МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ`Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ

ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА

АМЕР А.Р. АЛ-ОМАРІ

УДК 579.616.9:615.33

ПРОТИМІКРОБНА АКТИВНІСТЬ І БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ НОВОГО АНТИСЕПТИКА ТУБЕРКУЛОЦИДУ

03.00.07 – Мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата біологічних наук

Харків - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Національній фармацевтичній академії України, Міністерства охорони здоров`я України.

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор

Дикий Ігор Леонідович,

Національна фармацевтична академія України,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології |

Офіційні опоненти: |

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Бабич Євген Михайлович,

доктор біологічних наук, професор

Руденко Ада Вікторівна,

Завідувач відділу Українського НДІ урології та нефрології АМН України |

Провідна установа: |

Київський науково-дослідний інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського МОЗ України |

Захист відбудеться “ 15 ” грудня 2000 р. об 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. Мечникова (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. Мечникова (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14).

Автореферат розісланий “ 14 ” листопада 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради

кандидат медичних наук Кучма І.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інфекційні та гнійно-запальні захворювання різного етіологічного походження, які мають свої особливості патогенезу та симптомокомплексами клінічних проявів, займають провідне місце в загальній клінічній патології. При цьому доказано, що хіміотерапевтичним знаменником у їхньому лікувально-профілактичному вирішенні є розробка й спрямоване використання у лікуванні антимікробних препаратів, номенклатурний базис яких складають антибіотики і сульфаніламіди (Ухін А.В., 1991, Вашна Т.А., 1998).

В основу промислового виробництва антибіотиків мікробного походження покладено використання продуктів екзоцелюлярного метаболізму штамів-продуцентів з біологічними ознаками відповідного антагонізму. При цьому сама мікробна маса являє собою технологічний залишок від виробництва антибіотиків. Водночас аналіз хімічного складу мікроорганізмів показує, що мікробна маса деяких прокаріотів і еукаріотів, наприклад, мікобактерій туберкульозу, може бути використана в біотехнологічному виробництві як джерело отримання антимікробних препаратів з властивостями, що відрізняються від антибіотиків за механізмом, спектром і рівнем антимікробної дії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом планової наукової роботи кафедри мікробіології Національної фармацевтичної академії України № держреєстрації 0198 U 007008 “Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини”.

Мета дослідження. Експериментально-теоретично обґрунтувати антимікробний потенціал мікобактеріальних ліпідів і на підставі використання технологічних залишків від виробництва туберкуліну розробити спосіб отримання субстанції з антимікробними властивостями.

Для вирішення зазначеної мети поставлені такі окремі завдання:

1. Встановити придатність мікобактеріальних ліпідів для отримання антимікробних препаратів;

2. Дослідити сумаційний і пофракційний склад структурних ліпідів у штамів-продуцентів при виробництві туберкуліну на підприємстві ЗАТ “Біолек”;

3. Провести порівняльний аналіз екстракційних засобів вилучення ліпідів з мікробної маси мікобактерій туберкульозу;

4. Розробити спосіб отримання антимікробного препарату на субстрат ній основі мікобактеріальних ліпідів;

5. Дослідити спектр, рівень і механізм антимікробної дії отриманого препарату;

6. Вивчити хіміотерапевтичну здатність отриманого препарату при експериментальній гнійно-запальній інфекції.

Об’єкт дослідження – знешкоджена біомаса мікобактерій туберкульозу.

Предмет дослідження – отримання антисептичного препарату мікробного походження.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше на експериментально-теоретичній підставі обґрунтована доцільність використання мікробної маси мікобактерій туберкульозу в біотехнологічному виробництві антимікробних препаратів.

Встановлено, що глюкогенні амінокислоти, наприклад, глютамінова і аспарагінова, завдяки кислотному рН і антикетогенним властивостям придатні як фактор гідролізу туберкулоліпідів, що реалізується вилученням з мікробної маси водорозчинних і обмежено розчинних дикарбонових кислот з наступним їх хімічним метаболізмом до рівноважної системи “жирна кислота – альдегіди та органічні перекиси”.

