Міністерство охорони здоров'я України

Харківський науково-дослідний інститут мікробіології та імунології

ім. І.І. Мечникова

ФІЛІПОВСЬКИЙ Олександр Вікторович

УДК 579.61: 616-078: 579.873.21

ВИЯВЛЕННЯ ВИДОСПЕЦИФІЧНОГО АНТИГЕНУ СЕРЕД ПОВЕРХНЕВИХ КОМПОНЕНТІВ Mycobacterium avium.

03.00.07 - мікробіологія.

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук.

Харків – 2000

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Одеському державному медичному університеті.

Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, доцент Протченко Павло Захарович, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології Одеського державного медичного університету МОЗ України.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, завідувач кафедри мікробіології, Національна Фармацевтична Академія МОЗ України.

доктор медичних наук, професор Климнюк Сергій Іванович завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології, Тернопільська Державна Медична Академія ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України.

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти

ім. П.Л. Шупика МОЗ України, м. Київ.

Захист відбудеться 12.12.2000 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д. 64.618.01 при Харківському науково-дослідному інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова (310057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського науково-дослідного інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова

(м. Харків, вул. Пушкінська, 14)

Автореферат розісланий 07.11.2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої Ради,

кандидат медичних наук Кучма І. Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В 1995 році в Україні офіційно об'явлено епідемію туберкульозу. Підвищення рівня захворюваності відзначається на всієї території України, а найвищі показники зареєстровано в Херсонській області (73,7 на 100 тис. населення), в Одеській області цей показник складає 61, 3 на 100 тис. (Фещенко Ю.І., 2000).

В останні роки клінічна картина туберкульозу зазнала змін у порівнянні з "класичними" описами цього захворювання, що пояснюють змінами екологічної обстановки, зростанням частоти інфікування хворих штамами мікобактерій з первинною лікарською стійкістю до низки хіміопрепаратів, розповсюдження мікобактеріозів серед осіб молодого віку. а також розповсюдженням СНІДу (Sherer R, 1986; Sippola A. A; 1993, Payen M C, 1997). Саме наслідком СНIДУ є розвиток опортуністичних інфекцій, спричинених атиповими мікобактеріями (Delaunois L., 1997). Найбільше значення серед цих захворювань мають мікобактеріози, спричинені M. avium. (Cavent W, 1997).

Починаючи з 1986 року в Україні спостерігається підвищення кількості захворювань, спричинених атиповими мікобактеріями. Так, наприклад, у 1995 році серед усіх мікобактеріозів хвороби, причиною яких були атипові мікобактерії, становили 3,1 %. Збудниками більшої частини цих мікобактеріозів були M. avium (Липкан Г. Н., 1999).

Особливу тривогу викликає той факт, що на сьогодні не існує ефективних засобів диференційної діагностики захворювань, які спричинені мікобактеріями. Встановлено, що M. avium, на відміну від туберкульозних мікобактерій, звичайно первинно стійкі до протитуберкульозних препаратів першого ряду (Ільїна Т. Б, 1980).

Таким чином, на сучасному етапі велике значення набуває створення диференціально-діагностичних тест-систем, які дозволили б швидко і без великих витрат ідентифікувати M. avium. Найбільші труднощі в напрямку розв'язання цієї проблеми пов'язані з великою антигенною спорідненістю мікобактерій різних видів, що значно ускладнює створення специфічних діагностикумів. Тому можливі два шляхи для створення тест-систем. По-перше, можна обмежитися диференціацією атипових мікобактерій від туберкульозних. Створення діагностичних препаратів з цією метою, хоча і дозволило б віддиференціювати туберкульозні мікобактерії від атипових, але не в змозі забезпечити типування збудників нетуберкульозного процесу. Хоча на цьому шляху є серйозні напрацювання, але остаточного вирішення цієї проблеми поки немає (Лисенко А.П., 1992).

