Наіональна академія наук України

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії

Терновська Тамара Костянтинівна

УДК 633.11 : 631.523 : 575

Перебудова геному м'якої пшениці (Triticum aestivum L)

для її генетичного аналізу та інтрогресії генів

Спеціальність 03.00.15.-генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ

1999

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті агроекології та біотехнології УААН.

Науковий консультант - Созінов Олексій Олексійович- доктор сільськогосподарських наук, професор, академік НАН України та УААН, завідувач лабораторії екологічної генетики Інституту агроекології та біотехнології УААН, директор Інституту агроекології та біотехнології УААН.

Офіційні опоненти:

·

·

·

Провідна установа: Київський Університет ім. Т. Шевченка, кафедра

загальної та молекулярної генетики.

Захист відбудеться 16.09.1999р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, 252143,Київ, вул.Заболотного,148.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, вул. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано 12.08.1999 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Тарасенко Л.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Походження м'якої пшениці (Triticum aestivum L.) пов'язано з об'єднанням в одному алогексаплоїдному геномі, AABBDD, трьох геномів - AA (від пшениці-однозернянки), BB (джерело невідоме) і DD (егілопс Тауша). Вважається, що наслідком такої структури геному є триплікованість однотипних генів в системах, що контролюють окремі ознаки. Це ускладнює співвідношення розчеплення при генетичному аналізові пшениці за будь-якими ознаками і особливо за ознаками з неперервною мінливістю - кількісними. Між тим з усієї багатоманітності ознак, успадкування яких потрібно знати, найважливішими є саме кількісні, тому що до цієї категорії відносять більшість селекційно-значущих ознак.

Ідея перебудувати геном м'якої пшениці таким чином, щоб гексаплоїди відрізнялись один від одного лише за одним з трьох субгеномів, тобто виконати опосередковану деполіплоїдизацію гексаплоїдної пшениці, належала Є.Г.Жи-рову. Її було реалізовано для субгенома D (Жиров,Терновская, 1987). Концентрація уваги на субгеномі D пояснюється двома причинами. По-перше, з включенням саме цього геному у склад алогексаплоїда пов'язують низку властивостей м'якої пшениці, що роблять її основною хлібною рослиною: високі хлібопекарські властивості (Welsh, Hehn, 1964, Kerber, Tipples, 1969, Dedio, Kaltsikes, 1972), розширення ареалу за рахунок проникнення в північніші та посушливі райони (Halloran, Boydell, 1967, Kuckuck, 1970, Шулындин,1972), а також деякі негативні ознаки: підвищена спринятливість до грибних захворювань (Kerber, Dyck, 1969, Мигушова,1975), знижений вміст білка в зерні і лізину в білкові (Lawrence, 1958, Тютерев и др., 1973), гени гібридного некрозу і хлорозу (Kihara, 1951). По-друге, субгеном D виявився єдиним з трьох субгеномів пшениці, А, В і D, який вдалося відділити від двох інших, виділивши тетраплоїдний компонент ААВВ (Kerber, 1964, Kaltsikes et al., 1968, Терновская, Жиров, 1979). Крім цього, ми змогли приєднати субгеном D різних сортів м'якої пшениці до одного і того ж тетраплоїду ААВВ, отримавши гексаплоїдні форми м'якої пшениці, що відрізняються одна від одної субгеномом D і які однакові в геномній частині АВ (Жиров, Терновская, 1987). При схрещуванні цих форм вся мінливість в популяціях, що розчеплюються, відбувається за рахунок генів геному D, тобто є диплоїдний тип розчеплення. Ця обставина дає можливість використати для аналізу субгенома D, що є у складі гексаплоїдного організму, будь-які методи класичного генетичного аналізу, в тому числі, гібридологічний.

Основним завданням цитогенетики м'якої пшениці є розробка методів її покращення на гени, що контролюють господарсько-цінні ознаки як за рахунок інтрогресії окремих генів, так і прямим конструюванням генотипу,використовуючи сучасні методи генетичної інженерії. Для вирішення такого завдання потрібно добре знати генетику м'якої пшениці і мати інформацію про закономірності успадкування ознак, які бажано було б передати цій культурі від дикорослих родичів шляхом інтрогресії генів. Виконане дослідження м'якої пшениці спрямовано на генетичний аналіз однієї зі складових частин її складного генома - субгеному D за низкою якісних і кількісних ознак і на перебудову цього субгеному шляхом інтрогресивної гібридизації з використанням методів геномної і хромосомної інженерії.

