НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

_____________________________________________________________

АЗАРОВ ВОЛОДИМИР ІВАНОВИЧ

УДК 612.17+616.12:092

ДОСЛІДЖЕННЯ ПОРУШЕНЬ КОРОНАРНОГО КРОВООБІГУ

ІШЕМІЗОВАНОГО СЕРЦЯ ТА ЇХ КОРЕКЦІЯ

14.03.04- Патологічна фізіологія

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеню кандидата біологічних наук

КИЇВ 2000 г.

Диссертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук,

Мойбенко Олексій Олексійович

Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,

завідувач відділу експериментальної кардіології

Офіційні опоненти: професор, доктор медичних наук

Французова Стела Борисівна

Київський медичний університет МОЗ України,

доктор біологічних наук,

Шаповал Людмила Николаевна

Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,

пров. співр. відділу кровообігу

Провідна установа: інститут ендокрінології, відділ…., Хомазюк А. І.

Захист відбудеться “26”__грудня__ 2000 р. о “15.30” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024 Київ, вул.Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України

Автореферат розісланий “25”___листопада_ 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О.Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи.

Актуальність теми. Важливість проблеми боротьби з серцево-судинними захворюваннями зумовлена тим, що і досі, незважаючи на значні успіхи в лікуванні захворювань серця і судин, саме ці хвороби є основною причиною смертності населення України, яка складає близько 60% від загальної смертності. Це пояснюється не тільки якістю медичного обслуговування, але і недостатнім вивченням механізмів розвитку цих захворювань, що ускладнює розробку нових методів лікування.

Одним із загальних фундаментальних механізмів розвитку захворювань серця і, зокрема, гострого інфаркту міокарда (ІМ) і реперфузійного синдрому є порушення структури і функції мембран ендотеліоцитів, кардіоміоцитів і інших клітин серця. Це відбувається внаслідок активації ряду ферментів (фосфоліпаз, оксигеназ) і гальмування АТФ-залежного ресинтезу фосфоліпідів (Gross RW, 1992; Van der Vusse GJ, 1997, Gryglewski RJ, 1999). Наслідком цього є деградація фосфоліпідів мембран і утворення біологічно активних речовин, серед яких особливе значення в патогенезі захворювань серця можуть мати лейкотрієни, тромбоксани, лізофосфатиди, фактор активації тромбоцитів, яким властива коронароконстрикторна, аритмогенна, хемоатрактантна та проагрегантна дії. Найбільш істотне патогенетичне значення в цьому відношенні, очевидно, має активація ліпоксигеназ. Процеси деградації фосфоліпідів також супроводжуються утворенням проміжних продуктів, які мають виражені оксидантні властивості (Kuzuya Т et al., 1993).

У зв'язку з цим одним з перспективних напрямків у пошуку нових методів терапії захворювань серця потрібно вважати розробку методів стабілізації клітинних мембран шляхом гальмування надмірної активності ферментів, які їх руйнують, а також перекисного окислення ліпідів мембран (Мойбенко АА, Колчин ЮН, 1992).

У цей час встановлено три важливих фактори, що визначають кінцевий розмір ІМ: розмір ішемізованої ділянки міокарда, так званої "зони ризику", тривалість ішемії та рівень коронарного колатерального кровоструменя (Hearse DJ et al., 1992; Kersten JR et al., 1999).

Відомо, що у людини, також як і деяких інших видів колатеральний кровострумень має істотне значення для збереження міокарда після оклюзії коронарної артерії. Терапія, спрямована на збільшення коронарного колатерального кровоструменя в перші години ІМ до проведення тромболітичної терапії може істотно зменшити кінцевий розмір інфаркту міокарда. Однак розробці нових терапевтичних підходів до модуляції коронарного колатерального кровоструменя при ішемії міокарда перешкоджає суперечність і недостатність даних про динаміку і механізми його змін, особливо в перші години розвитку ІМ. Залишаються практично невивченими реакції колатерального кровоструменя на БАР мембранного та фосфоліпідного походження (простаноїди, лейкотрієни).

Також треба зазначити, що ішемія міокарда впливає значним чином на інтактну (неішемізовану) зону міокарда. Ця зона зазнає сильних стрессорних впливів, що може призводити до змін і нерідко до значних порушень скорочувальної функції серця. Оскільки міокард в зоні ішемії швидко втрачає здатність скорочуватися, то доля хворого інфарктом міокарда в більшості залежить від стану “інтактної" (що не зазнала ішемії ) зони. В “інтактній зоні" при ішемії та інфаркті міокарда виявлені порушення метаболізму і структурні зміни, характерні для ішемії, але виражені в меншій мірі (Фетісова ТН, Фролькис РА, 1976; Хомазюк АИ, 1985 ). Однак, в цей час, дані про дію ішемії і реперфузію на судини “інтактної” зони обмежені і суперечливі (Kahn JK, 1995).

Переважна більшість сучасних експериментальних досліджень по відтворенню гострої ішемії і реперфузії міокарда проведена на тваринах з відкритою грудною порожниною і штучним диханням. Інформацію, одержану в таких експериментах, треба розглядати з обережністю, оскільки добре відомо, що розкриття грудної порожнини істотним чином змінює не тільки функції дихання, але і кровообігу і діяльність серця. Тому існує необхідність розробки методу, що дозволяє відтворювати гостру ішемію і реперфузію міокарда і дослідити коронарний і колатеральний кровострумені в умовах експериментів із закритою грудною порожниною і природним диханням.