Розроблена технологія отримання антимікробного препарату з субстрат ним використанням знешкодженої біомаси туберкульозних бактерій як технологічного залишку від виробництва туберкуліну.

На рівні доклінічних досліджень встановлена виражена хіміотерапевтична здатність отриманого препарату при експериментальній гнійно-запальній інфекції.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлена можливість субстратного використання технологічного залишку від виробництва туберкуліну для отримання препаратів антимікробного призначення, що визначає нові напрямки в біотехнологічному розвитку клітинної інженерії з розділу біологічно активних речовин (БАР), це має безпосереднє відношення до створення нових напрямків у розвитку антибактеріальної хіміотерапії, удосконалює підходи до створення беззалишкових і малозалишкових технологій при виробництві анатоксинів, діагностикумів, алергенів та інших імунобіологічних препаратів. Використання мікробної біомаси як сировини при створенні антимікробних препаратів має економічні переваги, порівняно з існуючими технологіями виробництва природних, напівсинтетичних і синтетичних антибіотиків.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено запланований комплекс мікробіологічних, імунологічних, хіміотерапевтичних і технологічних досліджень з розробки і всебічного дослідження антимікробного препарату “Туберкулоциду”, а також статистична обробка отриманих результатів дослідження.

Апробація результатів дисертації. Основні фрагменти дисертації викладені в доповідях на наукових конференціях Національної фармацевтичної академії України (1997, 1998, 1999 рр.) і V з’їзді фармацевтів України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статі у фахових журналах.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 149 сторінках машинописного тексту, з них 118 залікових і складається із вступу, огляду літератури, 5 розділів власних досліджень, обговорення результатів і висновків. Список літератури містить 151 джерело вітчизняних та іноземних авторів. Матеріали дисертації ілюстровано 27 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали, методи і обсяг досліджень. Основний обсяг робіт виконано на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Національної фармацевтичної академії України на протізі 1997-2000 років. Біофармацевтичні та фармакотерапевтичні дослідження проводились з використанням 1084 мишей, 14 кролів та 36 пацюків. Локалізовану гнійно-запальну інфекцію відтворювали за методикою Г.М.Першина шляхом підшкірного введення 0,2 мл суміші добових агарових культур.

Генералізовану інфекцію відтворювали шляхом внутрішнього черевного LD50 мікробних сумішей з 0,4% агаром. Вихідним субстратом при виготовленні антимікробного препарату “Туберкулоциду” служила знешкоджена біомаса 9 референс-штамів туберкульозних бактерій (Valle, e, Bovinus-8, Віноградов, Bang, №42, Academia, DT/ST, H37Rv, T-3480), що становило технологічний залишок від виробництва туберкуліну на ЗАТ “Біолек”.

При вивченні антимікробних властивостей “Туберкулоциду” використано 158 референс- і клінічних штамів 12 видів патогенних і умовно патогенних видів мікроорганізмів: Ps.aeruginosa – 9, Pr. vulgaris – 8, Pr.mirabilis – 10, E.coli – 10, Sh.flexneri – 9, S.typhi – 12, Vibrio – 8, N.intracellulare – 7, N.gonorrhoeae – 10, B.subtilis – 11, Staphilococcus – 16, Streptococcus – 13, Cor.diphtheriae – 24 штами.

Референс-штами отримані з музеїв живих культур ДНДІСК ім. Л.А.Тарасевича та ХНДІМІ ім. Мечнікова, клінічні штами виділені від хворих на опікові, гнійно-запальні й урологічні захворювання.

Вивчення механізму дії “Туберкулоциду”, його інгібіційного впливу на естеразну, дегідразну, пероксидазну, індофенолопероксидазну, ліпазну, амілазну активність відповідних тест-мікробів проводилось за Г.Н.Першиним (1971).

Вплив препарату на структурні ліпополісахариди, білки, нуклеїнові кислоти мікроорганізмів вивчено за Ю.Б.Філліповичем, Т.Єгоровою, Г.Севастяновою (1975).

Загальний і пофракційний склад туберкулоліпідів у складі штамів-продуцентів мікобактерій туберкульозу вивчено за Asselineau (1978).

