НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ.Р.Є.КАВЕЦЬКОГО

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ ОНКОЛОГІЇ І РАДІОЛОГІЇ

ЗАВЕЛЕВИЧ МИХАЙЛО ПЕТРОВИЧ

УДК 578.245.4 : 577.151.54 : 57.085.23

СИСТЕМА 2-5 ОЛІГОАДЕНІЛАТУ В ПУХЛИННИХ ТА ВІРУСІНФІКОВАНИХ КЛІТИНАХ ПРИ ДІЇ ІНТЕРФЕРОНІВ ТА ЇЇ МОДУЛЯЦІЯ РЕТИНОЇДАМИ

14.01.07 - Онкологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ-1999 р.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології,онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Науковий керівник |

-академік НАН України,

доктор медичних наук, професор

Бутенко Зоя Андріївна,

завідувач відділу механізмів лейкозогенезу Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України,

Офіційні опоненти: |

-доктор медичних наук, професор

Шляховенко Володимир Олексійович,

завідувач відділу ензимотерапії пухлин

Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України,

-член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Дяченко Наталія Сергіївна,

завідувач відділу молекулярної біології вірусів

Інституту мікробіології і вірусології

ім. Д.К.Заболотного НАН України,

Провідна установа |

-Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедри онкології і вірусології, м.Київ

Захист відбудеться ‘’_____’’___________ 1999 р. о ________ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України (252022, Київ-22, вул. Васильківська, 45)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР НАН України

Автореферат розісланий ‘’______’’_______________1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради

доктор медичних наук

І.В.Абраменко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інтерферони (ІФН) посідають одне з перших місць серед цитокінів, які використовую-ться в сучасній медицині. Наявність проти-проліферативних та імуномодуляторних ефектів у ІФН обумовила можливості їх застосування в онколо-гіч-ній практиці. Клінічні дослідження, проведені з препаратами рекомбінантних ІФН, дозволили накопичити чималий досвід, необ-хідний для розробки раціональних схем інтерферонотерапії (Ершов 1996; Возиа-нов с соавт. 1998; Talpaz 1995; Kantarjian et al 1996). Застосування ІФН в ком-плексі з хіміопрепаратами та іншими засобами протипухлинної терапії доз-во-лило до-сягти значних результатів в лікуванні волосатоклітинного лейкозу (Golomb et al 1996), хронічного мієлолейкозу (Tura 1996) та метастазуючого раку нирки (Возианов с соавт. 1997). Разом з тим, не можна не зазначити, що й до цього часу клінічні схеми використання ІФН лишаються здебільшого емпіричними та неіндивідуалізованими, при цьому існує певний розрив між новітніми да-ними про молекулярні механізми дії ІФН та існуючими обгрунтуваннями схем їх за-сто-сування.

Згідно з сучасними уявленнями численні біологічні ефекти ІФН врешті решт пов’язані з обмеженим колом ефекторних механізмів системи ІФН, які за-пускаються в результаті взаємодії ІФН з рецепторами на поверхні клітин. Одне з цен-тральних місць серед таких ефекторних ланок посідає сис-тема 2_олігоаденілату (2_А), головним компонентом якої є специфічний фермент, 2_5А синтетаза (Kerr and Brown 1978). Саме цьому ферменту останнім часом приділяють значну увагу в спробах знайти загальний знаменник для пояс-нення різноманітних ефектів ІФН. Ви-явилось, що система 2_А пов’язана з диференціюванням клітин, регулюванням їх проліферації та модулюванням ряду біосинтетичних процесів (Player and Torrenece 1998), вона бере участь в підтри-манні клітинного гомеостазу та в таких фундаментальних процесах як апоптоз (Castelli et al 1998).

Оскільки дія ІФН на сприйнятливі до них клітини в більшості випадків супроводжується індукцією 2_А синтетази, визначення активності цього ферменту може бути корисним як для прогнозування ефективності застосування ІФН, так і для моніторингу інтерферонотерапії (Ferbus et al 1990; Moritz et al 1992). Зміни активності 2_5A синтетази можна визначати не лише в клітинах пухлин, а й в ефекторних клітинах імунної системи, що може сприяти розумінню ефектів, які ІФН справляє опосередковано.

