Українська Академія Аграрних Наук
Українська Академія Аграрних Наук
Державний Нікітський ботанічний сад
Карпов Павло Андрійович
УДК 582.572.228: 581.16: 573.6: 581.19
БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ Yucca torreyI Shafer.: РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН І ОДЕРЖАННЯ СТЕРОЇДНИХ ГЛІКОЗИДІВ in situ ТА in vitro
03.00. 20 - біотехнологія
АВТОРЕФЕРАТ
Дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Ялта - 2000
Дисертація є рукописом
Робота виконана у відділі експериментальної біології Державного Нікітського ботанічного саду УААН
Науковий керівник: | доктор біологічних наук,
професор, член-кор. УААН,
Ліщук Адольф Іванович
Державний Нікітський ботанічний сад УААН,
завідувач відділу
Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук,
професор, член-кор. НАН України
Блюм Ярослав Борисович,
Інститут клітинної біології та
Генетичної інженерії НАН України,
завідувач лабораторії
доктор біологічних наук,
Бугара Олександр Михайлович,
Інститут ефіроолійних і
лікарських рослин УААН,
завідувач лабораторії
Провідна установа | Інститут молекулярної біології та
генетики НАН України, м. Київ
Захист відбудеться 26 травня 2000 р. о 13:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 при Державному Нікітському ботанічному саді УААН за адресою: 98648, Крим, м. Ялта, Державний Нікітський ботанічний сад УААН.
З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Державного Нікітського ботанічного саду УААН за адресою:
98648, Крим, м. Ялта, Державний Нікітський ботанічний сад УААН.
Автореферат розісланий "22" квітня 2000р.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук |
С. Ю. Садогурський
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Представники виду Yucca L. з давніх-давен знаходили широке господарське застосування, а в другій половині XX сторіччя стали активно використовуватися як цінні джерела стероїдних глікозидів. (Cruse et al., 1973) Згідно з літературними даними, стероїдні глікозиди (СГ) досліджені у 16 представників роду.
За останніми даними рід Yucca L. нараховує 42 види, 12 з яких представлені в Арборетумі ДНБС. Серед них Y. torreyi Shafer. є найбільш великою і високодекоративною.
Yucca torreyi Shafer. (син. Y. macrocarpa Engelm.) - невелике дерево, росте тільки на південному заході Техаса, значно південно-східніше Нью-Мехіко, з ареалом, що простягається вглиб Мексіки.
На півдні України юкки широко використовуються в декоративному садівництві, проте впровадження Y. torreyi як декоративної і лікарської рослини стримується із-за відсутності запилювача (Tegeticula yuccasella), що утруднює одержання насіння. Традиційні способи вегетативного розмноження малоефективні і не застосовуються до таких великих видів як Y. torreyi. (Голубєв та ін., 1973)
Досягнення останніх років в галузі культури органів і тканин продемонстрували величезну можливість клітинних технологій як в розмноженні цінних генотипів, так і в одержанні біологічно активних речовин. (Носов, 1992; Бутенко, 1999) Методи клонального мікророзмноження були розроблені для Y. elephantipes Regel. (Pierik, et al., 1983) і Y. schidigera (Kaneda et al., 1987). Дані про використання біотехнологічних методів в розмноженні та одержанні стероїдних глікозидів Y. torreyi в літературі відсутні.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувалися у відділі експериментальної біології Державного Нікітського ботанічного саду НАН України, в період з 1997 по 1999рр. у відповідності з розділом тематичного плану № 0197U004314 - "Вивчити фізіолого-біохімічні основи адаптації плодових і декоративних культур з метою оптимізації продукційного процесу і розробки теоретичних аспектів селекції екологічно стійких форм", а також планом аспірантської підготовки.
Мета і завдання досліджень. Метою даної роботи є вивчення біологічних і біохімічних особливостей рослин Y. torreyi інтродукованих в Нікітський ботанічний сад, можливості їхнього насінного і клонального мікророзмноження, а також визначення здатності рослин різного віку, культури клітин і тканин in vitro синтезувати стероїдні глікозиди. В ході роботи необхідно було вирішити такі завдання:
1.
Вивчити морфобіологічні і біометричні особливості плодів і насіння Y. torreyi, одержаних при штучному запиленні в умовах інтродукції на Південному Березі Криму і виявити взаємозв'язок з розвитком проростків in vivo та in vitro.
1.
Підібрати оптимальні умови для індукції адвентивного пагоноутворення in vitro в культурі епікотилю Y. torreyi. Розробити спосіб мікророзмноження рослин в умовах in vitro.
1.
Індукувати калюсоутворення з різних експлантів Yucca torrei і виявити здатність калюсу синтезувати стероїдні глікозиди; встановити взаємозв'язок їхнього синтезу з гістогенезом і морфогенезом.
1.
Відібрати калюс, що має здатність синтезувати СГ при відсутності виражених ознак гістогенезу і морфогенезу і провести його цитоморфометричний аналіз.
1.
Визначити місце первинного синтезу СГ в культурі ізольованих органів і тканин in vitro.
1.
Провести методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) порівняльне вивчення вмісту СГ у вегетативних і репродуктивних органах і тканинах рослин Y. torreyi, здатних і не здатних зав'язувати повноцінні плоди і насіння при штучному запиленні в умовах інтродукції на ПБК, а також в ювенільних рослинах різного віку.