Розрахунок середньоактивної хіміотерапевтичної дози препарату проведено за методом Кербера (Біленький, 1963).

Визначення фагоцитарного індексу, активності завершеного фагоцитозу і показника пошкодження нейтрофілів проводили за В.Фрадкіним (1975).

Для вирішення поставлених задач дослідження відтворювали локалізовану і генералізовану гнійно-запальну інфекцію відтворювали шляхом внутрішньошкіряного, підшкірного, внутрішньочеревинного або внутрішньосудинного зараження білих мишей грампозитивними, грамнегативними піогенними мікроорганізмами, а також їх сумішшю.

Достовірність досліджень підтверджена статистичною обробкою результатів.

Результати власних досліджень. Антибіотики та, забезпечуюча завдяки їм, антимікробна хіміотерапія складають основу сучасної клінічної медицини. Однак довготривале використання антибіотиків показало, що, поряд із безсумнівною терапевтичною ефективністю, їх дія супроводжується побічним впливом як на організм хворого, так і на збудника захворювання.

Одним із можливих напрямків удосконалення специфічної активності антибіотиків може бути надання їм антисептичних властивостей. Однак це означає відмову від притаманного їм механізму антиметаболітної дії і як результат – створення препаратів, відмінних за основними ознаками від антибіотиків.

Дотримуючись мікробіологічних принципів природного отримання антибіотиків, одним із можливих рішень цієї проблеми може бути біотехнологічне використання мікробної маси як вихідного субстрату для отримання препаратів з антимікробними властивостями, що підпадає під положення клітинної інженерії.

Субстратним аналогом при цьому можуть бути препарати рослинного й тваринного походження, наприклад, ектерицид, хлорфіліпт і деякі інші, що набули позитивне хіміотерапевтичне визначення в клініці інфекційних та гнійно-запальних захворювань.

Виходячи з порівняння хімічного складу мікроорганізмів і наведених вище препаратів, нами субстратним аналогом було обрано, виготовлений з риб’ячого жиру препарат ектерицид, вибіркові бактерицидні властивості якого відносно грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів сумаційно визначає водорозчинна рівноважна дисоціативна система дикарбонових кислот, органічних перекисей і альдегідів.

Субстратним аналогом ектерициду можуть бути кислото- і спиртостійкі мікроорганізми і, перш за все, мікобактерії туберкульозу, частка структурних ліпідів яких доводиться більш ніж 40%.

Дослідження ліпідного складу 9 штамів-продуцентів туберкуліну на виробництві ЗАТ “Біолек” підтвердило це положення, показавши що в залежності від ознаки вірулентності у біомасі вивчених штамів міститься від 27г % до 45,6 г % структурних ліпідів (Табл. 1).

Сукупність таких факторів як придатність використання біотехнологічного методу клітинної інженерії, економічна рентабельність отримання субстратної мікробної маси і тим паче можливість використання технологічних залишків від основного виробництва, достатньо високий відсоток і фракційна різноманітність ліпідного компоненту – все це обґрунтовувало доцільність обраного напрямку з розробки антибактеріального препарату на субстратній основі біомаси мікобактерій туберкульозу.

Бактеріохімічне обґрунтування доцільності використання біомаси туберкульозних бактерій як вихідного ліпідного субстрату при отриманні антимікробного препарату ставило першочерговою задачею розробку адекватного засобу, який забезпечує оптимальне вилучення з біомаси туберкулоліпідів і подальшу їх деградацію до водорозчинних дикарбонових кислот, альдегідів і перекисей у рівноважній асоціативно-дисоціативній системі. У вихідній позиції, як альтернативні, експериментально досліджені технологічні варіанти розподільного вилучення в апараті Сокслета фракції мікобактеріальних ліпідів з використанням відповідних розчинників, комплексного розчинника з компонентним представництвом ефіру, хлороформу, ацетону й спирту, а також кислотного та лужного гідролізу. При цьому встановлено, що отримані з використанням органічних розчинників

Таблиця 1

Загальний і фракційний склад ліпідів у структурі досліджених штамів мікобактерій туберкульозу.