Зв'язок дисертаційної роботи з науковими програмами, планами, темами. В дисертації узагальнено результати науково-дослідницької роботи, виконаної у відповідності з тематичними планами програм "Розробка методiв та технологiй у селекцiї, насiнництвi, радiобiологiї та агроекологiї на основi використання молекулярно-генетичних маркерiв, хромосомної та генетичної iнженерiї", номер держреєстрації 01930036999, "Теоретично обгрунтувати і застосувати на практиці засоби та методи генетики і біотехнології для цілей спрямованого формування генетичної компоненти сталих агроекосистем", номер держреєстрації 0196U012975 в рамках проблеми "Теоретично обгрунтувати і застосувати на практиці способи і методи генетики і біотехнології з метою спрямованого формування генетичної компоненти сталих агроекосистем".

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було продемонструвати шляхи та методи використання гексаплоїдних форм пшениці з перебудованим геномом для геномного аналізу м'якої пшениці, генетичного аналізу її субгеному D та інтрогресії генетичного матеріалу від її дикорослих родичів. Для досягнення мети було поставлено та вирішено такі задачi: 1. Використовуючи геномно-додані форми м'якої пшениці, що мають однаковий тетраплоїдний компонент геному АВ і різні субгеноми D, створити гібридний матеріал, необхідний для виконання геномного аналізу двох частин алогексаплоїдного геному, АВ та D і генетичного аналізу субгенома D. 2. На створеному гібридному матеріалі вивчити внесок окремих частин геному м'якої пшениці (АВ і D) у контролювання розвитку деяких кількісних ознак і виконати біометричний генетичний аналіз субгеному D м'якої пшениці 3. Ідентифікувати гени субгеному D, що їх можна використати як гени-маркери окремих хромосом цього субгеному. 4. Використовуючи ідентифіковані гени-маркери хромосом субгеному D та феномен зчеплення, здійснити хромосомну локалізацію головних генів мірних ознак. 5.Використуючи гени-маркери хромосом різних гомеологічних груп Triticinae, класифікувати отримані нами раніше гексаплоїдні лінії м'якої пшениці з міжгеномними заміщеннями хромосом за наявністю в них чужинних ромосом або їх ділянок певної гомеологічної групи, заклавши тим самим підгрунтя для використання ліній у генетичному аналізові представників Triticinae та у селекції як ліній-донорів чужинних генів, що контролюють бажані ознаки.

Наукова новизна. 1. Вперше в світі здійснено генетичний аналіз суб-геному D м'якої пшениці трьох різних її сортів і двох різновидів дикорослого прабатька цього субгеному, що знаходиться у складі повністю збалансованих за кількістю хромосом і відношенню ядро-цитоплазма рослинних форм 2. Вперше в світі виміряно внесок двох різних в еволюційному плані складових частин гексаплоїдного геному пшениці: АВ і D - в розвиток кількісних ознак пшениці, переважно селекційно значущих, i показано відмінності в напрямку дії різних частин геному. 3. Ідентифіковано декілька нових генів м'якої пшениці, що контролюють морфологічні ознаки колоса, і кілька головних генів, що вони беруть участь в контролі кількісних ознак колоса і стебла. 4. Доведено ефективність використання геномно-заміщених гексаплоїдів пшениці з геномною структурою ААВВХХ для створення чужинно-заміщених ліній м'якої пшениці з одинарними та множинними заміщеннями хромосом субгеному D на хромосому субгеному Х геномно-заміщеної форми. 5. Встановлено переважну залежність успішного отримання чужинно-пшеничних заміщень від належності критичної хромосоми до певної гомеологічної групи у порівнянні з її належністю виду-донору генетичного матеріалу, що інтрогресується.

Практична значущість. 1. Розроблено метод геномного аналізу алопо-ліплоїдів на прикладі м'якої пшениці. Він придатний для аналізу різного типу рослинного матеріалу, коли у порівнюваних генотипах можна виділити дві складові частини, одна з яких – загальна для декількох досліджуваних форм. Метод можна використати для інших алополіплоїдних видів рослин. 2. Ре-зультати геномного аналізу мають значення для оптимізації селекційного про-цесу та можуть бути використані селекціонерами при виборі компонентів схре-щування. 3. Розроблено спосіб хромосомної локалізації головних генів мірних ознак, який грунтується на використанні результатів попереднього генетичного аналізу ознаки, що вивчається, методами біометричної генетики. Метод може бути використано для різного типу еуплоїдного рослинного матеріалу, коли гібриди розчеплюються на диплоїдному рівні, а окремі хромосоми геному мають ідентифіковані гени-маркери. 4. Створено популяції F6 рекомбінантно-інбредних ліній від схрещування геномно-доданих форм за діалельною схемою. Вони відрізняються від усіх популяцій РІЛ м'якої пшениці тим, що фіксують мінливість гексаплоїдів, що розчеплюються лише за субгеномом D, тобто на диплоїдному рівні. Можуть використовуватись для генетичного аналізу ознак, за якими компоненти схрещування відрізняютьсяодин від одного, і є цінним генетичним матеріалом для ідентифікації і картування QTL. 5. Гексаплоїдні лінії пшениці з хромосомами і транслокаціями від Aegilops umbellulata, Ae. speltoides, Ae. sharonensis, Agropyron glaucum характеризуються стійкістю до грибних захворювань пшениці, доброю зимостійкістю, підвищеним у порівнянні з м'якою пшеницею вмістом білка. Вони без обмежень схрещуються з сортами м'якої пшениці і можуть бути використані як донори генів, що контролюють перераховані ознаки, в селекції пшениці. 6. Загальну схему виконання даного дослідження і отримані результати можна включити в курс генетичного аналізу, що читається студентам зі спеціальності генетика, для ілюстрації важливості відповідності методів дослідження матеріаловi, до якого вони застосовуються.

