ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КРАВЧЕНКО НІНА ОЛЕКСІЇВНА

УДК 616.153:577. 112. 856: 575. 113

ДИСЛІПОПРОТЕЇДЕМІЯ, ХbaI РЕСТРИКЦІЙНИЙ ПОЛІМОРФІЗМ ТА СТРУКТУРА 3’-ГІПЕРВАРІАБЕЛЬНОЇ ОБЛАСТІ ГЕНА АПО В

03.00.15. - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ХАРКІВ- 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті терапії Академії медичних наук України

Науковий керівник - доктор медичних наук Целуйко Віра Йосипівна

Інститут терапії АМН України,

завідувач відділом генетики атеросклерозу.

Офіційні опоненти - доктор медичних наук, професор

Ковальова Ольга Миколаївна, Харківський

державний медичний університет, завідувач

кафедрою пропедевтики внутрішніх хвороб №1

- кандидат біологічних наук Клімова Олена

Михайлівна, Харківський інститут загальної

та невідкладної хірургії, завідувач лабораторно-

діагностичним відділом

Провідна установа - Iнститут молекулярної біології і генетики НАН

України, місто Київ, відділ регуляторних

механізмів клітини

Захист відбудеться “ 22 “,березня 2000 р. о 1400 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради К64.051.18 при Харківському національному університеті за адресою: 31007, м. Харків, майдан Свободи, 4, аудиторія 3-15.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Харківського національного університету (31077, м.Харків, майдан Свободи,4)

Автореферат розісланий 17 лютого 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради А. В. Некрасова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Згідно даних епідеміологічних досліджень, розповсюдженність генетично зумовлених чинників ризику атеросклерозу (АС), ішемічної хвороби серця (ІХС) в різноманітних популяціях висока і коливається в межах від 42 до 67 % (Tao S.G., et al.,1993). При обстеженні сімей виникають труднощі в розмежуванні генетичних чинників і факторів довкілля, які зумовлені укладом життя і звичками. Поліморфні генетичні системи, біохімічно і патофізіологічно пов'язані з хворобою, служать “генетичним тлом”, що підвищує імовірність розвитку захворювання. Необхідність в ідентифікації мутації і з'ясування їхнього вкладу в дисліпопротеїдемію також зумовлені тим, що різноманітні генетичні порушення можуть мати схожі фенотипічні прояви. В популяційних дослідженнях отримані різні результати стосовно звязку між ХbаI рестрикційним поліморфізмом гена апоВ (екзон 26, кодон 2488), ліпідами та атеросклерозом (Talmud et al., 1989, Jasgues et al., 1994). Популяційні дослідження, спрямовані на виявлення розповсюдженності генотипів та характеру звязку між ХbаI рестрикційним поліморфізмом на Україні проведені вперше. Для окремих популяцій встановлена асоціація цього типу поліморфізма з підвищеним рівнем ліпідів в той час як для інших популяцій такого взаємозв'язку не встановлено. Причина полягає в наявності або відсутності нерівноваги по зчепленню зі значущою і на цей час невстановленою мутацією, яка безпосередньо впливає на метаболізм апоВ в складі ліпопротеїдів. На Україні були проведені окремі популяційні дослідження 3-VNTR (гіперваріабельна кількість тандемних повторень) гена апоВ з метою встановлення розповсюдженності окремих алелей та індекса гетерозиготності (Кравченко С. А. та інші, 1997). Зв’зок між структурою 3-гіперваріабельної ділянки гена апоВ і рівнем ліпідів не вивчався.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертацію виконано відповідно плану науково-дослідної роботи Інтитута терапії АМН України “Вивчення функціонального стану генів, що контролюють ліпідний обмін, в популяційних дослідженнях в осіб з дисліпопротеїдемією” (№ державної реєстрації 0195U009082)

Мета дослідження полягала в розробці генетичних маркерів атерогенних дисліпопротеїдемій на підставі вивчення Хbа1-рестрикційного поліморфізма і особливостей будови 3-гіперваріабельної ділянки гена апоВ. Досягнення поставленої мети передбачало рішення ряду задач:

1. Створити банк ДНК осіб з дисліпопротеїдемією і нормоліпідемією.

2. Підібрати праймери для проведення полімеразної ланцюгової реакції.

Підібрати оптимальні умови реакції (температурний режим, титри компонентів ампліфікуючої суміші) для проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

3. Визначити розповсюдженність ХbаI поліморфізму та елементів 3- області з варіабельною кількістю тандемних повторень (3-VNTR) гена апоВ в групі осіб з гіперліпідемією і нормоліпідемією.

4. Встановити характер взаємозв'язку між поліморфізмом гена апоВ та рівнем ліпідних і апобілкових фракцій.

5. Визначити ступінь адитивного впливу двох типів поліморфізму гена апоВ на рівень ліпідів та апобілків.

6. Виявити найбільш атерогенні поєднання алелей.

7. Встановити характер зв’зку між поліморфними алелями та клінічними фенотипами.

Наукова новизна. Проведені дослідження дозволили встановити закономірності відносно звязку атерогенності профілю ліпідів плазми з ХbаI рестрикційним поліморфізмом і алельним поліморфізмом 3-гіперваріабельної ділянки гена апоВ.

Виявлена залежність між рівнем ліпідів плазми крові та ХbаI рестрикційним поліморфізмом (екзон 26, кодон 2488). Присутність сайту рестрикції повязана з високим рівнем холестерина (ХС) і тригліцеридів (ТГ). Встановлена поширенність ХbаI рестрикційного сайту та поліморфних алелей 3’-VNTR серед осіб з ІХС і в контрольній групі.

Доведено, що кількість повторів в 3- гіперваріабельній області гена апоВ менше 34 та понад 36 супроводжуються атерогенними змінами ліпідного спектра сироватки крові. При кількості повторів менше 34 відзначене зниження рівня ХС ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ), яким притаманні антиатерогенні властивості, в той час як при кількості тандемних повторень більше 36 - підвищення ХС і апоВ.