Вид | Штам | Всього | Фракції ліпідів (2% до сухої мікробної маси) | Хлороформочутлива | Ефірочутлива | Спирточутлива | Ацетоночутлива

M.tuberculosis | DT/ST | 45,601,4 | 37,742,1 | 2,520,2 | 5,361,1 | 0,980,02

№42 | 38,500,9 | 23,483,2 | 6,981,4 | 6,171,4 | 1,920,02

T-3480 | 37,201,2 | 19,003,2 | 4,751,1 | 6,181,0 | 2,770,27

H37Rv | 28,402,0 | 20,404,2 | 1,980,4 | 4,260,9 | 1,760,22

Academia | 271,6 | 17,552,8 | 4,051,1 | 4,590,7 | 0,810,16

M.bovis | Valle, e | 43,051,5 | 17,221,9 | 5,160,9 | 15,193,2 | 5,181,1

Bang | 34,601,2 | 5,710,9 | 4,981,0 | 13,882,3 | 10,031,2

Bov-8 | 39,602,3 | 15,842,7 | 4,750,8 | 14,251,5 | 4,760,7

Виноградов | 31,801,5 | 12,242,0 | 4,480,8 | 11,402,9 | 3,681,0

ліпідні субстрати, за своїми фізико-хімічними властивостями не придатні до подальшого окислення киснем і водного гідролізу, а лужний і кислотний гідролізи лише на проміжних стадіях утворюють нестабільні похідні з фоновими антимікробними властивостями.

У зв’язку з негативними результатами необхідним було розробити новий спосіб, що у своєму здійсненні відповідає двом основним вимогам: 1) первинне зниження вихідної фізико-хімічної стабільності туберкулоліпідів і 2) забезпечення дозованої деградації туберкулоліпідів до антимікробно активних дикарбонових кислот, альдегідів і органічних перекисей.

Виходячи з відомої природної чутливості жирів і ліпідів до спонтанного і індукованого перекисного окислення, для здійснення першої вимоги на підставі порівняння активності деяких окисників використано обробку біомаси туберкульозних бактерій перекисом водню, а для другої вперше запропоновано кислотний гідроліз з використанням глюкогенних амінокислот, антикетогенні властивості яких дозволяють у залежності від концентрації розчину та терміну гідролізу дозовано отримувати різного рівня проміжні похідні туберкулоліпідів зі стабільними фізико-хімічними й антимікробними властивостями.

На підставі експериментально-теоретичного обґрунтування було розроблено спосіб отримання препарату “Туберкулоцид”, суть якого складається з первинної обробки сухої знешкодженої біомаси туберкульозних бактерій 10% розчином перекису водню протягом однієї-двох діб (тривалість контролюється повною витратою Н2О2) з подальшим кислотним гідролізом обробленої біомаси 1% розчином аспарагінової кислоти в умовах рН 2,5-2,7 і температурою 37-38 С протягом 16-30 діб.

Отриманий препарат представляє собою прозору, обезбарвлену рідину, солонкувато-кислого смаку з рН 3,07-3,16, яка характеризується стабільними фізико-хімічними властивостями й придатна для зберігання протягом 2-х років. За одиницю активності “Туберкулоциду” прийнята його бактерицидна активність відносно стрептококу Даше у розведенні 1:16.

Вивчення спектру та рівня антибактеріальної активності “Туберкулоциду” відносно 158 референс- і клінічних штамів з 13 видів патогенних, умовно патогенних, грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів показало, що досліджуваний препарат характеризується широким спектром антимікробної дії й за рівнем специфічної активності перевищує ектерицид у 5-58 разів.

