ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Товстяк Володимир Васильович

УДК 577.352.2/3; 539.1; 534.29

МЕХАНІЗМИ ВПЛИВУ ЕЛЕКТРОНІВ ТА АКУСТИЧНИХ ПОЛІВ НА БІОЛОГІЧНІ МЕМБРАНИ

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фізико-математичних наук

Харків – 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному університеті

Міністерства освіти України.

Науковий консультант:

доктор фізико-математичних наук, професор, член-кореспондент НАН України Залюбовський Ілля Іванович, Харківський державний університет, проректор з наукової роботи.

Офіційні опоненти:

- доктор фізико-математичних наук, професор, член-кореспондент НАН України Сльозов Віталій Валентинович, Національний науковий центр “Харківський фізико-технічний інститут”, завідувач відділу;

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник,

Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу (м. Харків);–

доктор фізико-математичних наук, Волков Сергій Наумович, Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України, провідний науковий співробітник, (м. Київ).

Провідна установа: Інститут фізики НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “30” вересня 1999 р. о 1530 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському державному університеті за адресою: 310077, м. Харків, пл.Свободи, 4, ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського державного університету за адресою: 310077, м. Харків, пл.Свободи, 4.

Автореферат розісланий “ 27 ” серпня 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради С.В. Гаташ

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В останні роки іонізуюче й акустичне випромінювання широко використовують у різноманітних галузях промисловості, медицини та біології. Іонізуюче випромінювання застосовують для лікування цілого ряду онкогенних захворювань, а також для діагностики патологічних процесів. Велике поширення одержало використання направленого випромінювання електронів і гальмуючого випромінювання від електронних пучків у лікувальній практиці та радіобіології. З успіхом використовується ультразвукова діагностика для дослідження кровотоку судин і порожнин серця, для візуалізації глибоко розташованих внутрішніх органів і локалізації пухлин. Ефективне й безпечне застосування вже існуючих приладів, а також створення принципово нових імпульсних методів радіаційного та акустичного впливу і діагностики, неможливе без детального вивчення механізмів дії цих випромінювань на клітинному та молекулярному рівнях.

Сьогодні стало загальновизнаним, що радіобіологічні ефекти мають складний, багатофакторний характер, що залежить як від специфіки опроміненого об'єкту, так і від фізичних властивостей випромінювання. Експериментальні дані свідчать про те, що незважаючи на виняткове значення генетичного апарату в радіаційному пошкодженні клітин, не можна зводити всю сукупність радіобіологічних ефектів лише до ушкодження геному. Тому, як і раніше, науковою проблемою є виділення і дослідження критичних систем, які зумовлюють радіаційне ушкодження клітин.

До біологічних систем, що мають високу радіочутливість, належать плазматичні мембрани. Характер протікання первинних фізичних процесів і радіаційно-хімічних реакцій, що призводять до порушення структури і функціонального стану мембранних компонентів, багато в чому визначає радіаційну загибель клітини. Розуміння важливості ролі плазматичних мембран в ефектах радіаційної поразки призвело до того, що радіаційна мембранологія виділилася в самостійний розділ клітинної радіаційної біофізики. Дослідження, що спрямовані на одержання порівняних експериментальних даних і визначення фізичних механізмів впливу випромінювань на плазматичні мембрани, є базовими для розвитку радіаційної мембранології, отже актуальними.

Вивченню впливу радіації на мембранні компоненти присвячена велика кількість наукових праць. Як результат досліджень були виявлені основні закономірності впливу радіації на олігосахаридний шар, білкову і ліпідну фази мембран. Променеве пошкодження структури глікокаліксу виявляється в зміні поверхневого заряду клітин і порушенні взаємодії клітинних рецепторів з лігандами. В основі радіаційної модифікації білкового компоненту мембран лежить оксидація сульфгідрильних груп та ароматичних амінокислотних залишків, розрив водневих, дисульфідних і пептидних зв'язків, що призводять до істотних змін конформації та внутрішньомолекулярної рухливості білків. Радіаційне ушкодження ліпідної фази проявляється у зміні заряду, полярності, мікров’язкості ліпідного матриксу, порушенні структури та просторової організації ліпідних молекул. Важливим аспектом формування радіаційних мембранних ефектів є існування тісного взаємозв'язку і взаємозумовленості процесів, які індукуються опроміненням у різних компонентах мембрани. З цієї точки зору дуже важливим для радіаційної біофізики є порівняльний аналіз результатів, отриманих на простих модельних системах, біологічних мембранах і клітинах.