Встановлено нерівновагу по зчепленню між Х+ алелею (сайт рестрикції присутній) зі структурою 3-гіперваріабельної області, що містить більш ніж 36 гіперваріабельних елементів, та між Х- алелею (сайт рестрикції відсутній) і кількістю тандемних повторів менше 34.

Встановлено, що найбільш атерогенним поліморфізмом гена апоВ є поєднання гомозиготності по ХbаI рестрикційному сайту з кількістю тандемних повторень в 3 -VNTR понад 36.

Показано звязок між клінічними фенотипами та поліморфними сайтами. Практичне та теоритичне значення роботи. Виявлені генетичні маркери атерогенних дисліпопротеїдемій (ДЛП) дозволять відокремити групу осіб з підвищеним ризиком розвитку АС, ІХС на доклінічній стадії, що надасть можливість впровадити вчасні профілактичні заходи. Відомо, що різні мутації можуть мати однакові клінічні прояви, тому на клінічній стадії ДЛП визначення генетичних маркерів стане основою при виборі гіполіпідемічних препаратів.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи викладено й обговорено на науково-практичних конференціях Інституту терапії АМН України (1994-1999 рр.), III з'їзді кардіологів (Budapest, 1995р.), IV конгресі кардіологів України (м. Київ, 1997р.), ХIVз'їзді терапевтів України (м.Київ,1998 р.), I конгресі Асоціації кардіологів СНГ (м.Москва,1997 р.). Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 3 статті, 5 тезисів.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 129 сторінках машинопису та складається зі вступу, огляду літератури, пяти розділів власних досліджень, висновків, списку літератури (169 джерел). Дисертаційна робота ілюстрована 14 таблицями, 8 фотографіями електрофореграм, 17 рисунками.

Декларація конкретного особистого внеску в розробку наукових результатів. Дисертантом створено банк ДНК осіб з ІХС і контрольної групи. Отримані ампліфікати досліджуваних ділянок гена апоВ (екзон 26 і 3-гіперваріабельна область), проведена ідентифікація довжини фрагментів та імуноферментне визначення рівня апобілків крові, полімеразна ланцюгова реакція, рестрикційний аналіз, електрофорез рестриктів та ампліфікатів в агарозному гелі, проведена ідентифікація генотипів. Самостійно проведено узагальнення та інтерпретація результатів.

ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

ДНК виділяли з лейкоцитів стандартним засобом екстракції фенолом/хлороформом. Копії досліджуваних ділянок гена одержували ПЛР з використанням термоциклера “Біоком” (м. Москва) і реактивів фірми Fermentas (м. Вільнюс). Для визначення точкової мутації був застосований рестрикційний аналіз (ХbаI-рестриктаза). Ідентифікація ампліфікатів і рестриктів була проведена електрофорезом в 2 % агарозному гелі. В якості маркера довжин фрагментів використана ДНК фага/Есо47. Для визначення вмісту апобілків застосовано неконкурентний імуноферментний метод з використанням антитіл до апоВ та апоАI (м. С.-Петербург). Рівень ліпідів визначено ферментативним методом наборами фірми “Boehringer - Mannheim” (ФРН-Австрія). Клінічне обстеження осіб з ДЛП і нормоліпідемією проводилося в відділі генетики атеросклероза Інституту терапії. Випадки вторинних ДЛП, супутнього синдрома при таких захворюваннях як діабет, гіпотіреоз, хронічна ниркова недостатність, нефротичний синдром, холестаз, алкоголізм, були виключені. Математична обробка результатів і вірогідність отриманих даних проводили по t-критеріям Стьюдента, критерію 2.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

АпоВ-100 - один з найбільших білків, який циркулюе в судинному руслі, характеризується низькою розчинністю, що ускладнює дослідження білкової молекули. Значний прогрес у визначенні атерогенності апоВ був досягнутий з відкриттям ПЛР. Використання основних принципів ПЛР з урахуванням особливостей структури ділянок ДНК, що досліджуються, і праймерів з високою температурою відпалювання дозволило ампліфікувати специфічні ділянки гена апоВ: 3-VNTR і ділянки з Хbа1 рестрикційним сайтом довжиною в 218 н.п. (екзон 26, кодон 2488). Застосування олігонуклеотидних праймерів, що містять значну масову частку C|G пар з високою температурою відпалювання, підвищило специфічність ПЛР. В аналогічних дослідженнях з метою збільшення виходу продукта реакції 3-VNTR ділянки гена апоВ були послідовно використані дві пари олігонуклеотидных праймерів. Рестрикційний аналіз фрагментів ДНК гена авоВ (екзон 26), отриманих в результаті ПЛР показав, що ступінь гетерозиготності по Хbа1 рестрикційному поліморфізму склала 0.46. Отримані дані узгоджуються з результатами досліджень, проведених в Європейських країнах (Innerarity T.L., et al., 1990). В контрольній групі розповсюдженність Х+Х+ генотипу (сайт рестрикції присутній) була нижчою порівняно з ДЛП і становила 18 % в той час як в групі осіб з ДЛП -34% (2= 15,8; р<0.001). Масова частка гетерозигот в групах не відрізнялась і становила 46 % і 52 %, відповідно (рис.1).

Дисліпопротеїдемія Контрольна група

Рис. 1. Розповсідженність генотипів по ХbаI рестрикційному полімофізму серед осіб з ДЛП і в контрольній групі.

