелету астроцитів входить гліальний фібрилярний кислий білок, який є маркером цих клітин. Внутрішньоклітинний глікопротеїн S100 також використовується як маркер для популяції астроцитів (Ghandour M.S. et al., 1981). Ураження мозку різної природи призводить до реактивного астроцитозу - локального збільшення числа і розмірів астроцитів, при цьому часто створюється астроцитарний рубець. Спільно з мікроглією астроцити формують імунну відповідь в ЦНС.

Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу цитології Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України.

Мета і задачі дослідження.

Метою роботи було вивчення особливостей морфогенезу мікрогліальних клітин і розподіл мікроглії в процесі онтогенезу, використовуючи високу специфічність антитіл до LC1, обгрунтовану методами порівняльного кількістного анализу, дати порівняльну кількістну характеристику розподілу мікроглії та астроцитів в різних регіонах зрілого мозку в нормі та при експериментальній патології різної етиології.

В зв’язку з цим в задачі роботи входило:

1. Вивчити специфічність LC1 як маркера мікроглії.

2. Порівняти розподіл LC1+, PT+, GSA+ мікрогліальних клітин в різних регіонах мозку.

3. Вивчити морфогенез та розподіл LC1+ мікроглії на зрізах мозку в процесі онтогенезу, використовуючи для цього гістологічний та імуногістохімічний методи.

4. Порівняти розподілення популяцій мікроглії та астроцитів в різних областях зрілого мозку для більш детального вивчення функцій і взаємодії цих клітин в зрілому мозку в нормі.

5. Вивчити відповідь мікроглії та астроцитів на ураження мозку різної етиології, а саме, при глобальній короткочасній ішемії, перерізці підочноямкового нерву та при впливі лазерним опроміненням на сенсомоторну кору.

Наукова новизна одержаних результатів.

В дисертаційній роботі охарактеризовано LC1 як специфічний маркер всіх зустрічающихся в нервовій системі форм (амебоїдної, проміжної, розгалуженої та активованої) мікроглії, проведено порівняння популяцій мікроглії, виявлених різними маркерами: ліпокортином-1, фосфотирозином, ізолектином GSA IB4. Проведено кількісний аналіз розподілу мікрогліальних клітин та співставлені топографічні карти локалізації мікроглії в різні періоди розвитку мозку щурів, в зрілому стані та при патологіях різної природи.

В роботі міститься ряд нових експериментальних даних відносно реактивних властивостей мікрогліальних клітин при ураженні тканини мозку. Встановлено, что при ураженнях різної етиології мікрогліальні клітини змінюють свої фенотипові ознаки, що свідчить про їх активацію, виявляються характерні особливості топографічного розподілу активованої мікроглії. Так, при механічному ураженні підочноямкового нерву виявлена відповідь активованої мікроглії в стовбурі мозку в ядрах трійчастого нерву - області первинної синаптичної передачі сигналів при перерізці підочноямкового нерву. Показано, при експериментальній ішемії активована мікроглія скупчується біля найбільш чутливими до ішемії пірамідних нейронів в СА1 області гіпокампу. Після ураження кори головного мозку лазерним опроміненням активована мікроглія концентрується біля уражених кортикальних нейронів.

S100-глікопротеїн використовували як маркер для астроцитів. Для кількісного порівняльного аналізу розподілу мікроглії та астроцитів у різних регіонах мозку щурів використовували статистично-стереологічний підхід та спеціальну комп’ютерну програму, яка дозволила одержати топографічні карти розподілу глії в різні періоди розвитку, в зрілому мозку та при патології.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів.

Одержані результати значно доповнюють сучасні знання про морфогенез мікрогліальних клітин в процесі онтогенетичного розвитку, їх розподіл в різних областях мозку. Крім того, получені дані дають можливість аналізувати відношення і взаємодію між клітинами астроцитарної глії та мікроглії, а також оцінити реактивні властивості мікроглії та астроцитів при патологічних станах нервової тканини різної етиології.

Одержані дані представляють значний інтерес і в практичному плані. Зокрема, встановлений факт про те, що LC1 являється ефективним маркером, який найбільш повно виявляє мікроглію, дозволяє рекомендувати цей препарат не тільки для імуногістохімічного аналізу інтактної нервової тканини, але і для патоморфологічного аналізу секційного матеріалу в нейрохірургічній практиці з метою ідентифікації гліальних пухлин мозку та інших осередків ураження мозку, що супроводжуються концентрацією мікрогліальних клітин (при запальних, травматичних, ішемічних, неопластичних процесах). Представлений морфометричний метод дослідження гліальних клітин може бути використаний в їх подальшому вивченні.