Мета і задачі дослідження. Мета цієї роботи полягала в дослідженні динаміки і механізмів порушень коронарного кровообігу при ішемії та реперфузії міокарда у собак, а також корекції цих порушень за допомогою мембранопротектора - антиоксиданта й інгибітора ліпоксигенази - ліпосомального кверцетина. Відповідно до мети в роботі поставлені наступні завдання.

1. Розробити метод, що дозволяє в умовах експериментів із закритою грудною порожниною і природним диханням відтворювати гостру ішемію і реперфузію міокарда і дослідити вазомоторні реакції та метаболічні зсуви в ішемізованому серці.

2. Дослідити реакції резистивних коронарних судин в неішемізованій зоні серця при гострій ішемії і реперфузії міокарда.

3. Дослідити динаміку змін коронарного колатерального кровоструменя і реакції колатеральних судин на біологічно активні речовини переважно мембранного походження при ішемії і реперфузії міокарда.

4. Дослідити зміни вмісту ейкозаноїдів (лейкотрієнів С4-Е4 і простацикліна) в коронарній колатеральній крові при гострій ішемії і реперфузії міокарда.

5. Дослідити зміни вільнорадикальних процесів в динаміці ішемії і реперфузії міокарда.

6. Оцінити ефективність корекції ішемічних і реперфузійних порушень коронарного кровообігу, функції серця і метаболічних зсувів за допомогою мембранопротектора, антиоксиданта і блокатора ліпоксигенази – ліпосомального кверцетину.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше в умовах патофізіологічного експеримента використано новий метод відтворення ішемії і реперфузії міокарда, що дозволяє дослідити коронарний і ретроградний колатеральный кровострумені в умовах експериментів із закритою грудною порожниною і природним диханням.

За допомогою розробленого методу, вперше досліджені динаміка і механізми реакцій резистивных судин “інтактної" (неішемізованої) зони серця при локальній ішемії та реперфузії міокарда, динаміка змін коронарного колатерального кровоструменя, реакції коронарного колатерального судинного русла на біологічно активні речовини мембранного походження (простаноїди і лейкотрієни) при ішемії і реперфузії міокарда. Показана ефективність антиоксиданта і блокатора ліпоксигенази (кверцетина) для корекції ішемічних і реперфузійних порушень коронарного кровообігу (поліпшення коронарного колатерального кровоструменя) і функції серця (антиаритмічний ефект, зменшення об'єму некротичного міокарда).

Практичне значення отриманих результатів. Отримані експериментальні дані лягли в основу комплексних медико-біологічних досліджень по створенню нового лікарського препарата на основі кверцетина і його обмежених клінічних випробувань, видані методичні рекомендації.

Випробування результатів дисертації. Основні положення і окремі фрагменти роботи були докладені, обговорені і представлені на XV Європейській секції міжнародного товариства по дослідженню серця (Копенгаген, 1994), II Міжнародному конгресі по патофізіології (Кіото, Японія, 1994), XV Всесвітньому конгресі міжнародного товариства по дослідженню серця (Франція, 1995), I Національному з'їзді фармакологів України (Київ, 1995), III міжнародному конгресі патофізіологів (Лахті, Фінляндія 1998), на засіданні сектора вісцеральних систем інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (1999), VI Кардиологічному конгресі (Київ, 2000).

Основний зміст роботи.

Матеріали і методи досліджень. Вперше розроблено метод подвійної катетеризації коронарної судини, що дозволяє в умовах, що жорстко контролються, відтворювати гостру ішемію і реперфузію міокарда і дослідити коронарний і ретроградний колатеральный кровострумені в умовах експериментів на тваринах із закритою грудною порожниною і природним диханням. Особливості використаного нами методу представлені на мал. 1. Тонкокостінний металевий нікелевий катетер вводився через праву сонну артерію, ретроградно просувався до гирла лівої коронарної артерії і вводився в одну з магістральних гілок лівої коронарної артерії відповідно до методу, описаного Хомазюк А.И. і співавт. (1965). Цей катетер служив направляючим для внутрішнього тефлонового катетера, який вводився в більш дрібну гілку цієї ж артерії. Магістральна коронарна артерія (як правило, огинаюча) перфузувалась власною кров'ю тварини насосом з сталою витратою. Введення внутрішнього тефлонового катетера в магістральну коронарну судину призводило до перекриття однієї з вторинних гілок огинаючої коронарної артерії і при відключенні його перфузії - до ішемії ділянки міокарда, що кровопостачається цією гілкою, а при включенні перфузії - до реперфузії цієї ділянки. Цей метод дозволяв реєструвати: 1) реакції резистивних судин інтактної (неішемизованої) зони міокарда; 2) об'ємний ретроградний коронарний колатеральный кровострумень за допомогою витратоміра-каплеписця і 3) брати проби коронарної крові з ділянки ішемії для дослідження біохімічних зсувів.