Наукова новизна роботи. Вперше визначені кореляції між морфометричними характеристиками насіння і плодів, одержаних при штучному запиленні. В процесі вивчення потенційних можливостей насінного розмноження Y. torreyi встановлений взаємозв'язок морфо-логічних і вагових характеристик насіння з їхньою схожістю. Показана залежність схожості насіння Y. torreyi in vivo та in vitro з його виповненням, строками і умовами зберігання. Визначені стадії розвитку проростків Y. torreyi і їхня тривалість в умовах in situ та in vitro. Досліджена здатність калюсу різного походження синтезувати стероїдні глікозиди. Виявлений взаємозв'язок початку синтезу СГ в культурах калюсу з гістогенезом і морфогенезом. Одержаний калюс Y. torreyi, що синтезує СГ при відсутності ознак гістогенезу і проведений його цитоморфометричний аналіз. Вперше визначені три шляхи індукції утворення адвентивних пагонів Y. torreyi і розроблені два способи одержання рослин в умовах in vitro. Виявлені СГ у вегетативних і репродуктивних органах в умовах in situ. Визначений їхній максимальний вміст в насінні і встановлена хімічна структура переважного глікозида.
Практичне значення одержаних результатів. Дані, одержані внаслідок морфологічного і морфометричного аналізу плодів і насіння Y. torreyi, мають значення при відборі посівного матеріалу. Встановлено, що насіння Y. torreyi, яке знаходиться в плодах, зберігає схожість більш тривалий час, ніж ізольоване насіння в паперових пакетах.
Розроблені три шляхи індукції адвентивного пагоноутворення Y. torreyi, що дозволяють за один цикл вирощування (1-2 місяці) одержувати від материнського пагона 7 дочірніх. Визначені живильне середовище для укорінення мікропагонів і умови адаптації in vivo рослин, одержаних in vitro. Застосування способу клонального мікророзмноження дає високий вихід рослин у порівнянні з традиційними способами насінного і вегетативного розмноження Y. torreyi, що має яскраво виражене апікальне домінування.
Проведені дослідження з аналізу СГ в органах і тканинах рослин Y. torreyi є основою для подальших більш глибоких хімічних і фарма-кологічних досліджень, а виявлені закономірності синтезу СГ в культурах ізольованих органів і тканин є основою для розробки моделі виробництва СГ біотехнологічними методами.
Особистий внесок пошукача полягає в самостійному зборі рослинного матеріалу, постановці експериментів та обробці одержаних даних, аналізі літератури, підготовці і написанні наукових статей, оформленні дисертаційної роботи. Разом з науковим керівником проведені вибір об'єктів досліджень, освоєння методик і розробка структури дисертаційної роботи.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на міжнародних конференціях: на сесії ради Ботанічних садів України "Ботанічні сади - центри збереження біологічної різноманітності світової флори" (Ялта, 1995); конференції країн СНД "Інтродукція лікарських нетрадиційних культур" (Крим, Алушта, 1995); 2-му міжнародному симпозіумі присв'яченому 200-річчю дендрологічного парку “Софіївка” "Старовинні парки і проблеми їхнього збереження" (Умань, 1996); "Четверта міжнародна конференція з медичної ботаніки" (Київ, 1997); на VII Міжнародній конференції "In vitro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation" (Москва, 1997); "II International Symposium on Plant Biotecnology" (Kyiv, 1998); "Інтродукція рослин і віддалена гібридизація" (Москва, 1998); 7 International Meeting of Young Scientists in Horticulture (Lednice, Czech Republic, 1999).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 робіт, з них 4-статті в спеціалізованих наукових виданнях і 8 - матеріали і тези наукових конференцій.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 6 розділів, висновків і переліку цитованої літератури, що включає 247 джерел, в тому числі 162 зарубіжних авторів. Робота викладена на 173 сторінках машинописного тексту і містить 58 рисунків, 28 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Проведений аналіз даних, опублікованих у вітчизняній і зарубіжній літературі з біології представників р. Yucca L., біології їхнього насінного розмноження in vivo, in situ та in vitro, а також літератури, присвяченої клональному мікророзмноженню представників Yucca sp. in vitro. Опрацьована література, присв'ячена вивченню стероїдних глікозидів представників р. Yucca L. в умовах in vivo та in vitro і господарському застосуванню юкк. Проведений аналіз літератури, присв'яченої виробництву стероїдних глікозидів методами сучасної біотехнології.
РОЗДІЛ 2. ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкти дослідження
Як об'єкти дослідження були використані органи і тканини рослин Yucca torreyi Shafer., що ростуть в арборетумі ДНБС були розділені на здатні зав'язувати плоди і давати повноцінне насіння, не здатні зав'язувати плоди і насіння, а також ювенільні рослини різного віку.
2.2. Матеріали і методи досліджень
При проведенні досліджень і постановці дослідів дотримувалися методів, прийнятих в біотехнології, біохімії, ботаніці. Насіння Y. torreyi було одержано при штучному запиленні (гейтоногенії) з урахуванням рекомендацій Ф.М. Русанова (1959), В.М. Голубєва та ін. (1973), О.П. Максимова та ін., (1989).
Визначення СГ проводили методом ТШХ на пластинах Silufol UV-254, Silufol UV-366 (фірма "Kavaler", Чехія) в системі n-бутанол: етанол: аміак (7:2:5) згідно з загальноприйнятою методикою (Кинтя та ін., 1979, 1987; Зураб'ян, 1989; Hostettman & Marston, 1995). Як проявники використовували фосфорно-вольфрамову кислоту і реактив Ерліха. Аналіз структури переважного глікозида насіння проводився з залученням ЯМР - і 13С-спектроскопій.