Особистий внесок здобувача.

Здобувачем особисто виконані фізіологічні, патофізіологічні та всі імуногістохімічні експерименти, аналіз і побудова топографічних карт та обрахування даних при допомозі BIOQUANT програми. Здобувач брав активну участь у обговоренні результатів та формулюванні висновків. Вперше здобувачем показано, що на ранніх етапах онтогенезу LC1+ мікроглія мігрує із субвентрикулярної зони і в зрілому нормальному мозку розподіляється в більшій кількості в порівнянні з іншими маркерами. Відповідь LC1+ та РТ+ активованої мікроглії була ідентичною в ядрах трійчастого нерву після перерізки підочноямкового нерву. Вперше показано, що LC1+активована мікроглія скупчується в СА1 зоні гіпокампу. Була проаналізована реакція мікроглії і астроцитів після лазерного опромінення.

Апробація роботи.

Основні положення роботи доповідались і обговорювались на міжнародній конференції в Греції (European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease.May 6-10, 1998 Athens, Greece), на XV з’їзді Фізіологів в Донецьку (Матеріали XV З‘їзду Українського Фізіологічного Товариства) 1998, на 1 (Установчій) Конференції в Києві (Українське Товариство Нейронаук. 24-26 листопада 1998).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано чотири статті в наукових журналах і тези п’яти доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел зі 182 найменувань. Робота викладена на 120 сторінках та ілюстрована 28 рисункамита однією таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи досліджень.

Робота була проведена на 82 щурах лінії Long-Evans(США). Вивчали мозок різностатевих щурів у процесі постнатального розвитку - на 1, 7, 15 та 21 день та в зрілому стані. Для вивчення реакції мікроглії на ураження були створенні різні по природі ураження мозку а саме: глобальна ішемія, перерізка підочноямкового нерву та ураження кори головного мозку щурів лазерним опроміненням. Модель глобальної ішемії створювалась відповідно описаному методу (Reid K.H. et al., 1996), при котрому після наркотизування кетаміном (50 мг/кг) у щурів здавлювали грудну клітку протягом 7-10 хвилин з послідуючою кардиостимуляцією для відновлення дихання та серцебиття. Мозок вивчали на 30-тий день після ураження.

У випадку перерізки підочноямкового нерву щурів наркотизували кетаміном та перерізали нерв у області підочноямкового отвору (Melzer P. et al., 1997). Мозок вивчали через 4-ри дня після операції.

Для створення ураження кори щурів наркотизували нембуталом (40 мг/кг), фіксували голову і робили трепанацію черепа. Піддавали лазерному опроміненню область сенсомоторної кори по методу Edwards G. et al., (1994) (довжина хвилі 4 мкм, макроімпульсна енергія 22 міліДжоуля/макроімпульс, 16 точок, довжина лазерного шляху 1 см) і тканину мозку вивчали через 3 та 6 днів після ураження.

Фіксація тканини.

Для вивчення розподілу мікроглії в зрізах мозку щурів ми використовували модифікований імуногістохімічний метод (McKanna J.A. et al., 1997).

Наркотизованих щурів спочатку перфузували транскардіально фізіологічним розчином в об’ємі 100 мл, що містив гепарин (1000 од/кг) та 0.01% нітріту натрію, а потім - фіксуючим розчином GPAS об’ємом 250 мл, що містив 2.5% глютаральдегіду, 0.01M мета-перйодату натрія, 0.1M хлориду натрія, 0.04M фосфату натрія, 1% оцтової кислоти (рН=4). Зразу ж після перфузії мозок вилучали та додатково фіксували в GPAS протягом 5 годин при кімнатній температурі. Для всіх випадків імуногістохімічного забарвлення клітин використовувався тільки GPAS фіксатор. Згідно даних McKanna J.A. et al. (1997), цей фіксатор дозволяє виявляти LC1 in situ, забезпечуючи тим самим специфічність імуногістохімічного забарвлення клітин мікроглії антитілами до цього глікопротеїну. GPAS використовувався для фіксації тканини у всіх випадках імуногістохімічного аналіза. Після дегідратації тканину постфіксували в 100% спирті протягом 12 годин при 40 С та заключали в парафін. На поперечних зрізах мозку щурів були вивченні морфологія та розподілення мікрогліальних клітин та астроцитів в передньому, середньому та задньому мозку.

Імуногістохімічний аналіз.