Уявлення про механізми радіаційного впливу на клітинні мембрани сформувалися, головним чином, на основі аналізу результатів вимірів, отриманих при опроміненні біологічних об’єктів рентгенівським та ?-випромінюванням. Суттєво менше вивчені закономірності впливу пучків заряджених частинок, зокрема, високоенергетичних електронів. Відзначимо, що в цій галузі досліджень основна увага приділялася біохімічним і біологічним аспектам впливу радіації, а питання, що торкаються специфіки первинних фізичних і хімічних процесів та механізмів, на цей час вивчені недостатньо. У цьому напрямку досліджень перспективним уявляється використання відносно простих біологічних систем та самого простого різновиду джерела випромінювання (моноенергетичні пучки електронів з малим розходженням), які дозволяють спланувати експеримент так, щоб значною мірою уникнути впливу репараційних явищ і взаємодії великої кількості різноманітних фізичних ефектів.

Аналогічні проблеми існують і в галузі досліджень впливу ультразвукового випромінювання на біологічні об'єкти. Зокрема, у більшості публікацій про вплив акустичних полів на біооб’єкти відсутні надійні дані, що дозволяють із певністю визначити первинні фізичні механізми спостережуваних біологічних ефектів. Крім того, дія акустичних і радіаційних полів у ряді випадків виявляється ідентичною до спостережуваних біологічних ефектів, тому дуже важливо дослідити можливий взаємозв'язок механізмів біологічної дії випромінювань різної фізичної природи.

Для визначення специфічних механізмів взаємодії випромінювання з мембранними структурами актуальною є розробка комплексної експериментальної методики, що містить достатньо повний набір методів вимірювання електрофізичних і структурно-функціональних властивостей біологічних мембран. У роботі наведені результати комплексного дослідження механізмів дії пучків високоенергетичних електронів та ультразвуку на клітини, мембрани клітин і модельні мембранні структури.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках досліджень кафедри експериментальної ядерної фізики Харківського державного університету за темами:

-

- “Дослідження фізико-хімічних механізмів впливу іонізуючого випромінювання на структуру та функціональні властивості модельних і природних мембран з метою розробки радіопротекторних засобів” (номер держреєстрації UA 01008653P)

- “Розробка фізико-хімічних методів екологічного контролю, радіаційного захисту та медичної діагностики дії іонізуючих випромінювань малої інтенсивності” (номер держреєстрації 0197U016499).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи є визначення фізичних механізмів модифікації біологічних мембран під впливом високоенергетичних електронів та акустичних полів.

Для досягнення цієї мети в роботі були поставлені та вирішені такі задачі:

- Розробити експериментальну методику та створити устаткування радіаційно-біологічних досліджень, що дозволяють одержувати набори порівняних даних шляхом вимірювання електрофізичних та структурно-функціональних параметрів біологічних мембран. Методика повинна використовувати модифікатори прямої та опосередкованої продуктами радіолізу середовища дії радіації для виділення внесків окремих механізмів у формування модифікацій мембранних структур під впливом випромінювань.

- Провести виміри й одержати дані про електрофоретичну рухливість еритроцитів та тимоцитів, проникність мембран для іонів калію та поверхневий заряд ізольованих мембран під впливом пучків високоенергетичних електронів та ультразвуку терапевтичної інтенсивності. На основі отриманих експериментальних даних провести теоретичний аналіз і деталізувати основні первинні механізми впливу зовнішніх фізичних полів на електрокінетичні та електрофізичні властивості мембранних структур.

- Провести комплексне вивчення індуктивно-резонансного перенесення енергії між флуоресцентними зондами при дії електронного випромінювання, а також аналіз тонкої структури спектрів флуоресценції та власної флуоресценції білків. Провести ідентифікацію основних первинних механізмів зміни фізико-хімічних і структурно-динамічних властивостей ліпідного компоненту і структурних білків мембран при опроміненні високоенергетичними електронами.

- Визначити радіорезистентність Ca2+- та Mg2+-АТФаз тіней еритроцитів у присутності різноманітних мембранотропних агентів, а також дослідити вплив пучків високоенергетичних електронів на ферментні системи клітинних органел. Встановити первинні механізми впливу випромінювання на ці біологічні об'єкти та характер зв'язку між механізмами впливу та параметрами білок-ліпідних та внутрішньомолекулярних взаємодій білкових глобул.