Другим напрямком є пошук шляхів точної видової ідентифікації різних видів мікобактерій. Такий підхід має важливе значення в медичній та ветеринарній практиці, оскільки це можна використати в розробці стратегії лікування і попередження мікобактеріозів людини і тварин.

Тому ми поставили перед собою завдання виявити та ідентифікувати видоспецифічні компоненти у M. avium.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом наукових розробок кафедри мікробіології, вірусології та імунології Одеського державного медичного університету № 0199U002025 "Вивчення видоспецифічних протеїнмістячих поверхневих компонентів мікобактерій з метою створення діагностичної тест-системи", та Одеського інституту клінічної біохімії та санітарії тварин УААН № 01.01.02 "Ідентифікувати, виділити та вивчити специфічні детермінанти мікобактерій туберкульозу", № 01.06.2 "Вивчити антигенну структуру атипових мікобактерій з застосуванням ІФА-методів та виділити видоспецифічні антигени з метою розробки антигенних діагностикумів".

Мета і задачі дослідження. Виявити видоспецифічні компоненти M. avium для подальшої розробки методів міжвидової диференціації мікобактерій.

Для досягнення поставленої мети було потрібно вирішити наступні задачі:

1. Отримати поверхневі протеїнові компоненти M. avium шляхом екстрагування бактерійної маси та імунні сироватки до них шляхом імунізації тварин.

2. Провести фракціонування екстрактів M. avium для виділення компонентів з антигенними властивостями.

3. Вивчити антигенну структуру нативних і фракціонованих екстрактів M. avium у серологічних реакціях.

4. Провести порівняльний аналіз антигенної структури екстрактів M. avium і представників інших груп мікобактерій.

Об'єкт дослідження – Mycobacterium avium.

Предмет дослідження – антигенна структура Mycobacterium avium.

Методи дослідження - бактеріологічні – посів та накопичення бактеріальної маси Mycobacterium avium; фізико-хімічні – екстрагування компонентів мікобактерій, електрофоретичне фракціонування, знесолювання шляхом гель-хроматографії, іонообмінна хроматографія для виділення окремих компонентів, спектрофотометрія, визначення білку за методами Lowry та Bradford; імунологічні - імунізація лабораторних тварин для отримання імунних сироваток, реакція преципитації у гелі, імуноелектрофорез, перехрестний імуноелектрофорез.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше показано, що серед поверхневих компонентів M. avium, отриманих у неденатуруючих умовах, є видоспецифічний антиген. Цей компонент, який було виділено внаслідок іонообмінної хроматографії і ідентифіковано за допомогою імуноелекрофорезу як "анодний" антиген, названий нами a2. Він не зустрічається в жодного з досліджених представників інших груп мікобактерій.

Розроблено методику отримання екстракту поверхневих антигенних компонентів мікобактерій в м'яких умовах, а також методика попереднього "неповного" очищення фракції екстракту, до складу якої входить антиген a2.

Обґрунтовано теоретичну можливість використання даного антигену для конструювання тест-системи для диференційної діагностики мікобактеріозів, спричинених M. avium.

Практичне значення одержаних результатів. Методика екстрагування бактерійної маси в малоденатуруючих умовах, що пропонується, а також подальше очищення екстракту від екстрагуючих речовин дозволяє отримати комплекс поверхневих компонентів M. avium у стані, що наближається до нативного. Можливе забруднення отриманих екстрактів внутрішньоклітинними компонентами зведене до мінімуму.

Спосіб фракціонування екстракту за допомогою іонообмінної хроматографії, що пропонується, дозволяє частково відокремити видоспецифічний поверхневий антигенний компонент від перехреснореагуючих антигенів.

Встановлено, що компонент a2 не виявляється в жодного з досліджених представників патогенних мікобактерій різних груп і може вважатися видоспецифічним для M. avium.