Для імуногістохімічного забарвлення поліклональними кролячими антитілами проти LC1 (1:8000) (Ahn N.G. et al., 1988), РТ (1:1000) (Zymed, США), S100 (1:4000) (Van Eldik L.J. et al., 1988) використовували депарафіновані зрізи мозку товщиною 10 мкм. Інгібування ендогенної пероксидази проводили 0.3% пероксидом водню. Блокування неспецифічного зв’язування здійснювалось за допомогою 10% нормальної козлиної сироватки на протязі 30 хвилин, після цього зрізи інкубували в розчині первинних антитіл протягом 12 годин при 4O С. Вторинними антитілами був біотинілований козлиний анти-кролячий IgG (H+L) (Vector Laboratories). Третинними антитілами служив комплекс авідин-біотин-пероксидаза (ABC kits, Vector Laboratories). Хроматогеном в цій реакції являвся діамінобензидин (DAB), а для забарвлення клітин використовували толуїдиновий синій.

Як контролі було використано зрізи мозку, інкубовані з: 1) нормальною кролячою сироваткою; 2) із спеціфічними кролячими антитілами, блокованими очищеними антигенами; 3) без кролячих антитіл. У всіх контрольних випадках забарвлення не спостерігалось.

Оскільки метою цієї роботи було виявлення мікрогліальних клітин за допомогою різних цитохімічних методів дослідження, нами був використаний також ізолектин GSA I-B4, який спеціфічно зв’язувався з альфа-D-галактозиловими залишками молекул глікокаліксу цих клітин (GSA I-B4 -HRP - Griffonia simplicifolia B4-ізолектин-пероксидазний комплекс) (Sigma L5391, США) (Streit W.J., 1990). Депарафіновані зрізи мозку інкубували з ізолектином (20 мкг/мл) в забуферованому фізіологічному розчині Дульбекко протягом 12 годин. Хроматогеном в цій реакції також служив DAB.

Статистична обробка.

Забарвлені зрізи спостерігали під мікроскопом (Ortholux, Leitz, Wetzlar, Germany). Для аналізу розподілу мікрогліальних клітин та астроцитів і побудови топографічних карт використовували комп'ютерну систему BIOQUANT OS/2 (R&M Biometrics, Nashville, USA).

Корекція результатів з використанням методу Abercrombie M. (1940) дозволила оцінити істинну кількість клітин на одиницю площі.

Результати досліджень.

Було показано, що в мозку новонароджених тварин LC1+ клітини амебоїдної мікроглії, мали округлу безвідростчасту форму, іноді на їх поверхні спостерігались псевдоподії. Діаметр клітин в середньому складав 10 мікрон. Амебоїдні клітини мікроглії були сконцентровані в субвентрикулярній зоні біля епендімальних клітин латеральних шлуночків; в інших областях мозку виявлялись лише одиничні розгалужені клітини. Середня кількість амебоїдних клітин мікроглії на перший день постнатального розвитку становила 318 клітин/мм2.

В мозку 7-денних щуренят для LC1+ мікрогліальних клітин були характерні ознаки "проміжного" типу, що являлось наслідком перетворення амебоїдної мікроглії в її розгалужену форму. Клітини мали амебоїдне тіло та кілька псевдоподій - коротких, потовщених відростків; діаметр клітин не перевищував 8-9 мікрон. В цей період у субвентрикулярній зоні спостерігалась значна кількість амебоїдних клітин. Спостерігалась міграція "проміжних" клітин із субвентрикулярної зони в різні регіони мозку. Середня кількість LC1+ клітин на всьому зрізі переднього мозку в цей час розвитку становила 5415 клітин/мм2.

На 15 день постнатального розвитку мозку LC1+ мікроглія знаходилась в процесі диференціювання. Тіло клітин мало невеликі розміри, діаметр соми не перевищував 6-8 мікрон, відростки були тонкими і в значній мірі розгалуженими. На цьому етапі розвитку розподіл клітин мікроглії був відносно рівномірним по всьому мозку, спостерігалось лише незначне підвищення густоти клітин у субвентрикулярній зоні. Середня кількість LC1+ клітин була 10420 клітин/мм2.

На 21 день постнатального розвитку LC1+ клітини мікроглії були представлені тільки розгалуженою формою, густота була подібною до LC1+ розгалуженої мікроглії в зрілому мозку. Тіло клітин було округле або овальне з довгими, тонкими, розгалуженими відростками. Розподілення LC1+ мікрогліальних клітин було відносно рівномірним в білій речовині уздовж аксонів та в сірій речовині.

Розподілення LC1+ мікроглії в зрілому мозку.