Проведено аналіз ліпідних фракцій при різних генотипах по Хbа1 рестрикційному поліморфізму. Згідно отриманим даним, середнє значення рівня -холестерина при Х+Х+ генотипі нижче у порівнянні з Х-Х - генотипом (р<0,01) і складає 40.8 0,6 мг/дл і 42.900,6 мг/дл, відповідно. Відзначене підвищення рівня загального холестерину (ЗХС) у осіб з Х+Х+ генотипом у порівнянні з гомозиготами без сайта рестрикції 2413 мг/дл і 2204 мг/дл, відповідно (р<0,01). Встановлене значне підвищення рівня ТГ при Х+Х+ генотипі у порівнянні з Х-Х -: 1488 мг/дл і 1135 мг/дл, що склало 23.6 % (р<0,001). Відповідні показники у гетерозигот мають проміжне значення у порівнянні з Х-Х - і Х+Х+ генотипами (рис. 2).

Рис. 2. Рівень ліпідів плазми у осіб з різним генотипом по ХbаI рестрикційному поліморфізму.

Згідно дослідженням Таlmud і ін. (1993), Хbа1 рестрикційний поліморфізм в різних популяціях визначає 4 - 10 % варіабельності рівня ЗХС. В даних дослідженнях Хbа1 поліморфізма довжин рестрикційних фрагментів (ПДРФ) гена апоВ в групі осіб з гиперліпідемією і нормоліпідемією було виявлено, що присутність одного Хbа1 сайта рестрикції повязана з 4 % підвищенням рівня ЗХС а у гомозигот Х+Х+ підвищення склало 8 % у порівнянні з гомозиготами Х-Х-. Вірогідних відзначень рівня апобілків в групах не встановлено (табл.1).

Таблиця 1. Рівень апоАI, апоВ (г/л) у осіб з різним генотипом по ХbаI рестрикційному поліморфізму гена апоВ (р>0,05).

Генотип | АпоАI | АпоВ

Х-Х- (n=54) | 1,290,09 | 1,090,06

Х-Х+ (n=99) | 1,340,05 | 1,150,05

Х+Х+ (n=43) | 1,370,09 | 1,060,07

Відомо, що гіпо--холестеринемія часто перебігає на тлі підвищеного рівня ТГ. При порівнянні груп з різним генотипом серед осіб з низьким рівнем антиатерогенної ліпідної фракції - ЛПВЩ встановлена зворотня кореляційна залежність між рівнем ТГ і апоА1 в групі осіб з Х+Х+ генотипом (r=-0,76; р<0,05). Рівень ЗХС у Х+Х+ гомозигот на 12 % вище у порівнянні з Х-Х - генотипом і складав 2385 мг/дл і 2115 мг/дл, відповідно (р<0,001). Відзнак в рівні ліпопротеїдів низької щільності (ЛПНЩ) між групами не встановлено (рис.3).

Рис. 3. Рівень ліпідів в залежності від ХbаI рестрикційного поліморфізма у осіб з гіпо-- холестеринемією.

Відношення апоВ/апоА, підвищення якого є несприятливим прогностичним чинником, вище у групі осіб з Х+Х+ генотипом і складає 1.090,04, в той час як при Х-Х - генотипі - 0.820,03 (р0.001). Підвищений рівень ТГ, відзначений як в групі з гіпо--холестеринемією, так і при IIа, IIб типах гіперліпідемії у випадку Х+Х+ генотипа в порівнянні з Х-Х - гомозиготами доводить, що Хbа1 поліморфізм впливає на рівень ліпідів (табл. 2).

Значення відношення ТГ/ЗХС при Х+Х+ генотипі вище у порівнянні з Х-Х - (р<0,03), що свідчить про домінування в плазмі ліпопротеїдних часток з високим вмістом ТГ, тобто Х+ алель впливає на формування ліпопротеїдних часток і зумовдює домінування в крові маленьких, щільних часток ЛПНЩ, яким притаманні атерогенні властивості і збільшення часу перебування в кровообігу. Можна також припустити, що підвищення рівня ЗХС, ТГ, який не супроводжується підвищенням апоВ, свідчить про домінування в кровообігу ліпопротеїдів з проміжною щільністю (ЛППЩ) і формування IIб типу гіперліпідемії (табл. 3). Маkamurа et al. (1998) вважають, що високий рівень ЛППЩ і низький ЛПВЩ являються незалежними чинниками ішемічної хвороби серця (ІХС).

Таблица 2. Хbа1 рестрикційний поліморфізм гена апоВ і рівень ліпідів (мг/дл) і апобілків (г/л). Випадки гіпо--холестеринемії виключено (Mm)

Генотип | ХС ЛПВЩ | ЗХС | ТГ | ХС ЛПДНЩ | ХС ЛПНЩ | АпоАI | АпоВ

Х-Х-

n=22 | 44,6

0,33 | 2336 | 1004* | 21,61,81 | 1514* | 1,38

0,08* | 1,16

0,06*

Х-Х+

n=30 | 44,5

0,24 | 2295* | 1103 | 20,81,45 | 1663 | 1,21

0,05 | 1,05

0,02

Х+Х+

n=14 | 44,1

0,26 | 2556* | 1984* | 20,82,13 | 190,74* | 1,01

0,09* | 0,79

0,07*

р* |

| <0,002 | <0,001 | <0,001 | <0,002 | <0,001

Таблиця3. Молярні відношення ТГ/ХС ЛПНЩ, ТГ/ЗХС, ліпідних і апобілкових фракцій у гомо- і гетерозигот по ХbаI рестрикційному поліморфізму (Mm)

Ліпіди/

Апобілки | Х-Х-

n=54 | Х-Х+

n=99 | Х+Х+

n=43

ТГ/ ХС ЛПНЩ

(р<0,02) |

1,400,07* |

1,560,06 |

1,750,09*

ТГ / ЗХС

(р<0,03) | 1,030,06* | 1,090,05 | 1,260,08*

-ХС / ЗХС | 1,950,09 | 1,790,05 | 1,690,11

-ХС / апоА1 (p<0,02) |

0,330,01* |

0,310,01 |

0,290,02*

ЗХС / апоВ

(p<0,02) |

2,020,08* |

2,060,04 |

2,270,07*

Вірогідного підвищення рівня апоВ-100 при Х+Х+ генотипі дослідженнями не встановлено. Ці результати не узгоджуються з висунутим припущенням про те, що Хbа1 рестрикційний поліморфізм перебуває в нерівновазі зі значущою мутацією в рецептор-зв'язуючому домені гена апоВ, яка уповільнює вилучення апоВ у складі ліпопротеїдів з кровообігу. Отримані результати також не узгоджуються з припущенням про нерівновагу Хbа1 поліморфізма з мутацією в промоторній області гена апоВ, яка підвищує рівень експресії цього гена.