Таблиця 2

Порівняльна характеристика спектру й рівня бактерицидної дії ектерициду та туберкулоциду

Тест-мікроб | Кількість штамів | Рівень бактерицидної активності (кратні розведення) | Кратність активно-стей | Ектерицид | Туберкулоцид | Ps.aerugmosa

Pr.vulgaris

Pr.mirabilis

B.subtilis

E.coli

Sh.flexneri

S.typhi

Vibrio

N.intracellulare N.gonorrhoae

Staphylococcus

Streptococcus M.tuberculosis

Cor.diphtheriae | 9

8

10

11

10

8

12

8

7

10

16

13

12

24 | 1:1,33±0,27

1:1,12±0,26

1:1,81±0,41

0

1:1,90±0,38

1:1,870,43

1:1,50±0,15

1:2,60±0,42

1:3,14±0,32

1:4,600,60

1:0,75±0,10

нативний 1:2,83±0,26

1:3,08±0,42 | 1:25,7±7,60

1:27,5±3,86

1:30,8±2,49

1:27,6±3,03

1:33,6±2,56

1:29,0±3,77

1:7,б0±0,91

1:38,0±3,11

1:18,8±1,67

1:92,8±11,3

1:44,0±3,17

1:38,1±2,29

1:32,0±2,14

1:74,5±8,8 | 21

24,5

17

27,6

17,6

15,5

5

14,6

5,9

20

58,6

38,1

11,3

21,1 | Примітка: P = 95%, n = 6, t05 = 2,57

Порівняльний аналіз даних табл. 2 показує, що, на відміну від ектерициду, “Туберкулоцид” проявляє виражену активність відносно патогенних коків, сінної палички, ешерихій, шигел і сальмонел, патогенних нейсерій, коринебактерій дифтерії. При цьому потрібно окремо наголосити на протитуберкульозній здатності препарату, який вивчається враховуючи, перш за все на те, що субстратним джерелом при його отриманні використана біомаса туберкульозних бактерій. Останнє, на наш погляд, принципово залежить від того, що антимікробні властивості “Туберкулоциду” пов’язані з вмістом у складі препарату альдегідів і органічних перемісив. Вихідним при цьому слід вважати те, що туберкульозні бактерії завдяки особливостям хімічного складу високочутливі до перекисного окису структурних ліпідів. Внаслідок цього в мікробній клітині утворюються відповідні токсичні речовини й аутогенно реалізується бактерицидний ефект. Виходячи з цього слід вважати, що альдегіди й органічні перекиси у складі препарату набувають біотехнологічну абстрагованість від вихідного субстратного джерела та на підставі ініціації перекисного окису структурних ліпідів забезпечують протитуберкульозну здатність “Туберкулоциду”.

Встановлення переважної бактерицидної дії, практична відсутність розбіжностей у рівнях антибактеріальної активності відносно чутливих і стійких до антибіотиків мікроорганізмів проте не менше не виключало наявності селективного потенціалу в досліджуваному препараті. Для перевірки останнього проведено 50 послідовних пересівів тест-штамів S.aureus і Pr.mirabilis у присутності субактивних концентрацій препарату в поживному середовищі. При цьому не виявлено реєструючої зміни у вихідній чутливості мікроорганізмів, що свідчить не тільки про відсутність селективного потенціалу, але й про відмінний від антибіотиків механізм дії “Туберкулоциду” на мікробну клітину.

При вивченні механізму дії “Туберкулоциду” досліджена його інгібуюча здатність відносно таких бактеріальних ферментів, як дегідраза, індофенолоксидаза, пероксидаза, каталаза, амілаза й естераза, що дає можливість в разі антибіотиків встановити тип їх антиметаболітної активності. При цьому показано, що крім незначної інгібіції пероксидази “Туберкулоцид” не впливає на вихідну активність бактеріальних ферментів.

Впродовж дослідження механізму антимікробної дії “Туберкулоциду” вивчено його вплив на хімічний склад тест мікробів і показано, що внаслідок добового контакту з бактерицидною концентрацією препарату кількість цитоплазматичного білка в S.aureus зменшується на 19% та у Pr.mirabilis на 14%, а дефіцит нуклеопротеїдів відповідно складає 23,6% і 51,6%. Висновком з цього випливає, що механізм антибактеріальної дії “Туберкулоциду” одночасно поєднує деградацію білків і нуклеопротеїдів.

Вивчення біофармацевтичних властивостей “Туберкулоциду” показало, що за класифікацією Н.Ф.Ізмерова, І.В.Саноцького й К.К.Сидорова (1977)він відноситься до практично нетоксичних речовин, не проявляє подразнюючої і алергізуючої дії, не кумулюється в організмі тварин. Під впливом одноразового внутрішньосудинного уведення у дозі 5 мл у кролів спостерігається підвищення рівнів комплементу, ліпази й лізоциму в крові, фагоцитарної активності лейкоцитів, накопичення лізоциму в легенях і нирках, що свідчить про певні імуностимулюючі властивості препарату.