Матеріали дисертації впроваджені до педагогічного процесу кафедри мікробіології, вірусології і імунології ОДМУ, кафедри мікробіології Національної фармацевтичної академії України, кафедри мікробіології, вірусології і імунології Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського, кафедри мікробіології Івано-Франківської медичної академії, кафедри мікробіології Лвівського державного медичного університету ім. Д. Галицького, кафедри мікробіології Луганського державного медичного університету, кафедри мікробіології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського, кафедри шкірно-венеричних хвороб і туберкульозу Буковинської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто виконав експериментальні дослідження, узагальнив отримані результати, провів їх аналіз, запропонував методику отримання екстракту поверхневих компонентів M. avium, а також методику попереднього очищення фракції, яка містить видоспецифічний компонент і методику визначення видоспецифічного антигену M. avium. Це дозволяє пропонувати продовжити початі дослідження з метою одержання виявленого антигену в очищеному вигляді для створення на його основі диференціально-діагностичної тест-системи. Усі положення та висновки дисертації належать авторові. Автором написано особисто, або у співавторстві з д.мед.н. Протченко П.З., к.біол.н. Созіновим В.О., Александровою Л.М., Грузевським О.А. усі друковані матеріали, що мають відношення до теми роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи висвітлено у 8 наукових працях, у тому числі у 5 журнальних статтях, з яких 1 - в іноземному журналі, 1 – в збірнику наукових праць.

Результати роботи були представлені на:

XIII з'їзді Українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів ім. Д. К. Заболотного (Київ – Вінниця, 1996); Науково-практичній конференції молодих вчених та студентів, присвяченої IV конгресу СФУЛТ (Одеса, 1996); Конференції "Актуальні проблеми мікробіології, вірусології та імунології" (Харків,1998); Пленумі УНМТМЕП ім. Д.К. Заболотного "Наукові та практичні аспекти боротьби з інфекціями в Україні на межі сторіч" (Одеса, 2000).

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 152 сторінках комп'ютерного тексту та складається iз вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів та висновків. Список літератури включає 186 джерел вітчизняної та іноземної літератури. Матеріали дисертації ілюстровано 10 таблицями, 28 малюнками.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Усі експерименти проводили зі штамами мікобактерій, які були надані Одеським інститутом клінічної біохімії та санітарії тварин УААН. У роботі були використані штами M. bovis як представника туберкульозних мікобактерій, M. avium як представника групи нефотохромогенних мікобактерій, M. kansasii як представника групи фотохромогенних мікобактерій, M. scrofulaceum як представника скотохромогенних мікобактерій і M. phlei, як представника групи кислотостійких сапрофітів. Для вирощування та зберігання мікобактерій використовували поживне середовище Гельберга, а накопичували бактеріальну масу на синтетичному середовищі Сотона. Типування мікобактерій проводили з застосуванням стандартних біохімічних тестів.

Для отримання екстракту поверхневих компонентів M. avium бактерійну масу інактивовували 2 % розчином фенолу, після чого обробляли розчинами детергентів (додецилсульфатом натрію, тритоном Х-100, твіном-80, холатом натрію. В подальшому екстракти очищували від детергентів за допомогою відповідних методів.

Вміст білку в екстрактах контролювали шляхом спектроскопічного дослідження при 260 і 280 нм, а також за допомогою методів Lowry і Bradford (Досон Р. та співавт., 1991). Нуклеїнові кислоти у розчині визначали за допомогою УФ – спектрофотометрії, орцинового та дифеніламінового методів (Досон Р. та співавт., 1991). Вуглеводи та ліпіди визначали якісно методом тонкошарової хроматографії, застосовуючи для обробки хроматограм відповідні реагенти (Шаршунова М. та співавт., 1980, Kirchner J.G. та співавт., 1990).

Для кількісної та якісної оцінки компонентів, що входять до складу отриманих екстрактів, а також для визначення молекулярних мас цих компонентів, було проведено електрофоретичне розділення їх за Laemmli (Остерман Л.А., 1981, Laemmli U.K., 1970) з використанням маркерніх білків фірми "Sigma". Молекулярну масу розраховували за допомогою відповідних формул.