Апробацiя роботи. Результати дослідження доповідались, або були представлені і отримали позитивну оцінку на: конференції Європейського об'єднання досліджень з анеуплоїдії пшениці, EWAC, Угорщина, Мартонвашар,1981,Міжнародній науковій конференції вчених країн-членів РЕВ, Одеса, 1981, Всесоюзній нараді з віддаленої гібридизації рослин і тварин, Москва, 1981, П Російскому симпозіумі "Новые методы био-технологии растений", Пущино-на-Оці, 18 – 20 травня, 1993, Ш Всеросійському симпозіумі з біотехнології рослин в Пущино-на-Оці, 22 –27 травня 1995, Міжнародній конференції "Молекулярно-генетичні маркери і селекція рослин", Київ,10 - 13 травня 1994, Міжнародному симпозіумі в м. Харкові, 2-4 жовтня. 1996 р., Міжнародній конференції "Актуальные проблемы в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", Москва, 30– 31 жовтня 1996, Міжнародній конференції "Молекулярно-генетические маркеры растений", Ялта, 11 - 15 листопада, 1996, Міжнародній конференції "Молекулярно-генетические маркери растений и животних", Київ, 29-30 травня 1997.

Особистий внесок автора полягає у створенні основної концепції дослідження, що виконано, визначенні задач і методів для їх вирішення, проведенні переважної частини експериментальної роботи, створенні мо-делей і обробцi отриманих даних, аналізові і узагальненні результатів.

Публикацiї результатiв дослiджень. За матеріалами дисертації опуб-ліковано 37 робіт. Серед них 28 статей у фахових наукових виданнях, 6 з яких написано без співавторів, 2 статтi у збiрниках праць та 7 тез, вміщених в матеріалах міжнародних конференцій і симпозіумів.

Структура дисертацiї. Дисертація містить вступ, огляд літератури (складається з двох розділів), викладення власних експериментів - п'ять розділів, що включають опис матеріалів і методів. В окремий розділ вине-сено обговорення головних результатів, є заключення і висновки. Роботу викладено на 417 стор. машинописного тексту, включаючи 69 таблиць і 70 малюнків. Перелік цитованої літератури складають 626 джерел. 50 таблиць розташовано у додатках.

ОСНОВНА ЧАСТИНА

РОЗДІЛ 1. Генетичний аналіз м'якої пшениці - досягнуті

результати і проблеми (огляд літератури)

Розглянуто такі питання сучасного стану генетичних досліджень пше-ниці: структура геному пшениці, етапи вивчення її генетики з використанням анеуплоїдних серій м'якої пшениці, становлення методу молекулярно-генетичних маркерів в застосуванні до генетичних досліджень пшениці. Цей метод охарактеризовано як найбільш перспективний у генетичних дослідженнях пшениці, в тому числі i за кількісними ознаками. Розкрито поняття деполіплоїдизації алогексаплоїдної пшениці, прямої та опосередкованої, підкреслено її значення для генетичного аналізу. Виділено чотири етапи генетичного дослідження виду T.aestivum: 1. Встановлення структури геному, відношень гомеології між хромосомами субгеномів і по-ходження останніх. Основний метод досліджень - цитологічний, головний практичний результат - чітке розуміння низької розрізняючої здатності класичного гібридологічного аналізу для генетичного аналізу пшениці (Kihara, 1937, Okomoto, 1962, Chapman, Riley, 1966, Филиппченко, 1979). 2. Створення повного комплекту серій всіх можливих анеуплоїдів на хромосомному і плечовому рівні на сорті м'якої пшениці Чайніз Спринг, розробка методів анеуплоїдного аналізу пшениці і методів цілеспрямованої заміни певних пшеничних хромосом на гомеологічні хромосоми інших видів і родів підтриби Triticinae. Основний метод дослідження - цитологічний. Основний результат - хромосомна локалізація "головних" генів, що відповідають за розвиток видових ознак різних гексаплоїдних видів пшениці, висновок про участь всіх хромосом пшениці у генетичному контролi будь-яких її кількісних ознак і накопичення величезного обсягу рослинного матеріалу, що являє собою продукти інтрогресивної гіб-ридизації м'якої пшениці з її родичами (Unrau, 1950, Sears, 1953, 1954, 1972, Kuspira, Unrau, 1959, Zeller, Fischbeck, 1974). 3. Використання нулі-тетрасомних ліній пшениці для локалізації генів, що контролюють синтез білків. Метод досліджень - електрофорез білків. Основний практичний результат – становлення методу молекулярно-генетичних маркерів, "візуалізація" всіх 42 плечей хромосом пшениці за рахунок локалізації на них білкових генів-маркерів і демонстрація можливостей нового методу для полегшення робіт, пов'язаних з інтрогресією чужинних генів в геном пшениці (Barber et al., 1968, McIntosh et al., 1998). 4. Акцент уваги дослідників - на молекули ДНК, поліморфізм яких використано для розробки двох типів молекулярних маркерів: RFLP-маркери та PCR-маркери і числені їх варіанти. Основний метод - біохімічні методики для роботи з ДНК. Практичний результат - створення молекулярно-генетичних RFLP-карт для всіх семи гомеологічних груп хромосом пшениці і декотрих споріднених видів та демонстрація можливості "етикетування" молекулярним маркером практично будь-якого гену (ознаки), коли це необхідно для генетичного аналізу і скринінгу селекційного матеріалу; формування поняття QTL (Young, Tanksley, 1989, Devos et al., 1992, 1993, Michelmore et al., 1991, Paterson et al., 1988)). На думку автора дисертації, перші три етапи розвитку генетичних досліджень пшениці характеризувались певною гармонією між матеріалом, що аналізується, і методами, що використовуються для аналізу. Змiст четвертого етапу - демонстрація відриву методів генетичного аналізу від матеріалу, який може бути запропонованим для реалізації можливостей метода. З цим пов'язано загострення цікавості до пошуку або створення рослинного матеріалу, на якому можна було б вивчити спільно з макроознаками і поліморфізм молекул ДНК.