В роботах останніх років, присвячених вивченню численних зв’язків між клітинами, які опосередкуються цитокінами та факторами росту, чи-мала увага приділяється речовинам, які належать до ретиноїдів, поси-лився інтерес і до їх клінічного застосування в онкологічній прак-тиці (Parkinson 1992; Berg 1997). Особливо цікавими є дані, що свідчать про можливо-сті адитивних та си-нергічних протипроліферативних ефектів ретиноїдів в поєднанні з ІФН (Giandomenico et al 1998). При цьому, як виявилось останнім часом, ретиноїди можуть впливати безпосередньо на систему 2_А, чим можуть хоча б частково бути пояснені подібні ефекти взає-модії (Lancillotti et al 1995; Gianni et al 1997; Pelicano et al 1997). Разом з тим в цих питаннях ще існує багато су-перечностей і розробка раціональних схем комбінованої терапії з застосу-ванням ретиноїдів потребує подальших досліджень. Аналіз впливу ретиноїдів на проліфе-рацію клітин та взаємодії ретиноїдів з системою ІФН не може проводитись відокремлено від аналізу впливу ретиноїдів на репродукцію вірусів з враху-ван-ням, зокрема, взаємозалежності між ретровірусами та індукованими і спонтанними пухлинами в експериментальній онкології, а також клініч-ного значення ретровірусних інфекцій у людини, тим більше, що останнім часом певна увага приділяється можливому використанню ретиноїдів для терапії ВІЛ-асоційованої саркоми Капоші та ВІЛ-асоційованих лімфом (Baily et al 1995). До того ж всі ас-пекти, пов’язані з взаємодією між ретиноїдами та системою ІФН, важливі і для клінічного застосування ІФН та ретиноїдів в онкології.

За останнє десятиріччя ІФН все ширше застосовуються в комбінованій терапії солідних пухлин різних локалізацій (Воронцова 1996). Чільне місце серед них посідають деякі по-ширені пухлини органів сечовиведення, зокрема рак нирки та рак сечового міхура (Horoszewicz and Murphy 1989; Torti and Lum 1987). Застосування ІФН альфа у хворих на рак сечового міхура дозволяє запобігати рецидивуванню після хірургічного видалення первинної пухлини. При цьому використову-ються переваги від створення локальних підвищених концентрацій ІФН за-вдяки можли-вості внутріміхурового введення препарату (Chodak 1989). Однак, нез’ясованим лишається питання, чому в ряді випадків пухлини є більш сприйтятливі до ІФН, а в інших випадках - відносно більш резистентними. Неясно також, яким є співвідношення безпосереднього впливу ІФН на пухлинні клітини та опосеред-кованої дії ІФН, враховуючи значну роль імун-ного компоненту, а можливо і порушень в системі ІФН, в патогенезі раку сечового міхура. Наскількі відомо з літератури, дослідження стану системи 2_5А в клітинах раку сечового міхура досі ще не проводились. Відносно маловивченими лишаються і проблеми взаємодії ІФН з ретиноїдами в терапії раку сечового міхура, незважаючи на те, що подібні схеми лікування вже почали випробуватись в клінічній практиці.

ІФН знайшли своє застосування і при лікуванні метастазуючого раку нирки, особливо в поєднанні з цитостатиками та інтерлейкіном-2 (ІЛ-2) (Возианов с соавт. 1997; Belldegrun et al 1996; Atzpodien 1995). Особливо перспек-тивними є підходи з мобілізацією in vitro лімфоцитів, які інфільтрують пухлини (Finke et al 1994). Незважаючи на те, що вже накопичено чимало даних про вплив ІФН та ретиноїдів на деякі з ефекторних клітин імунної системи (Bonavida et al 1993), нез’ясованими лишаються питання щодо стану системи 2_А як в природ-них кілерних клітинах, так і в лімфоцитах, які інфільтрують пухлини, особливо в плані спільного застосування ІФН та ІЛ_.

Актуальність тематики досліджень, таким чином, визначається необ-хідністю обгрунтування раціональних схем застосування ІФН та ретиноїдів в клінічній практиці та розробки інформативних методів, які могли б свід-чити про сприйнятливість до ІФН в поєданні з модифікаторами біологічної відповіді, зважаючи на досить широке клінічне застосування як ІФН, так і комбінованої терапії, яка включає інтерферонотерапію. В теоретичному аспекті особливий інтерес становило питання про роль системи 2_А як можливої загальної ефек-торної ланки, що обумовлює різноманітні ефекти ІФН.

Мета і задачі дослідження. Основна мета - одер-жання нових даних про функціонування ключового ферменту системи ІФН, 2_А синтетази, в клітинах перещеп-люваних лімфобластоїдних ліній, пухлинних клітинах та ефекторних клітинах імунної системи хворих на рак сечового міхура та рак нирки та аналіз можливості застосування методу тестування активності 2_А синтетази для ви-значення сприйнятливості клі-тин різного генезу до екзогенного ІФН, а також аналіз механізмів модуляції ефектів ІФН під дією ретиноїдів.