Іонообмінну хроматографію екстракту М. avium проводили на колонці з ДЕАЕ-целюлозою "Whatman DE-32" з використанням градієнтної елюції. Отримані фракції аналізували щодо вмісту протеїнів спектрофотометричним методом та за Lowry. Фракції, які відповідали хроматографічним пикам виходу окремих компонентів, концентрували на роторному випарювачі "LRV-2". Концентрати знесолювали за допомогою гель-фільтрації на колонці з сефадексом G-25. Імунні сироватки отримували шляхом внутрим'язової імунізації 16 кролів інактивованими мікобактеріями в неповному ад'юванті Фрейнда за модифікованою методикою В'язова та Ходжаєва (1973).

Імунологічні властивості суцільного екстракту і хроматографічних фракцій вивчали в реакції подвійної імунохімічної преципітації в агаровому гелі за методом Оuchterlony (1953) у модифікації Л.А Зільбера та Г. I. Абелева (1958). Результати відзначали візуально, а також фарбуванням гелевої пластинки та її фотографуванням.

З метою більш точного виявлення антигенів використовували імуноелектрофорез в агарозі та модифіковану методику перехресного імуноелектрофорезу (Остерман Л. А., 1983).

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

На першому етапі проводили розробку метода отримання поверхневих компонентів M. avium. При екстрагуванні бактеріальної маси за допомогою різних детергентів (додецилсульфату натрію, тритону Х-100, холату натрію, твіну-80) у різних умовах було встановлено, що для одержання екстракту поверхневих компонентів М. avium оптимальним є застосування послідовної дії на бактерійну масу 2 % розчину фенолу та 0,5 % розчину додецилсульфату натрію в 0,15 М трис-НСl буферному розчині рН 6,8. Далі з отриманого екстракту за допомогою двохетапного очищення видаляли додецилсульфат натрію. Для цього екстракти охолоджували до температури 0 оС, а після осадження частини додецилсульфату натрію його залишок видаляли шляхом гель-хроматографії. Одержані у такий спосіб екстракти за результатами реакції преципітації у гелі мали антигенні властивості.

За результатами мікроскопічного дослідження мікобактерій, забарвлених за Цілем-Нільсеном, після екстрагування вони повністю зберігали кислотостійкість, що могло свідчити про відсутність помітних пошкоджень клітинної стінки. В отриманому екстракті не визначалася ДНК, РНК ж визначалася у невеликій кількості. На підставі цих даних можна зробити висновок, що розроблена методика екстрагування дозволяє у малоденатуруючих умовах виділити з мікобактерій переважно поверхневі клітинні компоненти.

Вивчення отриманих екстрактів за допомогою електрофорезу в ПААГ-ДСН за Laemmli показало, що до їх складу входить велика кількість компонентів, різних за своїми електрофоретичними властивостями.

Так, при візуальному обліку електрофореграм у складі екстракту M. avium виявлено 16 фракцій (рис. 1), а при більш чутливому денситометричному аналізі - 29 (рис. 2). Ці фракції відрізнялися інтенсивністю забарвлення, відстанню, пройденою ними під час електрофорезу, молекулярною масою. Порівняння електрофоретичних спектрів типових представників різних груп класифікації Раньона - M. bovis, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. phlei показало, що в складі екстракту M. avium є 4 компоненти, що не зустрічаються в жодного з перелічених мікроорганізмів. Це були фракції з молекулярною масою 56 200, 75 000, 97 700, 158 500. Ці фракції слід вважати характерними для M. avium, їх розташування на електрофореграмах може бути підставою для ідентифікації M. avium. Але такий спосіб ідентифікації мало придатний для практичної мети. Тому в

Рис. 1 Електрофорез екстракту M. avium

Рис. 2 Результат денситометричного аналізу ектрофореграми екстракту M. avium;

по осі ординат – екстинкція фракцій;

по осі абсцис – відстань від старту;подальшому ми проводили препаративне розділення екстракту для більш глибокого вивчення цих компонентів. За допомогою іонообмінної хрома

тографії екстракт M. avium був розділений на три групи фракцій, що їх позначено літерами А, В, С у залежності від послідовності виходу з іонообмінної колонки (рис.3).

