КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

БУБЛИК АНДРІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ

УДК 599:539.1.047:577.346

СУМІСНА ДІЯ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ ТА КАДМІЮ НА КЛІТИНИ ПЕЧІНКИ І СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ТОНКОЇ КИШКИ ЩУРІВ

03.00.01 – радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор кафедри біохімії

Войціцький Володимир Михайлович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

Дружина Микола Олександрович,

Інститут експериментальної патології, онкології і

радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України,

провідний науковий співробітник;

доктор біологічних наук,

Дмитренко Микола Петрович,

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя

МОЗ України, завідувач лабораторії біохімії

Провідна установа: Науковий центр радіаційної медицини

АМН України, Інститут експериментальної

радіології, лабораторія радіаційної біохімії, м.Київ

Захист відбудеться “ 18 ” грудня 2000 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м.Київ, проспект Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64;

Спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м.Київ, вул Володимирська, 58

Автореферат розісланий “17” листопада 2000 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Підвищення радіаційного фону після аварії на Чорнобильській АЕС створює додаткове навантаження на організм за умов забруднення навколишнього середовища продуктами техногенного походження. З навколишнього середовища хімічні речовини надходять в організм людини через органи дихання, шкіру, з продуктами харчування та питною водою [Любченко, 1990]. Сумісна дія іонізуючої радіації та ксенобіотиків (до них відносяться і всі важкі метали) може призводити до суттєвих патологічних зрушень в організмі, і тому актуальним стає дослідження реакції біологічних об’єктів на поєднаний вплив факторів радіаційної та хімічної природи. Не менш важливою проблемою є вивчення захисно-компенсаторної ролі біомолекул за цих умов.

В теоретичній та прикладній розробці пріоритетних аспектів радіобіології, радіоекології та токсикології особливе місце займає проблема дії чинників низької інтенсивності та концентрації. Слід враховувати, що іонізуюча радіація та важкі метали, як хімічні забрудники, впливають на організм людини та інші біооб’єкти вже на рівні відносно низьких доз [Трахтенберг, 1994]. Сполуки кадмію є одним із найшкідливіших забруднювачів навколишнього середовища. Обмін іонів кадмію в організмі характеризується: 1) відсутністю ефективного механізму контролю; 2) тривалою затримкою в організмі та довгим періодом напіввиведення; 3) інтенсивною взаємодією з іншими двохвалентними металами в процесі всмоктування (яке проходить в тонкому відділі кишечника) та на тканинному рівні; 4) переважним накопиченням в печінці та нирках [Авицын и др., 1991; Богомазов, Габиян, 1992].

Клітинні та субклітинні мембрани - основні мішені впливу ендогенних факторів на клітини [Сапини, Билич, 1989; Хижняк и др., 1999] – приймають участь в регуляції обміну речовин та перетворенні енергії. Важливу роль в цих процесах відіграють ліпіди, які мають подвійні зв’язки (ненасичені жирні кислоти та їх залишки в ліпідах), тому легко та швидко пошкоджуються активними метаболітами кисню. Порушується рівновага в системі оксидант-антиоксидант. При цьому різні фізіологічні системи, що підтримують гомеостаз, часто зазнають неадекватних навантажень і перенапруження, зокрема порушується структурно-функціональний стан біомембран [Барабой, Судковой, 1997]. Взаємодія важких металів з компонентами клітин, клітинних органел та мембран лежить в основі їх токсичного впливу. Встановлення механізмів розвитку патологічних процесів потребує подальших досліджень на рівні клітин, субклітинних структур, їх мембранних та ферментних систем.

Відомо, що за характером впливу на організм тварин іонізуюча радіація та важкі метали мають багато спільного: активується синтез ДНК та інших функціональних структур, збільшується частота хромосомних аберацій, ініціюються процеси вільнорадикального окислення, ушкоджується структура та функції клітинних мембран, пригнічується імунітет та порушується гормональний статус [Wentink at all., 1988; Буштуева и др., 1989; Yiin at all., 1999]. Комбінація радіації та важких металів може проявляти синергічну дію на живі організми з коефіцієнтом (за канцерогенною ефективністю) 2 - 10 [Богомазов, Гарибян, 1992]. Разом з тим, недостатньо вивчені характер (тип) такої дії та внесок кожного із факторів в їх сумарний біологічний ефект.

Зв’язок з науковою тематикою організації. Робота виконана у рамках теми № 97083 Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Мета та задачі дослідження. Мета роботи полягала в дослідженні особливостей ефекту сумісної дії сублетальних доз іонізуючої радіації та низької дози хлориду кадмію на структурно-функціональні властивості тонкої кишки і печінки для оцінки спільного впливу цих факторів на організм.

В зв’язку з цим в роботі було поставлено наступні задачі:

1. Дослідити сумісну дію іонізуючої радіації (1,0 і 2,0 Гр) та хлориду кадмію (1 мг/кг) на:

а) морфофункціональний стан печінки та різних відділів тонкої кишки.