Природа ліпопротеїдів дуже низької щільності (ЛПДНЩ), синтезованих печінкою є дуже важливим чинником, який визначає концентрацію апоВ-100 у складі ліпопротеїдів в кровообігу (Hayek et al., 1993). Тому підвищений рівень ТГ і ЛПДНЩ вважають незалежним чинником ризику атеросклероза, ІХС. Більші частки ЛПНЩ, що містять багато ХС, утворюються при надлишку ХС ЛПВЩ, а менші - при недоліку (Miller N. E. et al., 1998). У випадку Х+Х+ генотипа відзначене деяке зниження ХС ЛПВЩ і значне підвищення рівня ТГ, що може свідчити про формування невеликих щільних часток ЛПНЩ, які характеризуються більш тривалим перебуванням в кровообігу. Збільшення кількості таких часток у фракції ЛПНЩ виявлено при синдромі Х (Levis G. F. et al. 1996). Синдром Х являє собою поєднання декількох метаболічних дефектів основними з яких є порушення толерантності до глюкози або інсуліннезалежний діабет, гіперліпідемія і схильність до розвитку атеросклероза. Детальний аналіз співвідношень ліпідних і апобілкових фракцій з урахуванням Хbа1 рестрикційного поліморфізма проведено вперше. В аналогічних дослідженнях констатовані факти присутності або відсутності зв'язку Хbа1 рестрикційного поліморфізма з рівнем ліпідів. Для значної частини популяцій, які було досліджено, взаємозв'язку між поліморфізмом і ліпідами не встановлено (Soria et al.,1989). В дослідженнях значущий зв'язок встановлений тільки для субпопуляції осіб з ІХС. В контрольній групі такої закономірності не виявлено.

3-VNTR гена апоВ є АТ-багатою областю гіперваріабельних елементів, які включають від 25 до 52 повторень. Основними характеристиками поліморфних локусів є: широка різноманітність алелей в популяції; незначна поширенність окремих алелей; високий індекс гетерозиготності; мутаційний рівень вище у порівнянні з кодуючими локусами. Даний поліморфний локус може бути використаний як маркер для сімейного аналізу зчеплення локусів хромосоми 2, вивчення генетичної гетерогенності популяції і проведення судово-медичної експертизи. Обговорюється питання про роль поліморфних локусів в атерогенезі (Attal J. et al.,1996).

Результати порівняння трьох груп, що відрізняються структурою 3-VNTR гена апоВ, привели до висносвку про існування зв'язку між рівнями ліпідних фракцій і кількістю гіперваріабельних елементів (HVE) (табл.4). Показано, що серед зразків ДНК в 3-VNTR переважають HVE кількістю 34/36 тандемних повторень, що складає 59 % від загальної кількость зразків ДНК. Зниження рівня ХС ЛПВЩ в другій групі зумовлене тим, що у 66.6 % з кількістю тандемних повторень в 3-VNTR менш 34, встановлено гіпо--холестеринемію, що в більшості випадків не супроводжувалась гіперліпідемією. Відомо, що гіпо--холестеринемія часто супроводжується підвищеним рівнем ЛПДНЩ, але така закономірність не зберігається, якщо рівень ЗХС не перевищує 200 мг/дл. В третій групі (кількість повторень більш 36) відзначений найвищий рівень ХС фракції ЛПНЩ і ТГ у порівнянні з другою групою (число тандемних повторень 34-36) (табл.4).

Таблиця 4. Рівень ліпідів (мг/дл) і апобілків (г/л) в групах осіб, які відрізняються кількістю HVE гена апоВ (Mm)

HVE | ХС

ЛПВЩ | ЗХС | ТГ | ХС

ЛПДНЩ | ХС

ЛПНЩ | АпоАI | АпоВ

< 34 (IIгр.)

n=32 | 39,1

1,2* | 2468 | 156

10* | 31,2

1,7 | 1694 | 1,37

0,09* | 1,05

0,06

34/36 (Iгр.)

n=118 | 43,4

0,7* | 2276* | 119

7* | 25,5

1,1 | 1663* | 1,28

0,06* | 1,03

0,02*

> 36 (IIIгр.)

n=47 | 42,1

1,0 | 2719* | 152

9* | 29,0

1,6 | 2027* | 1,25

0,08 | 1,39

0,07*

р*1-2

р*1-3 | 0,03 | <0,001 | <0,003

<0,004 | <0,005 |

<0,001 | <0,001 |

<0,001

Відношення апоВ/апоА1 в цій групі несприятливе. Підвищення ХС ЛПНЩ і апоВ, можливо, свідчить про накопичення в кровообігу фінального класу ліпопротеїдних часток - ЛПНЩ з відкритим лігандом - апоВ-100 (ТітовВ.Н.,1998). Рівень ЗХС нижче прикордонного відзначено у осіб з найбільш розповсюдженою кількістю тандемних повторень в 3-VNTR області гена апо В. Підвищення рівня ХС, зумовлене поліморфізмом 3-VNTR склало 16 % (р<0,001). Низьке значення відношення ТГ/ЗХС при HVE >36 у порівнянні з Х+Х+ генотипом свідчить про інший механізм формування гиперліпідемії, зумовлений підвищеним рівнем апоВ-100. Алель, яка включає велику кількість повторень в 3-VNTR області гена апоВ можна вважати незалежним маркером гіперхолестеринемії, зв'язаним з підвищенням рівня ХС фракції ЛПНЩ. Сприятливий прогноз по співвідношенню ліпідних фракцій відзначено при структурі 3-VNTR, яка містить найбільш розповсюджену кількість повторень - 36 і 34. Ліпідні показники при гаплотипі з кількістю тандемних повторень менш 34 займають проміжне положення між показниками при генотипі, який містить 36 і 34 повторень в гіперваріабельній області гена апоВ, з одного боку, і числом повторень більш 36, з іншого (табл.5).