Для досягнення цієї мети було постав-лено такі завдання:

- проаналізувати противірусні та протипроліфера-тивні ефекти ІФН при інтегративній ві-русній інфекції, зокрема в клітинах перещеплюваних культур мишачих лі-мфом, які продукують ендогенні ретровіруси;

- проаналізувати основні параметри системи 2_А в клітинах різного генезу та при різних функціональних станах, зокрема в перещеплюваних лімфобластоїдних лініях людини, в перещеплюваних лініях мишачої лім-фоми, в первинних клітинах раку сечового міхура та раку нирки людини, в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів та хворих на вірусні інфекції, в природних кілерних клітинах здорових та хворих людей та в лімфоцитах, які інфільт-рують пухлини;

- простежити взаємодію ретиноїдів з системою ІФН в переще-плюваних лініях клітин та в клітинах раку сечового міхура, а також проаналі-зувати можливості модуляції ефектів ІФН ретиноїдами як в пухлинних клітинах, так і при хронічних вірусних інфекціях людини;

-проаналізувати функціонування 2_А синтетази, на молекулярному рівні, зокрема проаналі-зувати форми синтезованого продукту та природу активато-рів ферменту.

Наукова новизна одержаних результатів. Одержано нові дані щодо стану системи 2_А в пухлин-них клітинах у хворих на рак нирки та рак сечового міхура, а також в мононуклеарах периферійної крові здорових і хворих людей в співставленні з аналогічними даними для пере-щеплюваних ліній пухлинних клітин. Вперше проаналізовано сприйнятли-вість клітин раку сечового міхура та раку нирки людини до різних типів рекомбінантних ІФН за визна-ченням активності індукованої 2_А синтетази. Результати роботи свідчать про можливості застосування ме-тоду визначення 2_А синтетази для одержання об’єктивних даних щодо сприйнятливості як пухлинних клітин, так і ефекторних клітин імун-ної системи до дії різних типів ІФН. Прове-дено порівняльне вив-чення рів-нів базальної та індукованої активності ферменту в перещеплюваних лініях клітин різного генезу, в первинних клі-тинах пухлин та в ефекторних клітинах імунної системи здорових людей, хворих на онкоурологічну патологію та хворих на вірусний гепатит; проаналізовані співвідношення між базальною та індукованою активністю 2_А синтетази в різних системах. Показано, що співвідношення між базальними та інду-кованими рівнями активності 2_А син-тетази в мононуклеарах периферійної крові та первинних культурах пухлинних клітин принци-пово відрізняє-ться від такого ж співвідношення в низці перещеп-люваних ліній пухлинних клітин різного генезу. Продемонстровано кореляції між фунціональною спроможністю ефекторних клітин імунної системи, зокрема природних кі-лерів та лімфоцитів, які інфільтрують пухлини, при дії ІФН, та індукцією в цих клітинах 2_А синтетази. Показано, що спільна дія рети-ноїдів та ІФН як в культурах перещеплюваних ліній, так і в первинних культурах раку се-чового міхура може призво-дити до синергіч-них ефектів щодо зростання рівнів індукованої активності 2_А синтетази. Встановлено, що ретиноїди мо-жуть за певних умов слугувати за інду-ктори ІФН людини, а також пригнічувати репродукцію як інтегрова-них ендогенних ретровірусів, так і вірусу імунодефіциту людини.

При вивченні молекулярних аспектів функціонування 2_А синтетази вперше було показано, що препарати тРНК можуть ефективно правити за активатор цього ферменту, що дозво-ляє передбачити можливості такого функціонування тРНК і в природних умовах. Одержані дані мають важливе зна-чення для розкриття механізмів функціонування 2_А синтетази в клітинах в нормі та при патологічних станах при відсутності вірусної інфекції.

В процесі виконання роботи вперше було одержано серію перещеп-люва-них ліній мишачих клітин з трансплантованих лімфом та охарактеризовано ретро-віруси, які продукуються цими клі-тинами.