В зрілому мозку щурів LC1+ клітини мікроглії були представлені розгалуженою формою. В сірій речовині тіло клітин було кругле, з довгими, тонкими, радіально розгалуженими відростками, а в білій речовині сома була овальною, з декільками відростками, розташованими удовж аксонів. Середня кількість LC1+ розгалуженої мікроглії в цілому мозку зіставляла 103±9 клітин/мм2 (Таблиця). Однак, густота мікрогліальних клітин змінювалась в залежності від дослідженої області. В сірій речовині густота клітин була вищою порівнюючи з білою. Середня кількість LC1+ клітин була найбільшою в неостріатумі, декілька меньшою - в гіпоталамусі та корі головного мозку. Низка густота LC1+ мікроглії була в гіпокампі, таламусі та найменьша кількість спостерігалась у мозочку і стовбурі мозку (Таблиця).

Для порівняльної оцінки здібності різних маркерів виявлять мікрогліальні клітини нами був використанний спектр поліклональних антитіл, специфічних по відношенню до микроглії.

Розподілення РТ+ мікроглії.

Антитіла до РТ добре забарвлювали тіла мікрогліальних клітин та слабо забарвлювали відростки. В сірій та білій речовині морфологія РТ+ мікроглії була такою ж гетерогенною, як і у LC1+ клітинах. РТ+ мікрогліальні клітини відносно рівномірно розподілялись по всьому мозку. Середня кількість РТ+ клітин була 54±5 клітин/мм2. Підвищена густота РТ+ мікроглії спостерігалась у лобній та тім’яній областях кори головного мозку. Найменьша кількість РТ+ мікроглії відмічена в aпікальній та латеральній частинах неостріатума, хотя в його медіальній частині число клітин було найбільшим.

Розподілення GSA+ мікроглії.

Мікрогліальні клітини в зрілому мозку слабо забарвлювались лектином і їх густота була набагато нищою, порівнюючи з LC1+ та РТ+ мікроглією. Середня кількість GSA+ клітин зіставляла 34±2 клітин/мм2. Таким чином, нами було проведено качественная та кількістна оцінка розподілення мікрогліальних клітин в головному мозку.

Щоб відрізнити популяції LC1+ мікроглії від астроцитів порівнювалось розподілення мікроглії та астроцитів в різних областях мозку.

Розподілення S100+ астроцитів в нормальному зрілому мозку.

Антитіла до S100 достатньо інтенсивно забарвлювали ядра астроцитів, однак, слабо забарвлювали цитоплазму та відростки клітин. Форма клітин не відрізнялась в різних областях мозку.

Середня кількість S100+ астроцитів в цілому мозку була 217±30 клітин/мм2, причому в білій речовині їх було більше, чим в сірій. Велика кількість астроцитів була виявлена в гіпокампі та гіпоталамусі, а найменьша - в корі головного мозку (за виключенням потилочної області), мозочку та довгастому мозку (Таблиця). В неостріатумі густота астроцитів також була низькою, за виключенням медіальної області, де густота цих гліальних клітин досягала 230±19 клітин/мм2. Густота локалізації астроцитів в різних зонах мозку була значно більшою, ніж густота мікрогліальних клітин. Якщо відкинути значення цього параметру в мозочку та довгастому мозку (де густота мікроглії мінімальна), то граничні значення густоти LC1+ мікрогліальних клітин відрізнялись приблизно в 1.5 рази, а такі ж значення для S100+ астроцитів - в 2.1 раза.

Порівняльний аналіз розподілу активованої мікроглії та реактивних астроцитів при короткочасній глобальній ішемії.

На 30-тий день після ішемії спостерігалось скупчення LC1+ активованої мікроглії в СА1 зоні гіпокампу. Найбільша густота цих клітин відмічалась навколо соми пірамідних нейронів, уздовж дендритів і аксонів. Середня кількість LC1+ мікрогліальних клітин в гіпокампі після ішемії становила 20106 клітин/мм2. В нормі ж LC1+ мікрогліальні клітини розподілялись в гіпокампі відносно рівномірно, і їх густота була значно нищою (949 клітин/мм2).

Невелике скупчення S100+ реактивних астроцитів спостерігалось в молекулярному шарі CA1 області гіпокампу порівнюючи з контролем. Проте, в інших областях гіпокампу розподіл реактивних астроцитів при ішемії не відрізнявся від контролю і середня кількість астроцитів складала 2448 клітин/мм2 після ішемії (24126 клітин/мм2 в контролі).

Ці дані свідчать про те, що при ішемії локалізація та проліферативна відповідь мікроглії та астроцитів відрізняються. Активована мікроглія, в основному, локалізується біля соми пірамідних нейронів, тим часом як астроцити - біля синаптичних закінчень в молекулярному шарі.

Відповідь активованої мікроглії на перерізку підочноямкового нерву.

