НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

--------------------------------------------------------------------

Волгін Денис Вікторович

УДК 612.2:612.821:616.24

ДОСЛІДЖЕННЯ МЕДУЛЯРНИХ МЕХАНІЗМІВ УЧАСТІ ОКСИДУ АЗОТУ ТА

РЕЦЕПТОРІВ N-МЕТИЛ-D-АСПАРТАТУ В РЕГУЛЯЦІЇ ДИХАЛЬНОГО

РИТМОГЕНЕЗУ У НОВОНАРОДЖЕНИХ ЩУРЯТ

03.00.13 - Фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Киев - 1999

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі по вивченню гіпоксичних станів

інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

СЕРЕДЕНКО Михайло Михайлович

інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук ШАПОВАЛ Людмила Миколаївна

інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

провідний науковий співробітник відділу

фізіології кровообігу

доктор медичних наук СОЛОВЙОВ Анатолій іванович

інститут фармакології та токсикології АМН України

головний науковий співробітник відділу

експериментальної терапії

Провідна установа: кафедра фізіології людини та тварин Київського

університету імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться "_27_" "_квітня_ " 1999 р. о "_14__" годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при інституті

фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 252024

Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця

Автореферат розісланий "24" "_лютого" 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Необхідність дослідження центральної регуляції дихального ритмогенезу у новонароджених ссавців пов'язана понад усе з тим, що в структурі причин смертності дітей в ранньому неонатальному периоді дихальні розлади займають провідне місце. Крім того, в акушерській та неонатологічній практиці використовуються фармакологічні препарати, які можуть бути донорами оксиду азоту (NO) і блокаторами рецепторів N-метил-D-аспартату (NMDA) (Маркова, Шабалов, 1993). Відомо, що NO у нервовій системі виконує функцію ретроградного месенджера, модулятора як збуджуючої, так і гальмівної синаптичної передачі (Dawson & Snyder, 1994; Wu & Dun, 1996), показано його спроможність до блокування потенціалзалежних кальцієвих каналів нейронів (Соловйова, Костюк, 1998). Можливим шляхом стимуляції активності ферменту, що від-повідає за біосинтез NO (NO-синтази), є збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію внаслідок активації NMDA-рецепторів (Dawson & Snyder, 1994). На теперішній час у літературі відсутні дані про центральний вплив NO на дихальний ритм у новонароджених тварин, як у нормі, так і за умов гіпоксії. Одним із загальновизнаних методів локалізації нейронів, які містять NO-синтазу, є гістохімічна ідентифікація маркерного ферменту нікотинамід аденін динуклеотид фосфат (NADPH)-діафорази (Dawson et al., 1991; Vincent & Kimura, 1992). NADPH-діафоразореактивні та NO-синтазоімунореактивні нейрони локалізовані у дорослих тварин у медулярних структурах, причетних до генерації дихального ритму (Vincent & Kimura, 1992; Dun et al.,1994). Аналогічні роботи, які були б проведені на новонароджених тваринах, невідомі. Роль NMDA-рецепторів у регуляції дихального ритму у новонароджених тварин на медулярному рівні залишається не остаточно з'ясованою. В ек-спериментах на зрізах довгастого мозку новонароджених щурят отримані дані про те, що NMDA-рецептори не беруть участі в дихальному ритмогенезі (Funk et al., 1993). Необхідно підкреслити, що ці дослідження проводилися в розчині з підвищеною втричі концентрацією іонів калію,що може призводити до потенціал- або кальційзалежної десенситизації NMDA-рецепторів (McBain & Mayer, 1994). Разом з тим відомо, що аплікація екзогенного NMDA призводить до стимуляції дихального ритму, який генерується медулоспінальними препаратами новонароджених щурят (Greer et al., 1991; Kashiwagi et al., 1993). Протиріччя існуючих даних свідчать про необхідність продовження досліджень у даному напрямку. Відомо, що за гіпоксичних умов відбувається збільшення вивільнення глутамату, що може призводити до активації NMDA-рецепторів (Mitiani at al., 1991; Johnston, 1997). Участь NMDA-рецепторів у центральній регуляції дихального ритму у новонароджених при гіпоксії при цьому не знайшло достатнього відображення в літературних джерелах. Визнано, що відхилення концентрації іонів водню для медулярної хемочутливості дихання є більш сильним подразником, ніж відхилення газового складу (Кельмансон, 1997). За поглядом ряду дослідників (Cohen, 1979; Arita et al., 1988), центральні хеморецептори вентральної поверхні довгастого мозку надають збуджуючого тонічного впливу на інспіраторні нейрони ритмогенеруючої мережі. Припускається, що NMDA-рецептори можуть брати участь у збуджучій синаптичній передачі на шляхах, які відповідають за модуляцію збудливості ритмогенеруючих ней-ронів (Funk et al., 1993). Але значення рецепторів даного типу та ендогенного оксиду азоту в медулярній хемочутливості дихання не вивчено.

Мета дослідження полягала у визначенні ролі NO та NMDA-рецепторів збуджуючих амінокислот у регуляції дихального ритму новонароджених щурят на медулярному рівні.

Головні задачі:

1. Дослідити NADPH-діафоразну реактивність нейронів медулярних структур, причетних до дихального ритмогенезу, у новонароджених щурят.

2. Вивчити вплив NO та блокування NMDA-рецепторів на електричну активність у діафрагмальному нерві частково изольованих медулоспінальных препаратів новонароджених щурят (ЧІМСП).

3. Визначити роль NO у зміні електричної активності у діафрагмальному нерві ЧІМСП під час впливу NMDA.