Робота виконана на 32 безпородних собаках обидвох статей, вагою від 16 до 25 кг під хлоралозо-уретановим наркозом (0,07 і 0,7 г на кг ваги відповідно, внутрішньовенно). У всіх експериментах реєстрували системний артеріальний тиск (САТ) і тиск в лівому шлуночку (ТЛШ). Про скорочувальну функцію лівого шлуночка судили за змінами першої похідної внутрішньошлуночкового тиску і індексу скоротливості міокарда Верагута ((dP/dtmax)/P), який реєструвався поударно за допомогою спеціалізованого обчислювального приладу. Регістрація коронарного кровоструменя проводилася за допомогою електромагнітного витратоміру фірми “Nichon Cohden” (Японія) з датчіками діаметром 2,5-3,5 мм. Регістрація коронарного судинного опіру проводилась за допомогою методу резістографії – перфузії з постійним об'емом крові та регістрацією перфузійного тиску. Електрокардіограма реєструвалася в I і III стандартному відведенні. Реєстрацію і запис експериментальних кривих здійснювали за допомогою полікардіографа “Mingograph-82" фірми Siemens-Elema (Швеція). Хвилинний об'єм крові (ХОК) визначали методом термодилюції. З даних ХОК розраховували загальний переферичний опір (ЗПО). Ретроградний коронарний колатеральний кровострумень реєстрували за допомогою витратоміра-фотоелектронного каплеписця і нормалізували його до змін артеріального тиску за допомогою коефіцієнта К (К=(к1/к)/(САТ1/САТ), де к, к1- об'ємний коронарний ретроградний колатеральный кровострумень до і після впливу препарата, САТ, САТ1 -системний артеріальний тиск до і після впливу ( Гацура ВВ, 1982).)

Було проведено дві серії експериментів: 1) з регіональною ішемією міокарда протягом 3-х годин; 2) з регіональною ішемією міокарда протягом 1,5 год. і реперфузією 4 год. Друга серія експериментів об'єднувала в собі дві групи експериментів: 1) контрольна; 2) експериментальна группа з введенням ліпосомального кверцетина. Ліпосомальну форму кверцетина (фосфатиділхолін:кверцетин - 50:1) вводили внутрішньовенно крапельно в дозі 6 мг кверцетина на кг маси з розрахунку 2,0 мг/кг/година. Введення препарата починали через 10-15 хвилин після оклюзії коронарної артерії, коли за даними ЭКГ розвивалася виражена ішемія міокарда. Тривалість введення становила 3 год. Експерименти другої групи виконані спільно зі ст. н.с. інституту токсикології і фармакології Хромовим А.С.

Процеси перекисного окислення ліпідів в плазмі крові досліджували за допомогою методу індукованої перекисом водню (1 %) хемолюмінісценції (Серкиз ЯІ., 1983). Хід досліду полягав в наступному: у вимірювальну кювету вводили плазму крові, яка розташовувалася перед катодом ФЭУ 39А. Спочатку реєстрували фон приладу при закритій шторці (30 с), потім власну хемілюмінісценцію при відкритій шторці (30 с), після чого реєстрували індуковану перекисом водню (кінцева концентрація 1 %) хемілюмінісценцію протягом 5 хв. Реєстрацію здійснювали при допомозі хемілюмінометра ЕА-1 і АХЛГ автоматизованого за допомогою ЕОМ аналізатора хемілюмінограм. Вимірювалися і враховувалися наступні параметри: амплітуда швидкого спалаху, амплітуда вільного спалаху, кінцеве значення інтенсивності спалаху через 5 хв. (I5), загальна світлосумма за 5 хв (S5).

Визначення концентрації похідних арахідонової кислоти (лейкотрієни С4-Е4, простациклін) проводили радіоімунним методом в етанольних екстрактах сироватки коронарної колатеральної крові, використовуючи набір Leukotriene C4-E4 -Ria kit фірми Amersham (Англія).

Площа ризику і площа некрозу міокарду визначалася за раніше описаним методом (Колчин Ю. Н. і співавт., 1990). Після закінчення експеримента гілка коронарної артерії відразу ж нижче головки тефлонового катетера перев'язувалася і серце перфузовалось через гирло лівої коронарної артерії 1% розчином метиленового синього під тиском 100-120 мм рт. ст. Після забарвлення вирізалися поперечні зрізи серця. Незабарвлена площа "ризику" вимірювалася планіметрично і після цього зрізи забарвлювалися нітросинім тетразолієм для виявлення зони некрозу.

Статистичний аналіз отриманих даних проводився за допомогою методу варіаційної статистики з використанням критерію Стьюдента для оцінки достовірності відмінностей. Значення з Р<0,05 приймалися як статистично достовірні.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Реакції коронарних судин при гострій ішемії та реперфузії міокарда.

Реакції коронарних судин неішемізованої зони при гострій ішемії та реперфузії міокарда.

Оклюзія коронарної судини і припинення коронарного регіонального кровоструменя приводило до типових для гострої ішемії змін ЕКГ – різкому зміщеню інтервала ST та збільшенню зубця Т. Поряд з тим мало місце зменшення швидкості зниження тиску в лівому шлуночку, зниження систоличного тиску в лівому шлуночку та системного артеріального тиску, зменшення ХОК.

Розроблений нами метод подвійної катетеризації коронарних судин в експериментах на собаках без розкриття грудної порожнини дозволив дослідити в умовах, що жорстко контролюються (стабілізація коронарного кровоструменя) зміни тонусу резистивних судин огинаючої гілки лівої коронарної артерії в неішемізованой області міокарда у відповідь на введення штучного ембола в одну з гілок другого порядку цієї ж артерії. Тривалість оклюзії в цій серії складала 5 хв.