РОЗДІЛ 2. Геномний аналіз м'якої пшениці

Дослідження, спрямоване на виявлення генетичного внеску окремих субгеномів м'якої пшениці у формування фенотипічних середніх значень за кількісними ознаками, виконано на спеціально створених штучних формах гексаплоїдної пшениці, геномно-доданих гексаплоїдах. Ці форми мають однакову геномну частину АВ і відрізняються одна від одної лише субгеномом D. Вивчений рослинний матеріал: 1) озимі сорти м'якої пшениці T.aestivum L. Кавказ (КВ) і Альбідум 114 (АЛ); 2) лінія озимої твердої пшениці T.durum Desf. var. muticitalicum Dorof. et Filat. (МІ); 3) п'ять геномно-доданих форм з одним і тим же субгеномом АВ, який є геномом лінії МІ, і різними субгеномами D: від сорту Кальянсона (КС) у форми Dкс, від сорту КВ - у Dкв, від сорту АЛ - у Dал, від Aegilops tauschii (Coss.) Schmal. var. strangulata (к-28) у форми Dt28 та var. eusquarrosa (к-346) у форми Dt346; 4) F1 від схрещування перерахованих форм за діалельною схемою без реципроків. Вивчено ознаки: дата колосіння (кількість днів від 1-го травня), довжина стебла (ДС, см), довжина верхнього міжвузля (ДМ, см), довжина колоса (ДК, мм), кількість колосків у головному колосі (ККК, шт.), довжина (ДЛ, см) і ширина (ШЛ, мм) листка, діаметр стебла під колосом (Д, мм), кількість (КЗК, шт.) і маса зерен (МЗК, г) з головного колоса, маса одного зерна (МОЗ, мг).

Відповідність розподілу рослин за фенотипічними класами у вивчених популяціях за кожною з ознак нормальному законовi було встановлено. Стандартна статистична обробка даних та розрахунки з використанням вибраних критеріїв і методів виконано за допомогою пакету статистичних програм QUATTRO PRO, версія 4. Для виявлення генетичних ефектів субгеномів D і АВ м'якої пшениці стосовно низки вивчених ознак використали концептуальну основу і термінологію біометричної генетики (Mather, Jinks, 1971). Геном гексаплоїдної пшениці розглядали як сукупність двох генетичних одиниць, D і АВ. В середині кожної з цих одиниць відношення будуються як між алелями одного гена - адитивність [d] або домінування [h]. Між одиницями можуть мати місце звичайні міжгенні взаємодії - різні сполучення ефектів [i] (взаємодія гомозигот), [j] (взаємодія гомозигот з гетерозиготами), [l] (взаємодія гетерозигот з гетерозиготами).