Хіміотерапевтичну здатність “Туберкулоциду” при локалізованій гнійно-запальній інфекції випробувано на білих мишах, яких підшкірно заражали відповідно добовими агаровими культурами стафілококу в дозі 800 млн. м.т., синьогнійної палиці у дозі 30 млн. м.т., гемолітичного стрептококу в дозі 25 млн. м.т., а також змішаною культурою піогенних мікроорганізмів. Лікування “Туберкулоцидом” відповідно проводили за схемами: 1) одночасне з зараженням одноразове внутрішньосудинне введення препарату в об’ємі 0,5 мл; 2) двократне внутрішньосудинне уведення у об’ємі 0,5 мл через 6 і 24 години після зараження; 3) двократне підшкірне введення в дозі 1,0 мл одночасно і через 12 годин після зараження; 4) триразове, з інтервалом 18 годин, підшкірне уведення у дозі 1,0 мл, починаючи через 24 години після зараження; 5)дворазове внутрішньом’язове уведення по 0,5 мл одночасно з зараженням і через 12 годин; 6) триразове, з інтервалом 18 годин, внутрішньом’язове введення по 0,5 мл, починаючи через 24 години після зараження.

Результати випробування хіміотерапевтичної активності “Туберкулоциду” на різних стадіях патогенезу локалізованої гнійно-запальної інфекції, відповідно відтвореної з використанням патогенних коків , грамнегативних бактерій та їх змішаною культурою, виявили його виражену лікувально-профілактичну активність, достатню для попередження розвитку інфекційного процесу при використанні рівночасно з зараженням, а також для обмеження та вилікування сформованих фокусів гнійного запалення у відносно невеликі терміни. При цьому звертає на себе увагу те, що на стадії інфікування використані методи парентерального введення “Туберкулоциду” з рівноцінним захисним ефектом попереджували виникнення фокусів гнійного запалення у 90% - 100% білих мишей. На клініко-патогенетичній стадії сформованого фокусу гнійного запалення найбільша ефективність простежена при перифокальному підшкірному використанні “Туберкулоциду” , про що свідчило зворотний розвиток і виліковування індукованого гнійного запалення протягом 3-4 діб. При цьому спонтанне вилікування тварин контрольних груп становило 15-17 діб.

Для відтворення генералізованої інфекції зараження білих мишей проводили внутрішньочеревним введенням LD50, визначеними для кожного збудника методом пробіт-аналізу. Мікробні культури уводили в суміші з 0,4% агаром.

За результатами проведених досліджень встановлено, що “Туберкулоцид” проявляє в 90% - 100% лікувально-профілактичний ефект в умовах одночасного з зараженням внутрішньосудинного й внутрішньочеревного уведення. При підшкірному і внутрішньом’язовому використанні лікувально-профілактичний ефект “Туберкулоциду” на стадії інфекування сягав 80% - 95%.

При дослідженні хіміотерапевтичної активності “Туберкулоциду” на продромальній стадії формування генералізованої інфекції (через 6 годин після зараження) рівень захисту білих мишей від септицемії при внутрішньосудинному введенні сягав 90% -100%, при внутрішньочеревному – 100%, при підшкірному й внутрішньом’язевому – 85% відповідно.

Внутрішньосудинне використання “Туберкулоциду” через 18 годин після зараження (період розгорнутої клінічної картини септицемії) характеризувався в разі стафілококової інфекції одужанням 75% білих мишей, при синьогнійній інфекції – 90% і при протейній – 80% відповідно.

При внутрішньочеревному введенні “Туберкулоциду” лікувальний ефект згідно використаних збудників відповідно склав 65%, 80% і 80%; при підшкірному – 69%, 65% і 60% і при внутрішньом’язовому – 60%, 50% і 50%. При бактеріологічному дослідженні органів і тканин загиблих і вилікуваних тварин встановлено, що клінічний ефект одужання закономірно супроводжується елімінацією збудника та стерильністю крові, а також внутрішніх органів.