- Оцінити роль радіаційно-акустичного механізму впливу високоенергетичних електронів на біологічні об'єкти та середовища, визначити ситуації, в яких цей механізм може бути вагомим у радіобіологічному ефекті для біологічних мембран.

Наукова новизна одержаних результатів.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження дозволили одержати нову інформацію про закономірності впливу пучків електронів та ультразвуку на фізико-хімічні та структурно-функціональні властивості клітинних мембран, необхідну, зокрема, для розвитку прикладних напрямків у біофізиці та ефективній розробці нових медико-біологічних технологій. Результати комплексних вимірів характеристик біологічних об'єктів стали основою для розробки і створення ряду нових методів, приладів і речовин, що мають практичне використання, а саме:

-

- розроблені технології отримання нових композиційних матеріалів з органічною основою;

-

- розроблено та створено кілька нових діагностичних приладів для медицини.

Доведена за одержаними результатами можливість підвищення радіорезистентності мембранних систем шляхом модифікації їхнього структурного стану та фізико-хімічних властивостей, що важливо при розробці нових радіопротекторних препаратів. Крім того, отримані дані про високу радіочутливість деяких компонентів мембранних структур можуть бути використані для розробки нових методів експрес-діагностики радіаційних пошкоджень живих організмів.

Особистий внесок здобувача. У дисертації узагальнені матеріали досліджень, що є результатом багаторічної самостійної роботи автора, або отримані при його особистій участі. З опублікованих робіт із співавторами використані лише ті матеріали, у які він вніс найбільш вагомий внесок.

У дисертації представлені результати досліджень, виконаних автором самостійно [14,15,17,18,20], а також під його науковим керівництвом [1-13,16,19], де здобувачу належить вибір проблематики та мети досліджень, постановка експериментальних і теоретичних задач, вибір оптимальних експериментальних методів. Йому належить значна роль у проведенні експериментів та обробці отриманих результатів. Автору належить основна роль в аналізі та інтерпретації експериментальних даних, у розробці конкретних фізичних моделей. У роботах [21,22,23] автором зроблені пропозиції по практичному використанню результатів проведених ним наукових досліджень. Він безпосередньо брав участь у розробці і створенні приладу для фізико-хімічного очищення води [22], в тестуванні нової радіопротекторної речовини [23], у розробці ультразвукового медичного перетворювача [21].

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень, які ввійшли в дисертаційну роботу, були представлені та обговорені на: Українській конференції по фундаментальним проблемам біології та медицини (Харків, 1987), Всесоюзному симпозіумі “Використання ультразвуку у промисловості та медицині”, Всесоюзній конференції по новим напрямкам у біотехнології (Пущино, 1988), VI конференції по спектроскопії біополімерів (Харків, 1988), Всесоюзній конференції по використанню ультразвуку в сільському господарстві (Москва, 1988), Всесоюзній нараді по новим методам та приладам у біології і медицині (Москва, 1989), I Всесоюзному радіобіологічному з'їзді (Пущино, 1989), International Symposium on Mechanisms of Acoustical Bioeffects (Pushchino, 1990), Радіобіологічному з'їзді (Київ, 1993), VIII Нараді по застосуванню прискорювачів заряджених часток у промисловості та медицині (Санкт-Петербург, 1995), II з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), II з'їзді біофізиків Росії (Москва, 1999), Семінарі Харківського відділення біофізичного товариства України (Харків, 1999).

Публікації. Результати роботи опубліковані в 44 наукових працях, у тому числі в 20 статтях, з них 5 без співавторів, в 3 авторських посвідченнях і патентах на винаходи та в 21 тезах доповідей національних і міжнародних конференцій, симпозіумів, з'їздів.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, восьми розділів та висновків. Повний обсяг дисертації складає 299 сторінок, 59 ілюстрацій, з них 4 ілюстрації займають повні сторінки, 28 таблиць, з них 2 таблиці займають повні сторінки, 41 сторінку займає список використаних бібліографічних джерел (428 найменувань).

Основний зміст роботи

У вступі визначене коло найбільш важливих проблем радіаційної мембранології та обгрунтовані необхідність і актуальність виконаних досліджень. Сформульовано мету дисертаційної роботи, поставлені задачі, рішення яких забезпечує досягнення мети.