Характер ліпідного профілю при різній структурі гіперваріабельної області гена апоВ істотно відрізняється від генотипів по Хbа1 рестрикційному поліморфізму. Якщо в останньому випадку відзначене переважне зростання ТГ при Х+Х+ генотипі, що, можливо, викликає підвищення рівня ХС, то особливістю алельного поліморфізма 3-VNTR є високе значення рівня ХС, апоВ-100 серед осіб з понад 36 HVE в 3'-області. Для осіб зі структурою 3-VNTR менш 34 HVE характерно високе відношення ХС ЛПВЩ/апоА-1.

Таблиця 5. Відношення ліпідних і апобілкових фракцій при різній кількості HVER в 3-гіперваріабельній області гена апоВ

Ліпіди

Апобілки | HVE < 34

n=32 | HVE 34/36

n=118 | HVE 36

n=47

ТГ / ЗХС (р*<0,04) | 1,280,09* | 1,060,03* | 1,140,06

-ХС / апоАI(р*<0,001) | 2,850,15* | 3,390,02* | 3,370,10

ТГ / апоВ (р*<0,002) | 1,490,08* | 1,160,07* | 1,090,09

ХС ЛПНЩ / апоВ | 1,610,15 | 1,610,10 | 1,450,14

ХС ЛПНЩ / ЗХС | 0,160,04 | 0,190,02 | 0,160,05

Відомо, що апоА-1 білок-ліпідний комплекс є акцептором гідрофобних ефірів ХС. Незважючи на велику кількість відомостей про особливості структури ЛПВЩ при блокуванні синтезу ефірів ХС, немає літературних даних, що пояснюють перетворення ЛПВЩ. Можна припустити, що високе значення відношення ХС ЛПВЩ/апоА-1 свідчить про домінування в кровообігу ЛПВЩ3, що відрізняються високим вмістом ХС у порівнянні з іншими підфракціями. Дані про зв'язок ДЛП зі структурою 3-VNTR, отримані при дослідженні різних популяцій, суперечливі. Для деяких популяцій відзначена асоціація між гіперхолестеринеміею і кількістю повторень в 3-VNTR понад 36 HVE, для окремих популяцій визначений інший тип взаємозв'язку - мала кількість повторень асоціює з високим рівнем ХС. В останній час увага дослідників до вивчення 3-області різних генів дозволила встановити цілий ряд дуже важливих фактів (Buresi et al. 1996, Balazs I. N., 1992, Deca R., 1992). В 3-області мРНК, окрім сигналів процесінга і поліаденілірування 3-кінців мРНК, виявлені сигнали, які впливають на трансляцію, стабільність і локалізацію всередині клітки цієї мРНК (Kalos M.,1995). Певно, що невідповідність між рівнем апоВ-100 в плазмі і мРНК цього білка в значному ступені визначається структурою HVE. Більш того, стало відомо, що послідовності 3- областей одніх генів можуть впливати на експресію інших (Chen B.S., 1998).).

Результати дослідження окремих поліморфних сайтів, у випадку полігенного характеру успадкування захворювання, мають обмежене прогностичне значення. В лаві випадків відзначений патологічний ефект тільки при поєднанні двох мутацій. Аналіз розподілу двох типів поліморфізма показав, що 3-VNTR з більшою кількістю повторень частіше зустрічається разом з Х+Х+ генотипом, а алелі з кількістю повторень менш 34 - з Х-Х -, що вказує на нерівновагу в перерозподілі цих алелей (Х2= 17,7

р <0, 001; 2 =54, 7; р< 0,001), (рис. 4).

A B

C

Рис. 4. Нерівновага по зчепленню між ХbаI рестрикційним поліморфізмом і структурою 3 -VNTR гена апоВ (А- група осіб з кількістю тандемних повторень менше 34, В - кількістю повторень 34-36, С - понад 36).

При дослідженні адитивного впливу двох типів поліморфізма гена апоВ встановлено, що незалежно від кількості HVE в 3-VNTR при X+ X+ генотипі рівень ТГ і ЛПДНЩ підвищений у порівнянні з іншими групами (P<0, 001). Фенотиповою особливістю прояву двох алелей (Х+Х+ і HVE >36) є поєднання гіперхолестеринемії зі зниженням рівня апо АI і підвищенням апоВ-100. Таке поєднання алелей призводить до формування атерогенного типу ДЛП, включаючого водночас декілька незалежних чинників ризику: підвищений рівень ХС (11.5 %), ТГ (23 %) і апоВ-100 (35 %) в поєднанні зі зниженням апоА-I, якому притаманні антиатерогенні властивості (табл. 6).

Відомо, що серед незалежних чинників ризику АС, ІХС одне з ведучих місць посідає надмірна вага. При аналізі поліморфізма і індекса маси тіла (ІМТ) встановлені відзнаки в рівні - холестерина при HVЕ 34/36, для інших груп такої закономірності не встановлено. Рівень ЗХС при нормальній вазі і надмірній вірогідно не відрізнявся. Відзначено підвищення ТГ і ХС ЛПДНЩ при надмірній вазі у випадку HVЕ 34/36, що склало 15 % (табл.7).