б) кількісний вміст основних ліпідів слизової оболонки тонкої кишки та печінки;

в) протікання процесів ПОЛ в слизовій оболонці тонкої кишки та печінки;

г) активність мембранозв’язаних ферментів тонкої кишки та печінки;

2. Провести факторний аналіз сумісної дії іонізуючої радіації та іонів кадмію на організм.

Об’єкт дослідження – сумісний вплив іонізуючого випромінювання та іонів кадмію на організм.

Предмет дослідження - епітеліальні клітини різних відділів тонкої кишки та печінки.

Методи дослідження: радіобіологічні, спектрофотометричні, спектрофлуометричні, світлова мікроскопія, факторний аналіз.

Наукова новизна. Вперше проведено комплексні гістологічні та біохімічні дослідження сумісного впливу іонізуючої радіації та іонів кадмію на структурно-функціональний стан тонкої кишки і печінки.

Виявлено прискорення фізіологічної регенерації тонкої кишки протягом доби після окремої дії іонізуючої радіації і хлориду кадмію та гальмування цього процесу при їх сумісній дії.

Встановлено, що сумісна дія випромінювання та кадмію (в досліджуваних дозах) приводить до порушень окисно-антиокисного статусу клітин печінки та слизової оболонки тонкої кишки в результаті зростання швидкості ліпідної пероксидації та накопичення в клітинах продуктів ПОЛ.

Виявлено пригнічення активності мембранозв’язаних ферментів печінки та слизової оболонки тонкої кишки при сумісній дії випромінювання та кадмію, як результат порушень структури клітинних мембран.

Застосування факторного аналізу дозволило виявити найхарактерніші, серед досліджуваних, показники сумісної дії іонізуючої радіації та кадмію на структуру і функцію печінки та слизової оболонки тонкої кишки.

З’ясовано характер та особливості окремої і сумісної дії на організм іонів кадмію та іонізуючого випромінювання, виявлено основні ланки пошкоджень, обгрунтовано можливість прогнозування ефекту при сумісній дії досліджуваних факторів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть слугувати науковим обґрунтуванням розробки методів корекції та профілактики порушень структурно-функціональних властивостей клітин при дії іонізуючої радіації та іонів кадмію.

Показано доцільність використання методу факторного аналізу для виявлення закономірностей впливу екстремальних факторів на організм.

Встановлений статистичний зв’язок досліджуваних параметрів стану окремих органів дозволяє обґрунтовати зроблені висновки стосовно характеру впливу досліджених чинників та прогнозувати розвиток процесу.

Особистий внесок здобувача. Дисертант опрацював необхідну за темою наукову літературу, оволодів необхідними аналітичними та статистичними методами досліджень, брав участь у плануванні експериментальних робіт і підготовці матеріалів до друку. Конкретний внесок дисертанта у роботу полягав у розробці концепції та виконанні всіх експериментальних робіт, обговоренні одержаних результатів.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на IV конференції країн СНД ”Проблеми екології та експлуатація об’єктів енергетики”, Севастополь – 1997, ІІ Всеукраїнській науково-методичній конференції з міжнародною участю “Екологія та інженерія. Стан, наслідки, шляхи створення екологічно чистих технологій”, Дніпродзержинськ - 1998, VIII International ІNЕСО conference “Measurment in Clinical Medicine” – Дубровниці, Хорватія – 1998, ІІ З’їзді біофізиків Росії, Москва – 1999 та науково-методичних конференціях біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у 1997-1999 роках.

Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті, 4 тези доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділів, що відображують результати власних досліджень, висновків та списку використаної наукової літератури, який містить 160 джерел. Роботу викладено на 131 сторінці машинопису, ілюстровано 14 рисунками та 14 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження були проведені на щурах-самцях масою 180-200 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію.

Тварин опромінювали на установці РУМ-17 рентгенівськими променями за таких умов: потужність дози 0,35 Гр/хв, фільтри 0,5 мм Cu та 1 мм Al, сила струму 10 мА, напруга 200 кВ, шкірно-фокусна відстань - 50 см. Хлорид кадмію вводили перорально за 2 години до опромінення. Тварин декапітували через 1 добу після дії досліджуваних чинників.

Тварин розділяли на групи (по 6-10 у кожній) в залежності від завдань експерименту:

1. Перша група – контрольні тварини;

2. Друга група – тварини, яким одноразово вводили хлорид кадмію у фізіологічному розчині в дозі 1,0 мг/кг маси тіла ( в перахунку на Сd2+) ;

3. Третя група – тварини, яких опромінювали в дозі 1,0 Гр;

4. Четверта група – тварини, яких опромінювали в дозі 2,0 Гр;

5. П’ята група – тварини, яких піддавали сумісній дії кадмію та випромінювання в дозі 1,0 Гр;

6. Шоста група – тварини, яких піддавали сумісній дії кадмію та випромінювання в дозі 2,0 Гр.