Підочноямковий нерв є гілкою трійчастого нерву, тому після його перерізки на периферії спостерігалась відповідь LC1+ та РТ+ мікроглії в ядрах трійчастого нерву. На 4 день після перерізки підочноямкового нерву спостерігалось скупчення LC1+ активованої мікроглії в області ядер трійчастого нерву стовбура мозку на стороні ураження. На більшому збільшенні було видно, що ці клітини мали сому більших розмірів та короткі потовщені відростки. Густота LC1+ активованої мікроглії складала 40522 клітин/мм2 на стороні ураження в області ядер трійчастого нерву. На протилежній стороні їх густота була значно нижчою і складала 724 клітини/мм2.

Подібна картина спостерігалась при використанні антитіл до РТ. Кластерізація РТ+ активованої мікроглії також відбувалась в області ядер трійчастого нерву. Форма РТ+ активованої мікроглії була подібною до LC1+ активованої мікроглії. Густота РТ+ активованої мікроглії на 4 день після операції складала 24215 клітин/мм2 на стороні ураження, а на протилежній стороні - 688 клітин/мм2.

Таким чином, реакція LC1+ та РТ+ активованої мікроглії помітна уже на 2-4 добу після операції на стороні ураження в ядрах трійчастого нерву. Кількість мікрогліальних клітин тут в 3-5 разів більша в порівнянні з протилежною стороною. При цьому LC1+ клітин виявляється більше, ніж РТ+ клітин, тобто не вся популяція LC1+ активованої мікроглії є РТ-позитивною. Можливо, що відповідь LC1+ активованої мікроглії після периферичного ураження нерву спряжена з фосфорилюванням білків за тирозином, зокрема, LC1.

Відповідь глії на ураження кори головного мозку лазером.

Порівнювалось скупчення мікроглії та астроцитів навколо ураженної зони через 3 та 6 діб після ураження.

Через 3 дня після ураження кори скупчення LC1+ активованих мікрогліальних клітин спостерігалось в місці ураження. Середня кількість мікроглії в корі на стороні ураження складала 14937 клітин/мм2, порівнюючи з контролем (1126 клітин/мм2).

В цей період незначна кількість S100+ реактивних астроцитів скупчувалась на межі осередку та здорової тканини. Проте, кількість астроцитів в корі на стороні ураження складала 13318 клітин/мм2, порівнюючи с контролем (1475 клітин/мм2).

Через 6 днів LC1+ активована мікроглія мала вигляд більш кущуватої і її густота в корі на стороні ураження значно зростала (31840 клеток/мм2), порівнюючи з контролем (9315 клітин/мм2).

В цей період також спостерігалось невелике скупчення S100+ реактивних астроцитів на межі осередку пошкодження та здорової тканини і кількість в корі на стороні ураження була 19632 клітин/мм2, порівнюючи з контролем (1485 клітин/мм2).

Відповідь мікрогліальних клітин на ураження кори мозку лазером проявляється їх активацією та проліферацією в перші дні після впливу. Астроцитарна реакція спостерігалась в меньшому ступені та пізніше.

Обговорення результатів досліджень.

В настоящому дослідженні було виявлено, що в процессі розвитку мозку відбуваються не тільки динамічні зміни морфологічних властивостей мікрогліальних клітин, але й змінюється їх топографічна організація.

В останньому десятиріччі для виявлення мікрогліальних клітин використовують антигени макрофагів, такі як СR3 (Perry V.H., 1994), F4/80 антиген (Lawson L.J. et al., 1990), CD45 та РТ (Karp H.L. et al., 1994), а також для виявлення мікроглії використовували GSA ізолектин B4 (Streit W.J. et al., 1990). На основі дослідження за допомогою загальних маркерів для мікроглії мозку та макрофагів інших тканин та наявності подібних і ідентичних рецепторів на цих клітинах і здатність здійснювати фагоцитарну функцію, автори стверджують, що мікроглія, макрофаги та моноцити крові мають загального попередника.

Однак, при удосконаленні методики фіксації в мікроглії був виявлений LC1, 35 кДа глікопротеїн, одною із його протизапальною властивосттю було інгібування утворення арахідонової кислоти. Цей глікопротеїн був відсутнім в нейронах, астроцитах та олігодендроцитах мозку. В примітивних гліальних клітинах серединної лінії базальної мембрани нервової трубки і в деяких епендімальних клітинах шлуночків протягом ембріонального і раннього постнатального розвитку також знаходиться LC1 як і в мікроглії в постнатальному мозку (McKanna J.A., 1993). Можливо, що примітивні гліальні клітини і епендімальні клітини являються попередниками мікрогліальних клітин.