Рис. 3 Хроматограма екстракту M. avium на ДЕАЕ-целюлозі.

Фракція "А", характеризувалася низькою афінністю до аніонообміннику і елюювалася одразу ж після нанесення екстракту. Рехроматографія цієї фракції у різних модифікаціях не призводила до додаткового розділення. За допомогою тонкошарової хроматографії було встановлено, що у складі фракції "А" є компоненти протеїнової, ліпідної та ліпополісахаридної природи. Дослідження фракції "А" за допомогою електрофорезу в ПААГ-ДСН дозволило виявити у її складі 5 компонентів, причому два з них за своєю електрофоретичною рухливістю та розташуванням на фореграмі були характерні для M. avium і мали молекулярну масу відповідно 158 500 і 75 000.

В реакції преципітації у гелі було встановлено, що до складу даної фракції належать компоненти, які володіють антигенними властивостями та утворюють одну лінію з однойменною сироваткою в реакції преципітації у гелі.

Компоненти групи "В" виходили з колонки внаслідок застосування градієнтної елюції, але спочатку не вдалося розділити їх на окремі фракції, оскільки концентрація білку в них була дуже низкою. Під час рехроматографії зконцентрованної групи фракцій "В" вдалося отримати наступні 4 фракції, відповідно B1 - при 0,38 М NaCl, В2 - 0,56 М, В3 - 0,92 М, В4 - 1,1 М.

За допомогою тонкошарової хроматографії було встановлено, що у складі фракції "В" містилися переважно речовини білкової природи. Електрофоретичне дослідження фракцій цієї групи дозволило показати, що до фракцій "В1", "В2", "В3", і "В4" входять по одному білокутримуючому компоненту. Антигенними властивостями, за даними реакції преципітації у гелі, компоненти групи фракцій “В” не володіли.

Остання фракція "С" характеризувалася значною міцністю зв'язку з аніонообмінником і елюювалася лише за допомогою 1н. NaOH. Після рехроматографії з використанням градієнту рН вдалося із складу цієї фракції виділити три компоненти (С1 – при рН 9,1; С2 – при рН 9,9; С3 – при рН 11,4). За допомогою тонкошарової хроматографії було встановлено, що фракція "C" містить речовини ліпопротеїдної та ліпополісахаридної природи, а також незначну кількість рибонуклеїнової кислоти. При електрофоретичному дослідженні було встановлено у складі фракції "С1" - три компоненти; "С2" і "С3" - по два компоненти. При цьому в складі фракції "С1" було два "характерних" компоненти з молекулярною масою 56 200 та 97 700. Антигенними властивостями, за результатами реакції преципітації у гелі володіли лише фракції "С1" і "С2", які утворювали по одній преципітаційній лінії з антисироваткою до M. avium.

Таким чином, внаслідок розділення суцільного екстракту M. avium було отримано 8 хроматографічних фракцій. Подальше їх вивчення дозволило встановити, що в складі фракції "А" і фракції "С1" є по два компоненти, визначені за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі як "характерні" для M. avium.

При дослідженні антигенних властивостей суцільного екстракту M. avium в реакції преципітації у гелі було встановлено, що до його складу входять принаймі три антигенно-активні компоненти.

Порівняльне дослідження в реакції преципітації у гелі взаємодії суцільного екстракту M. avium, а також окремих його хроматографічних фракцій з однойменною сироваткою та сироватками проти M. bovis, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. phlei не дозволило виявити видоспецифічні антигенні компоненти, тому що усі виявлені антигенні компоненти M. avium давали перехресні реакції з сироватками проти інших видів мікобактерій.