У розділі 1 на основі наявних літературних даних проведено детальний аналіз сучасного стану проблем, пов'язаних із біофізикою акустичних ефектів, особливостями дії радіації на мембранні компоненти й активність мембранозв’язаних ферментів. Біологічна ефективність випромінювання в значній мірі залежить від локальної щільності поглиненої енергії, тому необхідне детальне дослідження динаміки передачі енергії від частинок первинного випромінювання до біологічного середовища. У зв'язку з можливою радіаційно-акустичною дією пучків електронів актуально порівняння характеру залежності спостережуваних ефектів від дози опромінення під впливом полів різноманітної природи та виявлення граничних значень біологічної дії як за дозою, так і за абсолютним значенням акустичного тиску.

Відзначено, що запропоновані до цього часу моделі радіаційно-індукованого механізму структурних перебудов мембран відбивають у більшій мірі біохімічну сторону процесів, що протікають. За рамками розгляду залишається аналіз причин зміни спостережуваних фізичних величин та побудова коректних моделей для самоузгоджуваного опису сукупності спостережуваних ефектів. Важливим фактором необхідності детального дослідження пошкодження біологічних мембран пучками електронів є також виявлена до теперішнього часу неоднозначна залежність спостережуваних змін фізичних величин та ефектів впливу радіації від умов та виду опромінення.

У розділі 2 описана комплексна експериментальна методика з використанням лінійного прискорювача електронів ЛПЕ-8-5А, яка застосована для проведення радіаційно-біологічних та акустичних досліджень та отримання коректних і порівняних наборів даних про біофізичні механізми модифікації біологічних мембран під впливом випромінювань. Особливостями методики є комп'ютерна технологія планування режиму опромінення і стикування на апаратно-програмному рівні систем керування прискорювачем електронів і джерела ультразвукових коливань із контрольно-вимірювальним комплексом дозиметричного та метрологічного забезпечення проведення дослідів. Вимірювання фізико-хімічних параметрів мембранних структур проведено з використанням комплексу устаткування і методів, серед яких створені прилади для вимірювання провідності бішарових ліпідних мембран (БЛМ), електрофоретичної рухливості (ЕФР) клітин та концентрації К+ у суспензії еритроцитів. Розвинені та відпрацьовані методики вимірювання власної флуоресценції мембранних білків, флуоресцентних зондів та ін..

У розділі 3 представлені дані про зміну ЕФР еритроцитів і тимоцитів під впливом високоенергетичних електронів та ультразвуку терапевтичної інтенсивності. Показано, що вплив випромінювання призводить до зниження ЕФР клітин. Ступінь проявлення ефекту змінюється в присутності модифікаторів - перехоплювачів продуктів радіолізу води (тіомочевини, триптофану, іонолу), SH-активних сполук (цистаміну, дітіотреітолу, ПХМБ), зшиваючих агентів (глутарового альдегіду) та сполук, що модифікують ліпідну фазу мембран (іонів Са2+, хлорпромазину, тритону X-100).

Важливим фактором, що визначає зміну електрокінетичних властивостей клітин під впливом пучка електронів, є пошкодження структури білкової фази мембран, зумовлене оксидацією сульфгідрильних груп та порушенням білок-ліпідних взаємодій. Зміна електрокінетичних властивостей в значній мірі визначається взаємодією вільних радикалів, що утворюються при радіолізі води, з мембранними компонентами, внаслідок якого зменшується мікров’язкість білок-ліпідної компоненти мембран, що впливає на рухливість білкових молекул і приєднаних до них вуглеводних залишків.

Зменшення ЕФР пов'язується з просторовим перерозподілом заряду у примембранних шарах (рис.1) та обумовлено як прямою дією на нього радіації, так і зміною фізичних властивостей білок-ліпідного комплексу мембран. Запропоновано модель перерозподілу об'ємного заряду мембран при опроміненні і показано, що зміна електрокінетичних властивостей клітин може бути пояснена

Рис.1.

зменшенням об'ємної щільності негативних фіксованих зарядів олігосахаридного шару.

В рамках розглянутої моделі використано самоузгоджене рішення одномірного рівняння Пуассона

з граничними умовами

, ,

що враховує як поверхневий заряд мембрани , так і об'ємний фіксований заряд олігосахаридного шару

.

Рішення має вигляд

, (1)

де - товщина олігосахаридного шару, - дебаєвський параметр екранування, - діелектрична проникність, - постійна Больцмана, - температура, - потенціал, що визначає зв'язування глікопротеїнової молекули з поверхнею мембрани, і - середня щільність зарядженої групи типу в приповерхневому шару мембрани.