Як показали наші експерименти, попадання штучного ембола в коронарну судину супроводжувалося зменшенням коронарного судинного опору або збільшенням коронарного кровоструменя в неішемізованій ділянці міокарда. Цей ефект відтворювався практично у всіх експериментах, середня величина зниження опору коронарних судин становила 11,4±1,2 % (Р<0,05) від вихідного. Виявлена зворотна експоненціальна залежність між початковим коронарним кровоструменем і приростом коронарного кровоструменя у відповідь на оклюзію артерії серця (мал. 2). Чим нижче був початковий коронарний кровострумень (і вище коронарний судинний опір), тим більше була вазодилятаторна реакція судин неішемізованії області. Експерименти з фармакологічним підвищенням тонусу судин неішемізованії області і відтворенням ішемії міокарда з допомогою лейкотрієна С4 показали, що емболія гілочки коронарної артерії може приводити до пародоксального ефекту - зменшенню електрокардіографічних ознак лейкотрієнової гипоксії міокарда, що могло, очевидно, бути результатом зниження опору коронарних судин і збільшення кровопостачання міокарда. Таким чином, заклинення коронарної артерії приводить, очевидно, не тільки до зниження опору судин, але і зміни його метаболізму внаслідок парадоксального поліпшення кровопостачання ділянок міокарда, прилеглих до зони ішемії.

З нашої точки зору описана нами вазодиляторна реакція коронарних судин в неішемізованому міокарді є одним з найважливіших природних механізмів кардіопротекції при ішемії міокарда внаслідок оклюзії коронарної артерії. Дослідження можливих механізмів зниження коронарного судинного опору в неішемізованих ділянках серця при попаданні eмбола в судинні русла серця проведене в трьох серіях дослідів з інгібуваням утворення можливих вазодилятаторів: простаноїдів, оксиду азоту, а також АТФ-залежних калієвих каналів.

Після блокади циклооксигенази індометацином (5 мг/кг) початковий коронарний судинний опір збільшувався та збільшувався вазодилятаторний ефект в неішемізованих коронарних судинах до 20,1± 2,2% (Р<0,05). В дослідах з використанням відносно малих доз LNNA (20 мг/кг) вазодилятаторний ефект зберігався, але при збільшенні доз блокатора NOS до 50-60 мг/кг вазодилятація в неішемізованих ділянках коронарного судинного русла при емболії практично повністю зникала. Тенденція до зменшення ефекту мало місце також при інгібуванні АТФ-залежних калієвих каналів глібенкламідом (7,9±2,7%, Р<0,05). Таким чином варто констатувати, що в розширенні коронарних судин неішемізованого міокарда у відповідь на попадання ембола в коронарну судину можуть брати участь активація утворення NO в початковій стадії гострої ішемії міокарда, не виключена також участь калієвих механізмів розширення коронарних судин.

При тривалій ішемії міокарда 1,5-3 години (14 собак) дилятаторні реакції коронарних судин неішемізованої області міокарда зберігалися і навіть посилювалися (рис.3). При 3-х годинній ішемії міокарда зниження коронарного перфузійного тиску в неішемізованих ділянках серця становили максимально 45±6,7 % (Р<0,05).

У серії дослідів з реперфузією спостерігалося досить швидке зникнення і перекручення цієї вазодилятаторної реакції. Реперфузія міокарда протягом 30 хв призводила до достовірного підвищення коронарного судинного опору в неішемізованих ділянках міокарда (рис. 3) з подальшим його поступовим зменшенням.

Такого роду зміни реакцій коронарних судин неішемізованої зони можуть свідчити про істотну роль активних форм кисню і реакцій перекисного окислення ліпідів при реперфузії в механізмах змін реактивності судинного русла серця. Це, найвірогідніше, відображає розвиток "реперфузійного парадокса" - різкої активації ПОЛ при відновленні кровоструменя в ішемізованих судинах, яке може змінювати функціонування ендотелію судин. Деякі дослідники передбачають, що зміни реактивності судин при ішемії і реперфузії розвиваються головним чином у час реперфузії і включають участь вільних радикалів кисню (ВРК) і їх дію на ендотелій судин (Bolli R et al., 1990). Наші дослідження по індукованій Н2О2 хемолюмінісценції крові по ходу ішемії-реперфузії міокарда показали, що вираженість Н2О2 хемолюмінісценції на 60 хв реперфузії була на 26 ± 5 % (Р<0,05) більше, ніж в кінці ішемічного періоду, що свідчить про посилення вільнорадикальних процесів при реперфузії та про те, що наростання коронарного перфузійного тиску, що спостерігається при реперфузії може бути наслідком дії ВРК на ендотелій судин.

Реакції колатеральних коронарних судин серця при ішемії та реперфузії міокарда

Найважливішим фактором природної кардіопротекції при ішемії міокарда, мабуть, є збільшення колатерального кровоструменя в ішемізовану ділянку міокарда і, тому, терапія, спрямована на збільшення коронарного колатерального кровоструменя в перші години ІМ до проведення тромболізису може зменшити кінцевий розмір інфаркту міокарда. Дані про зміни колатерального кровоструменя при ішемії міокарда суперечливі: є відомості про його прогресуюче погіршення (Біленко МВ, 1989), однак є повідомлення і протилежного характеру: про відсутність змін або збільшення колатерального кровотрменя по мірі збільшення часу ішемії (Rivas F et al., 1976; Marcus ML et al., 1976; Lamping KG et al., 1997).

Дослідження змін ретроградного колатерального потоку крові (14 експериментів) показали значне його зниження по ходу ішемії міокарда (рис. 4). Максимальне зниження нормалізованого по САТ коефіцієнта “К” на 31% (Р<0,05) спостерігалося на другій годині ішемії міокарда. Реперфузія не попереджувала процес зменшення колатерального потоку крові. Так на 60 хв реперфузії спостерігалося подальше зниження коефіцієнта “К" на 41% (Р<0,05). Ці дані узгоджуються з отриманими Belcher P.R. і співавт. (1995), які показали істотне погіршення колатерального кровоструменя постішемичній реперфузії міокарда собак.