Вихідним було припущення про адитивно-домінантну дію геномів AB та D. Адитивно-домінантну модель наповнювали результатами вивчення семи батьківських форм і 21 гібрида між ними (мал. 1А) за кожною з 11 кількісних ознак. Модель включала параметр m - середнє значення, [P] - ефект плоїдності (оскільки одна з батьківських форм була не гекса-, а тетраплоїдом, а отримані за її участю гібриди - пентаплоїдами), шість параметрів [d], дев'ять параметрів [h] для різних субгеномів D та АВ. Числові значення параметрів визначали, використовуючи тест об'єднаного шкалювання Каваллі (цит. за Mather, Jinks, 1971). Емпіричні та теоретичні середні значення порівнювали методом c2.. Неадекватність адитивно-домінантної моделі дослідним даним було показано для кожної з вивчених ознак. Розгляд складових частин величин c2 виявив, що перевищення останніми критичного рівня завжди відбувається за рахунок одних і тих же сімей - при сполученні субгеномів AB і D, коли гетерозиготний один з них ([j], в нашому випадку це 8 параметрів) або обидва (взаємодія [l], 7 параметрів). Наявна кількість сімей не дала змоги додатково ввести до повної моделі всі 15 параметрів взаємодії. Для продовження аналізу тестували окремо дві моделі: 1) з 12 параметрами та 15 сім'ями, що враховують розбіжності лише за субгеномом D на тлі одного і того ж субгенома АВ (мал. 1Б); 2) з 5 параметрами та шістьма сім'ями з різними субгеномами АВ на тлi одного й того ж D (мал. 1В). Перша адитивно-домінантна модель виявилася адекватною для всіх ознак, тобто генетичні розбіжності між різними субгеномами D можна описати, приймаючи до уваги лише адитивні і домінантні ефекти. При розбіжності субгеномів АВ на тлі одного і того ж субгеному D адитивно-домінантна модель була адекватною лише у кількох випадках. Це може бути пов'язано з наявністю взаємодії частини АВ з субгеномом D або зумовлено тетраплоїдною природою частини АВ. Геномна структура компонентів схрещування (мал. 1В) дала змогу визначити лише взаємодію [j]. Адекватність моделі з урахуванням цього параметру було доведено у більшості випадків.

А КВ АЛ

. .

Dt28 . . МІ

DАЛ. . DКС

.

DКВ

Різні субгеноми АВ та D (повна схема схрещувань)

Б МІ . . DКС В МІ. . КВ(АЛ)

Dt28. .DКВ

. .

DАЛ DКВ(АЛ)

Відрізняються лише субгеноми D Відрізняються лише субгеноми АВ

Мал. 1. Схеми вибору сімей для побудови різних моделей:

А - 7 компонентів схрещування і 21 гібрид F1 за діалельною схемою без реципроків; Б - 5 компонентів схрещування і 10 гібридів F1 між ними; В - 3 компоненти схрещування і 3 гібриди F1

Геномний аналіз м'якої пшениці за субгеномами D і АВ виявив деякі загальні риси, властиві кожному з них (мал. 2): субгеном D привніс до гексаплоїду гени більш раннього виколошування, зменшення кількості колосків у колосі і кількості зерен у ньому та гени збільшення довжини ко-лоса і збільшення маси одного зерна. За вегетативними ознаками вплив суб-геному D, що належить сортам м'якої пшениці, проявляється у збільшенні середніх значень цих ознак, а з D від егілопсу - в зменшенні. Адитивний ефект субгеному АВ спрямовано у протилежний бік у порівнянні з дією D геному для ознак дата колосіння, кількість колосків у колосі та маса од-ного зерна і всіх вегетативних ознак рослини.

Геномний аналіз морозостійкості м'якої пшениці виконано при порів-нянні п'яти субгеномів D та трьох субгеномів АВ. Гени субгеному D харак-теризуються домінантним, а гени субгеному АВ - адитивним ефектом між-алельної взаємодії. Міжгеномна взаємодія адитивна. Субгеном АВ робить більшій внесок у морозостійкість гексаплоїду у порівнянні з субгеномом D того ж сорту пшениці: Aал>ABкв>Dал>Dкв>Dt346>ABми>Dt28.

РОЗДІЛ 3. Генетичний аналіз субгеному D м'якої

пшениці за кількісними ознаками

3.1. Діалельний аналіз гібридів першого покоління. Досліджували геномно-додані форми Dкс, Dкв, Dал, Dt28 та Dt346 і F1 від схрещувань цих форм за діалельною схемою без реципроків (мал. 3). Вивчені ознаки - ті ж, що і в розділі 2 за виключенням дати колосіння і діаметру стебла. Результати оцінювання рослин аналізували в два етапи: 1) дисперсійний та регре-сійний аналіз варіанс-коваріанс для перевірки адекватності адитивно-домі-нантної моделі; 2) у випадку адекватності цієї моделі проводився дис-персійний аналіз даних оцінювання з наступним розкладанням дисперсії на компоненти. Аналіз діалельних таблиць виконано за Хейманом (Hayman, 1954), Акселем та Джонсоном (Aksel, Jonson, 1963). Результати узагальнено в табл. 1 та 2.

1989 та 1990 роки 1993 рік 1996 рік

Dкс Dкв Dкв Dкс Dкв

Dt346 Dкс Dал

Dал Dt28 Dал Dt28

Dt28

Мал. 3. Схеми схрещування геномно-доданих форм.