4. Дослідити вплив NO та блокування NMDA-рецепторів на електричну активність у діафрагмальному нерві ЧіМСП при гіпоксії та при зниженні рН зовнішньоклітинної рідини.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено розподілення нейронів, які містять NADPH-діафоразу (в якості маркеру NO-синтази), та їх середню щільність в ядрах вентральної і дорсальної респіраторних груп нейронів (ВРГ и ДРГ) довгастого мозку новонароджених щурят. Показано присутність мічених клітин в ядрах ВРГ та ДРГ, їх популяцію з найбільшою щільністю виявлено в ростральній частині ВРГ – в області латерального парагігантоклітинного ретикулярного ядра. Вперше продемонстровано участь NO в регуляції дихального ритму, який генеруїться ЧіМСП новонароджених щурят, досліджено деякі механізми цієї участі. Вперше показано роль ендогенного NО в тонічному тормозному контролі дихального ритму, який здійснюється ростральною частиною вентролатерального відділу довгастого мозку (ВЛВДМ) новонароджених щу

рят, у нормі і за умов гіпоксичного тесту. Підтверджено участь ендогенного NO в опосередкуванні впливу активації NMDA-рецепторів на дихальний ритм ЧІМСП. Вперше досліджено роль ендогенного NO в медулярній хемочутливості дихання; показано, що цей нейромодулятор опосередковує активацію дихального ритму ЧІМСП при зниженні рН суперфузуючого розчину. Вперше досліджено вплив екзогенних донорів NO на дихальний ритм ЧІМСП. Показано збільшення тривалості, амплітуди та інтегральної інтенсивності інспіраторних розрядів (ІР) з одночасним зменшенням їх частоти при аплікації донорів NO. Продемонстровано спроможність нітропрусиду натрію до блокування NMDA-рецепторів, що беруть участь в регуляції дихального ритму ЧІМСП. За умов гіпоксичного тесту попередня аплікація нітропрусиду натрію призводила до більш вираженого збільшення інтегральної інтенсивності ІР і меншого відносного пригнічення їх частоти, що є підтвердженням результатів експериментів інших дослідників, проведених in vivo на дорослих тваринах. У цей же час аплікація нітропрусиду натрію при наступному впливі розчину зі зниженим рН зменшувала стимуляцію частоти дихального ритму ЧІМСП. Одержані результати розширюють існуючі уявлення про участь NMDA-рецепторів у регуляції дихального ритму на медулярному рівні у новонароджених тварин. Вперше показано збільшення тривалості ІР у діафрагмальному нерві ЧІМСП при аплікації кетаміну, що може свідчити про участь NMDA-рецепторів у переключенні вдиху на видих на медулярному рівні у новонароджених щурят. Цей механізм забезпечується структурами ростральної частини ВЛВДМ. Вперше показано участь NMDA-рецепторів у фазі короткочасної стимуляції дихального ритму ЧІМСП за умов гіпоксичного тесту, а також у більш тривалому процесі активації частоти дихального ритму при зниженні зовнішньоклітинного рН.

Теоретичне та практичне значення роботи. Результати дослідження мають певну теоретичну цінність, оскільки дозволяють сформувати нові уявлення про медулярні механізми участі NO і NMDA-рецепторів у регуляції дихального ритму у новонароджених тварин в нормі, а також при гіпоксії та зниженні зовнішньоклітинного рН, які відбуваються під час багатьох патологічних станів, у тому числі і дихальних розладів. Практичне значення роботи полягає у демонстрації можливості змінювати параметри медулярного дихального ритму новонароджених тварин шляхом фармакологічного впливу на механізми його регуляції за участю NO та NMDA-рецепторів.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто виконано всю експериментальну частину, проведено аналіз та узагальнення її результатів у зв'язку з даними літератури. Здобувач брав активну участь в обговоренні результатів експериментів. Вперше здобувачем продемонстровано існування у новонароджених щурят морфологічного базису участі NO в регуляції дихального ритму, отримано дані про вірогідний вплив ендогенного NO та екзогенних його донорів, а також блокування NMDA-рецепторів на інтегральну електричну активність медулярного дихального генератору. Програмне забезпечення, що обслуговує електрофізіологічні експерименти, розроблене В.Б. Феніком та В.А. Марченком.

Апробація дисертації. Основні положення роботи доповідалися та обговорювалися на XV З'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), Міжнародній конференції "Hypoxia: Destructive and Constructive Effect" (Київ, 1998), Всеукраїнській науковій конференції"Проблеми вікової фізіології" (Луцьк, 1998), Міжнародній конференції "Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности" (Минск, 1998), I (установчій) конференції Українського товариства нейронаук (Київ,1998),засіданнях відділу по вивченню гіпоксичних станів інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (1997,1998), засіданні сектору фізіології вісцеральних систем інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (1998).

Публікації. За результатами роботи опубліковано чотири статті та тези п'яти доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 177 найменувань. Роботу викладено на 156 сторінках та ілюстровано 22 рисунками і 5 таблицями .

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи досліджень.

Гістохімічні дослідження проведені на 8 три-чотиридобових щурятах лінії Вістар. Виявлення NADPH-діафоразореактивних (NADPH-д) структур проводилося за допомогою модифікованого методу Вінсента і Кімури (Vincent & Kimura, 1992; Petrovicky & Nemcova, 1995) на фронтальних зрізах довгастого мозку та перших трьох сегментів спинного мозку. Під глибоким ефірним наркозом у тварин розкривали мозок, який після 10-15 хв суперфузії фіксатором (4-5% параформальдегіду на 0.1 М фосфатному буфері, pH 7.3) виділяли і протягом 2 год проводили постфіксацію при 4-50 С. Після 24 год експозиції в 15%-му розчині сахарози у кріостаті виготовляли зрізи 50 мкм завтовшки. Проводили гістохімічну реакцію у середовищі 0.1 М фосфатного буферу (pH 7.3), що містило 0.3% тритону Х-100, 0.5 мг/мл блакитнього тетразоліума, 1.0 мг/мл NADPH натрієвої солі та 1.2 мг/мл малату натрію (всі реактиви виробництва "Sigma," США), при 37o С протягом 40-60 хв. Дослідження зрізів та їх мікрофотографування здійснювали за допомогою світлового мікроскопу ("Carl Zeiss, Jena", Німеччина). Локалізацію NADPH-д-реактивних клітин на схемах фронтальних зрізів проводили за допомогою двохкоординатного графопобудівника, межі ядер контролювались за допомогою стереотаксичного атласу (Paxinos & Watson, 1986).