Дослідження окремих хроматографічних фракцій виявило наявність антигенних компонентів у фракціях "А", "С1" і "С2, але вони також давали перехресні реакції з сироватками проти M. bovis, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. phlei.

Вивчення суцільного екстракту M. avium за допомогою імуноелектрофорезу дозволило виявити в його складі наявність п'яти антигенних компонентів (рис 4.)

Рис. 4 Імуноелектрофорез суцільного екстракту M. avium

Ці компоненти розрізнялися сумарним зарядом їх молекул і швидкістю міграції в електричному полі. У залежності від напрямку міграції виділили дві "катодні" і три "анодні" фракції, які було названо "a1", "a2", "a3". Вивчення окремих хроматографічних фракцій за допомогою цієї ж методики дозволило встановити, що "катодні" антигени входять до складу хроматографічної фракції "А". Хроматографічну фракцію "С1" формують два "анодних" антигени - "a1" і "a2", а фракцію "С2" - один анодний антиген "a3".

Порівняльне дослідження взаємодії суцільного екстракту M. avium і хроматографічних фракцій "А", "С1" і "С2" з сироватками проти M. bovis, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. phlei показало, що компонент "a2", той, що входить до складу хроматографічної фракції "С1", не виявляється в жодної з досліджених мікобактерій.

Таким чином, отримані результати дозволяли припустити, що компонент "a2" хроматографічної фракції "С1" є видоспецифічним антигеном.

Для підтвердження його видоспецифічности були проведені дослідження з застосуванням більш точного методу двомірного електрофорезу. При перехресному електрофорезі у першому напрямку проводили розділення екстракту M. avium, після чого змінювали напрямок міграції компонентів екстракту на перпендикулярний. При цьому компоненти екстракту проходили через зону гелю, до складу якого входила сироватка проти одного з представників вивчених мікобактерій (M. bovis, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. phlei). В результаті відбувалося зв'язування перехреснореагуючих компонентів, тоді як видоспецифічний антиген виходив до зони гелю, вільної від антитіл. Для виявлення цього компоненту до гелю вводили сироватку проти M. avium. Відтак, було встановлено, що антиген "a2" не реагує з сироватками M. bovis, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. phlei, а давав лінію преципітації саме з сироваткою проти M. avium. Це підтверджує видоспецифічність антигену "a2" для M. avium.

Таким чином, на підставі отриманих даних про те, що антиген "a2" не давав перехресних реакцій при імуноелектрофорезі та не зв'язувався сироватками проти представників інших груп атипових мікобактерій, можна зробити висновок, що він є видоспецифічним для M. avium.

ВИСНОВКИ

1. Розроблено метод екстрагування поверхневих компонентів Mycobacterium avium 0,5 % додецилсульфатом натрію в 0,15 М трис-HCl буферному розчині рН 6,8. Встановлено, що цей метод дозволяє солюбілізувати переважно поверхневі компоненти мікобактерій без помітної дезінтеграції клітин і денатурації білокмістких речовин, які переходять до розчину.

2. Отриманий за цим методом екстракт поверхневих компонентів М. avium за результатами електрофорезу в поліакриламідному гелі і тонкошарової хроматографії є багатокомпонентною сумішшю речовин білкової, ліпопротеїдної та ліпосахаридної природи. Серед компонентів екстракту М. avium виявлені чотири фракції, характерні за молекулярною масою та електрофоретичною рухомістю тільки для М. avium і що не зустрічаються в основних представників потенційно патогенних мікобактерій М. bovis, М. kansasii, М. scrofulaceum, М. phlei.