В наближенні постійної в межах товщини глікокаліксу просторової щільності заряджених груп для потенціалу з (1) отримуємо

, (2)

де - частина повного поверхневого заряду клітини, обумовлена фіксованими зарядами глікопротеїнового шару. З урахуванням характерних розмірів товщини глікокаліксу та величини дебаєвського радіусу екранування з формули (2) маємо, що відносний внесок фіксованих зарядів приповерхневого шару є визначальним для потенціалу в примембранній області. Зменшення величини призводить, як бачимо з (2) і показано на рис.1, до зменшення електрокінетичного потенціалу в площині ковзання навіть при зберіганні величини повного заряду . Зміна щільності негативного заряду безпосередньо на поверхні білок-ліпідного матриксу при опроміненні залежить від характеру перерозподілу об'ємного заряду глікокаліксу і може зростати при зменшенні останнього.

В рамках теорії мішені отримана аналітична оцінка величини радіочутливого об’єму за кривою “виживання” ЕФР, яка для еритроцитів наведена на рис.2 у логарифмічному масштабі.

Для обробки даних і розрахунку величини радіочутливого об’єму

Рис.2.

була використана загальна формула

, (3)

де - доза опромінення, - відносна густина речовини об'єкту, - об’єм мішені, - кількість чутливих областей, U - електрофоретична рухливість.

З урахуванням аддитивності поверхневої щільності заряду в (2) можна вважати, що залишкова ЕФР обумовлена здебільшого поверхневим зарядом , а змінна складова пов'язана в основному зі зміною об'ємного заряду та зумовленою ним величиною . Відповідно до цього постійні величини і визначають зв’язок між величиною U та параметром виживання , прийнятим у теорії мішені:

.

Велика порівняльно з характерними розмірами треку частинок величина розрахованого таким чином радіочутливого об’єму мішені  5,5·10_ мкм3 підтверджує важливість внеску вільних радикалів, що утворюються при радіолізі води, які впливають на структурний стан та об'ємний розподіл заряду в приповерхневих шарах мембрани. Як відомо, продукти радіолізу води локалізовані уздовж треку електрона в невеличких обсягах-шпорах, що знаходяться на відстані ~ 500 нм один від одного. У такого роду шпорах з діаметром  нм утворюється 10-12 гідратованих електронів та первинних радикалів - продуктів радіолізу води, на утворення кожного з котрих витрачається енергія ~ 10 еВ. При народженні декількох вторинних та третинних електронів це означає збільшення практично на два порядки кількості безпосередньо діючих на заряд мембрани радикалів, на кожний з яких припадає, вочевидь, відносно невеликий об’єм локальної дії.

У розділі 4 досліджено вплив високоенергетичних електронів і ультразвуку на мембрани еритроцитів (рис.3) та виявлено збільшення виходу калію з клітин. Аналіз кінетики виходу калію показує, що при малих відрізках часу пострадіаційної інкубації внеском у збільшення потоку іонів калію

(4)

Рис.3.

можливої зміни мембранної різниці потенціалів можна знехтувати. Тут - товщина мембрани, розглянутої як безперервний шар, - рухливість іонів калію, - валентність іонів калію.

У порушенні проникності еритроцитарних мембран для іонів калію важливу роль відіграють пошкодження білкового компоненту мембран продуктами радіолізу води - гідроксильними радикалами та гідратованими електронами. Збільшення проникності мембран обумовлено, зокрема, ушкодженням SH-груп мембранних білків і, як наслідок, зміною білок-ліпідних та внутрішньомолекулярних взаємодій білкової глобули.

Характер залежності виходу іонів К+ від температури підтверджує, що у формуванні реакції еритроцитів на вплив радіації важливу роль відіграють фізичні властивості ліпідного бішару. Виявлено збільшення радіорезистентності систем пасивного транспорту іонів K+ при підвищенні текучості ліпідної фази. Збільшення ж в’язкості мембран при 4°С призводить до більшого відносного виходу іонів калію і, таким чином, до зниження стійкості еритроцитів до дії опромінення.

У рамках запропонованої моделі та на підставі даних, отриманих при ультразвуковому опроміненні БЛМ (рис.4), показано, що додатковим фактором підвищення проникності є зміна дифузійного режиму в примембранних шарах електроліту. Як бачимо з рис.4, частота відкриття іонних каналів, утворених дімерами граміцидіну, достатньо добре описується лінійною функціональною залежністю від часу

,

де - міжфазовий коефіцієнт розподілу граміцидіну і D - коефіцієнт дифузії. Для досліджених клітинних структур наявність достатньо великих неперемішуваних шарів Нернста пов'язана не тільки із структурованістю води поблизу поверхні мембрани, але й з морфологією мембран, а саме, наявністю глікокаліксу. Тому ефективна товщина цих шарів за порядком величини збігається з характерною товщиною олігосахаридного шару .