Зменшення колатерального кровоструменя при оклюзії і реперфузії коронарного судинного русла могло бути наслідком низки причин: 1) механічної перешкоди для кровостуменя в судинах (агрегація формених елементів крові, адгезія нейтрофілів до ендотелію судин і інш.), а також змін екстрасудинних сил в ділянки ішемії; 2) вазомоторних реакцій колатеральних судин на біологічно активні речовини, що утворюються у вогнищі гіпоксії та ішемії міокарда (катехоламіни, серотонін, оксид азоту, арахідонову кислоту, простаноїди, лейкотрієни, вільні радикали та інш.). Потрібно зазначити, що цілий ряд речовин, що вивільняються у вогнищі ішемії може модулювати процеси агрегации, адгезии і акумуляції формених елементів крові (простаноїды, лейкотрієни, оксид азоту, вільні радикали кисню) і таким чином посилювати механічні перешкоди в колатеральных судинах.

У цей час є всі підстави передбачати важливу роль ендотелій-залежних механізмів в модуляції колатерального кровоструменя в так званих добре “розвинених” колатералях в попередньо тривало ішемізованому серці (Flynn NM et al., 1991; Angus JA et al., 1991). Однак дані відносно інтактних колатеральных судин набагато більш обмежені.

Ми досліджували дію на колатеральний кровострумень різних речовин при їх введенні в неішемізовану частину оклюзованої судини (ЛОКА) через катетер К5 на ретроградний потік крові через катетер К3 (див. мал. 1) в різні терміни 3-х годинної ішемії міокарда. При такому способі введення ефекти, що спостерігалися нами були цілком пов'язані з реакціями колатеральных судин, які з'єднують неішемізовані й ішемізовані ділянки міокарда. При тривалій ішемії міокарда спостерігалася зміна характеру реакцій колатеральних судин на ацетилхолін (АХ). Як правило, в перші 1-1,5 години ішемії зберігалися вазодиляторні реакції, а після 1,5 годин ішемії переважно спостерігалися реакції зменшення колатерального кровоструменя в серці. Статистично оброблені дані про ці два типи реакцій представлені на мал. 5, де приведені дві групи даних (в початковий період ішемії і після 1,5 годин від початку ішемії): перша - із збільшенням ретроградного потоку крові на 11±2% (Р<0,05), друга - з його зменшенням на 11±4% (Р<0,05). Перехід дилятаторних реакцій колатеральных судин на АХ у вазоконстрикторні дозволяє передбачити значне пошкодження ендотелію колатеральних судин при більш тривалих термінах ішемії міокарда.

Аналогічні перекручення реакцій колатеральных судин спостерігалися при внутрішньокоронарному введенні арахідонової кислоти (АК). Добре відомо, що кількість АК в серці швидко наростає при гострій ішемії міокарда (Chien KR et al., 1984; Van der Vusse GJ et al., 1997 ) внаслідок активації фосфоліпази А2. Тому АК і її метаболіти можуть відігравати певну роль в змінах колатерального кровоструменя при ішемії міокарда.

Як видно з даних, наведених на мал. 5, в початковій стадії ішемії міокарда (в перші 60-90 хв) спостерігалося збільшення ретроградного колатерального кровоструменя в середньому на 18,5±4,5% (Р<0,05), тоді як на 2-й та 3-й годині ішемії міокарда практично у всіх випадках спостерігалося зменшення колатерального кровоструменя в середньому на 7,4±1,5% від вихідного (Р<0,05).

Про збільшення ретроградного потоку крові при інфузії АК собакам з добре розвиненими колатеральными судинами повідомляли Altman J.D. і співавт. (1993). Це збільшення ретроградного потоку крові автори пов'язали із збільшенням рівня вазодиляторних простагландинів, зокрема простацикліна, в колатеральной системі, оскільки інгібування циклооксигенази індометацином спричиняло зниження ретроградного потоку крові. Однак дія АК на інтактні колатеральні судини в більш пізні терміни ішемії (в нашому випадку після 90 хв ішемії), коли запальні зміни в колатеральних судинах стають більш значними, може змінюватися, особливо, якщо враховувати залучення до процесу росту колатеральних судин тромбоцитів і лейкоцитів, що мають потужні системи метаболізму АК. При введенні АК в наших дослідах, посилення утворення вазоконстрикторних для колатералей ейкозаноїдів може бути причиною зниження ретроградного потоку крові, що спостерігається в більш пізні терміни ішемії міокарда при введенні АК.

Також, якщо виходити з отриманих нами даних про можливе пошкодження ендотелію в межах 90 хв ішемії, то зменшення ретроградного потоку крові при введенні АК після цього періоду часу можна пояснити прямою констрикторною дією АК на гладеньком'язеві клітини колатеральних судин. Це припущення підтримується даними, що АК може безпосередньо впливати на гладеньком'язеві клітини судин, вивільняючи внутрішньоклітинний кальцій з внутрішньоклітинних депо через активацію протеїнкінази С (Linden D, Routtenberg А, 1989).

Гострий інфаркт міокарда поряд з місцевими розладами метаболізму закономірно супроводиться стрес-синдромом (Меерсон ФЗ, 1984), що призводить до ще вищого збільшення вже існуючого збудження симпато-адреналової системи, і появи в крові надлишку катехоламінів (Levene DL, Freeman MR, 1976; Меєрсон ФЗ і співавт., 1982). У той же час є суперечливі дані про дію адренергічної активації на коронарні колатеральні судини. Деякі дослідники повідомляли, що адренергічні агоністи викликають вазоконстрикцію колатеральних судин (Maruoka Y et al., 1987), інші -про відсутність вазоконстрикції, опосередкованій µ-адренорецепторами як “розвинених", так і “нерозвинених" колатеральнх судин (Harrison DG et al., 1986; Hautamaa PV et al., 1987).