Для вивчення морфологічних показників готували парафінові напівтонкі зрізи [Волкова та ін., 1982; Карупу, 1984]. Висоту ентероцитів одношарового епітелію тонкої кишки вимірювали за допомогою окуляр-мікрометра, а діаметр ядер гепатоцитів та площі поперечного перерізу ядер ентероцитів - на напівавтоматичній установці "Інтеграл-2МТ" за програмою "Маркер". Мітотичний індекс визначали згідно методики [Астауров, 1974] та підраховували кількість клітин, які припадають на крипту. При даних дослідженнях за 2 години до забою тваринам перорально вводили розчин колхіцину в концентрації 0,2 мг на 100г живої маси.

Активність лужної фосфатази визначали згідно [Chijsen et all., 1980], активність -глутамілтрансферази та аланінамінотрансферази - згідно [Lin et all, 1981]. Активність Na+,K+-АТФази та Са2+,Mg2+-АТФази визначали як вказується в роботах [Chijsen et all., 1980; Harms,1980].

Вміст ТБК (2-тіобарбітурова кислота) - активних продуктів, рівень яких перераховували на кількість малонового діальдегіда (МДА), визначали за методом [Орехович, 1977]. Визначення вмісту шиффових основ проводили згідно [Tappel, 1978], а дієнових кон’югатів (ДК) - [Орехович, 1977].

Визначення антиокисної активності (АОА) проводили за методом [Семенов и др., 1985] з використанням відновленої форми 2,6-діхлорфеноліндофенола в якості окисника.

Визначення кількості триацилглицеролів, холестеролу та загальних фосфоліпідів проводили ферментативним методом, за допомогою біхроматичної фотометричної системи "STAT FAX 1904 PLUS" (США).

Для визначення ступеня взаємного впливу різних параметрів досліджуваних процесів та виявлення об'єктивно існуючих закономірностей використовували метод факторного аналізу [Харман, 1972; Браверман, 1983].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Цитоморфометричні дослідження стану слизової оболонки тонкої кишки і печінки. Для гістологічних досліджень брали зразки печінки і різних відділів тонкої кишки: дванадцятипалої та порожньої. За даними світлової мікроскопії гістоструктура епітелію тонкої кишки контрольних та піддослідних тварин, через добу після окремої та сумісної дії іонізуючого випромінювання і кадмію майже не відрізняється. Виявлене збільшення числа бокаловидних клітин в дванадцятипалій та порожніх кишках через одну добу після введення кадмію може слугувати одним із показників її гіперсекреторного стану.

Результати морфометричного аналізу препаратів печінки та епітелію різних відділів тонкої кишки свідчать, що іонізуюча радіація в дозах 1,0 та 2,0 Гр приводить до зменшення висоти ентероцитів, особливо в дванадцятипалій кишці (приблизно на 30 %). Площа ядер при цьому зменшується на 12-18 %, що вказує на пригнічення функціональної активності ентероцитів кишечнику.

Сумісна дія іонів кадмію та випромінювання майже не впливає на висоту ентероцитів порожньої кишки, але в дванадцятипалій кишці їх висота менша на 10-14 % відносно контролю. Поряд з цим, площа ядер ентероцитів, які вистилають ворсинки дванадцятипалої та порожньої кишок зменшується приблизно на 10-12%.

Морфометричні дослідження гепатоцитів, проведені в паралельних експериментах, свідчать про зменшення діаметра ядер за даних умовах впливу, що віддзеркалює пригнічення їх синтетичної активності. Найсуттєвіше зменшується діаметр ядер при опроміненні в дозі 1,0 Гр чи сумісній дії кадмію та опромінення в дозі 2,0 Гр (приблизно 20-23 %).

Проліферативна активність клітин тонкої кишки. Вивчення структури різних ділянок тонкої кишки показало, що через дві години після дії різних чинників спостерігається достовірне зниження популяції клітин крипт, які утворюють її проліферативну зону (рис.1).

Рис.1 Загальна кількість клітин в крипті дванадцятипалої (а) та порожньої (б) кишки після дії іонізуючої радіації та кадмію

Тут і далі: 1-6 – номери груп піддослідних тварин

*- р < 0,05 – по відношенню до контролю.

Так, для дванадцятипалої кишки при опроміненні в дозі 1,0 та 2,0 Гр зниження даного показника відбувалось в середньому на 62% та 66 %, а для порожньої кишки - відповідно на 40% та 60 % і залишається значно меншим від контролю через добу після дії іонізуючої радіації. Через 2 години після сумісного впливу випромінювання та кадмію, у дванадцятипалій та порожній кишці кількість клітин зменшується в середньому на 38% та 42%, відповідно, а через 1 добу їх кількість майже не відрізняється від контролю.

Дослідження динаміки процесів проліферації тонкої кишки свідчить про значне пригнічення проліферативної активності стовбурних клітин крипт різних відділів тонкої кишки через 2 год після окремої та сумісної дії досліджуваних чинників і про її зростання через 1 добу (рис.2). Причому, після дії іонізуючої радіації в дозі 2,0 Гр мітотичний індекс збільшується відносно контролю у дванадцятипалій кишці в середньому на 30%, а у порожній кишці - на 65 %. Після сумісної дії випромінювання та кадмію через 1 добу мітотичний індекс залишається нижче контрольних значень в середньому на 55 % та 44 % у дванадцятипалій та порожній кишках відповідно.