Є лише два загальних для всіх вивчених ознак висновки про характер їх генетичного контролю: має місце участь генів як з адитивним, так і з домінантним типом міжалельної дії, і кількість генів, що збільшують чисельний вираз ознаки (u), практично ніколи не дорівнює кількості генів, що зменшують це значення (v). За весь період досліджень було вивчено загалом 35 комплексів "рік дослідження-ознака". Ознаки стебла, листка, а також ознака "дата колосіння" і "жорсткість луски" умовно віднес-ли до вегетативних ознак (всього 18 комплексів) і відділили її від ознак колоса як найбільш помітних компонентів урожайності - маса одного зер-на, довжина колоса, кількість колосків у колосі, кількість зерен з коло-са, маса зерна з колоса (17 комплексів). З 18 комплексів за участю ве-гетативних ознак 14 могли бути описані за допомогою адитивно-до-мінантної моделі генетичного контролю, але лише для 7 з 17 комплексів за ознаками продуктивності була адекватною ця ж модель. Тобто взаємодія між генами частіше має місце в контролі ознак продуктивності, ніж ознак вегетативних. Серед генів, що контролюють обидва типи ознак, в гене-тичному пулі вивчених форм переважають гени, за незначними виключеннями, з рецесивним типом міжалельної взаємодії. Напрямок дії домінантних генів відрізняється нестабільністю в різні роки дослідження для трьох ознак: довжина стебла, довжина і ширина листка. І максимальна кількість домінантних алелів завжди була притаманна тому компоненту схрещування, фенотип якого відповідав напрямку дії домінантних генів.

3.2.Генетичний аналіз за даними оцінювання F1, F2 та беккросів до кожного з батьків. Компоненти схрещування та схеми отримання гібридів наведено на мал. 3. В 1989 році для всіх комбінацій схрещування вивчено гібриди першого і другого поколінь, в усі інші роки - F1, F2 та беккроси першого покоління до кожного з батьків. Вивчені ознаки - ті ж, що й у підрозділі 3.1. Для аналізу результатів оцінювання ознак використано об'єднаний тест Каваллі. В пошуках адекватної моделі тестували дві моделі: адитивно-домінантну і модель з урахуванням взаємодії двох генів. Адитивно-домінантна модель часто виявляється придатною для опису вегетативних ознак і довжини колоса (мал. 4). При аналізі генотипів за генами, що контролюють ознаки продуктивності колоса, для опису розбіжностей майже завжди доводиться звертатися до моделі з урахуванням взаємодії між двома генами. В низці випадків підібрати адекватну модель не вдалося, оскільки кількість наявних у нашому розпорядженні сімей не давало змоги розглядати моделі більш складні, ніж з участю двох взаємодіючих генів. Найбільша кількість комбінацій, для яких в жоден рік дослідження не вдалося підібрати адекватної моделі, спостерігається для ознак довжина і ширина листка, довжина колоса та жорсткість колоскової луски. На нашу думку, є три різні причини такого стану справ. Ознаки довжина і ширина листка, на відміну від інших вегетативних ознак, виявилось важко оцінювати через неконтрольовані та безсистемні спотворення. В контролі ознаки жорсткість луски бере участь кілька генів і два з них зчеплені (розділ 4 дисертації). Для створення моделі, що враховує зчеплення генів, які взаємодіють, не було потрібної кількості сімей. Ознаку довжина колоса оцінювати дуже просто, і якщо не вдається побудувати адекватної моделі для опису її контролю, то це пов'язано або з перевищенням кількості генів, що взаємодіють (більше двох), або, як для жорсткості луски, в контролі беруть участь гени, що зчеплені. В абсолютній більшості випадків в контролі всіх ознак всіх комбінацій схрещування значущими виявляються позитивні адитивні ефекти міжалельної взаємодії ([d]). Винятків було кілька: дію алелів спрямовано в сторону зменшення ознаки кількість зерен у колосі в комбінації Dквх Dt28 і параметр [d] виявився незначущим для ознак довжина стебла і міжвузля в комбінації DквхDt346, довжина і ширина листка в комбінації Dкс х Dt346, кількість зерен у колосі в комбінації Dкв х Dал, маса зерен в

комбінаціях Dксх Dал, Dксх Dt28, Dкв х Dал і маса одного зерна в комбінації Dксх Dкв. В цих випадках значущий внесок у фенотипічний вираз ознаки належить або домінантному ефекту алелів, або міжгенній взаємодії. Домінантна дія алелів виявляється значущою також доволі часто. Порівняння напрямку дії домінантних алелів знову поділяє досліджені ознаки на дві групи: вегетативні, в їх контролі беруть участь домінантні алелі, що діють у напрямку як збільшення фенотипічного виразу ознаки, так і в напрямку його зменшення; ознаки продуктивності, для яких частіше виявляються алелі, що діють в напрямку зменшення числового виразу ознаки. Аналогічну картину спостерігаємо при вивченні параметру [i]: для ознак довжина стебла і міжвузля він завжди позитивний і більшою мірою позитивний для ознаки маса одного зерна. Для інших ознак продуктивності і жорсткості колоскової луски негативні значення цього параметру зустрічались частіше.