У наших експериментах внутрішньокоронарне введення адреналіну в дозі 2 мкг в період 3 год. ішемії міокарда спричиняло як зменшення об'ємного колатерального (ретроградного) кровоструменя в середньому на 15±2,5% (Р<0,05), що могло свідчити про збільшення опору в системі колатеральных судин ішемізованого серця. Незважаючи на, ймовірно, комплексний механізм вазомоторних реакцій при внутрішньокоронарному введенні адреналіну, потрібно думати, що катехоламіни погіршують колатеральний кровообіг при гострому інфаркті міокарда.

Особливе значення в регуляції коронарних вазомоторних реакцій може грати серотонін, що пов'язано з його участю в патогенезе тромбоемболічних реакцій. Введення серотоніну в гирло лівої передньонисхідної артерії при ішемії міокарда, що викликає розвиток гіпертензивного хеморефлекса, супроводжувалося різким зменшенням коронарного ретроградного потоку крові. У середньому ретроградний колатеральний кровострумень після внутрішньокоронарного введення серотоніну, нормалізований по артеріальному тиску був зменшений на 27±4% (Р<0,05). При відсутності гіпертензивного хеморефлекса реакції на серотонін були незначні.

Нами була досліджена також дія двох основних продуктів циклоксигеназного метаболізму АK в серці, простацикліна і ПГЕ2 на коронарний судинний опір і ретроградний колатеральний кровострумень.

Простациклін є могутнім коронарним вазодилятором. Показано, що він може викликати дилятацію добре “розвинених" коронарних колатеральных судин в ізольованому серці собаки (Altman JD et al., 1993). У наших експериментах на інтактних тваринах простациклін спричиняв підвищення колатерального кровоструменя в середньому на 13±4% (Р<0,05). В той же час рівень простацикліна в ретроградній крові до 120 хв ішемії практично не змінювався. Ці дані вказують на те, що зниження ретроградного потоку, що спостерігається в наших експериментах, в цей період часу, очевидно, не пов'язане із зменшенням утворення простацикліна в межах колатеральної системи, а зумовлено, ймовірно, іншими факторами.

У наших експериментах введення ПГE2 в дозі 200 мкг спричиняло статистично достовірне зменшення ретроградного потоку крові, як розрахованого по коефіцієнту К - на 29±4% (Р<0,05) (рис.5), так і об'ємного ретроградного потоку крові за 1 хв - на 0,42±0,06 мл.

Зниження ретроградного потоку крові, що спостерігається в наших експериментах по ходу ішемії міокарда може бути також пов'язане з посиленням утворення лейкотрієнів, які будучи одними з самих потужних хемоатрактантів сприяють акумуляції формених елементів крові в ділянке ішемії, їх адгезії та агрегації.

З метою з'ясування прямої дії екзогенно лейкотрієнів, що вводяться, на ретроградний колатеральний потік крові ми провели серію досліджень з введенням лейкотрієна С4 в дозі 2 мкг в неішемізовану частину коронарної судини.

Введення ЛTC4 в дозі 2 мкг спричиняло в ряді досліджень статистично достовірне збільшення ретроградного потоку крові на 18±4% (Р<0,05), але потім, приблизно, через хвилину, ККК міг зменшуватися. Хоч ЛTC4 відомий як коронароконстриктор, що підтверджувалось підвищенням КПД в наших дослідах, однак є ряд фактів, які можуть пояснити незвичайну дію ЛTC4 на ретроградний колатеральний кровострумень в наших дослідженнях. Так встановлено, що інфузія ЛTD4 може посилювати утворення простацикліна (Terashita Z-I, 1981). Відомо також, що лейкотрієни можуть також спричиняти утворення коронарного вазодиляторного фактору (Ezra D et al., 1985), який, як передбачається утворюється тромбоцитами і ідентичний або схожий з атріальним натрійуретичним пептидом (Fiedler VB et al., 1987). Також можливо, що лейкотрієни спричиняють утворення невідомого медіатора, який стимулює утворення атріального натрійуретичного пептида (Feuerstein G, 1984).)

Таким чином, по ходу ішемії міокарда відбувається зміна реактивності коронарних колатеральных судин на біологічно активні речовини. Ці зміни виражаються в характері реакцій колатеральных судин на ендотелій-залежні вазодилятатори (ацетилхолін, арахідонову кислоту). Як правило, в перші 1,5 години ішемії вазодиляторні реакції зберігалися, а після 1,5 годин переважно спостерігалися реакції із зменшенням колатерального кровоструменя в серці. Проведені дослідження також дають основу передбачати, що причиною зменшення ретроградного колатерального кровоструменя в період ішемії міокарда, може бути як значне пошкодження ендотелію колатеральних судин, так і посилення утворення вазоконстрикторних для колатералей речовин (наприклад, адреналін, серотонін, ПГE2) в межах колатеральної системи.