Рис.2 Мітотична активність стовбурових клітин крипт дванадцятипалої (а) та порожньої (б) кишки після дії іонізуючої радіації та кадмію

*- р < 0,05 – по відношенню до контролю.

Отримані дані свідчать, що протягом доби після окремої дії іонізуючої радіації та кадмію зростає мітотична активність клітин різних відділів тонкої кишки поряд із меншою (в порівнянні з контролем) їх кількістю в криптах. Це може вказувати на зростання виходу клітин на ворсинки, тобто підвищення процесів регенерації в цих відділах тонкої кишки. При сумісній дії досліджуваних чинників спостерігається зниження проліферативної активності при всіх строках дослідження. Однак, кількість клітин в криптах різних відділів тонкої кишки через 1 добу не відрізняється від контролю. Таким чином, на відміну від окремої, при сумісній дії кадмію та випромінювання гальмується процес виходу клітин на ворсинки, що вказує на пригнічення регенеративних процесів в різних відділах тонкої кишки.

Активність ферментів тонкої кишки і печінки. Вплив іонізуючого випромінювання або взаємодія важких металів з клітинними структурами приводить до порушень функціонування локалізованих в них ферментних систем [Рискулова, 1986; Трахтенберг, 1994]. Клітини тонкого кишечника та гепатоцити характеризуються присутністю таких ферментів, як лужна фосфатаза (ЛФ), ?-глутамілтрансфераза (ГГТ) та аланінамінотрансфераза (АлАТ) [Becciolini, 1987].

Активність гідролаз в клітинах епітелію тонкої кишки знижується незначно при дії кадмію. Дія іонізуючого випромінювання та сумісна з іонами кадмію викликає зниження активності ЛФ (в середньому на 10%); ГГТ (на 14%) та АлАТ (на 14%) (табл. 1).

В гепатоцитах окрема дія кадмію чи випромінювання в дозах 1,0 та 2,0 Гр призводить до зниження активності ЛФ (в середньому на 14 %) та АлАТ (на 8 %). В результаті сумісної дії іонізуючої радіації та кадмію активність ЛФ знижується на 26-28%, а АлАТ на 18-25% відносно контролю. Активність ГГТ зменшується в середньому на 11-15% при дії всіх досліджуваних чинників.

Таблиця 1.

Активність ферментів після впливу іонізуючої радіації та іонів кадмію (мкмоль продукту / хв мг білка ) (М±m , n = 6 – 7)

*- р < 0,05 – по відношенню до контролю.

Ведуча роль в підтримці внутрішньоклітинного іонного гомеостазу належить Na+,K+-АТФазі та Са2+,Mg2+-АТФазі, що обумовлює визначення їх активності при дослідженні впливу різних чинників на організм [Рискулова, 1986; Дворецкий и др., 1990]. Представлені в табл.2 дані свідчать, що в результаті введення кадмію активність Na+,K+-АТФази незначно змінювалась: в препаратах тонкої кишки вона зменшувалась в середньому на 11%, а в печінки - зростала на 11% відносно контролю. Опромінення в дозах 1,0 і 2,0 Гр викликало дозозалежне зменшення активності цього ферменту: в препаратах тонкої кишки на 13% і 25% відносно контролю, препаратах печінки - на 19% і 29% відповідно. Сумісний вплив іонів кадмію та іонізуючої радіації приводив до значного зниження активності ферменту в обох органах. Так, в результаті дії кадмію та опромінення в дозі 2,0 Гр активність Na+,K+-АТФази зменшувалась в середньому на 43% та 51% відносно контролю в препаратах тонкої кишки та печінки відповідно. Активність Са2+-АТФази в препаратах слизової оболонки тонкої кишки знижувалась як після дії випромінювання та кадмію, так і при сумісному впливі цих факторів, в останньому випадку вона зменшувалась на 30-40% відносно контролю. Менш чутливою до дії досліджуваних чинників виявилася Mg2+-АТФаза.

Функціональна активність Na+,K+-АТФази та Са2+,Mg2+-АТФази SH-залежна, а однією з мішеней дії активних форм кисню в результаті впливу іонізуючого випромінювання та кадмію на білкові молекули виступають саме SH-групи [Рискулова, 1986; Михалева, 1988]. Показано, що кількість тіолових груп зменшується в результаті дії всіх досліджуваних факторів: в слизовій оболонці тонкої кишки на 32-35%, а в печінці – на 14-20%.

Кількісний склад ліпідів тонкої кишки і печінки. Формування відповіді клітин на екстремальні впливи в значній мірі пов'язано з структурною перебудовою мембран, яка обумовлена зміною складу її ліпідної компоненти [Элойя, 1989; Коломийцева и др., 1989].

Отримані результати (табл. 3) свідчать, що в клітинах печінки кількість основних структурних ліпідів (фосфоліпідів та холестеролу, а також триацилгліцеролів) практично не змінюється при даних видах впливу.