3. Екстракт М. avium за методом колонкової іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі вдалося розділити на три групи фракцій, що розрізнюються міцністю зв'язку з аніонообмінником: фракцію "А", що не здатна адсорбуватися на колонці за використаних умов, фракцію "В", що елююється при зростанні концентрації NaCl у буферному розчині від 0,3 М до 1,5 М і фракцію "С", що виходить при нанесенні розчину гідроксиду натрію на колонку. Внаслідок рехроматографії фракцій на ДЕАЕ-целюлозі за дещо інших умов вдалося додатково розділити фракцію "В" на "B1", що виходила при 0,38 М NaCI, "В2" - 0,56 М; "В3" - 0,92 М та "В4" - 1,1 М, а фракцію "С" - на "C1" - при рН 9,1; "С2" - при рН 9,9; "С3" - при рН 11,4.

4. При вивченні антигенних властивостей компонентів кожної фракції в реакції преципітації у гелі було встановлено, що фракція "В" позбавлена антигенної активності, фракції "А", "C1", "C2" містять від одного до трьох антигенів. У складі виділених фракцій за допомогою реакції преципітації у гелі не вдалося виявити антигенних компонентів, видоспецифічних для М. avium.

5. Внаслідок дослідження екстракту М. avium методом імуноелектрофорезу було встановлено, що в складі фракції "С1" є антигенний компонент (a2), що мігрував до анода, який є специфічним для М. avium. Видоспецифічність цього компоненту підтверджена дослідами перехресного імуноелектрофорезу з використанням сироваток проти М. bovis, М. scrofulaceum, М. kansasii, М. phlei. Виявлення видоспецифічного антигену в складі поверхневих компонентів М. avium відкриває перспективу для розробки тест-системи з метою індикації та ідентифікації М. avium, а також серологічної діагностики мікобактеріозів, викликаних М. avium.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Филиповский А. В. Значение микобактерий комплекса АVIUM - INTRACELLULARE в инфекционной патологии. // Проблемы туберкулеза.-1999.-№5.-С. 45-48.

2. Протченко П.З., Грузевский А.А., Филиповский А. В., Александрова Л.Н. Изучение протеинового состава и антигенных свойств некоторых видов микобактерий // Экспериментальная и клиническая медицина. – 1999. -№2. – С.75-78.

3. Грузевський О.А., Протченко П.З., Філіповський О.В. Вивчення протеїнових екстрактів деяких видів атипових мікобактерій методом іонообмінної хроматографії // Одеський медичний журнал.- 1999. - №4. – С.12-15.

4. Філіповський О.В., Протченко П.З., Грузевський О.А. Використання аніонного детергенту додецилсульфату натрію для екстракції поверхневих протеїнвмісних компонентів мікобактерій // Одеський медичний журнал.-1999. - №3.- С.19-21.

5. Грузевський О.А., Філіповський О.В. Виділення поверхневих протеїнових компонентів M. bovis та M. kansasii // Нові технології у навчальному процесі теоретичній та клінічній медицині (Додаток до "Одеського медичного журналу"). – 1999. –С. 157-159.

6. Протченко П.З., Грузевський О.А., Філіповський О.В. Вивчення поверхневих видоспецифічних компонентів деяких видів атипових мікобактерій // Матеріали Пленуму УНМТМЕП ім. Д. К. Заболотного. Одеса. - 2000. – С. 86-87.

7. Созінов В.О., Протченко П.З., Грузевський О.А., Александрова Л.М., Філіповський О.В. Дослідження протеїнового складу та антигенної структури деяких видів мікобактерій // Тези доповідей XIII з'їзду українського наукового товариства мікробіологів, епідеміологів та паразитологів. Київ. - 1996. – С. 139-140.

8. Грузевський О.А., Філіповський О.В. Антигенна структура та протеїновий склад деяких видів атипових мікобактерій // Тези доповідей науково-практичної конференції молодих вчених. Одеса. - 1996. - C.8-10.

АННОТАЦИЯ

Филиповский А. В. Выявление видоспецифического антигена среди поверхностных компонентов Mycobacterium avium. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Научно-исследовательский институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова, Харьков, 2000.