Вивчення впливу нової лікарської форми – ліпосомального кверцетина – на ішемічно – реперфузійні порушеня коронарного кровообігу, функцію міокарда і об'єм пошкодження

Отримані нами дані про реакції коронарних судин неішемізованої частини міокарда лівого шлуночка і зміни колатерального кровообігу в динаміці ішемії та реперфузії міокарда свідчать про істотну роль ендогенних біорегуляторів в розвитку патологічних процесів в серці. Як видно з даних представлених в таблиці 1 в процесі 3-х годинної ішемії міокарда спостерігається підвищення вмісту лейкотрієнів в коронарній крові, що досягає в кінці ішемії 200 % від початкового рівня. Через годину після ішемії кількість лейкотрієнів ЛТС4-ЛТЕ4 збільшується в 2,5 рази, а в період реперфузії в 4,2 рази (табл. 1). Це свідчить про інтенсивну активацію ліпоксигенази при ішемії та реперфузії міокарда. Разом з тим, ми не спостерігали при ішемії міокарда значних змін активності другого ключового ферменту, що бере участь в процесах деградації фосфоліпідів і метаболізму арахідонової кислоти- циклооксигенази. Протягом 2-х годинної ішемії спостерігалися лише незначні зміни рівня простацикліну в крові, відтікаючій від серця.

Добре відомо, що пептидолейкотрієни ЛТС4-ЛТД4 мають сильну коронароконстрикторну дію, а у великих дозах викликають аритмогенний ефект. Як показано раніше в нашому відділі (Колчин Ю.Н., Мойбенко А.А., 1991) лейкотрієн С4 дозозалежно звужує коронарні судини і викликає виражену гіпоксію міокарда. У наших експериментах на ішемизованому серці ЛТС4 в дозах 2-4 мкг спричиняв істотне збільшення коронарного судинного опору в середньому на 22% і провокував виникнення різких порушень ритму. Відомо також, що лейкотрієн В4 має виражену хемоатрактантну дію, що визначає акумуляцію формених елементів крові, особливо нейтрофілів і приводить до активації вільнорадикальних процесів у вогнищі ішемії, збільшення рівня лейкотрієнів за рахунок активації 5-ліпоксигенази нейтрофілів і нарешті до створення механічної перешкоди в дрібних коронарних судинах.

У ряді дослідів ми спостерігали значне збільшення колатерального кровообігу в умовах ішемії міокарда після інгібування ліпоксигенази за допомогою специфічного суіцидального інгібітора лінолеіл гідроксамової кислоти в дозі 3 мг/кг. Отже, при виборі методів корекції порушень кровообігу при ішемії-реперфузії міокарда, очевидно, необхідно було виходити з необхідності переважного гальмування саме ліпоксигенази.

Важливим аспектом патогенезу порушень структури і функції клітинних мембран при ішемії і особливо реперфузії міокарда є активація вільнорадикальних процесів, що призводить до накопичення вільних радикалів кисню. Збільшення кількості активних форм кисню в наших дослідженнях (за даними хемолюмінісценції) має місце вже в початковій стадії ішемії міокарда, але особливо різко цей процес інтенсифікується з початком реперфузії, коли показники хемілюмінісценції збільшуються практично вдвічі.

У зв'язку з цим одним з перспективних напрямів в пошуку нових методів терапії захворювань серця потрібно вважати розробку методів стабілізації клітинних мембран шляхом гальмування надмірної активності ферментів, які їх руйнують, і прооксидантних процесів. Серед такого роду лікарських речовин велику увагу заслуговують біофлавоноїди, особливо кверцетин, який має виражений інгбуючий вплив на активність ліпоксигенази (в меншій мірі циклооксигенази) і на ряд інших ферментів (протеїнкіназу С, фосфодіестерази і т.д.), а також виражену антиоксидантну дію ( Robak J, Gryglewski RJ, 1988; Yuting С et al., 1990; Hollman PC et al., 1999).

У двох групах експериментів нами проведене вивчення впливу інгибування активності ліпоксигенази та дії активних форм кисню за допомогою ліпосомального кверцетина. Як випливає з даних, представлених в табл. 1 кверцетин в значній мірі запобігав продукції лейкотрієнів в динаміці ішемії і реперфузії міокарда. Якщо в контрольних дослідах рівень лейкотрієнів зростав при ішемії на 150%, а при реперфузії на 350%, то в дослідах з кверцетином всього лише на 40% і 90%, відповідно. Як і в контрольних дослідах істотних змін вмісту простацикліна не спостерігалося, що свідчить про досить високу виборчу специфічність дії кверцетина на каскад саме ліпоксигеназних ферментів.

Таблиця 1. Вплив ЛК на рівень лейкотрієнів С4-Е4 (нг/мл) і простациклина (пг/мл) в плазмі артеріальної крові при ішемії-реперфузії міокарда у собак.

Показники Умови Дослідів Контроль Ішемія 60 хв Реперфузія 60 хв

ЛТС4-ЛТЕ4 Без ЛК 0,23±0,054 0,57±0,07* 0,98±0,11*

З ЛК 0,34±0,04 0,47± 0,06* 0,67±0,1*

ПГI2 Без ЛК 113,0±4,5 114,0±3,0 116,0±2,9

З ЛК 111,0±5,3 112,0±5,4 115,0±2,7

*- Р<0,05 в порівнянні з контролем

Поряд з цим чітко виявлялися антиоксидантні властивості кверцетина. Так в контрольних дослідах спостерігалося значне збільшення всіх кінетичних параметрів хемолюмінісценції плазми крові (ХЛ). На 90 хв. ішемії сумарна ХЛ за 5 хв. реєстрації (S5) збільшувалася на 50,2±9,2% (Р<0,05) від вихідного рівня, збільшувалося кінцеве значення інтенсивності випромінювання за 5 хв. (І5), по величині якого можна судити про швидкість загасання ХЛ і опосередковано про стан антиоксидантної системи. Цей показник збільшувався на 58,5±11,4% (Р<0,05) на 90 хв. ішемії від вихідного рівня. Реперфузія призводила до ще більш інтенсивного наростання перекисних процесів. Так на 120 хв. реперфузії приріст S5 становив 123,9±23,6% (Р<0,05), а І5 - 79,2±10,1 % (Р<0,05) від початкового рівня.