В слизовій оболонці тонкої кишки, на відміну від печінки, спостерігається зниження вмісту ліпідів в порівнянні із контролем, як при окремій, так і сумісній дії кадмію і випромінювання. Причому, більш суттєво зменшується кількість холестеролу (в середньому на 28-30%).

Таблиця 3.

Кількість ліпідів у печінці, слизовій оболонці та апікальній мембрані клітин тонкої кишки через 1 добу після впливу іонізуючої радіації та іонів кадмію (М m, n = 6-7)

* - р<0,05 по відношенню до контролю

В апікальній мембрані, яка є однією із складових плазматичної мембрани ентероцитів тонкого кишечнику, після введення кадмію або дії іонізуючої радіації спостерігається зменшення кількості фосфоліпідів, холестеролу і триацилгліцеролів в середньому на 27-32%, 27-28%, 18-23% відповідно. Сумісна дія кадмію і опромінення викликає ще більше зменшення кількості фосфоліпідів, холестеролу і триацилгліцеролів в цих мембранах, яке складає 35%, 40% і 35% відповідно до контрольних значень.

Зміна ліпідного складу апікальної мембрани може впливати на функціонування травних ферментів і, як результат, приводити до порушення мембранного травлення, оскільки плазматична мембрана ентероцитів грає ключову роль в травній функції кишечнику [Уголев, 1985].

Окисно-антиокисний гомеостаз тонкої кишки та печінки. Активація ПОЛ - універсальна реакція клітин на екстремальні впливи різної природи [Барабой, Сутковой, 1997].

Встановлено, що вміст первинних продуктів ПОЛ - дієнових кон'югатів (ДК) в слизовій оболонці тонкої кишки та печінці при окремій дії кадмію та іонізуючої радіації суттєво не змінюється. Однак, сумісний вплив кадмію та випромінювання в дозах 1,0 Гр чи 2,0 Гр приводить до зростання кількості ДК в печінці (на 30-33%) та зниження (на 30%) в слизовій оболонці тонкої кишки.

Показником вмісту вторинних токсичних для організму продуктів ПОЛ слугували речовини, що реагують з тіобарбітуровою кислотою. Рівень ТБК-активних продуктів перераховували на кількість МДА. За даних умов впливу в слизовій оболонці тонкої кишки вміст МДА зростає, в середньому, в 3,0 рази лише при сумісній дії іонізуючої радіації та іонів кадмію. В тканинах печінки найбільше зростання вмісту МДА (на 43-53%) також спостерігалось при сумісній дії цих чинників.

Визначення вмісту кінцевих продуктів ПОЛ - шиффових основ (ШО) показало, що в печінці спостерігається їх накопичення, як після введення кадмію (на 15%) та випромінювання (на 20-40 %), а також при сумісній дії цих чинників (на 28 - 33%). В слизовій оболонці тонкої кишки навпаки - при окремій дії опромінення та іонів кадмію вміст ШО знижується, а при сумісній дії зростає незначно (6-16%).

Інтенсивність протікання ПОЛ в печінці та слизовій оболонці тонкої кишки досліджували в модельних системах, що містили Fe2+ +аскорбат. Отримані дані свідчать про зростання інтенсивності ПОЛ при сумісній дії випромінювання та кадмію. Розрахована початкова швидкість (Fe2+ +аскорбат)-залежного накопичення МДА в препаратах слизової оболонки тонкої кишки складала в середньому 1,2 та 0,84 відповідно при сумісній дії кадмію та випромінювання в дозах 1,0 чи 2,0 Гр, в порівнянні з контролем, де ця величина становить 0,44 нмоль /мг білка за 1 хв. В печінці ця величина в контролі становила 2,4 нмоль /мг білка за 1 хв, а при сумісній дії кадмію та опромінення в дозах 1,0 чи 2,0 Гр 2,94 та 4,26 відповідно .

Контролює процеси ПОЛ у нормально функціонуючому організмі антиокисна система. Інтегральною характеристикою стану антиоксидантної системи тканин може бути антиокислювальна активність (АОА) її гомогенної фракції [Семенов и др., 1985].

Отримані результати свідчать, що в печінці АОА зростала лише при дії іонізуючої радіації в дозах 1,0 та 2,0 Гр відповідно на 18% та 20% відносно контроля в слизовій оболонці тонкої кишки - відповідно на 27% та 20 %.

Аналіз отриманих даних свідчить, що сумісна дія випромінювання та іонів кадмію викликає дисбаланс між накопиченням продуктів ПОЛ. Ймовірно в клітині існує декілька пускових та захисних систем, які можна розглядати як фактори, що впливають на швидкість окислення ліпідів на різних стадіях. Можливо саме порушення їх взаємодії на різних етапах, які відрізняються при різних впливах на організм і обумовлюють виявлені відмінності в накопичені продуктів ПОЛ в печінці та кишечнику при окремій та сумісній дії опромінення та кадмію на організм.

Обробка результатів досліджень з використанням методу факторного аналізу. Для виявлення можливих взаємовпливів досліджуваних параметрів, встановлення прихованих неявних закономірностей окремої та сумісної дії іонізуючої радіації та кадмію на організм при математичній обробці отриманих результатів було використано метод факторного аналізу.