Гістохімічне визначення СГ проводили на свіжому матеріалі (Brunarska et al., 1978; Гурієлідзе та ін., 1992) за допомогою реактивів Саньє (Sannie et al., 1975) на олігоспіростанозиди (ССГ), Ерліха (Kiyosawa et al., 1968) на олігофуростанозиди (ФСГ) і Лафона (Brunarska et al., 1978) на загальні сапоніни. Створення бібліотеки цифрових зображень хроматограм і відтисків зрізів листків виконували методом комп'ютерного сканування з застосуванням сканерів PRIMAX Colorado 600p і PRIMAX Colorado C4800 при оптичному дозволі 400 dpi з застосуванням інтерполяризації.
Приготування тимчасових препаратів і цитометричні дослідження проводилися за загальноприйнятою методикою (Паушева, 1980).
При одержанні асептичної культури, органів, тканин рослин Y. torreyi дотримувалися як прийнятих в біотехнології методів (Бутенко, 1964, 1999; Здруйковська-Ріхтер, 1974; Калінін та ін., 1980, 1992; Катаєва, Бутенко, 1983; George et al., 1987; Dixon & Gonzales, 1994; Gamborg & Phillips, 1995), так і методів, розроблених у відділах експериментальної біології і біотехнології ДНБС. Як первинні експланти були використані насіння місцевої репродукції та ізольовані з них зіготичні зародки.
Асептичну роботу проводили в ламінар-боксі БП-4-004. Культивування in vitro здійснювалося на модифікованих живильних середовищах МС (Murashige & Skoog, 1962) і QL (Quoirin & Lepoivre, 1977), а також на середовищах, що містять повну і половини концентрації макро- і мікросолей.
Експланти культивували в колбах Елемеєра об'ємом 300мл (Німеччина), на СПВР, при 24-28С і 16-годинному фотоперіоді. Освітлення здійснювали за допомогою люмінісцентних ламп ЛФР-150. Періодичність субкультивування складала 2-3 місяці.
Для дослідження процесів морфогенезу в живильні середовища вводили фітогормони: БАП, ІОК, ІМК, НОК, 2.4-Д. При проведенні дослідів з індукції закладки адвентивних бруньок, епікотили проростків, одержаних в асептичних умовах на середовищі МС (1962), що не містило фітогормони, поміщали на агаризовані середовища МС і QL, що містили різні концентрації і співвідношення НОК (0; 0.1; 0.4; 1.0; 2.0; 3.0; 10.0 мг/л) і 6-БАП (0; 0.1; 0.4; 1.0; 2.0; 3.0; 10.0 мг/л).
Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми STATISTICA for Windows 5.1С, Copyright StatSoft, Inc. 1984-1996 (WEB: http:/www. statsoftinc. com) Кореляційні залежності оцінювалися на основі лінійного коефіцієнта кореляції за Пірсоном (r) (Лакін, 1973).
РОЗДІЛ 3. БІОМОРФОЛОГіЧні дослідження плодів, насіння І проростків Yucca torreyi Shafer. В зв'язку з насінним
Розмноженням в умовах інтродукції
3.1. Біоморфометричні характеристики плодів і насіння Y. torreyi
В ході досліджень, що проводилися, плоди і насіння були одержані при штучному запиленні шляхом гейтоногенії в 1994, 1996 та 1997 роках.
3.1. 1. Корелятивні зв'язки біометричних параметрів плодів
Довжина і діаметр плодів варіювали від 4,5см до 10см і від 1,8см до 3см відповідно. При цьому маса плодів становила від 6,12 г до 20,07 г і залежала від кількості насіння, яка варіювала від 9шт до 59шт. При обчисленні корелятивних зв'язків між такими біометричними параметрами плодів як маса, довжина і ширина, виявлений позитивний зв'язок, що підтверджується значеннями і величинами коефіцієнтів кореляцій. Для маси і довжини плодів r=0,99, а для маси і діаметра плодів r=0,91. Таким чином, маса плоду знаходиться у вираженому прямому корелятивному зв'язку з його лінійними розмірами, які також позитивно корелюють між собою (r=0,90)
3.1.2.
Біоморфометричні властивості насіння Y. torreyi і їхній взаємозв'язок з біоморфометричними показниками плодів і схожістю
Для Y. torreyi характерне велике, чорне насіння. Вага 1000 насінин Yucca torrei становила 147.6 г.
Вагові характеристики насіння варіювали в різні роки (Табл.1). Їхня маса вкладалася в нормальний розподіл. Аналіз вагових біометричних показників плодів і насіння з них (Табл.2) виявив кореляційну залежність між параметрами плоду і показниками насіння і їхній зв'язок з схожістю (Табл.3).