Вивчення великої кількості сімей (від 4 до 10 в залежності від року дослідження і комбінації схрещування) в рамках тесту масштабного шкалювання стосовно загальної характеристики генотипічних особливостей D геномів, що вивчаються, дало, загалом, ту ж картину, що й вивчення гібридів першого покоління від схрещування геномів D за діалельною схемою. Для опису системи генів, що беруть участь в контролі ознак вегетативної частини рослини, часто виявляється придатною адитивно-домінантна модель, а в контролі ознак продуктивності колоса до генів з адитивно-домінантним типом дії приєднуються гени з епістатичним типом міжгенної взаємодії. Порівняння результатів, отриманих при оцінюванні принципово різних наборів популяцій ( батьківські популяції та F1, що не розчеплюються, в діалельному аналізі і батьківські популяції та F1, що не розчеплюються і популяції, що розчеплюються; F2, перший беккрос до кожного з батьків, F3 і ще три різні популяції від схрещування рослин F2 з F1 і з кожним з батьків в об'єднаному тесті Каваллі) виявило дуже виразно, що загальна характеристика всіх компонентів схрещування за їх генотипічною структурою в цілому не є простою сумою характеристик, яку ми отримуємо в тесті Каваллі для кожної конкретної батьківської пари. Зроблено висновок, що основна інформація, яку можна здобути з результатів діалельного аналізу, стосується співвідношення рецесивних і домінантних генів в популяції і постійності цих співвідношень з року в рік. Всі інші характеристики вивчених генотипів потрібно отримати з результатів тесту Каваллі з тією істотною перевагою перед результатами, отриманими з діалельного аналізу, що вони стосуватимуться кожної конкретної пари геномів D, що вивчаються, а не всієї популяції вивчених форм в цілому.

РОЗДІЛ 4. Генетичний аналіз субгеному D м'якої пшениці за

ознаками морфології рослини і деякими білками

Геномно-додані форми і гібриди, отримані від циклічних схрещувань (мал. 3), вивчали за морфологічними (наявність/відсутність воскового нальоту, забарвлення стиглого колосу, розподіл забарвлення на лусці та опушення колоскової луски, борідка, остевидні відростки, жорсткість колоскової луски, вдавленість основи колоскової луски, забарвлення зернівки) і біохімічними (електрофоретичні спектри глютенінів, гліадинів, бета-амілази) ознаками. Використовуючи традиційні прийоми гібридологічного аналізу, виконали генетичний аналіз аналізованих субгеномів D за перерахованими ознаками, встановивши кількість генів, що беруть участь в контролі цих ознак, тип міжалельної та міжгенної взаємодії.

За генами, що контролюють ознаку наявність/відсутність воскового нальоту на рослині досліджувані форми мають генотипи: Dкс, Dкв, Dал - W1(2B)W2i(2D), Dt28- W1(2B)W2I(2D), а сама ознака може бути маркером хромосоми 2D (Tsunewaki, 1966). Пенетрантність повна. Контроль ознаки колір стиглої колоскової луски здійснюється генами Rg2 та Rg3,що зчеплені і які взаємодіють за типом комулятивної полімерії за участю рецесивного інгібітора Rg3i. Встано-влено генотипичні формули: Dкс - rg2Rg3Rg3I, Dкв і Dал- rg2Rg3Rg3i, Dt28 - Rg2rg3Rg3I. Rg2 локалізовано на хромосомі 1D (Rowland, Kerber, 1974), тому колір стиглої луски слугує маркером цієї хромосоми. Розподіл пігменту на ко-лосковій лусці контролюється домінантним геном з доброю експресивністю і повною пенетрантністю. Ген ідентифіковано вперше. Генотипи: Dкс, Dал та Dt28 Cd1I, Dкв - Cd1i. Ознака опушення колоскової луски контролюється кількома генами. Два з них відповідають за густоту опушення (Hg та Hgi-HgI) і два – за рівномірність його розподілу по лусці. Генотипи: Dкс - Hg(1A)hg2 HgIhg3, Dкв 1Hg(1A)hg2HgiHg3, Dал- Hg(1A)Hg2HgIhg3, Dt28- Hg(1A) Hg2Hgihg3. Як маркерна ознака може бути використана лише в декількох комбінаціях схрещування. Опушення основи членика колосового стрижня (борідка) є під контролем генів Br1, домінантного і Br2, напівдомінантного. Гени ідентифіковано вперше. Генотипи вивчених форм: Dкс та Dал - br1Br2, Dкв - br1br2, Dt28 - Br1Br2. Як маркерний краще підходить той ген, який відрізняє Dt28 від Dкс і 1Dал. Жорсткість колоскової луски контролюється генами Tg (Kerber, Rowland, 1974) і Tg2 (ідентифиіковано вперше) - напівдомінантними і зчепленими, хромосома 2D. Рецесивні алелі tg2 відповідають за формування вдавленості в основі колоскової луски. Генетичний контроль цієї ознаки встановлено в цьому дослідженні вперше. Генотипи: Dкс - tgTg2кс, Dкв - tgtg2, Dал - tgTg2ал, Dt28 - TgTg2кс. Ген R1 (червоне забарвлення зернівки, форми Dкв і Dt28) маркерують хромосому 3D (McIntosh et al., 1998), рецесивні алелі контролюють білий колір зернівки (форми Dкс та Dал). За генами Glu-D1(Bietz et al., 1975; Lawrence, Shepherd, 1980) відрізнялися один від одного всі геноми, крім Dкв та Dал, за генами Gli-D1 (Mecham et al., 1978; Созинов с соавт., 1978) і Gli-D2 (Shepherd, 1968) - всі геноми, за генами b-Amy-D1 (Ainsworth, 1983) - геном Dt28 від будь-якої з трьох інших форм. Перераховані локуси можуть бути використані як маркери хромосом 1D, 6D та 4D, відповідно.