Отриманий масив даних охоплював спостереження 48 змінних (параметрів) (табл. 4). Для всіх них спочатку була обчислена повна матриця коефіцієнтів кореляції, а на її основі визначені головні фактори (їх виявилося три) та факторні навантаження. Значення першого фактора а1 пропорційні числу змінних, які враховуються в значеннях усіх нормованих параметрів для даної групи тварин.

Таблиця 4.

Параметри, які вимірювалися в дослідженнях

Встановлено, що найбільші навантаження мають наступні показники: х6 х7- мітотичний індекс в дванадцятипалій і порожній кишці відповідно; х10, х11, х12 і х13 – загальна кількість клітин в крипті різних відділів тонкої кишки; х27 – вміст ШО в препаратах печінки; х29 і х30 – вміст МДА в препаратах слизової оболонки тонкої кишки; х40 – кількість фосфоліпідів в апікальній мембрані.

Найбільші навантаження на другий головний фактор а2 мають наступні змінні: x6 - мітотичний індекс в дванадцятипалій кишці, x31 , x32 - вміст МДА в препаратах слизової оболонки тонкої кишки; x40 - кількість фосфоліпідів в апікальній мембрані. Притому, збільшення значення фактора а2 відповідає збільшенню параметрів (х6, х40) та зменшенню (х31, х32), і навпаки. Таким чином, групування даних в проекції на фактор а2 визначає конкуренцію відповідних процесів у тонкій кишці.

Аналогічний аналіз для фактора а3 дозволяє виділити наступні групи змінних з позитивним навантаженням: х7 – мітотичний індекс в порожній кишці, х27 – вміст шиффових основ в печінці; х29, х30 – вміст МДА в печінці та з негативним навантаженням х10 – х13 – кількість клітин в крипті різних відділів тонкої кишки, тобто значення даного фактору визначається конкуренцією відповідних процесів у кишечнику та печінці.

Графічне відображення отриманих результатів з урахуванням усіх вимірюваних параметрів представлено на рис.3.

Рис.3. Групування ознак у підпросторі (a1, a2, a3) з урахуванням усіх 48 змінних. 1 – 6 - номери груп піддослідних тварин.

На основі аналізу представлених на рис.3 результатів, зроблено висновки:

1. Спостерігається чітке виділення області локалізації груп об’єктів 5 і 6, що відповідають групам тварин, які зазнали сумісної дії випромінювання та іонів кадмію. Взагалі це групування відрізняється різким зменшенням значення фактора а2, що узгоджується з приведеним вище заключенням про роль змінних (x6, x40) і (x31, x32). Отримані дані свідчать про значне (в 1,5 – 2 рази) зменшення першої групи параметрів та збільшення (до 3 раз) другої при сумісній дії кадмію та опромінення.

2. Конкуренцію процесів в печінці та кишечнику ілюструє зміна значення фактора а3. Із підвищенням дози опромінення збільшується значення змінних, які пов’язані з підвищенням мітотичного індексу клітин слизової оболонки порожньої кишки (x7), вмістом шиффових основ і малонового діальдегіду в печінці (x27, x29, x30) та зменшується значення тих, що пов’язані з кількістю клітин в криптах різних відділів тонкої кишки (x10 -x13). Вплив тільки іонів кадмію також викликає збільшення мітотичного індексу (x7) і зменшення вмісту клітин в криптах тонкої кишки (x10-x13). В той же час сумісна дія кадмію і випромінювання приводить до протилежного ефекту – різкого зменшення мітотичного індексу клітин слизової оболонки порожньої кишки x7 та підвищення загальної кількості клітин в криптах дванадцятипалої та порожньої кишки (x10 -x13 ).

На завершення проаналізована можливість зменшення числа досліджуваних параметрів. Як показав проведений вище аналіз факторних навантажень, лише невелика кількість змінних дає значний внесок в три основні фактори, так що можливість суттєвого зменшення числа змінних вірогідна. Для перевірки цього припущення була виконана аналогічна обробка за множиною змінних, які включають лише ті 12 із них, які мають максимальні навантаження, а саме (x6, x7, x10, x11 , x12, x13, x27, x29, x30, x31, x32, x40).

Рис.4 Групування ознак в підпросторах a) — (a1, a2) та b) — (a3, a2) для основних параметрів (N=12) та при повному наборі параметрів (N=48).

У порівнянні з результатами, що отримані із повного набору змінних, групування ознак змінюється незначно, за винятком фактора a1, котрий, як було відмічено вище, збільшується пропорційно числу змінних та зберігає загальну структуру простору ознак (рис.4). Таким чином, основними серед отриманих 48 параметрів при даних умовах досліджень, зміна яких характеризує вплив сумісної дії іонізуючого опромінення та кадмію на організм є: мітотичний індекс клітин (x6, x7 ) і загальна їх кількість в криптах різних відділів тонкого кишечнику (x10-x13), вміст шиффових основ в препаратах печінки (х27), малонового діальдегіду в препаратах слизової оболонки тонкої кишки та печінки (x29-x32), кількість фосфоліпідів в апікальній мембрані клітин тонкої кишки (x40).