Підсумовуючи результати випробування хіміотерапевтичної активності “Туберкулоциду” можна дійти висновку про його виражену лікувальну здатність при експериментальній гнійно-запальній інфекції, відтвореній використанням піогенних збудників.

ВИСНОВКИ

1. Вперше на принципах методології клітинної інженерії експериментально-теоретично обгрунтовано біотехнологічне використання біомаси ліпідомісних мікроорганізмів, а саме мікобактерій туберкульозу для отримання антимікробних препаратів.

2. З використанням методів бактеріохімічних досліджень доведена субстратна придатність біомаси туберкульозних бактерій як вихідного донора ліпідів при отриманні антимікробного препарату.

3. Як вихідний ліпідний субстрат мікробного походження запропоновано використання знешкодженої біомаси туберкульозних бактерій, що є технологічним залишком від виробництва туберкуліну.

4. Встановлені нові реакційні властивості глюкогенних амінокислот, які полягають у здатності до дозованого кислотного гідролізу ліпідів з утворенням стабільних проміжних метаболітів з антимікробними властивостями.

5. Розроблено спосіб отримання антибактеріального препарату “Туберкулоциду”, заснований на попередній обробці біомаси туберкульозних бактерій з метою активації процесу перекисного окису туберкулоліпідів і подальшого кислотного гідролізу аспарагіновою кислотою.

6. Встановлено антисептичний механізм антибактеріальної дії “Туберкулоциду”, який полягає у деградації структурних нуклеопротеїдів сукупною активністю дикарбонових кислот, альдегідів і органічних перекисей. Препарат має незалежний від антибіотикорезистентності широкий спектр антибактеріальної активності, включаючи мікобактерії туберкульозу.

7. При локалізованій і генералізованій гнійно-запальній інфекції “Туберкулоцид” проявляє виражену хіміотерапевтичную активність.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ

ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Амер А.Р. Ал-Омарі, Дикий И.Л., Филимонова Н.И. Антибактериальные свойства туберкулоцида // Актуальні проблеми акушерства і гінекології, клінічної імунології та генетики, 2000, №4.- С.394-398.

2. Амер А.Р. Ал-Омарі, Дикий І.Л. Хіміотерапевтична здатність туберкулоцида при експериментальній інфекції // Вісник Вінницького державного медичного університету, 2000, №1.- С.3-4.

3. Амер А.Р. Ал-Омарі, Филимонова Н.И., Дикий И.Л. Бактериохимические основы клеточной инженерии при получении антимикробных препаратов на основе туберкулоцидов // Експериментальна і клінічна медицина, 2000, №1.- С.52-54.

4. Вплив стафілококів на показники клітинного імунітету у хворих на внутрішньошпитальні інфекції / Гайдаш І.С., Флегонтова В.В., Сидорчук І.Й., Волянський А.Ю., Гречко В.А., Суглобов Є.В., Амер А.Р. Ал-Омарі, Шевченко М.Ю. // Український медичний альманах, 2000, Том 3, №1.- С.35-36.

АНОТАЦІЯ

Амер А.Р. Ал-Омарі. Протимікробна активність і біологічні властивості нового антисептика туберкулоциду

Дисертація на здобуття ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. Інститут мікробіології і імунології ім. І.І.Мечнікова, Харків, 2000.

Дисертацію присвячено експериментально-теоретичному обґрунтуванню нового напрямку у створенні антимікробних препаратів на підставі біотехнологічного використання біомаси мікроорганізмів як субстратного джерела хімічних речовин з потенціальними антибактеріальними властивостями.

Використовуючи як аналог технологію виготовлення ектеріциду, бактеріохімічними дослідженнями показано, що біомаса туберкульозних за складом туберкулоліпідів не поступається риб’ячому жиру і може бути використаною як субстратне джерело при отриманні антимікробних препаратів.

Розроблено засіб отримання препарату “Туберкулоциду”, що полягає у попередній обробці біомаси туберкульозних бактерій 10 % розчином аспарагінової кислоти. У дослідах in vitro показано, що “Туберкулоциду” притаманне широкий спектр антибактеріальної активності, незалежно від чутливості або стійкості мікроорганізмів до антибіотиків.