Таблиця 6. Адитивний вплив двох типів поліморфізма гена апоВ на рівень ліпідів (мг/дл) і апобілків. Порівняння ліпідного спектра при генотипі, що містить HVE 34/36 з іншими поліморфними алелями

3 -VNTR | Генотип |

XC |

ТГ | XC

ЛПДНЩ | XC

ЛПНЩ | АпоАI |

АпоВ | ХС ЛПВЩ

HVE | X-Х- (n=21) | 2406 | 1546 | 313 | 1707 | 1,390,09 | 1,070,06 | 41,50,8

<34 | X-X(n=9) | 2335 | 1255* | 253 | 17311 | 1,280,05 | 1,100,04 | 42,31,0

X+X+(n=4) | - | - | - | - | - | - | -

HVE | X-X- (n+35) | 2338** | 1258 | 255* | 1736* | 1,150,08 | 0,970,03 | 42,30,6

34/36 | X-X+ (n=59) | 2386 | 1258 | 313 | 1725** | 1,100,06 | 1,040,02 | 41,60,3

X+X+ (n=22) | 2427* | 1978 | 344 | 1697 | 1,380,08* | 0,730,03* | 39,90,7

HVE | X-X- (n=9) | 2798 | 10013* | 295 | 2149* | 1,360,11 | 1,440,15 | 43,01,4

>36 | X-X+ (n=24) | 2666** | 13110 | 253 | 2167** | 1,300,07 | 1,400,18* | 40,20,7

X+X+ (n=14) | 2719* | 2178* | 443* | 1868 | 0,870,09* | 1,300,16 | 41,00,8

p*

p** | <0,005

<0,001 | <0,004 | <0,001 | <0,001

<0,001 | <0,001 | <0,002

Таблиця7. Рівень ліпідів у осіб з ІМТ>3,6 г/см2 і в контрольній групі (ІМТ<3,6 г/мс2) при різній кількості HVE гена апоВ

HVE | ХС

ЛПВЩ | ЗХС | ТГ | ХС

ЛПНЩ | ХС ЛПДНЩ

HVE36

контроль (n=27) |

41,80,64 |

2675 |

1546* |

29,51,9 |

19510

ІМТ3,6 (n=22) | 41,20,7 | 2685 | 1367* | 32,32,3 | 20212

HVE34/36

контроль (n=76) |

44,10,6* |

2326 |

1215* |

23,01,6 |

1608

ІМТ3,6 (n=42) | 40,51,1* | 2317 | 1436* | 28,31,6 | 1699

HVE34

контроль (n=28) |

38,81,3 |

2497 |

1516 |

30,01,7 |

18211

ІМТ3,6 (n=5) | - | - | - | - | -

р*>36

р*34|36 |

0,003 | 0,05

<0,002

При дослідженні впливу типів поліморфізма на формування певних біохімічних фенотипів було виявлено, що серед субпопуляції осіб з ІХС, генотип Х-Х- поєднується з гіпо--холестеринемією і IIa типом ДЛП. Серед гомозигот по сайту рестрикції розповсюдженність IIа типу гіперліпідемії склала 60 %. Окремі випадки гіпо--холестеринемії, як правило, сполучаються з гіперхолестеринемією і склали 18 % від загальної кількості осіб з гіпо--холестеринемією в поєднанні з гіперліпідемією (табл. 8).

Таблиця 8. Розповсюдженність ХbаI рестрикційного поліморфізма і алельного поліморфізма 3-VNTR серед осіб з різними типами ДЛП (%).

Генотип | IIa | II б | гіпо -- ХС | гіпо -4 тип ДЛП

X-X- | 39 | - | 44 | 15

X-X+ | 45 | 50 | 56 | 67

X+X+ | 16 | 60 | - | 18

HVE <34 | 12 | - | 57 | 8

HVE 34/36 | 46 | 60 | 43 | 48

HVE >36 | 42 | 40 | - | 44

Серед осіб зі структурою 3-VNTR гена апоВ-100, включаючої понад 36 гіперваріабельних елементів, розповсюджений IIa і IIб тип ДЛП (2=13.5, Р<0, 005; 2 =10, 7 р <0, 005, відповідно). Всі випадки гіпо--холестеринемії сполучені з гіперліпідемією (2=16.6; р <0,001). Встановлено зв'язок між кількістю HVE менше 34 і гіпо--холестеринемією (2=20.1; р<0, 001).

Встановлено, що при Х-Х - генотипі випадки інфаркту міокарда (ІМ) серед осіб з ІХС не супроводжуються гіперліпідемією, а при Х+Х+ генотипі- поєднуються з підвищенням рівня ТГ і ЗХС. Серед осіб з ІХС, ІМ, разповсюдженність Х-Х - генотипу була декілька вищою у порівнянні з контрольною групою (38 % і 28 %, відповідно; 2=3.6; р> 0.05) (рис. 5А).

A B

Рис.5. Поширенність ХbаI рестрикційного поліморфізма (A) та алелей VNTR з 3’-області гена апоВ-100 (B) серед осіб з такими клінічними фенотипами як ІХС, ІМТ>3,6 г/см2, ІМ.

Масова частка HVE 36 серед осіб з IБС і ІМ склала 46 %, що значно вище у порівнянні з розповсюдженністю цього типу поліморфізма в популяції України (2=20.1; р<0,001) (табл.9). Кількість тандемних повторень менш ніж 34 серед осіб з IМ становить всього 5 %, що значно нижче порівняно з розповсюдженністю алелі в популяціях мешканців України.