Таблиця 1 - Вагові характеристики насіння трьох урожаїв
Рік | n
(шт.) | Загальна вага
(мг) | mid
(мг) | min
(мг) | max
(мг) | Маса насіння
(мг)
1994 | 132 | 20961 | 158.80 | 63 | 212 | 137,574,5
1996 | 283 | 45952 | 162.38 | 64 | 275 | 169,0105,5
1997 | 404 | 54022 | 111.5 | 22 | 201 | 111,589,5
Таблиця 2 - Вагові біометричні показники плодів і
насіння урожаю 1997 року |
Плоди | Насіння
Ї | m
(г) | L
(см) |
(см) | Повноцінне насіння (шт.) | Сумарна вага повноцінного насіння (мг) | S | max
(мг) | min
(мг)
1 | 19.3 | 9.5 | 2.8 | 56 | 8149 | 101+79 | 180 | 22
2 | 20.07 | 10.0 | 3.0 | 59 | 7872 | 110.5+66.5 | 177 | 44
3 | 15.06 | 8.0 | 2.8 | 44 | 6150 | 135.5+65.5 | 201 | 70
4 | 10.66 | 6.5 | 2.6 | 37 | 4817 | 110+75 | 185 | 35
5 | 9.6 | 6.0 | 2.5 | 28 | 2822 | 90.5+47.5 | 138 | 43
6 | 9.47 | 5.2 | 2.5 | 39 | 5348 | 109.5+68.5 | 178 | 41
7 | 6.95 | 5.0 | 2.0 | 18 | 2802 | 119.5+65.3 | 185 | 54
8 | 6.12 | 4.5 | 1.8 | 17 | 2018 | 123.5+25.5 | 149 | 98
9 | 6.99 | 5.0 | 2.0 | 30 | 3869 | 107.5+60.5 | 168 | 47
10 | 6.85 | 4.5 | 2.0 | 9 | 1173 | 129.5+25.5 | 155 | 104
Таблиця 3 - Значення коефіцієнтів кореляції (r) біометричних
показників плодів і ізольованого з них насіння |
Насіння
n | Сумарна вага виповненого насіння | S | max | min
Вага плоду | 0.92 | 0.92 | -0.91 | 0.46 | -0.51
Довжина плоду | 0.91 | 0.91 | -0.92 | 0.45 | -0.53
Діаметр плоду | 0.91 | 0.87 | -0.92 | 0.48 | -0.61
Зі збільшенням у плоді Y. torreyi числа насіння, відбувається паралельне збільшення їхньої маси, хоча останній показник помітно відстає (r=0,22). В свою чергу, кількість виповненого насіння чітко позитивно корелювала з числом насіння що зійшло (r=0,99). Виражена позитивна кореляція також виявлена між вагою насіння і їхньою схожістю (r=0,89). На основі виявлених кореляційних зв'язків встановлено, що при максимальному зав'язуванні насіння в плоді Y. torreyi їхні посівні якості знижуються і кращим є насіння з плодів, виповнених не більше ніж на 70-80%. Мабуть це пов'язано з тим, що в природі 20-40% насіння, що розвивається, поїдається гусеницями запилювача. Внаслідок чого відбувається розвантаження плоду і перерозподіл живильних речовин.
РОЗДІЛ 4. Морфогенетичні потенції органів і тканин Yucca torrei В умовах in vitro в зв'язку з мікророзмноженням
3.1. 3. Морфологія проростків Y. torreyi in vivo та in vitro
Схожість свіжозібраного насіння становила 95-98%. При зберіганні його в паперових пакетах вона швидко падала і до кінця другого року практично втрачалася. Проте при зберіганні насіння всередині плодів схожість становила 70-80%. (Рис.1)
В процесі вивчення розвитку проростків на ранніх етапах онтогенезу з свіжозібраного морфологічно виповненого насіння в умовах in vivo та in vitro, було виявлено 7 стадій (I, II, III,..., VII), причому тривалість відповідних стадій в умовах in vitro була вище, ніж in vivo (Рис. 2).
Показано, що кількість насіння, що зійшла в умовах in vivo становила 89-95%. Проте, при введе-нні в культуру in vitro ізольованих зіготичних зародків відзначали їхню більш друж-ну, 100%-ну схо-жість. |
I | II | II | IV | V | VI | VII
in vivo | 26 14 | 1,5 0,5 | 1,5 0,5 | 1,5 0,5 | 2,5 0,5 | 2,5 1,5 | 4 2
in vitro | 74 64 | 2,5 0,5 | 4 2 | 4 2 | 3,5 1,5 | 5 3 | 7 4
Рис. 2. Тривалість (доба) стадій розвитку проростків Y.torreyi
in vivo та in vitro
Клональне мікророзмноження юкк in vitro є перспективним методом розмноження поряд з традиційним насінним. Нами були визначені три шляхи індукції утворення адвентивних бруньок з використанням модифікованих у відділі Експериментальної біології середовищ МС та QL що містять 6-БАП, ІМК і НОК (Рис. 3).
Краща закладка адвентивних бруньок (в середньому 1:8) відбувалася при послідовному культивуванні епікотилей і мікропагонів, одержаних внаслідок розвитку зіготичних зародків на живильних середовищах: QL, доповненого 2 мг/л БАП і 0.4 мг/л ІМК та QL, що містить 2 мг/л БАП і 0.4 мг/л НОК. Активний різогенез відзначали на середовищі МС з 0.1 мг/л НОК. Приживаність рослин досягала 80-95% при пікіровці регенерантів у грунт, взятий з плато Ай Петрі. (Табл. 4, 5, 6)
Таблиця 4 - Ефективність адвентивного пагоноутворення
Спосіб | Кількість адвентивних пагонів
Мікророзмноження | min | max | S x
I | 1 | 6 | 3,5 2,5
II | 2 | 14 | 8 6
III | 2 | 10 | 6 4
Таблиця 5 - Індукція розвитку бруньок і утворення пагонів Y.torreyi при трьох способах клонального мікророзмноження
Спосіб | Число бруньок (%) | Число пагони / | Інтенсивність
Мікророзмноження | Що розвиваються | Що утворюють адвентивні пагони | експлант (шт.) | проліферації
I | 75 25 | 41 25 | 3,52,5
II | 42,85 7,15 | 85.7 14,3 | 86 | +
III | 35 15 | 55 5 | 64
*Примітка: +активна, середня, низька
Таблиця 6 - Основні характеристики рослин Y. torreyi, одержаних з зародків перед висадкою в умови in vivo
Спосіб мікророзмно-ження | Середня довжина головного кореня (см) | Висота надземної частини рослини (см) | Середня кількість листків
(шт.) | Забарвлення
листків
I | 103 | 7,53 | 31 | Зелене
II | 11,54,5 | 126 | 3,51,5 | Світло-зелене
III | 9,752,25 | 9,52,5 | 3,51,5 | Світло-зелене
Як показали результати дослідів, потенційна ефективність мікророзмноження Y.torreyi через індукцію адвентивного пагоноутворення in vitro значно перевершує можливості культури in vitro ізольованих зіготичних зародків (Табл. 7).