Практичне значення одержаних результатів. Метод визначення актив-ності 2_А синтетази, модифікований стосовно первинних культур пухлин-них клітин та мононуклеарів периферійної крові, було апробовано в клі-ниці Українського НДІ урології і нефрології та Київській міській онколо-гічній лікарні для аналізу сприйнятливості до ІФН пухлин хворих на рак сечового міхура, які підлягали комбінованій терапії із застосуванням пре-парату рекомбінантного ІФН альфа. Дані, одержані в процесі виконання роботи, були використані в подальших дослідженнях, які проводяться в НДІ урології і нефрології , з метою застосування цього параме-тру для моніторингу інтерферонотерапії. Методика ви-значення синтетазної активності та одержані результати були впрова-джені в НДІ епідеміології та інфекційних хвороб для скринінгу синтетичних та природних речовин як можливих індукторів ІФН. Результати щодо вза-є-модії ретиноїдів з системою ІФН можуть мати практичне значення для розробки методів комбінованої терапії з використанням ретиноїдів та ІФН. Одержані перещеплювані лінії клітин ОН, які можуть слугувати за модель, придатну для одночасного вивчення впливу ІФН та модулюючих факторів на проліферацію клітин і на репродукцію інтегрованих вірусів, впроваджені в лабораторіях інституту експериментальної патології, онкології і радіобіоло-гії, інституту молекулярної біології і генетики та НДІ епідеміології та інфе-кційних хвороб.

Апробація результатів дослідження. Одержані результати були представлені на таких національних та міжнародних конференціях та симпозиумах:

ІІІ Всесоюзна конференція «Сучасні методи морфологічного дослі-дження в теоретичній та практичній онкології» (Тбілісі 1983); симпозиум з профілактики та лікування вірусних інфекцій (Любліце, Чехословаччина 1985); щорічні збори Міжнародного товариства з досліджень по інтерфе-рону (ISIR) (Ніцца, Франція 1991 та Торонто, Канада 1992); Міжнародний симпозіум з алергології та клінічної імунології (Алма-Ата, Казахстан 1992); 8_й Міжнародний конгрес з імунології (Будапешт, Угорщина 1992); 4_а Міжнародна конференція з протиракових досліджень (Ретимнон, Греція 1992); 1_й з’їзд імунологів Росії (Новосибірськ, Росія 1992); 9_а Міжнародна конференція з СНІДу (Берлін, Німеччина 1993); науково-практична конфе-ренція онкологів України (Донецьк 1993); 7_й Пленум наукового товарис-тва урологів України (Київ 1993); 18_й Міжнародний конгрес з хіміотерапії (Стокгольм, Швеція 1993); 19_й Міжнародний конгрес з хіміотерапії (Монреаль, Канада 1995); 1_а науково-практична конференція з проблем ВІЛ/СНІД з міжнародною участю (Київ, Україна 1995); 9_й Міжнародний конгрес з лікування раку (Париж, Франція 1999).

Публікації результатів досліджень. За результатами проведених досліджень опубліковано 4 журнальних статті в провідних фахових виданнях (одна з них - в закордонному виданні), 4 статті в збірниках праць (одна з них - в закордонному виданні) та 13 тез доповідей в вітчизняних та міжна-родних збірниках матеріалів конференцій та симпозіумів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослі-дження проводились на базі Інституту експериментальної патології, онко-логії і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України у відповідності з те-матикою наукових досліджень Інституту, програмою ДКНТ України, а та-кож Державною програмою досліджень з СНІДу. Дослідження були також узгодженні з тематиками НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.Громашевського МОЗ України та Інституту урології та нефрології АМН України, на базі яких було виконано частину досліджень. Перещеп-лювані лінії клітин мишачої лімфоми, які продукують ендогенні ретрові-руси, були одержані на основі штамів лімфом, що були індуковані Вас.megaterium H. в рамках досліджень, започаткованих чл.-кор. НАН України Д.Г.Затулою.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто було визначено план досліджень та виконано більшу частину експериментальної роботи, зокрема комплекс вірусологічних досліджень та експерименти з визначення активності 2_А синтетази в первинних пухлинних клітинах, мононуклеарах периферійної крові здорових донорів та хворих, а також в перещеплю-ваних лініях пухлинних клітин різного генезу, включаючи і лінії мишачих лімфом, вперше одержаних автором з пухлин, індукованих бактеріями. Здобувач також особисто виконав експерименти по визначенню активності ІФН в культуральній рідині первинних та перещеплюваних ліній клітин та в сироватці здорових донорів і хворих, а також експерименти з визначення функціональної активності ефекторних клітин імунної системи. Здобувач виконав статистичну обробку одержаних даних та приймав безпосередню участь в оформленні матеріалів та підготовці їх до публікації.