Таблиця 9. Поширенність алелей VNTR з 3-області гена апоВ-100 в популяційних дослідженнях мешканців України (%) (Кравченко С.А. та інші 1998, Целуйко В.Й.та інші,1998)

3-NTR | Харків | Київ | Львів | Алчевськ | Україна

HVE34 | 17 | 17 | 17 | 15 | 16

HVE 34/36 | 59 | 62 | 59 | 64 | 61

HVE36 | 24 | 21 | 24 | 21 | 23

Серед осіб з діагнозом ІХС і Х-Х- генотипом встановлений підвищений рівень апоВ. Quebec Heart Study показали, що ризик судинних захворювань не збільшувався при гіпертригліцерідемії з нормальним рівнем апоВ-100, в той час як збільшення апоВ-100 і ТГ при ДЛП і підвищений рівень апоВ-100 при нормоліпідемії збільшує ризик захворювання (Lamarhe B et al.,1995). Високий рівень апоВ (понад 1.45 г/л) серед осіб з ІХС виявлено у 50 % гомозигот Х-Х -; у 40 % гетерозигот і 10% гомозигот Х+Х+.

ВИСНОВКИ

1. Розроблені оптимальні умови полімеразної ланцюгової реакції для ампліфікації ділянки гена апоВ, що поєднують застосування СG-багатих олігонуклеотидних праймерів, які характеризуються високою температурою відпалювання, з подовженням часу реакції полімерізації.

2. Х+Х+ генотип, зумовлений присутністю ХbаI рестрикційного сайта в 26 экзоні гена апоВ, впливає на підвищення рівня холестерина на 8,0 % і тригліцеридів - на 23.6 % у порівнянні з гомозиготами без сайта рестрикції і є потенційно більш атерогенним.

3. Фенотипова варіабельність рівня холестерина і аполіпопротеїна В, зумовлена VNTR поліморфізмом з 3’-області, складає 16 % і 35 %, відповідно. Алелі, які містять понад 36 тандемних повторень, пов’язані з надмірною вагою і з гіперліпідемією.

4. Встановлена нерівновага по зчепленню між Х+ - гаплотипом і кількістю тандемних повторень більше 36 (2=17.7 р 0.001), а Х - гаплотипа - з, кількістю тандемных повторень менше 34 (2=54.7 р 0.001).

5. Розроблені “генетичні маркери” атерогенних дисліпопротеїдемій. Генотип, в якому поєднана гомозиготність по ХbаI поліморфізму (сайт рестрикції присутній) з кількістю тандемних повторень понад 36 фенотипово виявляється найбільш атерогенними типами дисліпопротеї-демій.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Кравченко Н.А. Связь полиморфизма гена апоВ с дис-липопротеидемией как причиной атеросклероза // Цитология и генетика -1995.-Т.29.-С. 83-85.

2. Целуйко В.И., Кравченко Н.А., Шуть И.В., Черкашина В.И. Связь полиморфизма длины рестрикционных фрагментов гена апоВ с липидным спектром крови у больных ишемической болезнью сердца //Цитология и генетика .-1994.-Т. 28.- С. 73-77.

3. Целуйко В.И., Кравченко Н.А., Чернышов В.А.,Максимова Н.А., Назаренко И.Л. Генотип апоВ и эффективность гиполипидемической терапии //Цитология и генетика-1998.-№ 1.- С.126-134.

4. Кравченко Н.А. Детерминированность уровня плазменных триглицеридов и холестерина полиморфизмом гена апоВ // Матеріали науково-практичної коференції “Сучасний стан медичної генетики в Україні",19-20 травня 1998 р. Київ.- С.86.

5. Целуйко В.И., Кравченко Н.А. , Кантемир Е.В. Генетика заболева-ний сердечно-сосудистой системы // Матеріали науково-практичної коференції “Сучасний стан медичної генетики в Україні, 19-20 травня1998р. Київ.-С.149.

6. Целуйко В.И., Кравченко Н.А.,Чернышов В.А., Максимова Н.А., Шуть И.В. ДНК-полиморфизм гена апо-В и эффективность липантила // I конгресс Ассоциации кардиологов стран СНГ: Москва, 20-23 мая1997 г.-М.,1997.-С.80.

7. Целуйко В.И., Кантемир Е.В., Кравченко Н.А., Шуть И.В. Генетические маркеры дислипопротеидемии // XIV з'iзд терапевтiв Украiни: -Киiв, 1998.-С.71.

8. Tseluiko V., Kravschenko N., Kovalevskaya O., Maksimova N. Effectiveness of hipolipidemic therapiy and DNA - polymorphism of gene apoB // Cardiology Hungarica Abstracts 3rd Alpe-Adria Cardiology Meeting, Budapest, Hungary, May 17-20. -1995-Suppl. 3.-P. 42.

АНОТАЦІЯ

Кравченко Н. О. Дисліпопротеїдемія, ХbаI рестрикційний поліморфізм і структура 3'-гіперваріабельної області гена апоВ (на правах рукопису).

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук з спеціальності 03.00. 15. Генетика /Інститут терапії АМН України, 1999р., м. Харків.

Встановлено, що рівень холестерина на 8 % і тригліцеридів на 24% вище у осіб з Х+Х+ генотипом (екзон 26), в той час як рівень ліпопротеїдів високої щільності, які характеризуються антиатерогенними властивостями, знижений в порівнянні з гомозиготами Х-Х-. Виявлено взаємозв'язок між Х+Х+ генотипом і клінічними фенотипами. В субпопуляції осіб з ДЛП цей генотип фенотипово виявляється IIб типом гіперліпідемії. Варіабельність рівня холестерину і апоВ, зумовлена структурою 3'-VNTR гена апоВ, становить 16 % і 35 %, відповідно. Алель, яка включає більше 36 тандемних повторень також асоціює з таким фактором ризику атеросклерозу як надлишкова маса тіла. Алель з кількістю тандемних повторень менше 34 асоціює з таким чинником ризику атеросклерозу, як низький рівень ХС ЛПВЩ. Гіпо--холестеринемія, як правило, не супроводжується гіперліпідемією. Встановлена нерівновага по зчепленню між Х+ алелею і кількістю повторень понад 36 в 3'-гіперваріабельній області гена апоВ, а Х - гаплотипу - з кількістю тандемних повторень менше 34. Фенотипічною особливістю прояву такого поєднання алелей є гіперхолестеринемія, підвищенний рівень апоВ і ТГ на тлі гіпо--холестеринемії. Поєднання Х+Х+ генотипу з кількістю повторень більше 36 в 3'-гіперваріабельній області гена апоВ визнаний як найбільш атерогенний.