Таблиця 7 - Порівняльна характеристика результатів мікророзмноження Y.torreyi в умовах in vitro
Показник | Тип експланта
Зіготичний зародок | Апекс (епікотиль)
Тривалість початкового росту до першого пасажу (міс.) | 1-1,5 | 1-2
Коефіцієнт розмноження (шт./рік) | 400* | 1.38104- 2.1108
Живильні середовища:
- що індукують розвиток | MC, 1/2MС, QL, 1/2 QL | QL+2мг/л БАП+0, 4мг/л НОК;
МС+1мг/л БАП+0, 1мг/л НОК
- для укорінення | MC, 1/2MС, QL, 1/2QL | МС+0, 1мг/л НОК
Кількість мікропагонів, що укорінилися, % | 98 - 100% | 95 - 100%
Приживаність рослин в грунтових умовах
(через 45 діб), % |
90 - 95% |
80 - 95%
Тривалість культивування від введення експланта до одержання регенеранта (міс.) |
1 |
1,5-2
*- що відповідає числу насіння, одержаного при штучному запиленні 100 квіток при реальному, в умовах інтродукції, 15% - ному зав'язуванні плодів
При роботі з культурою калюсу було виявлено, що активне калюсоутворення відбувалося на середовищі МС з 0.5 мг/л БАП і 4 мг/л 2.4-Д (Табл. 8). Активний калюсогенез спостерігали з зіготичних зародків, середній - з висічок листка, слабкий - з висічок коріння. Калюс зародкового походження володів високим морфогенетичним потенціалом, що реалізується через гемогенез, різогенез та ембріоідогенез. Аналогічні типи морфогенезу відзначені в калюсі листкового походження, проте здатність їх до морфогенезу була нижча. Низький морфогенетичний потенціал відзначали у калюсів кореневого походження.
Таблиця 8 - Індукція калюсоутворення на модифікованому середовищі МС, що містить 0.5 мг/л БАП і 4мг/л 2.4-Д
Первинний | Число експлантів (шт.) | Колір | Щільність
експлант | всього | що утворюють калюс | калюсу | калюсу
Зародок | 30 | 27 | світло-лимонний | щільний
Листок* | 30 | 16 | білий | середньої щільності
Корінь | 30 | 3 | білий | середньої щільності
* - Висічки листків бралися з базальної зони листка
Первинний калюс без ознак гістогенезу і морфогенезу не містив СГ. Синтез СГ пов'язаний з початком гістогенезу і осередки синтезу знаходились поблизу провідних елементів, що диференціюються. При цьому самі провідні елементи не містили сапоніни.
РОЗДІЛ 5. Визначення стероїдних глікозидів в
Органах і тканинах Yucca torreyi Shafer.
При вивченні здатності інтактних рослин синтезувати СГ були досліджені листя, коріння, квітки і насіння.
Результати гістохімічного аналізу СГ в листках рослин Y. torreyi, що вступили в репродуктивну фазу були ідентичні для рослин, здатних і не здатних зав'язувати насіння і показали різну локалізацію олігоспіростанозидів і олігофуростанозидів в тканинах листя. Провідні елементи ксилеми і механічні пучки реакції на сапоніни не давали. Цікаво те, що спостерігалася певна симетрія в положенні клітин-вмістилищ олігофуростанозидів відносно продихового апарату в епідермісі листка.
Аналіз СГ в листках рослин різного віку, що ростуть в умовах in vivo та in vitro виявив залежність накопичення СГ від віку рослин і зони листка. Вміст СГ був вищий в базальній частині листя однорічних рослин, що ростуть in vivo в порівнянні з рослинами, що ростуть in vitro.
Порівняльний ТШХ-аналіз олігоспіростанозидів і олігофуростанозидів рослин, що вступили в репродуктивну фазу, здатних і не здатних зав'язувати повноцінне насіння показав відмінності в хроматографічній рухливості і в числі СГ. При цьому, загальне число виявлених СГ в листках рослин, здатних зав'язувати насіння, становило 36 (23 ССГ і 13 ФСГ), а в листі рослин, не здатних зав'язувати насіння - 34 (24 ССГ і 10 ФСГ).
Визначення СГ в корінні рослин, що вступили в репродуктивну фазу, було утрудено із-за присутності в різодермі густого темно-червоного пігменту, що перешкоджає хроматографуванню. Проте, в них містилося не менше чотирьох СГ. Як показали дані гістохімічного аналізу, вміст ССГ і ФСГ в корінні залежав від віку рослини. Причому, останні були локалізовані переважно в ЦОЦ і значно в менших кількостях в клітинах первинної кори. СГ також виявлялися в корінні рослин, що ростуть in vitro, але були відсутні в культурах коріння, індукованих з ізольованих зіготичних зародків.