У розділі 5 проведено аналіз радіорезистентності Ca2+- та Mg2+-АТФаз тіней еритроцитів при великих дозах опромінення високоенергетичними електронами і показано, що активність АТФаз інгібується, причому Mg2+-АТФаза відрізняється більшою радіорезистентністю. Виявлено, що неіоногенний детергент тритон Х-100 сенсибілізує обидва ферменти до дії

Рис.4

радіації, у той час як глутаровий альдегід, що структурує білкову компоненту, зменшує радіаційний ефект для Ca2+-АТФази.

При низьких концентраціях мембранного білка в опроміненій суспензії активність кальцієвої АТФази інгібується переважно продуктами радіолізу води, основним діючим агентом серед яких є радикали Н* . Зі збільшенням концентрації мембранного білка починає переважати пряма дія радіації на фермент.

Дія радіації на досліджувані АТФази переважно реалізується через зміну молекулярних білок-ліпідних і внутрішньомолекулярних взаємодій білкової глобули, характер яких, зокрема, визначається збільшенням під дією радіації частки окислених SH-груп. У результаті підвищується структурна жорсткість білкових молекул і знижується внутрішньомолекулярна рухливість.

Встановлено, що ферменти органел (ДХФІФ- і ферріцианідредуктази мікросомальних мембран) мають меншу чутливість до дії пучків електронів у порівнянні з Ca2+-АТФазою тіней еритроцитів (рис.5). Мембранотропні агенти сенсибілізують обидва ферменти до опромінення швидкими

Рис.5.

електронами, причому радіорезистентність ферріцианідредуктази в присутності агентів виявляється істотно нижче. Механізм впливу високоенергетичних електронів на ферментативну активність оксидоредуктаз реалізується, головним чином, через зміну фізичних властивостей ліпідної фази внутрішньоклітинних мембран.

У розділі 6 наведені результати дослідження закономірностей впливу пучка високоенергетичних електронів на структурний стан та електрофізичні характеристики мембран еритроцитів і тимоцитів базуючись на даних, отриманих із використанням флуоресцентних зондів АНС і ДСМ. Виявлене зниження флуоресценції АНС (рис.6) і посилення інтенсивності свічіння ДСМ у суспензії опромінених тіней еритроцитів (рис.7) пояснюється збільшенням щільності поверхневого негативного заряду ізольованих еритроцитарних мембран під впливом радіації.

Відзначається, що висновок про збільшення щільності негативного заряду та потенціалу безпосередньо на поверхні мембрани

(5)

не суперечить виявленому зменшенню просторової щільності фіксованого негативного заряду в примембранному олігосахаридному шарі і, відповідно, потенціалу в площині ковзання. Відповідно до (2) електрокінетичний

Рис.6.

Рис. 7

потенціал, що реєструється методом ЕФР, відбиває перерозподіл заряджених груп поблизу площини ковзання, що знаходяться на відстанях ~ 30 нм від ліпідного матриксу мембрани, і мало впливає на потенціал (5) безпосередньої поверхні мембрани. Сильно екранований заряд поверхні мембрани також не виявляє істотного впливу на електрокінетичний потенціал.

Встановлено, що одним із головних факторів, що визначають радіаційно-індуковану зміну заряду тіней еритроцитів під впливом високоенергетичних електронів, є розвиток процесів ПОЛ. Показано, що для зонда АНС (ДСМ) збільшення негативного поверхневого заряду призводить до зменшення (збільшення) кількості центрів зв'язування і зменшенню (збільшенню) константи асоціації

обумовленому відповідною зміною величини потенціалу.

У розділі 7 наведені результати досліджень флуоресценції пірену та показано зниження інтенсивності флуоресценції під впливом опромінення електронами. Характер гасіння флуоресценції пірену полярним гасником - іонами йоду не змінюється при опроміненні, тому зниження інтенсивності пояснюється зниженням квантового виходу флуоресценції зонду.