Електрофізіологічні дослідження. Для виготовлення ЧІМСП in situ (Suzue, 1984) було використано 167 три-чотиридобових щурят лінії Вістар. Під глибоким ефірним наркозом проводили дорсальну ламінектомию та білатеральний переріз дорсальних спинномозкових корінців. Далі розкривали вентральну поверхню стволу мозку, який перерізали за рівнем виходу корінців n. abducens. Відпрепаровували правий діафрагмальний нерв. Після проведення вентральної ламінектомії спинний мозок перерізали за рівнем С6-С7. У деяких експериментальних серіях проводили поперечні перерізи ВЛВДМ за ростральною межою корінців IX-X пар черепномозкових нервів - між хемочутливими зонами М і S. Згідно даним літератури (Марченко та ін., 1995), перерізи за цим рівнем призводять до стимуляції частоти ІР у діафрагмальному нерві ЧІМСП щурят перших днів життя. Електричну активність у діафрагмальному нерві (ІР) відводили біполярно, підсилювали (коефіцієнт підсилення 104-105 ), дискримінували та інтегрували за допомогою амплітудно-частотного інтегратору з постійною часу 30.0 мс. Інтегровані сигнали подавали на 12-розрядний аналого-цифровий перетворювач (АЦП), з'єднаний з персональним комп'ютером.

Для суперфузії використовували модифікований розчин Кребсу наступного складу (у мілімолях на 1 л ): NaCl - 124.0; KCl- 5.0; KH2РО4 1.2; CaCl2 - 2.4; MgSO4- 1.3; NaHCO3 - 26.0; глюкоза-30.0 (pH 7.4). У складі тестуючого розчину з рН 7.0 концентрацію NaCl було збільшено до 140, а NaHCO3 - зменшено до 10 мілімоль на 1 л, експозиція даного розчину складала 3 хв. Розчини насичували карбогеном (95% О2 + 5% СО2) протягом 10 хв при швидкості подачі газової суміші 1 л/хв. Гіпоксія моделювалася аплікацією протягом 3 хв суперфузуючого розчину, насиченого за тих же умов газовою сумішшю, що містила 95% N2 і 5% СО2. Швидкість суперфузії складала 4.0 мл/хв при 26.5 oС. Протягом експериментів проводилося вимірення рО2 і рН суперфузуючого розчину, а також мікропроб розчину, відібраних безпосередньо на вентральній поверхні довгастого мозку, за допомогою мікроаналізатору (pH/Blood Gas Analyzer, Type OP-215 "Radelkis", Угорщина). У середньому рО2 у розчині над мозком складало 431± 34 мм рт. ст. у контролі та 36± 9 мм рт.ст. за умов гіпоксичного тесту. Середні значення рН розчину складали 7.34±0.09 у контролі, 7.30±0.11 при гіпоксії та 7.01±0.06 для тестуючого розчину зі зниженим рН.

В роботі застосували: 1) конкурентний інгібітор NO-синтази метиловий ефір NG-нітро-L-аргініну (L-NAME) у концентраціях 1.0 та 10.0 мкМоль/л; 2) бичачий гемоглобін, агент, що зв'язує NO (Hb), у концентрації 0.30 мкМоль/л; 3) екзогенні донори NO нітропрусид натрію (SNP) і нітрогліцерин у концентраціях 1.0 та 10.0 мкМоль/л; 4) L-аргінін, субстрат біосинтезу NO, у концентраціях 1.0 та 10.0 мкМоль/л; 5) агоніст відповідного типу рецепторів NMDA у концентрації 5.0 мкМоль/л (всі реактиви виробництва "Sigma", США); 6)неконкурентний блокатор NMDA-рецепторів 2-(орто-хлорфеніл)-2-(метиламіно)-циклогексан (кетамін, "Gedeon Richter", Угорщина) у концентраціях 1.0, 10.0 та 100.0 мкМоль/л.

Тестуючі експозиції (гіпоксичного і ацидотичного розчинів, розчину, що містив NMDA) складали 3 хв. В окремих експериментальних серіяхїх проводили після 10 хв суперфузії розчином, що містив один із досліджуваних препаратів, або їх комбінацію. Реєстрацію ІР проводили протягом 9 хв (3 хв контролю, 3 хв - суперфузія тестуючим розчином і 3 хв - відмивання). Оцінювали середні показники тривалості ІР (Ті, мс), їх частоти (Fi, хв-1), амплітуди (А, умовні одиниці) та интегральної інтенсивності (І, умовні одиниці). Одна умовна одиниця відповідає частоті 5 Гц при амплитуді 5 мкВ інтегрованого сигналу за один цикл опросу каналу АЦП. Отримані результати обробляли статистично за допомогою t-критерію Ст'юдента ( Минцер и др., 1991).

Результати досліджень.

Дослідження NADPH-д-реактивності нейронів медулярних структур, причетних до генерації дихального ритму, у новонароджених щурят. Значну кількість NADPH-д-реактивних нейронів було знайдено на всіх рострокау дальних рівнях довгастого мозку. На ростральних рівнях найбільші популяції позитивних мультиполярних клітин середнього діаметру (15-25 мкм) були виявлені у розташованих вентрально ядрах ретикулярної формації. Найбільшу щільність мічених нейронів (у середньому 27.9±2.6 клітинна 0.1 мм2) виявили у латеральному парагігантоклітинному (LPGі), ростровентролатеральному ретикулярному (у середньому 14.2±2.1 клітин на 0.1 мм2) та гігантоклітинному ядрах (у середньому 12.67± 1.2 клітинна 0.1 мм2). На більш каудальних рівнях NADPH-д-реактивність нейронів спостерігали у вентральних областях парамедіанного ретикулярного ядра (у середньому 10.1± 1.3 клітин на 0.1 мм2) та вентральному медулярному ретикулярному ядрі (у середньому 4.3 ± 0.7 клітин на 0.1 мм2).Група мічених нейронів малого та середнього діаметру присутня також у проміжному ретикулярному ядрі та у ретрофаціальній області. У обоюдному ядрі на всіх його рострокаудальних рівнях присутні поодинокі позитивні клітини (у середньому 2.9±0.3 клітин на 0.1 мм2). Поодинокі мічені нейрони виявлено також на каудальних рівнях в області позаобоюдного ядра. Позитивні мультиполярні нейрони середнього диаметру спостерігали на всіх рострокаудальних рівнях в ядрі поодинокого тракту, найбільшу їх щільність (у середньому 6.2±0.4 клітин на 0.1 мм2) виявили у вентролатеральних його областях. Поодинокі мічені нейрони знайдені в ядрі під'язичного нерву та їх групи - в області дорсального моторного ядра блукаючого нерву. Таким чином, у щурят перших днів життя NADPH-д-реактивні нейрони існують в усіх ядрах ДРГ та ВРГ, що може складати морфологічну основу участі NO в центральній регуляції дихального ритмогенезу у новонароджених щурят.

Вплив NO та блокування NMDA-рецепторів на електричну активність у діафрагмальному нерві ЧіМСП. Аплікація 10.0 мкМоль L-NAME призвела до вірогідного збільшення частоти (на 23.4%) зі зменьшенням тривалості (на 12.7%), амплітуди (на 14.0%) та інтегральної інтенсивності ІР (на 11.1%). Зміни аналогічної спрямованості спостерігали при аплікації гемоглобіну (табл. 1). Після відокремлення ростральної частини ВЛВДМ частота ІР при аплікації 10.0 мкМоль L-NAME зменшувалася на 29.4% (табл. 1). Аплікація 10.0 мкМоль L-аргініну викликала протилежні змінипараметрів ІР: їх тривалість, амплітуда та інтегральна інтенсивність вірогідно збільшувалися (на 7.0%, 18.1% и 15.8% відповідно), а частота зменшувалася на 6,2%. Після відокремлення ростральної частини ВЛВДМ аплікація L-аргініну, напроти, викликала збільшення частоти ІР (табл.1). Aплікація 10.0 мкМоль нітрогліцерину призвела до вірогідного збільшення амплітуди та інтегральної інтенсивності ІР ( на 13.0% та 16.9% відповідно) та зменшення частоти на 26.2%. У концентрації 10.0

мкМоль інший донор NO, SNP, також викликав зниження частоти (на 21.1%) та збільшення амплітуди та інтегральної інтенсивності (на 14.9% и 17% відповідно). Після відокремлення ростральної частини ВЛВДМ SNP викликав збільшення частоти ІР (табл.1). Таким чином, аплікація агентів, що впливають на біосинтез NO (L-NAME, L-аргінін), що зв'язують ендогенний NO (Hb), а також екзогенних донорів NO (нітрогліцерин, SNP) призводить до вірогідних змін середніх параметрів інтегрованої електричної актив

Табл. 1. Вплив NO на параметри іР, що генеруються ЧіМСП новонароджених щурят з інтактним довгастим мозком та після відокремлення ростральної частини ВЛВДМ (зони М) шляхом поперечного перерізу.

Умови досліду Ti, мс Fi, хв-1 А, ум.од. I, ум. од.

Контроль 799±27 6.49±0.24 104.4±4.6 4549±210

Контроль після перерізу 672±16 13.93±0.37 82.3±2.2 3403±93

L-NAME, 10.0 мкМоль 698±23* 8.01±0.23* 89.8±6.3* 4044±131*

Те ж, після перерізу 581±19 9.83±0.26* 81.1±2.6 3239±150

Hb, 0.3 мкМоль 790±37 7.61±0.26* 93.8±5.4* 4438±505

Те ж, після перерізу 678±48 13.18±0.31 81.5±5.9 3336±492

L-аргінін, 10.0 мкМоль 855±38* 6.09±0.41 123.3±6.2* 5268±497*

Те ж, після перерізу 685±50 20.26±3.68* 88.3±6.0 3573±635

SNP, 10.0 мкМоль 871±40* 5.12±0.23* 120.0±6.8* 5322±450*

Те ж, після перерізу 712±38 15.6±1.07* 84.8±5.7 3574±459

Примітка. Зірочками позначено статистичну вірогідність відмін (P<0.05)

від контрольних параметрів.

ності у діафрагмальному нерві ЧІМСП, що свідчить на користь участі NO у регуляції характеристик дихального ритму у щурят раннього віку на медулоспінальному рівні.

Аплікація 1.0 мкМоль кетаміну призвела до незначного збільшення тривалості ІР та вірогідного збільшення їх частоти на 8.1%. Після відокремлення ростральної частини ВЛВДМ аналогічна аплікація кетаміну викликала тенденцію до зниження частоти ІР (на 5.5%), тоді як їх тривалість, амплітуда та інтегральна інтенсивність вірогідно знижувалися на 15.7%, 24.7% та 24.8% відповідно. Кетамін в концентрації 10.0 мкМоль/л призводив до вірогідного збільшення тривалості ІР на 29.6%, амплітуди та інтегральної інтенсивності на 13.5% та 30.0% відповідно, водночас зі зменшенням частоти на 15.4%. Після відокремлення ростральної частини ВЛВДМ кетамін в аналогічній концентрації не викликав збільшення тривалості та інтегральної інтенсивності ІР, тоді як їх амплітуда і частота вірогідно зменшувалися на 25.4% та 8.7% відповідно. Таким чином, для збільшення частоти ІР при аплікації 1.0 мкМоль кетаміну та їх тривалості при аплікації 10.0 мкМоль цього агенту необхідною ї цілісність зв'язків з ростральною частиною ВЛВДМ. При аплікації 100.0 мкМоль кетаміну відбувалося пригнічення всіх параметрів ІР як за умов інтактного ВЛВДМ, так і після відокремлення його ростральної частини.

Вплив NO на зміни електричної активності у діафрагмальному нерві ЧІМСП при дії NMDA. Аплікація 5.0 мкМоль NMDA викликала вірогідне збільшення частоти ІР на 49.1% (табл. 2). На тлі попередньої аплікації 10.0 мкМоль L-NAME NMDA не призводив до вірогідних змін будь-яких характеристик ІР. Попередня аплікація Hb призводила до аналогічніх результатів: під час наступної аплікації NMDA частота іР навіть дещо зменшувалася. На тлі аплікації 10.0 мкМоль L-аргініну під час тесту з NMDA всі середні параметри ІР зростали більш суттєво, ніж у інтактних препаратів ( частота збільшувалася у 2.25 рази). Попередня аплікація 10.0 мкМоль SNP не викликала збільшення частоти ІР при наступній аплікації NMDA, але додавання Hb до розчину з SNP призводило до нейтралізації блокуючого впливу SNP на частоту ІР під час тесту з NMDA (табл.2). Таким чином, аплікація NMDA призводила до вірогідного збільшення частоти ІР. За умов попереднього блокування NO-синтази або зв'язування ендогенного NO ця реакция блокувалася; аплікація L-аргініну, напроти, стимулювала її.

Вплив NO та блокування NMDA-рецепторів на електричну активність у діафрагмальному нерві ЧІМСП при гіпоксії та при зниженні рН зовнішньоклітинної рідини. Гіпоксичний тест викликав у інтактних препаратів початкове незначне збільшення частоти ІР, яке швидко змінювалося на помітне її пригнічення. Середня частота протягом усього тесту була вірогідно нижчою на 23.2% за контрольну (табл. 3). Крім того, при гіпоксії спостерігали тенденцію до збільшення тривалості, амплітуди та інтегральної інтенсивності ІР. Гіпоксичний тест на тлі аплікації 10.0 мкМоль L-NAME викликав вірогідне збільшення частоти ІР на 66.8% разом із вірогідним зменьшенням тривалості (на 14.2%), амплітуди ( на 10.4%) та інтегральної інтенсивності ІР (на 17.8%). Попередня аплікація 10.0

Табл. 2. Вплив NO на параметри ІР, що генеруються ЧІМСП, при аплікації NMDA.

Умови досліду Ti, мс Fi, хв-1 А, ум. од. I, ум. од.

1.Контроль 771±27 6.60±0.18 104.8±5.1 4558±217

NMDA, 5.0 мкМоль 788±23 9.84±0.53* 108.6±3.4 4778±178

2.L-NAME, 10.0 мкМоль 720±21+ 6.68±0.25 90.1±2.7+ 3842±129+

NMDA, 5.0 мкМоль 750±23 6.88±0.34+ 89.8±2.8+ 3996±143+

3.Hb, 0.3 мкМоль 765±40 7.34±0.34+ 78.8±3.5+ 3617±405+

NMDA, 5.0 мкМоль 691±40+ 6.82±0.32+ 77.4±3.5+ 3303±435+

4.L-арг, 10.0 мкМоль 909±36+ 5.18±0.34+ 126.3±5.2+ 4820±369+

NMDA, 5.0 мкМоль 951±84+ 11.66±2.22* 136.0±10.4+ 5249±1150

5. SNP, 10.0 мкМоль 879±33+ 6.10±0.26 120.5±5.8+ 5330±0779+

NMDA, 5.0 мкМоль 850±58+ 6.00±0.53+ 132.2±6.9*+ 5581±822+

6. SNP, 10.0 мкМоль+

+Hb, 0.3 мкМоль 657±34+ 6.26±0.31 111.8±7.0+ 3557±410+

NMDA, 5.0 мкМоль 708±25+ 9.08±0.42* 121.0±7.4+ 3985±353*

Примітка. Зірочками позначено статистичну вірогідність відмін (P<0.05) від контрольних параметрів, хрестиками - вірогідність відмін параметрів у групах 2-6 від аналогічних у групі 1.

мкМоль L-аргініну під час гіпоксичного тесту призводила до більш вираженого, ніж у інтактних ЧІМСП, зменшення частоти (на 31.4%), але амплітуда та інтегральна інтенсивність ІР при гіпоксії зростали більше, ніж у контролі (на 7.0% и 12.0% відповідно). Попередня аплікація 10.0 мкМоль SNP призводила до менш вираженого, ніж у інтактних препаратів,пригнічення частоти ІР при наступній гіпоксії (на 5.7%), а тривалість та інтегральна інтенсивність ІР помітно збільшувалися порівняно з контролем (на 14.6% та 17.3% відповідно, табл. 3).

Тривала (10 хв) попередня аплікація 10.0 мкМоль кетаміну викликала виражене зменшення всіх контрольних показників ІР. Під час наступного

Табл. 3. Вплив NO та блокування NMDA-рецепторів на параметри ІР, що генеруються ЧІМСП, при гіпоксії.

Умови досліду Ti, мс Fi, хв-1 А, ум. од. I, ум. од.

1.Контроль 810±34 6.47±0.27 94.6±4.3 4273±227

гіпоксія 841±60 4.97±0.48* 96.7±8.7 4492±412

2.L-NAME, 10.0 мкМоль 663±41+ 6.68±0.31 69.4±2.3+ 2932±118+

гіпоксія 569±62*+ 11.14±1.02* 62.2±7.0*+ 2409±360*+

3.L-арг, 10.0 мкМоль 1061±35+ 5.99±0.29 119.2±6.4+ 6025±318+

гіпоксія 1087±84+ 4.11±0.35*+ 127.5±7.5+ 6748±714*+

4. SNP, 10.0 мкМоль 1029±28+ 5.43±0.25+ 91.7±5.0 5213±340+

гіпоксія 1180±77* 5.12±0.41 90.9±8.2 6120±830*+

5.Кетамін,10.0 мкМоль 426±14+ 4.92±0.20+ 65.2±7.0+ 1881±76+

гіпоксія 372±39*+ 3.76±1.08 58.4±11.0+ 1512±275*+

Примітка. Зірочками позначено статистичну вірогідність відмін (P<0.05) від контрольних параметрів, хрестиками - вірогідність відмін параметрів у групах 2-5 від аналогічних у групі 1.

гіпоксичного тесту тривалість ІР зменшувалася на 12.7%, а їх амплітуда та інтегральна інтенсивність - на 10.4% та 19,6% відповідно. Але частота ІР зменшувалася на 23.5%, що практично не відрізняїться від реакції інтактних ЧІМСП на гіпоксію (табл. 3). Аналіз зміни цього показника у перший та другий 90-секундний інтервал гіпоксичного тесту показав, що вплив гіпоксії на тлі кетаміну призводив у перші 90 с до вірогідного зменшення частоти на 23.0%, тоді як у інтактних ЧІМСП частота у цей час незначно збільшуїться. У другій половині тесту відбувалося подальше зменьшення частоти, але її значення після аплікації кетаміну було дещо вищим за аналогічний показник контрольного гіпоксичного тесту. Кетамін у концентрації 100.0 мкМоль/л при наступній гіпоксії у більшій частині дослідів призводив до повного зникнення дихальної активності у діафрагмальному нерві ЧІМСП. Таким чином, блоку вання NO-синтази при наступній гіпоксії призводить до зменшення тривалості, амплітуди та інтегральної інтенсивності ІР зі стійким збільшенням їх частоти. Аплікації L-аргініну та SNP призводили до помітного збільшення тривалості та інтегральної інтенсивності ІР при гіпоксії

порівняно з інтактними ЧІМСП. SNP сприяв також порівняно меншому пригніченню частоти ІР при гіпоксії. Блокування NMDA-рецепторів при наступній гіпоксії призводить до зменшення всіх параметрів ІР, внаслідок чого може відбуватися повне гальмування дихального ритму ЧІМСП.

Суперфузія ЧІМСП розчином з рН 7.0 викликала вірогідне збільшення частоти ІР на 27%, а їх амплітуда та інтегральна інтенсивність зменшувалися на 10% и 10.5% відповідно. За умов попередньої аплікації 10.0 мкМоль L-NAME при наступному впливі розчину з рН 7.0 частота ІР вірогідно не змінювалася. На тлі аплікації 10.0 мкМоль L-аргініну зниження рН розчину до 7.0 призводило до вираженого та тривалого збільшення частоти ІР , їх амплітуди та інтегральної інтенсивності. Аплікація розчину з рН 7.0 після обробки ЧІМСП 10.0 мкМоль SNP не викликала вірогідного збільшення частоти ІР. На тлі аплікації кетаміну суперфузія розчином з рН 7.0 призводила до короткочасного збільшення частоти ІР (на 22. 5% та 19% при аплікації 10.0 та 100.0 мкМоль кетаміну відповідно), а їх амплітуда та інтегральна інтенсивність вірогідно не змінювалися. Таким чином, L-NAME, кетамін та SNP зменшують реакцію дихального ритму ЧІМСП на зниження рН суперфузуючого розчину, а L-аргінін стимулює дану реакцію.

Обговорення результатів.

На підставі отриманих результатів ми припускаємо, що LPGi є найбільш суттївим джерелом біосинтезу NО, який впливає на генерацію дихального ритму нейронами ВРГ у новонароджених щурят. Деяким підтвердженням цьому може бути існування в даному ядрі у дорослих щурів великої групи NО-синтазоімунореактивних нейронів (Dun et al.,1994). В нейронах цього типу порівняно з клітинами, що не містять NO-синтазу, знайдено більшу щільність NMDA-рецепторів (Price et al., 1993). Відомо (Funk et al., 1993), що участь NMDA-рецепторів у новонароджених щурят не є необхідною для генерації дихального ритму поперечними медулярними зрізами 400 мкм завтовшки на рівні пре-Бетцингерова комплекса. За умов цього препарату більш ростральні відділи ВРГ, у тому числі і LPGi, безумовно, не брали участь у ритмогенезі. Результати наших дослідів свідчать на користь участі NMDA-рецепторів у регуляції параметрів дихального ритму ЧІМСП, що співпадає з результатами, отриманими на дорослих щурах in vivo при застосуванні більш специфічних антагоністів NMDA (Monteau et al., 1990). В нашій роботі одержано дані про участь ендогенного NO у тонічному гальмівному контролі, який здійснюється ростральними відділами ВЛВДМ у новонароджених щурят. Відомо (Ogawa et al., 1995), що NО здібний збільшувати вивільнення глутамату в медулярних структурах, а одним з нейромедіаторних механізмів тонічного гальмування ритму, що існує у ростральному ВЛВДМ, є глутаматергічний (Dillon et al., 1991). Але в більш каудальному ВЛВДМ, де розташований дихальний генератор (Smith et al., 1991), вплив глутамату на різні типи рецепторів та викликаний внаслідок активації NMDA-рецепторів біосинтез NО може стимулювати дихальний ритм. Можливо, NMDA-рецептори безпосередньо не беруть участі в функціонуванні ритмогенеруючої мережі нейронів, але відповідають за надходження до неї тонічного активуючого впливу від нейронів ретикулярної формації та хеморецепторних структур ВЛВДМ, а NО, що утворюється при активації NMDA-рецепторів, підсилює активуючий сигнал шляхом збільшення вивільнення глутамату та активації неNMDA-рецепторів, що безпосередньо беруть участь у генерації дихального ритму (Funk et al., 1993). Крім того, відомо, що NMDA та NO можуть збільшувати вивільнення ацетилхоліну в мозку (Ohkuma et al., 1995; Leonard & Lydic, 1995), а холінергічні механізми є провідними у медулярній хемочутливості дихання (Fukuda & Loeschcke, 1979). У механізмах зменшення частоти дихального ритму при гіпоксії в нашіх дослідах може брати участь ендогенний NO за рахунок прямого блокуючого впливу на канальні та рецепторні структури респіраторних нейронів, а також активації тонічного гальмування ростральними відділами ВЛВДМ. У новонароджених ця реакція, можливо, є адаптивною, тому що зниження метаболізму при пригніченні активності респіраторних нейронів сприяє збереженню їх життєздатності при пологовому гіпоксичному стресі (Cherniack et al., 1995).

ВИСНОВКИ

1. Роль NO в центральній регуляції дихання та розподілення нейронів, що містять NO-синтазу, в структурах медулярного генератора вивчалися лише в експериментах на дорослих тваринах і не вивчені у новонароджених; значення NMDA-рецепторів у дихальному ритмогенезі у цих тварин остаточно не з'ясовано. Актуальність нашого дослідження медулярних механізмів участі NO і NMDA-рецепторів у регуляції дихального ритмогенезу у новонароджених щурят пов'язана з необхідністю вивчення причин порушень центральної регуляції функції дихання в неонатальному періоді.

2. Досліджено розподіл нейронів, що містять NADPH-діафоразу (маркер NO-синтази) у структурах генератора дихального ритму щурят перших днів життя. В експериментах на частково ізольованих штучно суперфузованих медулоспінальних препаратах щурят перших днів життя показано участь NO та NMDA-рецепторів збуджуючих амінокислот у регуляції параметрів інтегрованої електричної дихальної активності у діафрагмальному нерві у нормі, при гіпоксії та при зниженні рН зовнішньоклітинного розчину.

3. NADPH-діафоразореактивні нейрони знайдені в усіх відомих ядрах дорсальної та вентральної респіраторних груп нейронів довгастого мозку чотириденних щурят, максимальна середня щільність мічених нейронів (27.9±2.6 клітин на 0.1 мм2) показана у ростральній частині вентролатерального відділу довгастого мозку - в області латерального парагігантоклітинного ядра.

4. NO опосередковує механізм тонічного гальмування частоти дихального ритму, що здійснюється ростральною частиною вентролатерального відділу довгастого мозку у новонароджених щурят, а також формування частотно-амплітудних характеристик дихального ритму, який генерується струк-турами, що розташовані більш каудально.

5. NMDA-рецептори беруть участь у механізмах тонічного гальмування частоти дихального ритму та гальмування тривалості інспірації, що здійснюються ростральною частиною вентролатерального відділу довгастого мозку новонароджених щурят.

6. Ендогенний NO опосередковує вплив екзогенного NMDA, що аплікується на вентральну поверхню довгастого мозку медулоспінальних препаратів новонароджених щурят, але аплікація донора NO нітропрусиду натрію призводить до блокування стимуляції частоти дихального ритму при дії NMDA. Даний вплив нітропрусиду натрію пов'язаний з блокуючою діїю надлишку NO на NMDA-рецептори, тому що зменшується при додаванні гемоглобіну, що зв'язує NO.

7. За умов гіпоксичного тесту ендогенний NO бере участь у механізмі пригнічення частоти дихального ритму та збереженні необхідного рівня амплітуди та інтегральної інтенсивності інспіраторних розрядів, що генеруються медулоспінальними препаратами новонароджених щурят. Попередня аплікація нітропрусиду натрію сприяє відносно меншому пригніченню частоти та збільшенню інтегральної інтенсивності інспіраторних розрядів за умов гіпоксії.

8. Блокування NMDA-рецепторів при наступній гіпоксії призводить до більш вираженого пригнічення параметрів дихального ритму, що генерується медулоспінальними препаратами новонароджених щурят.

9. Ендогенний NO опосередковує стимуляцію частоти дихального ритму, що генерується медулоспінальними препаратами новонароджених щурят, яка відбувається внаслідок активації хеморецепторів вентральної поверхні довгастого мозку суперфузуючим розчином з рН 7.0. Донор NO нітропрусид натрію зменшує дану стимуляцію, можливо, внаслідок блокування NMDA-рецепторів.

10. Блокування NMDA-рецепторів призводить до зменшення стимуляції частоти дихального ритму, що генерується медулоспінальними препаратами новонароджених щурят, при дії розчину з рН 7.0, що свідчить про участь даного типу рецепторів у медулярній хемочутливості дихання.

ПЕРЕЛІК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Волгин Д.В., Марченко В.А., Середенко М.М. Влияние оксида азота на респираторную активность, генерируемую медуллоспинальными препаратами крысят раннего возраста в условиях гипоксии // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 1997. - т. 29, N 6. - С. 420-430.

2. Волгин Д.В. Участие оксида азота в реализации влияния NMDA на респираторный ритм, генерируемый медуллоспинальными препаратами новорожденных крысят // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 1998. - т. 30, N1. - С. 59-67.

3. Волгин Д.В., Марченко В.А., Середенко М.М., Василенко Д.А. Участие NMDA-рецепторов в регуляции респираторного ритма, генерируемого медуллоспинальными препаратами крысят первых дней жизни // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 1998. - т. 30, N 2. - С. 129-135.

4. Волгін Д.В. Участь NMDA-рецепторів і оксиду азоту в реакціях медулярного респіраторного генератора щурят раннього віку на гіпоксію та ацидоз // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 1998. т. 30, N 6. - С.483-487.

5. Волгін Д.В., Красюк О.М. Вплив нітрогліцерину на респіраторну активність, що генерується медулоспінальними препаратами новонароджених щурят // Фізіологічний журнал. - 1998. - т. 44, N 3. - С. 133-134.

6. Середенко М.М., Волгін Д.В. Участь NMDA-рецепторів у регуляції респіраторної активності, яка генерується частково ізольованими медулоспінальними препаратами новонароджених щурят при гіпоксії // Фізіологічний журнал. - 1998. - т. 44, N 3. - С. 148-149.

7. Волгин Д.В. Глутаматергический контроль респираторного ритма новорожденных крысят при гипоксии // Гипоксия: деструктивное и конструктивное действие: Материалы Междунар. конф. - Киев, 1998. - С. 51-52.

8. Волгін Д., Середенко М. Вплив рН зовнішньоклітинного розчину на медулярний дихальний ритм щурів перших днів життя: значення NMDA рецепторів // Проблеми вікової фізіології: Матеріали всеукр. конф. -Луцьк, 1998. - С. 37.

9. Волгин Д.В., Середенко М.М. Участие монооксида азота в регуляции респираторного ритма, генерируемого медуллоспинальными препаратами крысят раннего возраста // Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности. - Минск, 1998. - С. 24-26.

Волгін Д.В. Дослідження медулярних механізмів участі оксиду азоту та рецепторів N-метил-D-аспартату в регуляції дихального ритмогенезу у новонароджених щурят. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Інститут фі-зіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 1999.

В експериментах на новонароджених щурятах вивчали розподіл нейронів, що містять NADPH-діафоразу (маркер нейрональної NO-синтази) у структурах медулярного дихального генератору, а також роль NO та NMDA-рецепторів збуджуючих амінокислот у регуляції дихальної активності у діафрагмальному нерві штучно суперфузованих частково ізольованих медулоспінальних препаратів. NADPH-діафоразореактивні нейрони знайдені в усіх ядрах дорсальної та вентральної респіраторних груп нейронів, їх максимальну щільність виявлено у ростральній частині вентролатерального відділу довгастого мозку (ВЛВДМ) - в області латерального парагігантоклітинного ретикулярного ядра. Встановлено, що ендогенний NO опосередковує механізм тонічного гальмування частоти дихального ритму (ДР), який існує у ростральній частині ВЛВДМ, у нормі та при гіпоксії, активацію частоти ДР при зниженні зовнішньоклітинного рН, а також бере участь у формуванні базального ДР більш каудальними структурами ВЛВДМ. Показано, що умовою реалізації впливу NMDA на ДР є біосинтез NO, але останній може блокувати NMDA-рецептори. NMDA-рецептори ВЛВДМ беруть участь у регуляції параметрів ДР у нормі, при гіпоксії та при зниженні зовнішньоклітинного рН.

Ключові слова: NO, NO-синтаза, NMDA, NADPH-діафораза, рН, дихальний ритм, частково ізольований медулоспінальний препарат, вентролатеральний відділ довгастого мозку, гіпоксія.

Волгин Д.В. Исследование медуллярных механизмов участия оксида азота и рецепторов N-метил-D-аспартата в регуляции дыхательного ритмогенеза у новорожденных крысят. -Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 1999.

С помощью гистохимического метода исследовано распределение нейронов, содержащих NADPH-диафоразу (NADPH-д, маркер синтазы оксида азота) в структурах генератора дыхательного ритма (ДР) крысят первых дней жизни. В экспериментах на частично изолированных (in situ) искусственно суперфузируемых медуллоспинальных препаратах (ЧИМСП) крысят первых дней жизни показано участие оксида азота (NO) и NMDA-рецепторов возбуждающих аминокислот в регуляции параметров интегрированной электрической дыхательной активности в диафрагмальном нерве в норме, при ги-поксии и при снижении рН внеклеточного раствора.

NADPH-д-содержащие нейроны выявлены во всех известных структурах дорсальной и вентральной респираторных групп нейронов продолговатого мозга четырехдневных крысят, максимальная средняя плотность меченых нейронов показана в ростральной части вентролатерального отдела про-долговатого мозга (ВЛОПМ) - в области латерального парагигантоклеточного ядра.

С применением метода поперечных перерезок ВЛОПМ и аппликаций конкурентного ингибитора NO-синтазы, экзогенных доноров NO и субстрата его биосинтеза исследована роль NO в регуляции параметров ДР, генерируемого ЧИМСП. NO участвует в механизме тонического торможения частоты ДР, осуществляемом ростральной частью ВЛОПМ, а также в формировании частотно-амплитудных характеристик ДР, генерируемого структурами, расположенными каудальнее. С применением метода поперечных перерезок ВЛОПМ и аппликаций неконкурентного