Із вище наведених результатів слідує, що на різних этапах розвитку мозку мікроглія виявляється у вигляді різноманітних за морфологічними характеристиками клітин: амебоїдної форми з цитоплазматичними випинаннями, проміжної форми з короткими потовщеними відростками і розгалуженої мікроглії, котра виявляється у зрілому мозку. Ці дані узгоджуються з даними Streit та іншими, які при використанні ізолектина GSA I-В4 (із Griphonia Simplicifolia) також виявляли аналогічні перетворення амебоїдної мікроглії і подальше її диференціювання (Streit W.J. et al., 1988; Streit W.J., 1990).

Так, робиться передбачення, що розподіл макрофагів і мікроглії в мозолистому тілі у новонародженому мозку може бути пов’язаний з ростом аксонів протягом формування перехрестного аксонального шляху, чи з ліквідацією нейронів, які не установили контакта з іншими нейронами (Innocenti G.M. et al.,1983; Iversen L. et al., 1994).

Нами було показано, що в процесі постнатального розвитку (Р1-Р15) проміжна мікроглія розповсюджується від субвентрикулярної зони по всьому мозку. Можна припустити, що мікрогліальні клітини у вигляді проміжної форми з потовщеними, короткими псевдоніжками мігрують по всьому мозку і диференціюються до 15 дня постнатального розвитку. Hurley і Streit при використанні ізолектина GSA виділяють трансформовану мікроглію як проміжний тип при перетворенні амебоїдної форми в розгалужену мікроглію (Hurley S.D. and Streit W.J., 1996). За нашими даними амебоїдна мікроглія проліферує і мігрує із субвентрикулярної зони по всьому мозку і диференціюється в розгалужену мікроглію. Слід замітити, що на протязі періоду розвитку мозку густота мікроглії була вищою в білій речовині в області латеральних шлуночків.

За нашими даними LC1 як маркер мікроглії дозволяє найбільш повно виявити популяцію цих клітин в зрілому мозку. До теперішнього часу функції розгалуженої мікроглії в зрілому мозку недостатньо відомі і для більш детального вивчення мікроглії було б доцільно побудувати топографічні карти для вивчення популяції розгалуженої мікроглії з використанням відносно нового маркера LC1 і порівнянням з іншими маркерами. РТ як маркер мікроглії був вибраний для того, щоб вивчити процеси фосфорилювання білків по тирозину в розгалуженій і активованій мікроглії. При порівнянні популяцій LC1+ і PT+ мікрогліальних клітин було показано, що кількість LC1+ мікрогліальних клітин більша в порівнянні з PТ+ клітинами. Причиною цього може бути те, що білки не всієї популяції розгалуженої мікроглії являються фосфорильованними по тирозину. Для LC1+ і РТ+ мікрогліальних клітин, виявлених в сірій речовині, була характерна округла сома і радіально розгалужені відростки; в білій речовині - овальної форми тіло і декілька відростків, розташованих вздовж аксонів. Так як в сірій речовині секретується велика кількість біологічно активних речовин, можна припустити, що вони стимулюють ріст відростків мікроглії, що приводить до збільшення поверхні їх контактів з сомою нейронів, іншими клітинами і оточуючим середовищем. В білій речовині, де знаходяться тільки мієлінізовані аксони, форма і кількість мікроглії суттєво відрізняється, що узгоджується з даними Lawson і Streit із співавторами (Lawson L.J. et al., 1990; Streit W.J., 1990).

Аналіз імуногістохімічного забарвлення показав, що морфологічні особливості мікроглії, виявленої за допомогою антитіл до різноманітних маркерів та ізолектина, достатньо схожі, однак, кількість забарвлених клітин була найбільшою при використанні LC1 (р<0.05). Ми зробили припущення, що LC1, на відміну від інших маркерів, являється найбільш адекватним маркером для виявлення популяції мікроглії, і це дозволяє більш об’єктивно досліджувати її в нормальному мозку. Просторовий розподіл популяції мікроглії суттєво відрізнявся від розподілу астроглії, густота клітин якої в декілька раз перевищувала аналогічний показник мікроглії.

За нашими даними, мікроглія, яка перебуває в спокої, розсіяна відносно однорідно в мозку, формуючи сіть імуноефекторних клітин, які можуть активуватися при ураженні нервової системи, вірусній інфекції чи механічній травмі (Karp H.L. et al., 1994; Milligan C.E. et al., 1991). Підрахована нами середня кількість LC1+ клітин в мозку щурів була на 32% більшою, чим виявлена Lawson зі співавторами в мозку миші з використанням маркера F4/80 (Lawson L.J. et al., 1990). За нашими даними, найбільша кількість мікроглії міститься в неостріатумі. Це може бути пов'язано з секрецією дофамінергічних нейромедіаторів в цьому регіоні мозку (Lawson L.J. et al., 1990). Вивчаючи F4/80+ мікроглію, автори не виявили залежність її густоти від кількості нейронів,що загинули в різних регіонах нормального мозку миші, що дозволяє припустити, що скупчення мікроглії в зрілому мозку в нормі можуть бути пов'язані не стільки з фагоцитарною, скільки з іншими функціями мікрогліальних клітин (Lawson L.J. et al., 1990). Підтвердженням цього припущення може також служити відсутність чіткої кореляції між густотою астроцитів і мікроглії в різних регіонах мозку (Таблица).

Нами було виявлено, що астроцити розподілені в різних регіонах мозку менш рівномірно, ніж мікроглія. Найбільша їх кількість знаходиться в білій речовині, в нюховій і потиличній корі головного мозку, гіпоталамусі і зубчастій борозні гіпокампу. Можливо, взаємодія астроцитів з олігодендроцитами, присутніми в білій речовині, впливає на проліферацію перших (Schweizer M. et al., 1993). В білій речовині астроцити більш інтенсивно забарвлені, в зв'язку з чим можна припустити, що в цій частині мозку концентрація S100 в астроцитах вища. Скупчення астроцитів в області гіпоталамуса, можливо, пов'язано з нейроендокринною функцією вказанного відділу мозку.

Таким чином, можна припустити, що різна густота астроцитів і мікроглії в різних регіонах зрілого мозку може залежати від ролі, що виконується цими клітинами в даних областях мозку, від типів нейронів, від нейромедіаторів, що виділяються ними, а також від функціональних особливостей окремих регіонів мозку.

При патологічних станах мозку гліальні клітини реагують на загибель нейронів та на зміни концентрації секретуємих нейромедіаторів, проліферацією та фагоцитозом. Щоб визначити зміни з боку глії, необхідно вивчити істинну кількість мікроглії і астроцитів в нормі.

При ішемії відбувається ураження пірамідних нейронів у СА1 регіоні гіпокампу з послідуючою активацією мікроглії і астроцитів. Нами було показано, що кількість LC1+ активованої мікроглії різко збільшується навколо соми пірамідних нейронів, в меншій мірі уздовж дендритів і аксонів в СА1 зоні на 30-тий день після ішемії. Це скупчення мікроглії біля нейронів знаходиться тривалий період і тільки на 90-ту добу кількість мікроглії в цій області наближається до контрольної величини. Однак, розподіл S100+ астроцитів в CA1 області гіпокампу був відносно подібним до такого в контролі, за виключенням молекулярного шару - в місці розподілу синаптичних закінчень аксонів пірамідних нейронів СА3 зони. Це підтвержує вище розглянуте твердження про участь гліальних клітин в “віддаленні” пресинаптичних закінчень від дендритів уражених нейронів і про роль мікроглії в забезпеченні умов, які сприяють швидкому відновленню уражених нейронів після ішемії. Ці дані узгоджуються з висновками Ohno M. (1995) про те, що мікроглія швидко реагує на ішемію, в той час як відповідь астроцитів і проникнення макрофагів спостерігаються на більш пізніх етапах чи відсутні зовсім. При глобальній ішемії активована мікроглія локалізувалась в stratum pyramidale CA1 області, астроцити - в різних областях гіпокампу, які включають stratum radiatum і stratum oriens. Активована мікроглія в CA1 області гіпокампу швидше, ніж астроцити, экспресує периферичні бензодіазепанові рецептори (peripheral benzodiazepine receptors - PBRs), які індуковані після ішемії (Stephenson D.T. et al., 1995). Таким чином, при ішемії мікрогліальні клітини чи проліферують більш інтенсивно, порівнюючи з астроцитами, чи ступінь міграції їх із інших відділів мозку значна порівнюючи з астроцитами.

Було показано, що активація мікроглії при ішемії опосередковується підсиленням процесів фосфорилювання тирозину в цих клітинах (Henrich-Noack P. et al., 1994), секрецією фактора TGF -beta 1, який має нейропротекторну дію на пірамідні нейрони (Burne J.F. et al., 1996; Prehn J.H. et al., 1994). LC1 також виконує захисну функцію при ішемії, інгібуючи утворення арахідонової кислоти, яка в свою чергу, модулює функцію рецепторів глутамату (Eckert W.A. et al., 1994; Rothwell N.J. et al., 1993). Протизапальна дія LC1 підтверджується також інгібуванням IL-1 при ішемії (Rothwell N.J. et al., 1993).