В результаті визначення місця первинного синтезу СГ встановлено, що олігоспіростанозиди і олігофуростанозиди присутні в пагонах і в корінні рослин що ростуть in vitro. В культурі адвентивних пагонів відзначали позитивну реакцію виключно на олігофуростанозиди. Проте в культурі коріння СГ не виявлені. В індукованих з калюсу корінні і ембріоїдах, що знаходяться на ранніх стадіях розвитку, СГ були відсутні. Поряд з цим, в регенерованих з калюсу бруньках виявлені олігофуростанозиди (Табл. 9). На основі цього ми можемо затверджувати, що в рослинах Y. torreyi місцем синтезу СГ є пагони.
Таблиця 9 - Присутність стероїдних глікозидів in vitro в морфогенних структурах
Морфогенні структури | Олігофуростанозиди | Олігоспіростанозиди
Пагони (ювенільні рослини) | так | так
Коріння (ювенільні рослини) | так | так
Культура пазушних пагонів | так | ні
Культура коріння (від зіготичного зародка) | ні | ні
Бруньки (регенеровані з калюсу) | так | ні
Коріння (регенероване з калюсу) | ні | ні
Ембріоїди (регенеровані з калюсу) | ні | ні
Квітки, що знаходилися на різних стадіях фізіологічної зрілості дуже відрізнялися за складом СГ, причому, найбільшу різноманітність спостерігали в квітках V порядку. В квітках III порядку, що знаходилися на стадії пухкого пуп'янка і є найбільш готовими до запилення були присутні 6 СГ. При ТШХ-аналізі квіток відповідних порядків, рослин, здатних і не здатних зав'язувати насіння, відмінності в складі СГ виявлені не були. При хроматографуванні витяжок з частин квіток, рослин здатних і не здатних до зав'язування насіння, виявлено, що кількість СГ у відповідних частинах була ідентична. Хроматографічна рухомість у випадку з частинами, що відповідають за виконання репродуктивної функції, відрізнялась, а у випадку з частинами, безпосередньо не пов'язаними з репродуктивною функцією, була ідентична. Всього за даними ТШХ, з квіток різного порядку виділені не менше 28 індивідуальних сполучень.
В результаті гістохімічної реакції з реактивом Лафона СГ були виявлені як в периспермі, так і в зародку насіння. ТШХ показала наявність в насінні 9 СГ - 2 ФСГ і 7 ССГ з переважанням першого і третього.
Специфічні реакції з реактивом Ерліха і Саньє свідчать про наявність олігофуростанозидів в зародку при їхній практично повній відсутності в переспермі. Це підтверджується ТШХ, що показала присутність в зародку двох олігоспіростанозидів і двох олігофуростанозидів з перевагою останніх. В той же час в периспермі переважали олігоспіростанозиди, про що свідчать дані гістохімічного і ТШХ аналізів.
СГ насіння складали 20% від їхньої маси і були представлені переважно похідними двох генінів, з переважанням більш полярного, який був виділений в чистому вигляді з 10%-вим виходом від маси насіння. Він виявився близьким за хроматографічною рухомістю до тигогеніну і смілагеніну і більш полярним щодо гекогеніну.
Аналіз структури з залученням ЯМР- і 13С- спектроскопії, показав, що даний глікозид є 3-о--D-глюкопіранозил-(12)-о--D-галактопірано-зидом сарсапогеніна. (Табл. 10, Рис. 4)
1H-ЯМР спектр 1(, м.д., О-ТМС, С5D5N): 5:34 (д, J1,2=7,8Гц, Н-1 Gal), 4,98 (д, J1,2=7,5Гц, H-1 Glc), 3,45 (дд, J26a,26b=10,5 Гц, J26a,25e=2,5Гц, Н-26а), 1,24 (д, J27,25=63Гц, 27-СН3), 1,16 (д, J21,20=6,6Гц, 21-CH3), 1,04 (c, 19-CH3), 0,91 (c, 18-CH3).
Табл.10 - Хімічні зрушення сигналів атомів 13С глюкозида 1,
(, м.д., О-ТМС, C5D5N)
С-атом | Хім.
зруше-
ння | С-атом | Хім.
зруш-
ення | С-атом | Хім.
зруше-
ння
Gal
1’ | 102,0 | 1 | 30,7 | 15 | 30,7
2’ | 81,1 | 2 | 26,8 | 16 | 81,1
3’ | 75,2 | 3 | 76,1 | 17 | 62,7
4’ | 69,5 | 4 | 31,9 | 18 | 16,3
5’ | 76,2 | 5 | 36,7 | 19 | 23,7
6’ | 61,8 | 6 | 26,6 | 20 | 42,3
7 | 26,6 | 21 | 14,5
Glc | 8 | 35,4 | 22 | 109,4
1’’ | 105,3 | 9 | 40,2 | 23 | 26,3
2’’ | 74,8 | 10 | 35,0 | 24 | 26,0
3’’ | 77,6 | 11 | 21,0 | 25 | 27,3
4’’ | 71,6 | 12 | 40,2 | 26 | 64,9
5’’ | 77,8 | 13 | 40,7 | 27 | 16,0
6’’ | 62,8 | 14 | 56,4
РОЗДІЛ 6. Дослідження синтезу СГ в культурах
Тканин Y. torreyi
Вивчаючи можливість одержання СГ методом культури тканин, був проаналізований калюс Y. torreyi листового, кореневого і зародкового походження.
ТШХ аналіз показав практично повну відсутність СГ, як в первинному калюсі, так і в живильному середовищі.
При гістохімічному аналізі калюсу тільки в зонах проліферації елементів спостерігали позитивну реакцію на олігофуростанозиди. Самі провідні елементи позитивної реакції на СГ не давали.