Проведено аналіз тонкої структури спектрів флуоресценції пірену (рис.8) та ступеню його ексимеризації при дії високоенергетичних електронів. Показано, що зменшення квантового виходу зонду

пов'язане, у свою чергу, не зі зміною полярності мікрооточення зонду, а з радіаційним порушенням фізичних властивостей ліпідної фази мембран. Про це свідчить зростання ступеню ексимеризації пірену в опромінених мембранах, що вказує на збільшення текучості в області вуглеводних ланцюгів ліпідних молекул. Висновок про зниження мікров’язкості гідрофобної зони ліпідної фази мембран під дією опромінення підтверджується також порівняльним аналізом параметрів флуоресценції пірену в суспензії тіней еритроцитів та модельних мембран.

Зміна фізичних властивостей та структурного стану мембран еритроцитів під впливом пучка електронів виявляється також у підвищенні ефективності перенесення енергії між флуоресцентними зондами АНС і ДСП-12. Розглянуті фізичні моделі сінглет-сінглетного переносу енергії вказують на збільшення рухливості молекул ДСП-12 в області неполярної зони ліпідного шару, що призводить до збільшення коефіцієнту доступності і зменшенню

Рис.8

відстані , на якій молекули акцептора проводять більшу частину часу поблизу донора.

Дійсно, у загальному випадку вираз для стаціонарної флуоресценції донора при його гасінні акцептором може бути записаний у вигляді:

(6)

де , - інтенсивності флуоресценції донора у відсутності та в присутності акцептора, відповідно; - час гасіння флуоресценції донора у відсутність акцептора. Інтегральна величина

(7)

визначається характером процесу перенесення енергії, зокрема, його мультіплетністю, умовами перенесення, розподілом у просторі молекул акцептора , а також часткою доступної для акцепторів частини об’єму, що примикає до донора. Молекула ДСП-12, що містить вуглеводний ланцюжок, локалізується ближче до неполярної зони ліпідного бішару та знаходиться, таким чином, на цілком визначеній відстані від найближчого донора. В рамках найбільш простого підходу такому взаємному розташуванню молекул АНС і ДСП-12 відповідає уявлення просторового розподілу молекул акцептора у вигляді

, (8)

де - -функція Дірака, - середня кількість молекул акцептора, що припадає на одного донора. У виразі (8) ураховано, що молекули ДСП-12 можуть займати півпростір навколо молекул донора АНС, тому коефіцієнт доступності в даному випадку приблизно дорівнює 0,5.

У цьому випадку відношення інтенсивностей флуоресценції зонда-донора в присутності та у відсутності акцептора може бути подане у вигляді

, (9)

де - така відстань між донором і акцептором, при якій можливість гасіння дорівнює 0,5.

Вираз (9) є безпосереднім узагальненням відомої формули, що описує систему “1 донор - 1 акцептор”, у випадку довільного числа акцепторів .

У рамках фізичної моделі, яка більш коректно враховує структуру мембрани, відношення інтенсивностей описується виразом

,

в якому величина безпосередньо залежить від коефіцієнту доступності та геометрії мембрани

, (10)

у той час як постійна визначається обертальною рухливістю, взаємною орієнтацією молекул та іншими фізичними параметрами, що характеризують процес перенесення енергії ( концентрація пов'язаного з мембраною акцептора). Відповідно до (10) результати експериментів свідчать про можливе зменшення площі поверхні мембран після опромінення, особливо при великих відрізках часу після опромінення, коли розвиваються процеси ПОЛ.

Встановлено, що індуковане опроміненням зниження білкової флуоресценції, показане на рис.9, суттєво зменшується при зменшенні радіаційно-хімічного виходу вільнорадикальних реакцій. Зміна внутрішньомолекулярних взаємодій та конформаційного стану білків, що

Рис. 9.

виявляється в зниженні флуоресценції, пов'язана з оксидацією SH-груп білкових молекул гідроксильними радикалами.

Виявлено зменшення ефективної константи гасіння триптофанової флуоресценції білків зовнішніми гасниками в ранні строки після опромінення та зміну характеру пошкоджень білкових молекул у процесі пострадіаційної інкубації. Зменшення швидкості дифузії гасників та ефективності гасіння пов'язано, очевидно, з підвищенням структурної жорсткості та обмеженням внутрішньомолекулярної рухливості мембранних білків еритроцитів та тимоцитів.