Диссертация посвящена актуальному вопросу дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний, вызванных атипичными микобактериями. Значение этих микроорганизмов как возбудителей оппортунистических инфекций особенно велико в настоящее время в связи с проблемой СПИДа, а также в связи с увеличением частоты возникновения иных состояний, при которых наблюдается развитие вторичных иммунодефицитных состояний.

В работе сообщается о новой методике получения поверхностных компонентов микобактерий с использованием детергентов, в частности, 0,5 % раствора додецилсульфата натрия. Было установлено, что в составе экстракта присутствует комплекс веществ различной химической природы, некоторые из которых обладают антигенными свойствами. Сравнительные исследования экстрактов других видов наиболее распространенных патогенных представителей разных групп микобактерий показали, что в полученном экстракте поверхностных компонентов Mycobacterium avium имеется видоспецифический антиген. С помощью биохимических методик удалось добиться его очистки от балластных веществ.

На основании полученных результатов серологических исследований можно говорить о том, что в случае полной очистки описанный антиген может быть основой для разработки диагностической тест-системы. Такая тест–система может быть использована как в клинической практике для серологической идентификации и дифференциальной диагностики микобактериозов, вызванных Mycobacterium avium как у людей, так и в ветеринарной практике.

Ключевые слова: микобактерии, оппортунистические инфекции, видоспецифический антиген, дифференциальная диагностика, М. avium, нефотохромогенные микобактерии.

АНОТАЦІЯ

Філіповський О.В. Виявлення видоспецифічного антигену серед поверхневих компонентів Мycobacterium avium. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Науково-дослідний інститут мікробіології і імунології ім. І.І. Мечникова, Харків, 2000.

Дисертацію присвячено актуальному питанню диференційної діагностики інфекцій, які спричинені атиповими мікобактеріями. Значення цих мікроорганізмів як збудників опортуністичних інфекцій особливо підвищується в теперішній час у зв'язку з проблемою СНІДу, а також із зростанням частоти виникнення станів, при яких спостерігається розвиток вторинних імунодефіцитних станів.

У роботі повідомляється про виявлення серед поверхневих протеїномістких компонентів Mycobacterium avium видоспецифічного антигену. За допомогою біохімічних методів вдалося досягти часткового його очищення від баластних речовин. При серологічному досліджені було встановлено, що цей антиген не зустрічається серед найрозповсюдженіших патогенних представників різних груп мікобактерій.

На підставі отриманих результатів серологічних досліджень можна казати, що у випадку повного очищення даний антиген може бути основою для розробки тест-системи. Така тест-система може бути використана у клінічній практиці для серологічної ідентифікації і диференційної діагностики мікобактеріозів, спричинених Mycobacterium avium.

Ключові слова: мікобактерії, опортуністичні інфекції, видоспецифічний антиген, диференційна діагностика, М. avium, нефотохромогенні мікобактерії.

SUMMARY

Philipovskiy A. V. Detection of the species-specific antigen among the surface components of the Mycobacterium avium. – Manuscript.

The dissertation on obtaining of scientific degree of the candidate of medical sciences on specialty 03.00.07 – microbiology. – Research Institute of Microbiology and Immunology named by I. I. Mechnikov, Kharkov, 2000.

Dissertation is dedicated to actual problem of the differential diagnostics of infectious diseases caused by "atypical" mycobacteria. Role of these pathogens as causative agents of opportunistic infections especially increases in present time due to the problem of AIDS.

In the work there is reported about the detection of the species-specific antigen among surface protein-containing components of Mycobacterium avium. With the help of biochemical methods this antigen was partly purified from the ballast components. In serological investigation there was established that this antigen is absent in the most widespread pathogenic representatives of different groups of mycobacteria.

On the basis of obtained results of serological tests one can say that in the case of complete purification this antigen could be used for creation of test-system. This test-system would be used in clinical practice for the serological identification of mycobacteria and for differential diagnostics of micobacterioses caused by Mycobacterium avium.