Позитивну реакцію на олігофуростанозиди давали клітини приблизно середнього розміру, які сусідили з дрібними і більш великими клітинами, що не давали характерне забарвлення.Введення в живильне середовище 0.01%, 0.1%, 1% холестерину як природного попередника СГ позитивного результату не дало, хоча ТШХ аналіз показав присутність холестерину в калюсних тканинах в усіх варіантах.
Таблиця 11 - Цитометричні характеристики клітин калюсу Y. torreyi
Клітини | Параметри клітин | Параметри ядер | Ядерно-плазмове відношення | Об'єм
Ядерця | Ядерно-ядерцеве відношення
D
Mm
(мкм) | d
Mm
(мкм) | V
Mm | D
Mm
(мкм) | d
Mm
(мкм) | V
Mm |
Mm |
Mm |
Mm
Всі клітини калюсу | 330300 | 11793 | 3073333,165
3069013,273 | 3327 | 3327 | 18017,549145
17981,550045 | 0,112691183
0,112308817 | 35,436614064
34,874128126 | 0,148148675129
0,1481670665
Що містять
Сапоніни | 162108 | 7545 | 297836,3039
284336,6414 | 34,525,5 | 19,510,5 | 6810,57973125
6689,08276875 | 0,073584333
0,072618149 | 35,436614064
34,874128126 | 0,1487424148895
0,1475529668895
Поряд з цим в процесі культивування мікропагонів біля їхньої основи був одержаний калюс, який активно наростав на середовищі QL, що містив 2 мг/л БАП і 0.4 мг/л НУК без проявів гістогенезу.
Гістохімічний аналіз цього калюсу показав наявність в ньому груп клітин, що містили олігофуростанозиди, які давали позитивну реакцію з реактивом Ерліха (Рис.5). При ТШХ витяжки з цього калюсу були виявлені два олігофуростанозиди: Y1 с Rf=0,32 і Y2 c Rf=0,23.
СГ спіростанолового ряду були відсутні, що, очевидно, пов'я-зано з відсутністю в недиференцій-ованих тканинах -глюкозидази, що зумовлює перехід олігофуростано-зидів в спіростанолові аналоги.
Математичне вираження показників величин ядерно-плазмо-вого відношення клітин цього калю-су, так само як і величини об'ємів клітин і ядер вкладається в експоненціальний розподіл (Рис. 6).
Між об'ємом ядра і об'ємом клітини виявлений корелятивний зв'язок (r=0,68). Об'єм ядра і величина ядерно-плазмового відношення знаходилися в слабо вираженій позитивній кореляції (r=0,21). Слабка, причому негативна, кореляційна залежність спостерігалася між об'ємом клітини і ядерно-плазмовим відношенням, (r=-0,19).
Таким чином, можна зробити висновок, що в первинному калюсі Y. torreyi СГ відсутні. Їхня поява віднесена до початку гістогенезу, і осередками синтезу є судини ,що диференціюються, хоча, як було показано, синтез можливий і в калюсі без видимих ознак гістогенезу, причому, в останньому випадку СГ виявляються тільки в частині клітин, які, очевидно, є місцями їхнього синтезу. На користь останнього говорить той факт, що в клітинах калюсу без ознак гістогенезу СГ представлені виключно фізіологічно неактивними олігофуростанозидами, що є також транспортною формою СГ і здатними переходити в спіростанолові глікозиди, які в свою чергу володіють значною фізіологічною активністю і, згідно з літературним даними (Miura et al., 1987; Носов, 1991), чинять вплив на цитодиферен-ціацію і морфогенез.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1.
Для одержання якісного посадкового матеріалу Yucca torreyi Shafer. і максимального виходу рослин при насінному розмноженні в умовах інтродукції на ПБК рекомендується використовувати насіння з плодів, виповнених не більше ніж на 70% ,що зберігалися не більше двох місяців.
1.
При необхідності тривалого збереження насіння Y. torreyi доцільним є зберігання його всередині непошкоджених плодів.
1.
Доцільним є використання клонального мікророзмноження in vitro через індукцію утворення адвентивних бруньок в культурі епікотилю для масового тиражування рослин Y. torreyi.
ВИСНОВКИ
1.
Вивчені взаємозв'язки схожості насіння Yucca torreyi Shafer. з морфологією насіння і плодів, одержаних при штучному запиленні. Показано, що середня маса насіння знаходиться в негативному, близькому до функціонального, зв'язку (r=-0,91) з масою плоду, а схожість насіння знаходиться в близькому до функціонального позитивного зв'язку (r=0,89) з їхньою масою.
1.
В процесі вивчення розвитку проростків Yucca torreyi Shafer. на ранніх етапах онтогенезу виявлено сім стадій, загальна тривалість яких в умовах in vitro на безгормональному середовищі МС і в умовах in vivo склала 138 і 140 діб відповідно.
1.
Показано, що схожість свіжозібраного виповненого насіння Yucca torreyi Shafer. при сівбі в грунтову суміш і на безгормональне живильне середовище МС становила 78-89% і 85-98% відповідно.
1.
Виявлена зворотна залежність схожості насіння Yucca torreyi Shafer. в умовах in vivo та in vitro від строків зберігання, найменш виражена при зберіганні насіння всередині плодів.
1.
Розроблені способи мікророзмноження рослин Y. torreyi в умовах in vitro: 1) розвиток повноцінних проростків в культурі зародків і подальше одержання рослин; 2) адвентивне пагоноутворення в культурі епікотилю, різогенез мікропагонів і одержання регенерантів.
1.