Ключові слова: ген апоВ, полімеразна ланцюгова реакція, ХbаI рестрикційний поліморфізм, 3’-гіперваріабельна область, дисліпопротеїдемія, холестерин, тригліцериди, атеросклероз.

ANNOTATION

Кravchenko N.А. Dislipoproteidemia, ХbаI restrictional polymorphism and structure of 3 '-hypervariable region of a gene аpоВ (on the rights of the manuscript).

Dissertation on competitions of a scientific degree of the candidate of biological sciences on a speciality 03.00.15.-genetic -Institute of therapy АМS of Ukraine, 1999, Kharkov

Is marked, that level of a cholesterol on 8 % and triglycerides on 24 % is higher at the persons with Х + Х + genotype (exon 26), while a level of lipoproteins high-density, having by antiatherogenous properties is lowered, in comparison with homozygotes Х-Х-. In a subpopulation of the persons with dislipoproteidemia this genotype is shown IIв by a type of a lipidemia. The amount of repetitions in 3'-VNTR of a gene аpоВ determines a level of a cholesterol and аpo В. Variation of a level of a cholesterol and аpоВ, caused by structure 3'-VNTR of a gene аpоВ, it has made 16 % and 35 %, accordingly. Allele including more than 36 tandem of repetitions also аssociated with such factor of risk of development of an atherosclerosis as exuberant weight of a body. An allele with amount tandem of repetitions less than 34 аssociated with such factor of risk of an atherosclerosis as low level of a CH LHD. Hypo--cholesterinemia, as a rule, is not accompanied by a lipidemia. Is established unequilibrium between Х + allele and plenty of repetitions (more than 36) in 3 '-VNTR of a gene аpоВ, and X- haplotype with quantity tandem of repetitions less than 34. Phеnоtypical feature of manifestation of such combination of alleles is the hypercholesterinemia, increased level ароВ and triglycerides on a background hipo--cholesterinemia. The combination Х+ Х+ genotype with quantity of repetitions more than 36 in 3'-VNTR of a gene ароВ is recognized by most atherogenous.

Key words: gene apoB, polymerase chein reaction, ХbаI restriction polymorphism, 3'-hypervariable region,, dislipoproteidemia, cholesterol, trigliceride, atheroscleros.

АННОТАЦИЯ

Кравченко Н.А. Дислипопротеидемия, ХbаI рестрикционный полиморфизм и структура 3’-гипервариабельного участка гена апоВ (на правах рукописи).

Диссертация на соискания ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15.-генетика /Институт терапии АМН Украины, 1999г., г. Харьков.

Диссертация содержит данные о связи между ХbаI рестрикционным полиморфизмом (экзон 26), 3’-гипервариабельным участком гена апоВ и профилем плазменных липидов. Амплификаты исследуемых участков ДНК гена апоВ получены полимеразной цепной реакцией. Использованы праймеры с высокой температурой отжига, содержащие большое количество С/G пар. ХbаI рестрикционный полиморфизм обусловлен заменой третьего основания кодона 2488 и не вызывает замены аминокислоты в молекуле белка. Определена частота встречаемости ХbаI полиморфизма в контрольной группе, которая составила 46 %, и у лиц с ДЛП - 60%. Установлено, что среди лиц с ДЛП распространенность Х+Х+ генотипа (гомозиготы по ХbаI сайту) выше по сравнению с Х-Х- генотипом (18 % и 34 %, соответственно). Отмечено, что у лиц с Х+Х+ генотипом уровень ХС на 8 %, триглицеридов на 24 % выше, в то время как уровень ЛПВП, обладающих антиатерогенными свойствами, понижен по сравнению с гомозиготами Х-Х-. Исследованиями не установлено повышение уровня апоВ при Х+Х+ генотипе. Эти данные не согласуются с выдвинутым ранее предположением о неравновесии ХbаI рестрикционного полиморфизма со значимой мутацией в рецептор-связывающем домене гена апоВ, снижающей скорость удаления апоВ-содержащих липопротеидных частиц из кровотока. Отношение апоВ/апоАI, повышение которого является неблагоприятным прогностическим фактором, выше у лиц с Х+Х+ генотипом по сравнению с гомозиготами без сайта рестрикции. Значение отношения ТГ/ХС свидетельствует о преобладании в кровотоке липопротеидных частиц богатых ТГ. Выявлена взаимосвязь между Х+ Х+ генотипом и клиническими фенотипами. В субпопуляции лиц с дислипопротеидемией этот генотип проявляется IIб типом гиперлипидемии и связан с избыточной массой тела. Среди лиц с Х-Х- генотипом, перенесших инфаркт миокарда, отмечен повышенный уровень апоВ в сочетании с нормолипидемией. При исследовании структуры 3’- гипервариабельной области гена апоВ определена частота встречаемости отдельных аллелей. Количество тандемных повторов 34-36 составили 59 %, аллели с количеством гипервариабельных элементов более 36 составили 24 %, а доля структуры 3’-VNTR, включающей менее 34 повторов, составила 17 % от общего числа исследованных образцов ДНК. Полученные данные согласуются с результатами популяционных исследований, проведенных в ряде стран Европы. Основными характеристиками полиморфного локуса является широкое разнообразие аллелей в популяции, низкая частота встречаемости каждого аллеля, высокий индекс гетерозиготности. При анализе