Для ідентифікації активованої мікроглії ми використовували антитіла до глікопротеїну LC1, фосфотирозину. Karp та інші показали, що РТ являється специфічним маркером мікроглії як в нормі, так і при патології (Karp H.L. et al., 1994). За нашими даними, морфологічні характеристики LC1+ і РТ+ активованої мікроглії були подібні після перерізки підочноямкового нерва.

Характер взаємодії мікроглії з нейронами можна проаналізувати, якщо порівняти розподіл мікроглії як в нормі, так і при ураженні. В нормі нейрони мають довгі відростки, а мікроглія розподіляється рівномірно по всьому мозку, скупчення цих клітин практично відсутні. При патології зменшується довжина дендритів, а мікроглія переміщується ближче до тіла нейронів і утворює кластери.

Таким чином, аналіз особливостей активації мікроглії при ураженні нейронів може служити дуже чутливим біологічним маркером (Streit W.J., 1996).

Нами було показано, що вже через 4 дня після перерізки підочноямкового нерва в місці находження соми уражених нейронів в області ядра трійчастого нерву стовбура мозку спостерігається скупчення LC1+ і РТ+ активованої мікроглії. Раніше були вивчені порівняльні характеристики LC1+ і S100+ клітин при перерізці підочноямкового нерву (Melzer P. et al., 1997) і було показано, що найбільша кількість активованої мікроглії спостерігалась протягом 2-х тижнів, що співпадає з іншими даними літератури. Так, Eckert W.A. зі співавторами (1994) виявили скупчення РТ+ клітин в поперековому відділі спинного мозку вже через 3 дня після перерізки сідничного нерву, і густота цих клітин була підвищеною навіть через 3 тижні після операції. Dusart I. і Schwab M.E. (1994) досліджували активацію глії після локального ураження спинного мозку. Найбільша густота мікроглії в ураженій ділянці була відмічена через 4-8 дній. При цьому на стороні ураження протягом першого тижня спостерігалась лише незначна кількість реактивних астроцитів.

Зроблено припущення, що мікроглія виконує нейропротекторну функцію при перерізці нерву.

Збільшення кількості активованих макрофагів/мікроглії у спинному мозку після перерізки дорзальних корінців забезпечувало регенерацію сенсорних аксонів, можливо, завдяки виділенню цитокінів і взаємодії з іншими ненейрональними клітинами в сусідніх областях (Prewitt C.M. et al., 1997).

Таким чином, після перерізки нерву біля соми уражених нейронів спостерігається локальне скупчення активованих мікрогліальних клітин, які, мабуть, виконують захисну роль и сприяють регенерації нейронів. Можна припустити, що активація мікроглії пов’язана з фосфорилюванням білків за тирозином, і можливо, в цьому процесі приймає участь також LC1.

Дві моделі, перерізка нерву і ішемія, відрізняються тим, що в першому випадку при механічному ураженні порушується контакт аксонів і соми; в другому випадку - при нестачі кисню виникає накопичення СО2 та продуктів метаболізму в клітинах. Можна припустити, що активована мікроглія виконує захисну роль і сприяє виживанню нейронів.

Відповідь активованої мікроглії на ураження кори головного мозку, викликаного лазерним опроміненням, залежить від ступеню проникнення його в різні шари тканини. При довжині хвилі 4 мкм і енергії 22 міліДж/макроІмп відбувається денатурація білків, коагуляція ліпідів і випаровування води в тканинах кори. Нами було встановлено, що астроцити оточують в невеликій кількості осередок ураження, в той час як LC1 мікроглія реагує вже через 3 дні після ураження і скупчується біля осередка ураження, а через 6 днів її кількість в корі значно збільшується.

Раніше було показано (Banner L.R. et al., 1997), що при ураженні кори головного мозку астроцити і мікроглія секретують лейкеміє-інгібіторний фактор (leukemia inhibitory factor (LIF)), який є фактором росту, що збільшує виживання нейронів. Цікавий той факт, що LIF імунореактивні мікроглія і астроцити розподіляються в корі на певній відстані від місця ураження, але не біля самої зони ураження. Amat J.A., та інші (1996) показали, що після травми кори у щурів мікроглія проліферує швидше і в більшому ступені, в порівнянні з реакцією астроцитів.

Усі клітини мозку загалом взаємодіють між собою за допомогою міжклітиних контактів, секреції протеїнів і біологічно активних речовин та виправленні при яких-небудь функціональних відхилинь. З кожним роком відбувається більш детальне вивчення функціонального значення астроцитів і мікроглії на ранніх стадіях розвитку мозку та зрілому мозку в нормі, а також при патологічних станах.