На окремих етапах роботи дослідження проводились спільно з іншими співробітниками. Дослідження з клітинами, що продукують ВІЛ, проводили на базі лабораторії загальної вірусології НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.Громашевського МОЗ України за участю д.м.н. С.Рибалко. Дослідження властивостей ендогенних ретровірусів мишей проводились разом з к.м.н. П.Верхацьким (ІЕПОР). При прове-денні досліджень були використані оригінальні ліпідно-вітамінні компози-ції, розроблені к.м.н. І.Хаєцьким (ІЕПОР). Електрофоретичний аналіз синтезованих олігоаденілатів було проведено за допомогою к.б.н. З.Петрушенко (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ). Препарати тРНК, які були попередньо виділені та охарактеризовані, були люб’язно надані к.м.н. А.Верхацькою, дослідження ролі природних активаторів ферментів системи ІФН були проведені за її люб’язного сприяння. Клінічний та біохімічний аналіз у хво-рих на вірусний гепатит було проведено д.м.н. С.Федорченко (клініка НДІ епідеміології та інфекційних хвороб). Морфоло-гічний аналіз препаратів раку сечового міхура та раку нирки хворих, які перебували на лікуванні в Українському НДІ урології і нефрології, було виконано на базі онкоурологічного відділення Київської міської онкологі-чної лікарні (керівник д.м.н. В.Кліменко). Відбір хворих та одержання опе-раційного матеріалу проводили за сприяння к.м.н. В.Григоренка.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 188 стор. машинописного тексту. Вона складається з вступу, огляду літератури (2 розділи), чотирьох розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел, який займає 30 стор. і містить 298 джерел. Дисертація містить 18 таблиць та 20 ілюстрацій.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи. Дослідження проводили на первинних культурах мононуклеарів периферійної крові, первинних культурах клітин раку сечового міхура та нирки та перещеплюваних лініях пухлинних клітин різного генезу. Всього було проаналізовано 12 первинних культур мононуклеарів периферійної крові здорових донорів, 20 первинних культур мононуклеарів периферійної крові хворих на вірусний гепатит В, 7 первинних культур клітин раку нирки, 29 первинних культур раку сечового міхура, 18 первинних культурах мононуклеарів периферійної крові хворих на рак сечового міхура, 5 культур лімфоцитів, які інфільтрують пухлини (рак нирки). Показники інтерферонового статусу (рівні ІФН в сироватці та індукцію ІФН в мононуклеарах периферійної крові) аналізували у 34 здорових донорів та 34 хворих на рак сечового міхура. В процесі виконання досліджень автором було одержано 4 стабільних перещеплюваних лінії клітин мишачих лімфом.

Вірусологічні дослідження проведено як з ендогенними ретровірусами, асоційованими з клітинами мишачих лімфом, так і з ВІЛ в умовах гострої та хронічної інфекції культур лімфобластоїдних ліній людини.

В роботі використано рекомбінантні ІФН людини (альфа, бета та гамма), рекомбінантний інтерлейкін-2 та природні препарати мишачого ІФН, індукованого in vitro і in vivo.

В досліджуваних культурах було проаналізовано як базальну активність 2_5А синтетази, так і рівні її індукції при дії ІФН. Активність ферменту визначали за рівнем конверсії 3Н-АТФ до 2_А. Для фракціонування синтезованого 2_А від невключеного попередника використовували хроматографію на мініколонках ДЕАЕ-целюлози із ступінчатою елюцією та хроматографію на ДЕАЕ-целюлозі в суспензії в статичному варіанті. Окрім визначення сумарної активності 2_А синтетази за інтегральним показником, проводили також аналіз продуктів синтетазної реакції за допомогою тонкошарової хроматографії та електрофорезу в поліакриламідному гелі з сечовиною (з використанням альфа-32Р_АТФ як міченого попередника).

ІФН титрували проти 100 ТЦПД50 вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) на клітинах L41 (ІФН людини) та L929 (ІФН мишей). Типування ІФН проводили як за критерієм кислотолабільності, так і з використанням моноклональних антитіл проти людського ІФН альфа.

Визначення активності природних кілерів проводили в тесті з 3Н_уридином з використанням клітин К562 як мішеней. Визначення цитолітичної активності лімфоцитів, які інфільтрують пухлини, проводили в тесті з 3Н-уридином проти клітин Raji.

Результати та їх обговорення. Для визначення сприйнятливості клітин до екзогенного ІФН було проведено порівняльний аналіз величин базальної активності 2_А синтетази та співвідношення між рівнями базальної та індукованої ІФН активності. Зведені дані по визначенню базальної та індукованої активності 2_А синтетази в первинних культурах мононуклеарів периферійної крові та в деяких з досліджуваних перещеплюваних ліній лімфобластоїдних клітин наведені в таблиці 1.