Показано, що синтез стероїдних глікозидів Y. torreyi віднесений до початку гістогенезу. Проте одержаний калюс без ознак гістогенезу, в 35% клітин якого містились два олігофуростанозиди (Rf=0,32; Rf=0,23).
1.
Виявлені СГ в листі, корінні, квітках і насінні, їхніх частинах і тканинах. Визначена локалізація СГ в тканинах і клітинах листя і коріння різного віку і в насінні. Встановлена залежність зміни в складі СГ від місця розташування тканин і органів, віку самої рослини Y. torreyi, а також її здатності зав'язувати насіння. Показано, що високий вміст СГ був в насінні і квітках.
1.
Вперше встановлена структура переважного глікозида насіння Yucca torreyi, що є, 3-о--D-глюкопіранозил-(12)-о--D-галактопіранозидом сарсапогеніна, що складає 10% від маси насіння , при загальному вмісті суми СГ, що складає 20%.
1.
Негативна реакція на СГ при ТШХ і гістохімічному аналізі в культурі коріння in vitro і позитивна - в культурі мікропагонів довели, що в Yucca torreyi Shafer. синтез СГ відбувається в надземній частині рослини.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1.
Карпов П.А. Изучение стероидных гликозидов семян некоторых представителей рода Yucca. // Бюл. Никит. ботан. сада. -1997. - Вып.78. -С.92-95.
1.
Лищук А.И., Карпов П.А. Изучение стероидных гликозидов Yucca macrocarpa в вегетативных органах. // Бюл. Никит. ботан. сада. -1997. - Вып.78. -С.95-99.
1.
Карпов П.А., Чирва В.Я. Изучение стероидных гликозидов в репродуктивных органах Yucca macrocarpa Engelm. // Бюл. Держ. Нікіт. ботан. саду. -1998. -Вип.80. - С.168-174.
1.
Гришковец В.И., Карпов П.А., Иксанова С.В., Чирва В.Я. Стероидный гликозид из семян Yucca macrocarpa. // Химия природных соединений. -1998. -Вып.6. - С.828-830.
1.
Максимов А.П., Новикова В.М., Карпов П.А Перспективы размножения Юкки крупноплодной (Yucca macrocarpa Engelm.) в условиях интродукции. // Ботанические сады - центры сохранения биологического разнообразия мировой флоры. Тез. докл. сессии совета Ботанических садов Украины. Ялта, 1995. - C.136
1.
Максимов А.П., Новикова В.М., Карпов П.А Семенное размножение видов юкки в условиях Южного берега Крыма. // Селекция, экология, технологии возделывания и переработки нетрадиционных растений (посвящается творческому наследию Л.П. Симиренко): Материалы IV междунар. научно-производственной конф. г. Алушта, 11-17 сентября, 1995: Тез.докл. - Cимферополь, 1996. - С.73.
1.
Максимов А.П., Новикова В.М., Карпов П.А., Капелев О.И. Арборетум Никитского ботанического сада - источник генофонда однодольных древесных интродуцентов. // Старовинні парки і проблеми їх збереження.: Тез. доп. 2-го міжнар. симпозіуму присвяченого 200-річчю дендрологічного парку “Софіївка”. Умань, 1996. - С.100.
1.
Карпов П.А., Новикова В.М., Гришковец В.И., Максимов А.П., Чирва В.Я. Возможности использования видов рода Юкка (Yucca L.) для получения стероидных гликозидов. // Четверта міжнародна конференція з медичної ботаніки, г.Ялта, 24-26 сентября 1997г.: Тез. доп. Київ, 1997. - C.394-395.
1.
Novikova V.M., Karpov P.A. Culture in vitro of some kinds Yucca. // In vitro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation: ABSTRACTS of the VII Intern. Conf. Moscow. 25-28 Nowember 1997. -Moscow, Russia. -P.44-45.
1.
Novikova V.M., Kapelev O.I., Karpov P.A. Culture of tissues of some arboreal monocotyledonous plants. // ABSTRACTS II International Symposium on Plant Biotecnol. 4-8 October 1998.- Kyiv, Ukraine. - P.92.
1.
Карпов П.А., Новикова В.М., Максимов А.П. Юкка крупноплодная (Yucca macrocarpa Engelm.) перспективы изучения и культивирования. // Интродукция растений и отдаленная гибридизация.: Междунар. конф., г.Москва, 15-17 декабря 1998г.: Тез. докл. - Москва, 1998. - С.57-58.
1.
Карпов П.А. Гистохимическое определение локализации стероидных гликозидов в листьях Yucca macrocarpa Engelm. // Int. Meeting of Young Scientists in Horticulture: 7th Int. Conf. Lednice / Czech Republic, September 14-16, 1999. Materials. Lednice, 1999. -P.172-176.
Карпов П.А. Біологічні особливості Yucca torreyi Shafer.: розмноження рослин і одержання стероїдних глікозидів in situ та in vitro. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук з спеціальності 03.00.20. - бiотехнологiя. - Державний Нікітський ботанічний сад УААН, Ялта, 2000.
Дисертація присв'ячена вивченню біологічних особливостей Yucca torreyi Shafer. (син. Y.macrocarpa Engelm.) в зв'язку з розмноженням рослин і одержання стероїдних глікозидів in situ та in vitro. Вивчені можливості насінного і клонального мікророзмноження. Розроблені три способи індукції адвентивного пагоноутворення in vitro в культурі епікотилю. Досліджено наявність стероїдних глікозидів в листі, корінні, квітках і насінні. Встановлено, що найвищий вміст стероїдних глікозидів