РОЗДІЛ 5. Використання генів-маркерів для

генетичного аналізу субгенома D

Хромосомну локалізацію ідентифікованих генів, що контролюють морфологічні ознаки пшениці, виконали за фактом їх зчеплення з генами, локалізація яких відома (McIntosh et al., 1998), використовуючи критерій узгодженості для чотирипільних таблиць (Бейли, 1964). У відповідності з отриманими результатами вивчені генотипи можна описати певними генотипічними формулами стосовно всіх вивчених якісних ознак з вказуванням хромосомної локалізації генів (табл. 3).

Таблиця 3. Генотипи геномно-доданих форм за генами морфологічних ознак,

що вивчалися, та їх хромосомна локалізація

Ознаки Dкс Dкв Dал Dt28

Восковий наліт W2i W2i W2i W2I

Колір стиглого колосу rg2Rg3Rg3I Rg2Rg3Rg3i rg2Rg3Rg3i Rg2rg3Rg3I

Розподіл пігменту на лусці CdI Cdi CdI CdI

Опушення луски hg2HgIhg3 hg2HgiHg3 Hg2HgIhg3 Hg2Hgihg3

Остистість BnBn+1 bnbn+1 bnbn+1 BnBn+1

Борідка br1Br2 br1br2 br1Br2 Br1Br2

Жорсткість луски tgaTg2 tgtg2 tgbTg2 TgaTg2

Колір зернівки r1 R1 r1 R1

Хромосомна локалізація

1D 2D 3D 4D 6D

Rg2 W i R1 b-Amy-D1 Gli-D2

Rg3 Tg Tg3

Glu-D Tg2

Gli-D1 Cd I

Hg I Br2

Br1

При вивченні кількісних ознак з метою встановлення хромосомної локалізації головних генів, які контролюють розвиток кількісних ознак, використали два підходи: аналіз дисперсій і порівняння середніх значень. Дисперсії аналізували за схемою двофакторного дисперсійного аналізу за факторами генотип і повторність (Лакин, 1980). Порівняння середніх значень виконували за критерієм Стьюдента, дотримуючись розробленого нами алгоритму: 1. З популяції F2 вибирали дві групи рослин, одна з яких має материнський фенотип за певною ознакою-маркером, а друга - батьківський із середніми значеннями F2M1±sM1 та F2M2+sM2. Якщо різниця між цими середніми не була значуща, всі такі випадки виключали з подальшого аналізу групових середніх, спрямованого на локалізацію головних генів кількісних ознак. Коли різниця була значуща, переходили до другого пункту. 2. Емпіричне середнє значення групи, F2M1±sM1 або F2M2±sM2, порівнювали з теоретично очікуваним середнім значенням, вирахованим, виходячи з генотипічних формул моно і дигібридного розчеплень в F2, прийнятих в біометричній генетиці (Mather, Jinks 1971). Як генетичні ефекти використовували емпіричні значення параметрів, вирахувані в підрозділі 3.2 дисертації.

Результати наших досліджень (табл. 3) та відомості про характер успадкування і хромосомну локалізацію певних генів (McIntosh et al., 1998) було використано для хромосомної локалізації головних генів, що беруть участь в контролі кількісних ознак з числа нами вивчених. Одержані результати узагальнено в табл. 4. Комбінаціями, найбільш перспективними для подальшої роботи з ідентифікації і вивчення QTL, виявились: Dкс х Dt28 для ознак довжина стебла, міжвузля і листка, Dкв х Dt28 для ознак