ВИСНОВКИ

1. В результаті сумісної дії рентгенівського випромінювання (в дозах 1,0 і 2,0 Гр) та іонів кадмію (1 мг/кг) спостерігається пригнічення процесу фізіологічної регенерації різних відділів тонкої кишки, а при окремій дії цих чинників – прискорення.

2. Виявлено інгібування активності мембранозв’язаних ферментів печінки та слизової оболонки тонкої кишки при сумісній, на відміну від окремої, дії випромінювання та кадмію.

3. Сумісна дія випромінювання і кадмію супроводжується активацією процесу ПОЛ в тканинах печінки та слизової оболонки тонкої кишки, що проявляється в зростанні швидкості протікання ПОЛ та дисбалансі в накопиченні продуктів окислення ліпідів.

4. Зменшення кількості основних структурних ліпідів (холестеролу та загальних фосфоліпідів) в препаратах слизової оболонки тонкої кишки за умов сумісної дії іонізуючого випромінювання та кадмію відбувається, головним чином, за рахунок їх зменшення в апікальній мембрані ентероцитів.

5. Методом факторного аналізу встановлені найхарактерніші параметри, які в умовах дослідження дозволяють визначити особливості сумісної дії сублетальних доз іонізуючої радіації та низьких доз хлориду кадмію на клітини печінки та слизової оболонки тонкої кишки.

Список праць опублікованих за темою дисертації

1. Хижняк С.В., Степанова Л.І., Ромась І.І. Бублик А.А., Войціцький В.М. Використання флуоресцентних зондів для оцінки розмірів апікальної мембрани ентероцитів після дії іонізуючої радіації // Український радіологічний журнал.- 1998. -№ 2.- С.209-211.

2. Хижняк С.В., Ващенко І.В., Бублик А.А., Кисіль О.О., Войціцький В.М. Вплив сублетальних доз іонізуючої радіації на структурно-динамічні властивості білкових молекул апікальної мембрани ентероцитів // Вісник Київського університету. Серія Біологія.- 1999.- Вип.29.- С.21-23.

3. Хижняк С.В., Бублик А.А., Кисиль Е.А., Войцицкий В.М., Кучеренко Н.Е. Влияние ионизирующей радиации на структуру и функциональные свойства базолатеральной мембраны энтероцитов тонкого кишечника // Радиац. биол. Радиоэкология.- 1999.- Т.39.- С.644-647.

4. Хижняк С.В., Зотіков Л.О., Петренко З.Н., Степанов Ю.В., Бублик А.А., Войціцький В.М. Деструктивні зміни слизової оболонки тонкої кишки щурів після дії іонізуючого опромінення. // Вісник Київського університету. Сер. Біологія.- 2000.- Вип.31.- С.8-11.

5. Войцицький В.М., Векслярский Р.З., Хижняк С.В., Позюк Л.М., Бублик А.А., Влияние сочетанного воздействия ионов кадмия и - радиации на морфофункциональное состояние тонкого кишечника // Тезисы докладов VII конференции стран СНГ “Проблемы экологии и эксплуатации объектов энергетики”.-К.: Изд-во Ин-та электродинамики НАНУ.- 1997. -С 89-90.

6. Hizhnyak S.V., Voitsitsky V.M., Bublik A.A., Kucherenko N.E. Transmembrane transfer of ions and aminoacids in small intestine epithelium after exposure to ionizing radiation in low doses // Abstr. 8 Internayional IMECO Conference on Measurements in Clinical Medicine (Dubrovnic, Croatia).-1998.-P.564-565.

7. Войцицкий В.М., Хижняк С.В., Векслярский Р.З., Бублик А.А., Шевченко Л.Е. Сочетанное воздействие ионов кадмия и ионизирующей радиации на функциональные свойства плазматической мембраны клеток эпителия // Тезисы II Всеукр. наук-метод. конфер. з міжнарод. участю “Екологія та інженерія. Стан, наслідки, шляхи створення екологічно чистих технологій”.- 1998.- Дніпродзержинськ:-В-во при ДДТУ.-1998.- С.54.

8. Хижняк С.В., Войцицкий В.М., Бублик А.А., Кучеренко Н.Е. Структура белков плазматической мембраны энтероцитов тонкой кишки после воздействия ионизирующей радиации // Тезисы 2-го съезда биофизиков России.-М.: Изд-во РАН.- 1999.- Т.3.- С. 854-855.

АННОТАЦИЯ

Бублик А.А. Совместное воздействие ионизирующей радиации и кадмия на клетки печени и слизистой оболочки тонкой кишки крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01 – радиобиология. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко.- Киев.- 2000г.