В первинних культурах мононуклеарів периферійної крові здорових донорів величина базальної активності 2_А синтетази була відносно низькою. Обробка клітин ІФН в усіх випадках призводила до підвищення цього рівня, причому найбільші значення індукованої активності спостерігали при застосуванні ІФН альфа. Не було жодного випадку, коли б клітини донорів не відреагували б на той чи інший ІФН, хоча певної кореляції між вихідним рівнем активності ферменту та кратністю його підвищення при дії ІФН не існувало.

При вивченні тих же показників в мононуклеарах периферійної крові хворих на вірусний гепатит В, було встановлено, що у деяких хворих базальний рівень не відрізняється суттєво від такого у здорових донорів, в той час як в інших випадках спостерігається підвищення базальних рівнів майже на порядок. Характер індукції ферменту після інкубації клітин з ІФН розрізнявся в залежності від вихідних рівнів активності ферменту, а саме, в підгрупі з високими значеннями базальних рівнів активності для жодного з ІФН не було відзначено подальшого суттєвого підвищення активності 2_5А синтетази.

Значення інтегральної базальної активності 2_А синтетази в мононуклеарах периферійної крові хворих на рак сечового міхура були не набагато вищими за такі в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів. Підвищення рівнів активності ферменту після інкубації мононуклеарів периферійної крові таких хворих з будь-яким з рекомбінантних ІФН виражене в меншій мірі в порівнянні з відповідними показниками для здорових донорів.

Аналіз показників активності 2_А синтетази в перещеплюваних лініях трансформованих клітин показав, що в багатьох з них рівні базальної активності суттєво збільшені, разом з тим подальше зростання активності при індукції ІФН сягає в ряді випадків досить значних рівнів. Так, зокрема, в клітинах Raji активність 2_А синтетази після інкубації клітин з ІФН альфа збільшувалась приблизно в 90 разів.

Середній показник базальної активності 2_А синтетази в клітинах раку нирки був дещо вищим, ніж в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів, але значно нижчим від базальних значень в перещеплюваних лініях клітин різного генезу. Практично такі ж дані були одержані і при визначенні базальної активності ферменту в клітинах раку сечового міхура (таблиця 2). Рівні індукованої активності ферменту свідчать про те, що в багатьох випадках клітини раку нирки та раку сечового міхура є сприйнятливими до дії ІФН, хоча відносний рівень зростання був порівняно невеликим. При аналізі індивідуальних даних в первинних культурах раку нирки можна було простежити зворотну залежність кратності зростання активності ферменту при дії ІФН альфа чи бета від вихідного рівня активності. У випадку раку сечового міхура середня кратність збільшення рівнів активності під впливом ІФН різних типів була вищою в порівнянні з клітинами раку нирки. Кратність збільшення активності синтетази була більш значною при застосуванні ІФН бета, причому найбільш вираженим ефект був в групах чоловіків старших за 50 років.

Таблиця 1

Вихідні та індуковані рівні активності 2-5А синтетази в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів, хворих на вірусний гепатит В, хворих на рак сечового міхура та в лімфобластоїдних клітинах перещеплюваних ліній

Джерело клітин | Вихідний рівень активності* | Рівень активності після обробки ІФН*

ІФН альфа | ІФН бета | ІФН гамма

Здорові донори | 12,28,7 | 80,057,9 | 41,030,5 | 39,219,7

Хворі на вірусний гепатит В | 1-а підгрупа | 104,7 25,5 | 147,631,1** | 117,018,8** | 135,823,2**

2-а підгрупа | 13,53,6*** | 78,033.1 | 39,313,4 | 44,26,9

Хворі на рак сечового міхура | 19,26,8*** | 42,115,3 | 31,512,6** | 37,512,7**

Перещеплювані лінії лімфобластоїдних клітин

Raji | 36±4 | 3250±1525 | _ | 85±32

СЕМ | 75±12 | 1870±943 | _ | 168±54

*- активність 2_А синтетази виражали в пмоль 3Н-АТФ, конвертованого до 2_А за 1 годину на 105 клітин

**-різниця в порівнянні з вихідним рівнем недостовірна (р>0,05)

***-різниця в порівнянні з показниками у здорових донорів недостовірна (р>0,05)

Було проаналізовано також співвідношення між рівнями базальної та індукованої активності 2_А синтетази та рівнями ендогенного ІФН, а також деякими показниками, що характеризують функціональну спроможність ефекторних клітин імунної системи. В перещеплюваних лініях як віруспродукуючих, так і віруснепродукуючих пухлинних клітин, незважаючи на підвищені рівні базальної активності ферменту, титри ендогенного ІФН в культуральному середовищі були на межі чутливості визначення.