На моделі локалізованої гнійно-запальної інфекції, етіологічно відтвореної на білих мишах з використанням грампозитивних і грам негативних піогенних мікроорганізмів, показано високовиражену лікувально-профілактичну здатність “Туберкулоциду”.

Ключові слова: туберкульозні бактерії, антибіотики, гнійно-септичні захворювання.

АННОТАЦИЯ

Амер А.Р. Ал-Омари. Противомикробная активность и биологические свойства нового антисептика туберкулоцида.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата био-логических наук по специальности 03.00.07 - микробиология, Институт микробиологии и иммунологии им. И.И.Мечникова, Харьков, 2000

Диссертация посвящена экспериментально-теоретическому обоснованию нового направления по получению антимикробных препа-ратов на основе биотехнологического использования биомассы мик-роорганизмов как субстратного источника химических веществ, об-ладающих потенциальными свойствами.

В исходной позиции как аналог использована технология получения антибактериального препарата эктерицида, 30-летний клинический опыт применения которого подтвердил преимущества пе-ред антибиотиками в плене избирательного бактериального действия на чувствительные и устойчивые к антибиотикам микроорганизмы, а также по оптимальной биосовместимости для организма. Бактериохимическими исследованиями показано, что биомасса туберкулезных бактерий по качеству и разнообразию туберкулолипидов не уступает рыбьему жиру, используемому для получения эктерицида, и на основании этого может быть использована как субстратный источник при получении антимикробных препаратов.

Разработан способ получения препарата "Туберкулоцида", состоящий в первоначальной обработке биомассы туберкулезных бак-терий 10% раствором перекиси водорода и последующего кислотного гидролиза 1% раствором аспарагиновой кислоты. В опытах in vitro показано, что “Туберкулоцид” характеризуется широким спектром антибактериальной активности вне зависимости от чувствительности или устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.

На модели локализованной и генерализованной гнойно-воспалительной инфекции, этиологически обусловленной грамположительными и грамотрицательными пиогенными микрорганизмами, показана высоковыраженная лечебно-профилактическая активность “Туберкулоцида”.

Ключевые слова: туберкулезные бактерии, антибиотики, гнойно-воспалительные заболевания.

SUMMARY

Аmеr A.R. Al-Оmаri. Antimicrobic activity and biological properties of a new antiseptic of Tuberculocidum.

The dissertation on obtaining of scientific degree of the candidate of biological sciences in speciality 03.00.07 – microbiology; The I.I.Mechnikov institute of microbiology and immunology, Kharkov, 2000.

The thesis is dedicated to experimental - theoretical basing of a new direction in obtaining of antimicrobial preparations on the base of biotechnological use of biomass of microorganisms as a substratum source of chemical substances possessing by potential properties.

In initial position the technology of production of antibacterial preparation ectericidum was used as a analogue, the 30-year’s clinical experiment of using of this preparation has confirmed an advantage over antibiotics in election bactericidal action on sensitive and stable to antibiotics microorganisms and also in optimum biocompatibility for organism. It was shown by bacteriochemical investigations that biomass of tuberculous bacteria does not yield to fish oils used for obtaining of ectericidum by quality and variety of tuberculolipids and on the base of that it cab be used as a substratum source in obtaining of antimicrobial preparations.

Method of obtaining of the preparation “Tuberculocidum” was carried out. It consists in primary processing of a biomass of tuberculous bacteria by 10 % hydrogen peroxide solution and posterior acid hydrolysis by 1 % aspartic acid solution. It was shown in experiments in vitro that “Tuberculocidum” is characterized by a wide spectrum of antibacterial activity without dependence of sensitivity or stability of microorganisms to antibiotics.

Highly markedtreatment-and-prophylactic activity of “Tuberculocidum” was shown on the model of a localized and generalized pyo-inflammatory infection etiologically stipulated by Gram-positive and Gram-negative pyogenic microorganisms.

Key words: tuberculous bacteria, antibiotics, pyo - inflammatory diseases.