Отримані дані свідчили про зростання інтенсивності перекисних процесів в системі крові, що дозволило допустити існування порушення балансу між утворенням і інактиваціею перекисних ліпідів, яке може призводити до їх надмірного накопичення. Індукована перекисом водню ХЛ крові в дослідах з використанням ліпосомального кверцетина була значною мірою менш виражена. Введення ліпосомального кверцетина зменшувало рівень ХЛ по всіх кінетичних показниках, однак ці зміни досягали достовірності тільки при реперфузії. Так на 120 хв реперфузії різниця між 1 (контроль) та 2 (кверцетин) групою становила 110,8±16,7% (Р<0,05). При всій відносності такого методу оцінки вільнорадикальних процесів, можна передбачити, що однією з сторін протекторної дії кверцетина можуть бути його антиоксидантні властивості.

Значною була різниця між змінами коронарного кровоструменя в зоні "ризику". Як видно з даних табл. 2 коронарний кровострумень в зоні "ризику" істотно не відрізнявся в обох групах за вихідних умов, але в кінці реперфузії з'являлася різниця і дуже значна- в контрольних експериментах, де коронарний кровострумень був більш ніж вдвічі нижче ніж в експериментах з ЛК. Таким чином, кверцетин виявився здатним запобігати падінню коронарного кровоструменя при реперфузії, так званому феномену "no reflow" – не відновленню кровоструменя після ішемії міокарда.

Таблиця 2. Вплив ліпосомального кверцетину на коронарний кровострумень в зоні “ризику" при ішемії-реперфузії у собак (мл/хв).

Показники Умови досліду Контроль 240 хв реперфузії

Коронарний Без ЛК (n=6) 10,4±1,1 5,2±0,6*

Кровострумень З ЛК (n=8) 9,1±0,8 10,9±0,9*

*- Р<0,05 vs контроль

Визначення величин ретроградного колатерального потоку крові по коефіцієнту К також показало значну різницю між 1 і 2 групами. Так якщо в контрольній групі спостерігалося його зниження під час ішемії (рис. 5), то в групі з ліпосомальним кверцетином спостерігалася тенденція до його збільшення.

У табл. 3 приведені дані про розміри некрозу міокарда при ішемії-реперфузії в 1 та у 2 групах експериментів. Розмір некротичної зони в контролі становив 11,6±1,2% і був близьким до таких в експериментах з перев'язкою гілки коронарної артерії у собак (Tanaka M et. al., 1993). Як видно з приведених даних, незважаючи на те, що зона "ризику" в експериментах з ЛК була відносно більшою, розмір некрозу міокарда був більш ніж вдвічі меншим в порівнянні з контролем і становив 5,5±0,6% від розміру лівого шлуночка (Р<0,05 по відношенню до контролю). Співвідношення площі інфаркту до площі "ризику" було більш ніж в три рази менше, ніж у контрольній групі експериментів.

Таблиця 3. Вплив ліпосомальної форми кверцетина на розмір інфаркту

міокарда у собак при ішемії та реперфузії міокарда в контрольной (1 К) та дослідной (2 ЛК, кверцетин) групах.

Групи Тварин Статист. Показник Зона ризику від об'єму ЛШ (%) Зона інфаркту від об'єму ЛШ (%) Зона інфаркту від зони ризику (%)

1 К. (n=6) M± М 27,9± 2,8 11,6± 1,2 45,8± 4,7

2 ЛК. (n=8) M± М 38,6± 1,9 5,5± 0,6* 13,9± 1,8*

*- Р<0,05 vs контроль

Таким чином використання при ішемії і реперфузії міокарда антиоксиданта і блокатора ліпоксигенази - ліпосомального кверцетина – спричиняє захисну дію на міокард, що в наших експериментах виражалося в поліпшенні коронарного і колатерального кровоструменя, зменшенні площі інфаркту міокарда, інгібуванні ПОЛ, поряд зі зниженням вмісту лейкотрієнів в коронарній крові.

ВИСНОВКИ

1. Розробка і використання нової моделі ішемії і реперфузії міокарда у собак із закритою грудною порожниною, яка дозволяє в умовах, що жорстко контролюються, відтворювати гостру ішемію і реперфузію міокарда, досліджувати коронарний і ретроградний колатеральний кровострумені та скорочувальну функцію серця, дозволило встановити, що ішемія і реперфузія міокарда впливає значним чином як на коронарні судини інтактної зони серця, так і на коронарний колатеральний кровострумень. У залежності від тривалості ішемії реактивність колатеральних судин на біологічно активні речовини істотно змінюється. Використання антиоксиданта і блокатора ліпоксигенази - кверцетина - супроводжується вираженою кардіопротекторною дією при ішемії і реперфузії міокарда.

2. Як короткочасна, так і тривала локальна ішемія міокарда спричиняє значне зменшення тонусу коронарних судин інтактної (неішемізованої) зони серця. Вазодилятаторна реакція при оклюзії коронарної судини пригнічується при гальмуванні продукції оксиду азоту великими дозами інгібіторів нітрікоксид синтази, зменшується при блокаді активності АТФ залежних калієвих каналів. При реперфузії відбувається тривале підвищення опору кровоструменю в судинах неішемізованої зони міокарда.

3. Під час тривалої ішемії міокарда відбувається прогресивне