У хворих на рак сечового міхура відносне зменшення сприйнятливості мононуклеарів периферійної крові до ІФН за критеріями індукції в них 2_А синтетази супроводжується збільшенням рівнів ІФН гамма в сироватці крові та зменшенням функціональної спроможності природних кілерних клітин, яка частково відновлюється при їх інкубації з ІФН альфа (рис. 1).

Таблиця 2

Вихідні та індуковані рівні активності 2-5А синтетази в первинних культурах раку нирки та раку сечового міхура*

Група хворих | Вихідний рівень активності | Рівень активності після обробки ІФН

ІФН альфа | ІФН бета | ІФН гамма

Рак нирки

Всі хворі | 3016 | 10660 | 9448 | 7339

Рак сечового міхура

Чоловіки молодші 50 років | 156 | 7338 | 9233 | 6323

Жінки молодші 50 років | 2710 | 10224 | 13677 | 7915

Чоловіки старші за 50 років | 2317 | 15135 | 23843 | 9520

Жінки старші за 50 років | 1710 | 85 21 | 1857 | 8515

Хворі, яким проводили передопераційні інстиляції ІФН альфа | 258 | 12823 | 17333 | 10215

*- активність 2_А синтетази виражали в пмоль 3Н-АТФ, конвертованого до 2_А за 1 годину на 105 клітин

Інкубація з ІФН альфа культур, одержаних при культивуванні in vitro в присутності ІЛ-2 лімфоцитів, які інфільтрують ракові пухлини нирки, призводить до збільшення показників їх цитолітичної активності, що супроводжується збільшенням рівнів активності індукованої 2_А синтетази.

За допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі було проаналізовано профілі олігоаденілатів, синтезованих в безклітинних системах. В умовах стандартної синтетазної реакції з лізатами клітин, проінкубованих з ІФН, виявляються типові фосфорильовані та нефосфорильовані форми олігоаденілатів, причому в багатьох випадках переважають фосфорильовані форми. Вилучення дволанцюгової РНК з інкубаційної суміші призводить до повної втрати нефосфорильованих форм олігоаденілату. Саме використання цього методу аналізу продуктів 2_А синтетазної реакції дозволило продемонструвати збільшення активності ферменту в лізатах, одержаних з культур лімфоцитів, які інфільтрують пухлини, що проявлялось як в збільшенні інтенсивності існуючих смуг 2_А, так і в появі додаткових смуг.

Аналіз продуктів синтетазної реакції за допомогою тонкошарової хроматографії та електрофорезу дозволив продемонструвати, що очищені препарати тРНК можуть правити за активатори 2_А синтетази, хоча для ефективного синтезу необхідно використовувати тРНК в кількостях, що практично на порядок перевищують такі для поліІ-поліЦ. Форми олігоаденілатів, що синтезуються в присутності тРНК, мало відрізняються від тих, що синтезуються в присутності поліІ-поліЦ.

Рис. 1. Вплив ІФН на активність природних кілерних клітин хворих на рак сечового міхура:1 - у здорових донорів; 2-5 - у хворих на рак сечового міхура:2-без обробки ІФН; 3-обробка ІФН альфа; 4-обробка ІФН бета; 5-обробка ІФН гамма. Цитотоксичність - в літичних одиницях на 107 клітин

Взаємодію ретиноїдів з системою ІФН та безпосередні ефекти ретиноїдів на проліферацію клітин та репродукцію вірусів вивчали в перешеплюваних лініях пухлинних клітин (в тому числі і в системах інтегрованої ретровірусної інфекції), а також в первинних культурах клітин раку сечового міхура. Ретиноїди справляють помітний гальмівний ефект на проліферацію клітин мишачої лімфоми (рис. 2). При цьому в тій же системі гальмування продукції ендогенних ретровірусів було виявлено лише за умови постійного підтримання культури в експоненційній фазі росту, при досягненні культурою стаціонарної фази було виявлено навіть деяке підсилення репродукції вірусів.

Культивування ВІЛ-інфікованих клітин в присутності ретиноїдів в системах як гострої, так і хронічної інфекції не супроводжується помітними змінами експресії вірусу, але при цьому відбувається суттєве пригнічення його інфекційності (табл. 3).

Попередня інкубація клітин Нер-2 в присутності ретиноєвої кислоти спричинює потенціювання щодо наступної індукції синтетази під впливом екзогенного ІФН альфа. Збільшення рівнів індукованої активності синтетази є досить суттєвим і носить дозозалежний характер (рис. 3).