Диссертация посвящена изучению особенностей раздельного и сочетанного действия ионизирующей радиации (в дозах 1,0 и 2,0 Гр) и кадмия (1мг/кг) на структурное состояние и функциональную активность клеток слизистой оболочки тонкого кишечника и печени крыс. Выявленное угнетение активности локализованных в клеточных мембранах ферментов указывает на дискоординацию в работе ферментативных систем и может стать пусковым механизмом в развитии метаболических и функциональных нарушений при воздействии изучаемых факторов. В основе этого может быть наблюдаемая интенсификация окислительных процессов в клетках печени и слизистой оболочки тонкого кишечника, на что указывает уменьшение количества белковых SН-групп и дисбаланс в накоплении продуктов ПОЛ.

Выявлены различия в протекании процесса ПОЛ в клетках слизистой оболочки тонкого кишечника и печени при сочетанием воздействии облучения и кадмия. В печени наблюдается повышение накопления ДК и ШО, наряду с менее интенсивным образованием МДА. В слизистой оболочке тонкого кишечника, на фоне понижения количества ДК, приблизительно в 2-3 раза увеличивается скорость накопления и количество МДА.

Результатом ПОЛ может быть выявленное снижение количества основных структурных липидов мембран энтероцитов и гепатоцитов. Показано, что при сочетанием действии облучения и кадмия существенный вклад в изменения липидного состава мембран энтероцитов вносит уменьшение количества фосфолипидов и холестерола в плазматической мембране.

Исследования динамики процессов пролиферации в разных отделах тонкого кишечника свидетельствуют о значительном угнетении пролиферативной активности стволовых крипт и уменьшении их количества в первые часы после раздельного и сочетанного воздействия облучения и кадмия. Сочетанное воздействие исследуемых факторов приводит к торможению выхода клеток на ворсинку (обновления). Так, через 1 сутки после воздействия, количество клеток в криптальной части незначительно отличается от контроля наряду со значительным снижением их митотической активности.

Использование метода факторного анализа при обработке 48 исследуемых параметров позволило доказать существенное усиление структурно-функциональных нарушений кишечника и печени при сочетанном воздействии ионизирующего облучения и кадмия.

Основные изменения в тонком кишечнике проявляются в нарушении пролиферативной активности ее криптальной области, усилении процессов ПОЛ (повышается скорость и количество накопленного МДА), уменьшении количества фосфолипидов в апикальной мембране энтероцитов. В печени в наибольшей степени изменяется содержание МДА и ШО.

Ключевые слова: ионизирующая радиация, кадмий, тонкий кишечник, печень, факторный анализ.

АНОТАЦІЯ

Бублик А.А. Сумісна дія іонізуючої радіації та кадмію на клітини печінки і слизової оболонки тонкої кишки щурів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 – радіобіологія. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка. – Київ.- 2000р.

Дисертація присвячена вивченню особливостей окремої та сумісної дії іонізуючого випромінювання (в дозах 1,0 та 2,0 Гр) і кадмію (1мг/кг) на структурний стан та функціональну активність клітин слизової оболонки тонкої кишки та печінки щурів. Виявлено прискорення регенеративних процесів тонкої кишки протягом доби після окремої дії як радіації в досліджуваних дозах, так і введення кадмію та гальмування цього процесу при сумісній дії даних чинників. Встановлено, що сумісна дія опромінення та кадмію приводить до порушень окисного-антиокисного гомеостазу клітин печінки та слизової оболонки тонкої кишки в результаті зростання швидкості ліпідної пероксидації та накопичення в клітинах продуктів ПОЛ. Виявлено пригнічення активності мембранозв’язаних ферментів печінки та слизової оболонки тонкої кишки при сумісній дії досліджуваних чинників, як результат порушень структури клітинних мембран. Використання методу факторного аналізу при обробці отриманих результатів дозволило встановити найхарактерніші з досліджуваних параметрів, які визначають особливості сумісної дії іонізуючої радіації та іонів кадмію.

Ключові слова: іонізуюче випромінювання, кадмій, тонкий кишечник, печінка, факторний аналіз.

SUMMARY

Bublyk A.A. Combined effect of the ionizing radiation and cadmium on the cells of liver and small intestine of rats. – Manuscript.

The thesis for competition of scientific degree of candidate of biological sciences on a speciality 03.00.01 – Radiobiology. – Kyiv Taras Shevchenko National University.- Kiyv.- 2000.

The thesis is devoted to the investigation of the separate and combined of the ionizing irradiation (in doses 1,0 and 2,0 Gy) and cadmium (1mg/kg) effect on the structure and functional activities of the liver and small intestine rat cells. Acceleration of the regeneration processes in small intestine during 24 hours after the separate effect of the radiation and cadmium and slowdown of this process after the combined effect of these factors was shown. It was also found out that the combined effect of radiation and cadmium causes disorders in the oxidizing and anti-oxidizing homeostasis in liver and mucosa membrane of the small intestine as a result of acceleration of the lipid peroxidation process and accumulation in cells its products. Depression of the membrane – bound enzymes in liver and mucosa membrane of the small intestine in case of the combined effect of the factors as a result of disorders in the structure of cell membranes was disclosed. Factor analysis method implementation in the processing of the research results helped to find out the most typical parameters, which determine the peculiarities of the combined effect of the ionizing radiation and cadmium ions.

Key words: ionizing radiation, cadmium, small intestine, liver, factor analysis.