У розділі 8 теоретично досліджене збудження ультразвукових коливань при опроміненні біологічних об'єктів імпульсним пучком релятивістських електронів. Показано, що біологічна дія пучка швидких електронів може реалізуватися через ультра- та гіперзвукові коливання, що генеруються в процесі імпульсного опромінення речовини. При радіаційно-акустичному ефекті імпульсний електронний пучок виявляє дію на структури біологічного об'єкту, які не охоплені іонізацією безпосередньо. Ефективність трансформації енергії, що відбувається в мікроопіку, в енергію термоакустичного імпульсу досягає декількох відсотків для опіків від повторних електронів з енергією 50 – 500 еВ.

Характерною рисою збуджуваного імпульсу є його широкополосність та просторова локалізованість. Для оцінки величини виникаючих у зоні опромінення акустичних напруг можна використати вираз

, (11)

де - параметр Грюнайзена, який у загальному випадку залежить від температури речовини біооб’єкта, R - ефективний радіус пучка електронів, f - частота проходження імпульсів, - середній ток пучка, = 1,89 МеВ/см - іонізаційні втрати енергії електронів, s - швидкість звуку та - тривалість імпульса прискорювача. Наявна у виразі (11) величина b являє собою деяке порогове значення акустичної напруги, що призводить до суттєвих змін у біологічному об’єкті, тому нерівність у правій частині (11) є умовою радіаційно-акустичної дії на біооб’єкт з боку середнього акустичного поля.

Оцінка акустичних напруг, збуджуваних пучком у проведених

дослідженнях, та їхнє порівняння з відомими даними про граничні значення показує, що при використаних параметрах пучка дією на біологічні об'єкти усередненого акустичного поля мегагерцового діапазону можна знехтувати.

Вперше теоретично вивчена локальна радіаційно-акустична дія швидких електронів на біологічні об'єкти та середовища. Показано, що утворення малих перегрітих областей поблизу місць зупинення вторинних електронів при проходженні іонізуючого випромінювання через біологічні середовища призводить до генерації мікросферичних термоакустичних імпульсів, що мають, як показано на рис.10, початкову величину амплітуди акустичного тиску до декількох кілобар та початкову тривалість в декілька пікосекунд.

Рис. 10

Для оцінки розмірів мікроопіків і породжуваних ними акустичних імпульсів використане відоме інтегральне рішення Кірхгофа хвилевого рівняння

, (12)

де - потенціал зміщень, - локальна щільність поглиненої дози, - щільність середовища, - координати точки спостереження. Вважаючи, що щільність теплових джерел факторизується та задається гаусовим розподілом як у просторі, так і в часі, з (12) одержуємо такий вираз для величини акустичних тисків:

, (13)

де величина E визначає повну теплову енергію зони генерації, D - ефективний поперечник зони генерації і - ефективний час нагрівання. Пружна хвиля (13) має вигляд біполярного антисиметричного імпульсу, як це показано на рис.11.

Рис. 11.

Виникаючі мікроімпульси тиску можуть суттєво впливати на характеристики субклітинних структур у деякій сферичній зоні з центром у мікроопіці. Об’єм такої зони біологічної дії радіаційно-акустичного механізму визначається величиною збудженого у мікроопіці імпульсу тиску, законом його просторового спадання та граничного тиску інактивації. Урахування впливу поглинання акустичних хвиль показує, що для широкополосного акустичного сигналу (13) затухання має не експоненціальний, а степневий характер, внаслідок чого об’єм зони біологічної дії навколо мікроопіку може бути на порядок більше об’єму самого опіку. Відповідно, лінійні розміри області локальної динамічної дії порівняні з характерними розмірами мембранних структур і залежать від температури речовини біологічного об'єкту. У результаті цього зміна останньої може істотно впливати на швидкість інактивації при опроміненні. Відзначені особливості локального радіаційно-акустичного ефекту вторинних електронів дозволяють розглядати його як один із факторів біологічної дії високоенергетичних електронів.

Основні результати та висновки роботи

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Проведені дослідження й отримані результати відносяться до тієї області радіаційної біофізики, яка на сьогоднішній день продовжує залишатися найменш вивченою.Отримана нова інформація про закономірності впливу пучка електронів та ультразвуку на фізико-хімічні властивості клітинних мембран важлива для більш глибокого розуміння первинних механізмів взаємодії випромінювань із мембранними структурами. Водночас, значення поданих результатів не вичерпується тільки науковою цінністю, оскільки виявлені закономірності і тенденції разом із відомими даними про вплив інших видів випромінювань можуть суттєво сприяти ефективній розробці нових медико-технічних і медико-біологічних технологій.

Основні результати дисертації опубліковані в наступних роботах:

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.