Аналогічний ефект підсилення індукції синтетази при інкубуванні з ретиноєвою кислотою та ІФН альфа було виявлено і в первинних культурах пухлинних клітин деяких хворих на рак сечового міхура Таким чином, ефекти модулювання дії ІФН ретиноїдами в первинних та перещеплюваних культурах пухлинних клітин можуть частково опосередковуватись через систему 2_А.

Таблиця 3.

Вплив ІФН та ретиноїдів на репродукцію та інфекційність ВІЛ в хронічно інфікованих клітинах МТ4/ВІІІ

Препарат | Експресія ВІЛ за титром р24* | Інфекційний титр на клітинах МТ4** | Активність зворотної транскриптази***

| 1:102400 | 10-8 | 13,0

ІФН альфа | 1:51200 | 10-4 | 10,6

Ретинолацетат | 1:25600 | 10-6 | 7,3

*- Титр р24 визначали методом імуноферментного аналізу

**-Інфекційний титр ВІЛ визначали як таке крайнє розведення культуральної рідини, при інфікуванні в якому культур МТ4 через 5 діб в культуральній рідині останніх ще можна було достовірно визначити титр р24

***- Результати визначення наведені в тис.імп./хв. включення 3Н-ТТФ до ТХО-нерозчинної фракції на екзогенній матриці полі рА -оліго дТ

Рис.2. Вплив ретиноєвої кислоти на проліферацію клітин лімфоми ОН_.

Рис. 3. Вплив ретиноєвої кислоти (РК) на індукцію 2-5А синтетази ІФН альфа в клітинах Нер-2:1 - клітини прокультивовані без РК та без ІФН; 2 - клітини прокультивовані в присутності 10 мкмоль/л РК без наступної обробки ІФН; 3 - клітини прокультивовані в присутності 100 МО/мл ІФН альфа без попередньої інкубації в присутності РК; 4 - клітини були попередньо прокультивовані в присутності 1 мкмоль/мл РК, а потім оброблені 100 МО/мл ІФН альфа; 5 - клітини були попередньо прокультивовані в присутності 10 мкмоль/мл РК, а потім оброблені 100 МО/мл ІФН альфа

ВИСНОВКИ

1.Проведено порівняльний аналіз залежності між вихідними та індукованими ІФН рівнями 2-5А синтетази в перещеплюваних лініях та первинних культурах пухлинних клітин людини, в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів, онкоурологічних хворих та хворих на вірусний гепатит В. Показано, що первинні культури клітин раку сечового міхура та раку нирки в більшості випадків сприйнятливі до дії ІФН. Рівень індукції 2-5А синтетази в мононуклеарах периферійної крові онкологічних хворих нижчій за такий у здорових людей, а мононуклеари периферійної крові значної частини хворих на вірусний гепатит В з підвищеними вихідними рівнями активності ферменту були рефрактерними до дії ІФН за цим показником.

2.Встановлено, що зменшення сприйнятливості мононуклеарів периферійної крові онкоурологічних хворих до екзогенного ІФН супроводжується зниженням функціональної активності природних клітин-кілерів та підвищенням рівнів ІФН гамма в сироватці цих хворих. Підсилення цитолітичної активності лімфоцитів, асоційованих з пухлинами, при інкубації цих клітин з ІФН альфа супроводжується збільшенням активності 2_А синтетази.

3.Одержано серію перещеплюваних клітинних ліній мишачих лімфом, які можуть слугувати за модель для одночасного вивчення впливу факторів, що модулюють дію ІФН, на проліферацію клітин та репродукцію інтегрованих ретровірусів.

4.Показано, що в безклітинних системах очищені препарати природних тРНК можуть правити за активатори 2-5А синтетази замість штучних активаторів - длРНК, що дозволяє передбачати можливості такого функціонування тРНК і в природних умовах.

5.Доведено, що ретиноїди можуть за певних умов бути індукторами ІФН. Інкубація з ретиноїдами призводила до помітного гальмування росту клітин перещеплюваних ліній мишачих лімфом та до суттєвого зниження інфекційного титру ВІЛ. Показано, що ефекти модулювання дії ІФН ретиноїдами в первинних та перещеплюваних культурах пухлинних клітин можуть опосередковуватись через систему 2_А.

6.Показники активності 2_А синтетази, ключового ферменту системи ІФН, можуть використовуватись для визначення сприйнятливості клітин до ІФН та модуляції дії ІФН під впливом ретиноїдів.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

АНОТАЦІЯ

Завелевич М.П. Система 2-5 олігоаденілату в пухлинних та вірусінфікованих клітинах при дії інтерферонів та її модуляція ретиноїдами. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, Український науково-дослідний інститут онкології і радіології МОЗ України, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено