НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна

________________________________________________________

ГОНЧАР Михайло Васильович

УДК 577.121 + 579.22 + 543.5

ШЛЯХИ енергозабезпечення і детоксикаціЇ у МЕТИЛОТРОФНИХ дріжджів та їх СКЕРОВАНА модифікація З МЕТОЮ СТВОРЕННЯ НОВИХ ФЕРМЕНТАТИВНИХ І БІОСЕНСОРНИХ аналітичнИХ СИСТЕМ

03.00.04 – бiохiмiя

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

К и ї в – 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Львів).

Науковий консультант - доктор біологічних наук, професор

Сибірний Андрій Андрійович,

завідувач відділу біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України; з 1.11.2000 р. Відділення реорганізовано в Інститут біології клітини НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

професор кафедри біоорганічної, біологічної і фармацевтичної хімії Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (м. Київ);

доктор біологічних наук, професор

Калачнюк Григорій Іванович,

професор кафедри органічної та неорганічної хімії, директор НДІ біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького;

доктор медичних наук, доцент

Журило Олександр Анатолійович,

завідувач лабораторії мікробіології туберкульозу і неспецифічних захворювань легень Інституту фтизіатрії і пульмонології ім. Ф. Г. Яновського Академії медичних наук України (м. Київ).

Провідна установа - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, відділ біології газоокислюючих мікроорганізмів (м. Київ).

Захист дисертації відбудеться “ 29 “ січня 2001 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий “25” грудня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

Пам’яті дорогого Вчителя,

чл.-кор. РАН, професора

Валентина Михайловича Степанова

присвячую

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Метилотрофні дріжджі – унікальні еукаріотичні мікроорганізми, здатні рости на метанолі як єдиному джерелі вуглецю та енергії. Незважаючи на значні успіхи у вивченні цих дріжджів, ряд проблем метилотрофного обміну залишаються недостатньо вивченими. Особливо це стосується енергетичного обміну та детоксикації інтермедіатів обміну метанолу – формальдегіду, мурашиної кислоти та пероксиду водню. Досконале знання шляхів енергозабезпечення і детоксикаційних процесів при метилотрофному рості може стати теоретичною базою для конструювання штамів із покращеними біотехнологічними характеристиками з метою використання їх у широкомасштабному виробництві для отримання білково-вітамінних концентратів, біологічно активних низькомолекулярних сполук, власних і гетерологічних білків.

Метилотрофні дріжджі завдяки унікальній пристосованості до метаболізму одновуглецевих сполук генерують у присутності метанолу і формальдегіду ряд специфічних метаболічних реакцій, які можна розглядати як селективний аналітичний відгук на ці практично важливі речовини-аналіти. Ця проблема зовсім не вивчена і знайшла розвиток у даній роботі, зокрема в аспекті цілеспрямованої модифікації метаболічних ланок метилотрофних дріжджів для використання модифікованих клітин у біоаналітичній практиці.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (бюджетна тема “Дослідження катаболітної репресії, індукції синтезу ферментів та їх інактивації як механізмів регуляції метаболізму метилотрофних дріжджів” (програма 2.28.2.6, № держреєстрації 0194U008021). Робота виконувалась також у рамках вітчизняних і міжнародних конкурсних програм: 3-х проектів Державного фонду фундаментальних досліджень, зокрема, № 5.4/574 “Структурні та функціональні властивості цитохром с пероксидази із метилотрофних дріжджів і дослідження їх фізико-хімічних властивостей” (№ держреєстрації 0198U003999; автор – керівник проекту), 2 науково-технічних проектів, зокрема, № 2/1084-97 “Розробка ферментативних діагностикумів для кількісного визначення етанолу, метанолу, формальдегіду і глюкози в біологічних рідинах та харчових продуктах” (№ держреєстрації 0198U003993; автор – керівник проекту); 4-х міжнародних проектів: INTAS-94-0552 “Біофізичні, біотехнологічні та хімічні підходи до вивчення каталітичних механізмів дії каталаз, диоксигеназ і лакказ”; INTAS-96-1971 “Розробка нових ензиматичних наборів і мікросенсорів для екологічного моніторингу забруднень формальдегідом”; NATO Linkage Grant HTECH.LG 940691 “Структурні та функціональні дослідження мутантних форм каталази із метилотрофних дріжджів” і Міжнародного Наукового Фонду Сороса “Шляхи окислення метанолу і генерації енергії у метилотрофних дріжджів” (у чотирьох останніх проектах автор – відповідальний виконавець).

Мета і задачі дослідження. Основною метою дослідження був пошук додаткових (альтернативних) систем в енергозабезпеченні метилотрофного росту і детоксикації інтермедіатів обміну метанолу – пероксиду водню, формальдегіду і мурашиної кислоти, а також розробка нових ферментативних і біосенсорних методів аналізу метанолу, формальдегіду і етанолу з використанням ферментів і спеціально сконструйованих мутантних штамів метилотрофних дріжджів.

Для досягнення поставленої мети було сформульовано такі основні завдання:

1)

2)

3)

4)

5)

6)

7)

8)

Наукова новизна одержаних результатів. Доведено існування у метилотрофних дріжджів додаткової циклічно-лінійної системи енергозабезпечення росту на метанолі, яка включає ксилулозомонофосфатний цикл синтезу дигідроксиацетону з формальдегіду, ланку гліколітичного окислення тріозофосфатів та цикл трикарбонових кислот. Проаналізовано енергетичну ефективність даного шляху у порівнянні із прийнятою раніше схемою лінійного (прямого) окислення формальдегіду у двох дегідрогеназних реакціях.

Виявлено додаткові шляхи детоксикації інтермедіатів обміну метанолу у метилотрофних дріжджів, які включають окислення формальдегіду в неспецифічній альдегіддегідрогеназній реакції та енергозалежну екскрецію мурашиної кислоти в середовище. Показано необлігатність каталази при рості клітин на метанолі як єдиному джерелі вуглецю та енергії та її замінність у детоксикації пероксиду водню парою цитохром с - цитохром с пероксидаза за умови підвищеної експресії останнього фермента. Вперше виявлено наявність глутатіонпероксидазної активності у метилотрофних дріжджів.

Вперше виявлено і детально охарактеризовано систему закислення середовища у клітин метилотрофних дріжджів, яка індукується метанолом та формальдегідом. Обгрунтовано роль реакцій прямого (лінійного) окислення метанолу і формальдегіду в цій детоксикаційній системі.

Вперше виділено із метилотрофних дріжджів у препаративних кількостях цитохром с і цитохром с пероксидазу і вивчено їх фізико-хімічні властивості.

Отримано безкаталазний надпродуцент алкогольоксидази Hansenula polymorpha К-105, здатний конститутивно синтезувати цільовий фермент на глюкозному середовищі. Розроблено економічну схему препаративного отримання алкогольоксидази, її стабілізації та використання в аналітичній біотехнології для кількісного визначення метанолу, етанолу та формальдегіду.

Вперше показано, що скерована генетична та хімічна модифікація клітин мікроорганізмів дозволяє істотно підвищити селективність та чутливість аналітичного відгуку клітин (екструзії протонів або пероксиду водню, поглинання кисню), що відкриває широкі можливості вдосконалення біосенсорних методів аналізу з використанням клітинних елементів.

На моделі алкогольоксидазного рН-чутливого транзисторного сенсора вперше продемонстровано, що навіть за умови використання неспецифічного фермента селективність біосенсора до певних аналітів (наприклад, формальдегіду) можна різко підвищити завдяки двостадійності аналітичної реакції, поєднанню хемо- і біосенсорних ефектів і використанню відмінностей у каталітичних параметрах фермента відносно споріднених субстратів.

Практичне значення одержаних результатів. Практичне значення фундаментальних досліджень шляхів енергозабезпечення і детоксикації інтермедіатів обміну метанолу у метилотрофних дріжджів полягає у з’ясуванні ролі окремих додаткових (або альтернативних) ферментних систем у цих процесах, що може полегшити конструювання промислових штамів цих дріжджів із поліпшеними ростовими характеристиками та більшою резистентністю до стресових факторів середовища.

Розроблені підходи скерованої генетичної зміни метаболічних ознак клітин дріжджів з метою поліпшення їх аналітичних характеристик у складі біосенсорів відкривають широкі можливості вдосконалення клітинних сенсорних елементів і прискорення їх комерціалізації.

Виділені високоочищені препарати двох гемопротеїнів – цитохром с пероксидази та цитохрому с – можуть послужити моделлю у вивченні структурно-функціональних зв’язків цих білків та їх еволюції. Розроблена економічна схема виділення цитохрому с із клітин дріжджів може стати основою для промислового отримання цього фармакологічно цінного білка із дріжджових продуцентів.

Сконструйований безкаталазний штам – надпродуцент алкогольоксидази – вже використовується для отримання дешевих препаратів фермента, придатних для аналітичних цілей.

Розроблені аналітичні набори для ферментативного визначення глюкози та етанолу вже впроваджені у промислове виробництво (“ДІАГЛЮК”, Львівський завод лікарських препаратів, з 1989 р.), або рекомендовані для серійного випуску (“ДІАГЛЮК-2”, “АЛКОТЕСТ”) Фармакологічним комітетом МОЗ України. Набір “АЛКОТЕСТ” вже більше року використовується Львівським підприємством “Ензим” по випуску пекарських дріжджів для оптимізації технологічного процесу вирощування цих мікроорганізмів.

Селекціоновані штами та розроблені аналітичні методи описано в методичному посібнику для студентів-генетиків Львівського національного університету ім. І. Франка і стали методичною базою для проведення нового практикуму з основ біотехнології дріжджів.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було сплановано і виконано автором в основному самостійно, під загальним керівництвом наукового консультанта. Ідеї, гіпотези та теоретичні концепції роботи належать здобувачеві. Ряд штамів, описаних у роботі, було селекціоновано автором самостійно, інші було взято із колекції відділу або отримано іншими співробітниками за схемою селекції, запропонованою здобувачем. Дослідження енергетичного метаболізму проводилось у співпраці з канд. біол. наук Убийвовк В. М., ролі цитохром с пероксидази в детоксикації пероксиду водню – асп. Кострик Л. Б., ролі неспецифічної альдегіддегідрогенази в системі закислення – асп. (тепер – канд. біол. наук) Майданом М.М. З ним же проводилась робота по розробці амперометричних біосенсорів на основі О2- і Н2О2-чутливих електродів. Клітинні та ензимні біоелементи для рН-чутливих біосенсорів розроблялись на базі відділу біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини, а безпосереднє формування біочутливих мембран і біосенсорні вимірювання проводились у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України канд. біол. наук Корпаном Я.І. і докт. біол. наук Солдаткіним О. П. під керівництвом академіка Єльської А. В. та проф. Стародуба М. Ф. Робота по вивченню спектрів ядерного магнітного резонансу і визначенню редокс-потенціалу цитохрому с проводилась у співпраці з італійськими колегами (д-р О. Дикий, д-р Р. П’єрателі, д-р М. Борсарі) під керівництвом проф. Л. Банчі і проф. І. Бертіні.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на 38 вітчизняних та міжнародних конференціях і симпозіумах, зокрема, XII міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Ваймар, Німеччина, 1987), Всесоюзній конференції “Регуляция микробного метаболизма” (Пущино, 1989), VI міжнародному симпозіумі по мікробному росту на С1-сполуках (Геттінген, Німеччина, 1989), міжнародній конференції з генетики дихальних ферментів (Карпач, Польща, 1990), XV міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Рига, Латвія, 1991), VIII міжнародному симпозіумі по дріжджах (Атланта, США, 1992), міжнародному семінарі з генетики і молекулярної біології неконвенційних дріжджів (Базель, Швейцарія, 1992), III міжнародній конференції “Role of formaldehyde in biological systems” (Шопрон, Угорщина, 1992), VI з‘їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавілова (Полтава, 1992), VI Європейському конгресі з біотехнології (Флоренція, Італія, 1993), І Установчому (VIII) з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993), ІІ симпозіумі з судової медицини “Criminalistic traces” (Краків, Польща, 1994), VII міжнародному симпозіумі з генетики промислових мікроорганізмів GIM94 (Монреаль, Канада, 1994), міжнародному симпозіумі/семінарі “Environmental Biotechnology” (Ватерлоо, Канада, 1994), XII малому семінарі по транспорту та енергетиці дріжджів (Карпач, Польща, 1994), VII Європейському конгресі з біотехнології (Ніца, Франція, 1995), Beijerinck Centennial “Microbial physiology and gene regulation: emerging principles and applications” (Гаага, Нідерланди, 1995), “Biosensors 96” (Бангкок, Таїланд, 1996), “Eurobic 3” (Ноордвійкерхаут, Нідерланди, 1996), VIII Європейському конгресі з біотехнології (Будапешт, Угорщина, 1997), V і VII Українському біохімічному з’їзді (Івано-Франківськ, 1987; Київ, 1997), XIX міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах (Брага, Португалія, 1998), міжнародному семінарі “New trends in biosensor development” (Київ, 1998), І світовій мережевій конференції по Hansenula polymorpha (Дюсельдорф, ФРН, 2000), X міжнародному симпозіумі по дріжджах (Арнхем, Нідерланди, 2000). Робота доповідалась на семінарі відділу біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини та семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (травень 2000 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 81 роботу, включаючи 31 статтю, 3 авторські свідоцтва, 1 патент України та 1 брошуру (методичну розробку для студентів із біотехнології метилотрофних дріжджів), а також 45 тез доповідей на конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Результати досліджень та їх обговорення” (5 розділів), “Висновки”, “Список використаних джерел” (443 посилання) і “Додатки”. Робота викладена на 453 сторінках машинопису і містить 84 рисунки та 64 таблиці. Основна текстова частина дисертації включає 234 сторінки.

Огляд літератури

В огляді дається характеристика обміну метанолу у метилотрофних дріжджів і його регуляції, висвітлюється стан проблеми енергозабезпечення метилотрофного росту, розглядаються механізми детоксикації активних кисневих інтермедіатів та С1-метаболітів при метилотрофному обміні, висвітлюються перспективні напрямки біотехнологічного використання метилотрофних дріжджів. Оскільки частина дисертаційної роботи присвячена пошуку нових біоаналітичних підходів для кількісного визначення ряду важливих аналітів (метанолу, етанолу і формальдегіду), то в роботу (у формі додатку) включено характеристику сучасних методів для кількісного визначення вказаних сполук.

Матеріали та методи досліджень

У роботi використовували понад 40 штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha, Pichia methanolica (P. pinus), Pichia pastoris, у тому числі мутантних із селективним пошкодженням окремих ланок метилотрофного обміну, отриманих як автором, так і колегами з відділу біохімічної генетики, де виконувалась робота, а також люб’язно переданих із колекцій інших інститутів. Були використані також штами дикого типу парафінзасвоюючих дріжджів Candida maltosa і пекарських дріжджів Saccharomyces cerevisiae із колекції відділу біохімічної генетики.

Визначення концентрації білка проводили за методом Лоурі [Lowry et al., 1951].

Аналіз активності ферментів (алкогольоксидази, глутатіонзалежної формальдегіддегідрогенази, альдегіддегідрогенази, форміат-дегідрогенази, каталази, цитратсинтази, аконітази, ізоцитрат-дегідрогенази, глутаматдегідрогенази, Н+-АТРази, цитохром с пероксидази, глутатіонпероксидази) у безклітинних екстрактах і пермеабілізованих дигітоніном клітинах метилотрофних дріжджів проводили за відомими методами, описаними в роботах автора.

Концентрацію метаболітів у культуральній рідині та клітинах визначали такими методами: формальдегіду – за [Nash, 1953] і [Avigad, 1983], НСООН – [Johnson et al., 1967], Н2О2 – [Гончар і співавт., 1996], сумарного пулу глутатіону – [Brehe & Burch, 1976], NADH – [Jacobson & Jacobson, 1976; Петушков, 1984].

Аналіз включення радіоактивної мітки в вуглекислоту та біомасу проводили, як описано в роботах [Сибирный и Гончар, 1990; Sibirny et al., 1990].

Закислювальну активність клітин дріжджів визначали, як описано нами в роботі [Гончар и др., 1990]. Аналіз дихальної (кисеньпоглинаючої) активності клітин проводили за допомогою кисневого аналізатора Biological Oxygen Monitor YSI Model 5300 (“Yellow Springs Instruments Co.”, США). Н2О2–секретуючу активність безкаталазних клітин мутантних штамів аналізували пероксидазним методом [Гончар і співавт., 1998].

Виділення та очищення цитохрому с і цитохром с пероксидази із клітин метилотрофних дріжджів проводили за методом [Djavadi-Ohaniance et al., 1978] у нашій модифікації.

Електрофоретичне розділення білків у поліакриламідному гелі та визначення їх молекулярної маси проводили згідно із протоколами [Davis, 1964; Laemmli, 1970; Остерман, 1981].

Ізоелектрофокусування та визначення ізоелектричної точки цитохрому с на пластинках “Servalyt precotes pH 3-10” (“Serva”) проводили за методикою, описаною в роботі [Остерман, 1983].

УФ- та видимі спектри поглинання гемопротеїнів отримували на спектрофотометрі “Specord M40” (“Carlzeiss”, Німеччина). Розрахунок коефіцієнтів мілімолярної екстинкції проводили на основі незалежного визначення концентрації гему с у досліджуваних розчинах піридин-гемохромним методом [Berry & Trumpower, 1987].

1Н-ЯМР-спектри ферицитохрому с отримували на спектрометрах “Bruker” (моделі DRX-500 i AC-300) при робочих частотах 500,13 і 300,13 МГц, відповідно, на базі лабораторії біонеорганічної хімії Флорентійсько-го університету (Італія).

Редокс-потенціал цитохрому с визначали за допомогою циклічної вольтамметрії на приладі Potentiostat/Galvanostat PAR, модель 273A в атмосфері аргону у співпраці з д-ром М. Борсарі (Італія).

Формування біоселективних клітинних і ферментних елементів сенсорів здійснювали іммобілізацією клітин в альгінаті кальцію та в парах глутаральдегіду (для алкогольоксидази).

Конструювання лабораторних моделей потенціометричних біосенсорів на основі рН-чутливих польових транзисторів виробництва НВО “Мікропроцесор” (м. Київ) і сконструйованих мутантних штамів метилотрофних дріжджів та очищеної алкогольоксидази проводили на базі відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України, як описано в роботах [Korpan et al., 1993a, 1993b].

Конструювання лабораторних моделей амперометричних біосенсорів на основі О2- і Н2О2-чутливих електродів і сконструйованих мутантних штамів метилотрофних дріжджів проводили з використанням моніторної системи виробництва фірми “Yellow Springs Instruments Co.” (США), як описано в роботі [Gonchar et al., 1998a].

Побудову графіків та статистичну обробку даних здійснювали за допомогою програм Origin 4.0 і Excel 97.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження додаткових шляхів енергозабезпечення метилотрофного росту у дріжджів

Існуюча модель прямого (лінійного) шляху енергетичного обміну метанолу у дріжджів постулює участь CH2O- та НСООН-дегідрогеназних реакцій, в яких утворюються дві молекули NADH. Альтернативна концепція про енергозабезпечення метилотрофного росту [Сибирный, 1987; Sibirny et al., 1989] передбачає циклічно-лінійне перетворення метанолу в дигідроксиацетон (DHA) в ксилулозомонофосфатному (дигідроксиацетоновому) циклі та подальше окислення DHA в ході наступних гліколітичних перетворень та реакцій циклу Кребса:

2ATP 2ADP

3CH3OH 3HCHO DHA

ADP, Pi, NAD+с ATP, H2O, NADH(H+)с

DHA Піруват

4NAD+m, FAD, GDP, Pi 4NADH(H+)m, FADH2, GTP

Піруват 3CO2

Для з’ясування ролі лінійного та циклічно-лінійного шляхів окислення метанолу в енергетичному обміні метилотрофних дріжджів нами вибрано кілька методичних підходів: 1) аналіз впливу фторацетату - інгібітора циклу Кребса - на ріст клітин метилотрофних дріжджів у рідких культурах із різними вуглецевими субстратами; 2) вивчення включення мітки із 14С-метанолу в вуглекислоту та біомасу у мутантів з блоком формальдегіддегідрогенази, форміатдегідрогенази та дигідроксиацетонсинтази у порівнянні зі штамами дикого типу; 3) дослідження впливу “холодних” аналогів інтермедіатів лінійного та циклічного енергетичних шляхів на включення мітки із 14С-метанолу в вуглекислоту та біомасу у штамів дикого типу.

Гальмівна дія фторацетату на активність циклу Кребса зумовлена тим, що він, включаючись у цикл через ацетил-CoA-синтетазну і цитратсинтазну реакції, перетворюється у фторцитрат - специфічний інгібітор аконітази. Цей фермент розміщений в ЦТК до відгалуження гліоксилатного шунта, а тому його гальмування приводить до пригнічення функціонування обох гілок циклу.

Досліди по кількісному аналізу інгібуючого впливу фторацетату на ріст клітин дикого типу метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha в рідких середовищах із різними вуглецевими субстратами (табл. 1) показали, що чутливість метилотрофно вирощуваних клітин до фторацетату близька до чутливості клітин, вирощуваних на гліцерині, і в 30 разів вища, ніж для глюкозних клітин. Відсутність відновлення росту клітин на метанолі при внесенні глутамату або кетоглутарату на фоні фторацетату свідчить, що гальмівна дія інгібітора не може бути викликана лише впливом на анаплеротичну, анаболічну функцію ЦТК і може бути пояснена інгібуванням реакцій ЦТК, що залучені в енергетичний обмін. Враховуючи, що гліцерин - класичний незброджувальний ростовий субстрат, для повного окислення якого необхідним є цикл Кребса, можна зробити опосередкований висновок про аналогічне значення ЦТК для енергетичного обміну метанолу.

Таблиця 1

Гальмівний вплив фторацетату на ріст метилотрофних дріжджів H. polymorpha 42а в середовищах із різними вуглецевими субстратами (у величинах І50, тобто концентрації інгібітора, яка викликає двократне зниження біомаси порівняно із контролем).

Ростовий субстрат (%) | Час росту, год | І50, мМ

Глюкоза (1%) | 20 | 11,7

Гліцерин (1%) | 27 | 0,57

Метанол (1%) | 42 | 0,41

Інший підхід у вивченні ролі лінійного (прямого) та циклічно-лінійного шляху дисиміляції метанолу у дріжджів полягав у дослідженні здатності метаболізувати метанол у мутантів метилотрофних дріжджів із блоками вказаних метаболічних шляхів [Sibirny et al., 1988]. Мішенями для мутаційного порушення були вибрані два ферменти прямого шляху окислення формальдегіду – формальдегід- (ФдДГ) і форміатдегідрогенази (ФДГ) – і фермент циклічно-лінійного шляху окислення цього інтермедіату – дигідроксиацетонсинтазу (ДАС).

Аналіз ростових характеристик мутантного штама H. polymorpha 83 із блоком ФдДГ в умовах безперервного культивування показав, що мутант і вихідний штам дикого типу дають ідентичні виходи біомаси (0,34 г сухої маси на 1 г спожитого метанолу при швидкості розведення D 0,08 год-1) [Sibirny et al., 1990]. Мутація приводила лише до зниження максимальної швидкості розведення культури (0,08 год-1 проти 0,13 год-1 для штама дикого типу) як наслідок поступової акумуляції формальдегіду в культурі мутанта. Отже, незважаючи на генетичний блок реакцій лінійного окислення формальдегіду на формальдегіддегідрогеназній стадії, мутант H. polymorpha 83 зберігає здатність до метилотрофного росту і за умов, запобігаючих нагромадженню токсичного формальдегіду в середовищі понад критичний рівень (безперервне культивування при невисокій швидкості розведення), дає той же вихід біомаси, що й батьківський штам дикого типу.

Для кількісної оцінки інтенсивності потоків формальдегіду через два альтернативні шляхи окислення ми вивчали швидкість виділення міченого 14СО2 із радіоактивного метанолу клітинами мутантних штамів метилотрофних дріжджів, зокрема, штама H. polymorpha 83, дефектного по ФдДГ [Ubiyvovk et al., 1994], у порівнянні зі штамом дикого типу 356 (рис. 1). У попередніх експериментах визначались оптимальні умови культивування клітин і наступної їх інкубації з радіоактивним метанолом у суміші із його “холодним” аналогом для запобігання можливому токсичному впливу нагромаджуваного в культурі мутантного штама вільного формальдегіду.

Як видно із рис. 1, генетичний блок формальдегіддегідрогенази у мутанта H. polymorpha 83 не приводить до гальмування утворення вуглекислого газу, що підтверджує нашу гіпотезу про несуттєвість лінійного шляху окислення в дисиміляційному обміні метанолу. ФдДГ, вірогідно, відіграє більше детоксикаційну, ніж енергетичну роль, запобігаючи нагромадженню формальдегіду в клітині. Такому висновку не суперечать і дані радіоізотопних досліджень, отримані на іншому мутанті з дефектом ФдДГ метилотрофних дріжджів Pichia pastoris Fld-, адже зниження включення мітки в СО2 для цього мутантного штама, порівняно зі штамом дикого типу, не є істотним при врахуванні повного блоку активності ФдДГ у досліджуваного мутанта (рис. 1).

На користь нашої концепції про необлігатний характер лінійного шляху окислення метанолу у метилотрофних дріжджів свідчать також дані по включенню мітки в вуглекислоту та біомасу, отримані для мутанта H. polymorpha 103 з дефектом синтезу глутатіону. Цей мутант має знижену у 7 разів активність -глутамілцистеїнсинтетази, а внутрішньоклітинний пул глутатіону складає у нього лише 0,5% від рівня дикого штама [Убийвовк и др., 1998]. Оскільки глутатіон - обов‘язковий косубстрат формальдегіддегідрогенази метилотрофних дріжджів, то дефект його синтезу мав би блокувати потік утворення СО2 в лінійному шляху окислення метанолу. Проте, як показали радіоізотопні дослідження (рис. 1), сильного зниження включення мітки в вуглекислоту, співрозмірного із зменшенням пулу глутатіону, для цього мутанта не спостерігається. Набагато відчутнішим є зниження включення мітки в ТХО-нерозчинний матеріал мутантного штама - приблизно в 5 разів порівняно із батьківським штамом. Вірогідно, це можна пояснити суттєвою роллю глутатіону у забезпеченні нормального окисно-відновного потенціалу цитозолю та підтриманні в нативному стані багатьох асиміляційних ферментів.

Блок ФДГ у мутанта H. polymorpha 34-19 не приводить до істотного порушення здатності до метилотрофного обміну: криві росту мутантного та батьківського штамів майже не відрізняються ні за тривалістю лаг-періоду, ні за кінетикою в експоненційній фазі росту при різних концентраціях метанолу в середовищі, за винятком виходу біомаси, яка менша для мутантного штама [Sibirny et al., 1990]. Це явище, в рамках нашої гіпотези про необлігатний характер реакцій лінійного окислення метанолу в енергетичному обміні, можна пояснити не так випаданням форміатдегідрогеназної стадії генерування NADH, що постулюється в традиційній гіпотезі, як енергетичними затратами при екструзії клітинами мурашиної кислоти (див. далі), так і токсичним впливом цієї сполуки через протонофорну та комплексуючу здатність мурашиної кислоти. Аналіз внутрішньоклітинного пулу відновленого коферменту NADH у диких і мутантних штамів H. polymorpha показав, що генетичний блок форміатдегідрогенази (як і формальдегіддегідрогенази) не приводить до зниження рівня NADH у відповідних мутантів, що опосередковано теж може свідчити на користь нашої гіпотези.

Як показали радіоізотопні дослідження (рис. 1), на відміну від попередніх мутантів, штам із блоком форміатдегідрогеназної реакції виявляє суттєве зниження включення мітки в вуглекислоту (у 3,8 раза) за майже не зміненого рівня включення мітки в ТХО-нерозчинний матеріал. Такі дані легше пояснити участю в енергозабезпеченні метилотрофного росту прямого шляху окислення метанолу. Проте, навіть за повної відсутності форміатдегідрогеназної активності у безклітинних екстрактах мутанта, у нього зберігається відносно високий рівень включення мітки в СО2, що свідчить про неповне блокування реакцій катаболізму метанолу при вилученні форміатдегідрогеназної ланки. Отже, навіть і в цьому випадку ми можемо трактувати експериментальні дані на користь концепції про, принаймні, співіснування (разом із лінійним шляхом) альтернативної системи окислення метанолу.

Наступним етапом роботи були дослідження включення радіоактивної мітки із 14С-метанолу в вуглекислоту та біомасу у мутанта метилотрофних дріжджів з дефектом ключового фермента асиміляції та, згідно з нашою концепцією, циклічного шляху окислення формальдегіду - дигідроксиацетонсинтази (ДАС). Як видно з рис. 1, блокування даного фермента знижує рівень утворення вуглекислоти із метанолу лише на 16-20 %, проте помітно гальмує включення радіоактивності в ТХО-нерозчинний матеріал клітин. Останній гальмівний вплив можна пояснити важливою роллю ДАС в асиміляційних процесах. Збереження включення мітки в СО2 на рівні 74-80 % при блоку активності ДАС може свідчити про наявність альтернативного, не ідентифікованого досі фермента, здатного замінювати ДАС як в асиміляційному, так і дисиміляційному метаболізмі метанолу. Для метилотрофних дріжджів відсутні дані про кількість генів, які кодують різні форми транскетолаз, проте для мутанта H. polymorpha з дефектом дигідроксиацетонсинтази показано, що при втраті здатності засвоювати метанол як єдине джерело вуглецю та енергії клітини зберігають здатність утилізувати метанол із суміші з ксилозою. Втрачений фермент, можливо, функціонально комплементується цитозольною “класичною” формою транскетолази [Koning de et al., 1990a]. З іншого боку, отримані нами експериментальні дані можна пояснити функціонуванням у клітин двох шляхів дисиміляції метанолу, і введені мутації лише приводять до перерозподілу потоків окислення формальдегіду.

Третій методичний прийом для з’ясування ролі лінійного і циклічно-лінійного шляхів в енергетичному обміні метанолу полягав у застосуванні “холодних” аналогів інтермедіатів досліджуваних шляхів та вивченні їх впливу на включення мітки в вуглекислоту. Існування конкуренції між “холодним” аналогом і міченим інтермедіатом за включення певного ізотопу в кінцевий продукт може свідчити про участь у синтезі досліджуваного продукту того метаболічного шляху, інтермедіатом якого є використовуваний аналог. Нами вивчено вплив нерадіоактивного цитрату (інтермедіат циклу трикарбонових кислот), дигідроксиацетону (інтермедіат ксилулозомонофосфатного шляху обміну формальдегіду) на виділення міченого вуглекислого газу із 14С-метанолу клітинами дикого типу метилотрофних дріжджів H. polymorpha [Сибирный и Гончар, 1990].

Встановлено, що додавання дигідроксиацетону і цитрату до клітин, інкубованих із 14С-метанолом, приводить до істотного розведення мітки в СО2 (рис. 2), що свідчить про залучення цих метаболітів у дисимілятивний шлях обміну метанолу і, отже, є доказом суттєвої ролі реакцій ксилулозомонофосфатного циклу і ЦТК в енергетичному обміні метилотрофних дріжджів [Sibirny et al., 1988; 1990].

Підсумовуючи описані вище експериментальні факти, можна сказати, що практично всі застосовані нами методичні підходи у дослідженні ролі циклічного і лінійного шляхів окислення метанолу в енергетичному обміні метилотрофних дріжджів підтвердили участь циклічних ланок окислення метанолу (ксилулозомонофосфатного циклу та ЦТК) в енергетичному забезпеченні метилотрофного росту. Оскільки в ряді випадків (зокрема, аналізуючи дані радіоізотопних досліджень мутантів із дефектом по форміатдегідрогеназі і дигідроксиацетонсинтазі) ми не можемо постулювати виняткової ролі в дисиміляційному обміні метанолу саме циклічного шляху окислення, тобто повністю виключити аналогічну роль і реакцій лінійного (прямого) окислення метанолу, ми припускаємо існування гнучкої системи двох основних потоків дисиміляції формальдегіду - через циклічно-послідовні реакції та через лінійний шлях окислення. В умовах усталеного експоненційного метилотрофного росту перший може відігравати основну роль в енергетичному обміні при підпорядкованій ролі другого шляху в детоксикаційних процесах. За умов метанольно-формальдегідного стресу, коли детоксикація стає основним завданням метаболічних процесів в клітині, в дисиміляції формальдегіду провідну роль дістає лінійний (прямий) шлях окислення при меншій ролі реакцій циклічного шляху дисиміляції цього інтермедіату як кінетично менш вигідного. Існує, можливо, регуляторна система переключення потоків дисиміляції метанолу на той чи інший шлях, в залежності від поточних потреб клітин.

Ми провели порівняльний теоретичний аналіз енергетичної ефективності лінійного (прямого) та циклічного шляхів дисиміляції метанолу [Sibirny et al., 1990]. Розрахунок проводили за балансом кількості молів АТР, утворюваних при повній дисиміляції метанолу згідно з двома постульованими шляхами окислення метанолу, та використовуваних в асимілятивних реакціях для синтезу клітинного тіла. При цьому сумарний склад клітинних компонентів виражали умовною формулою C4H7O2N0,6 [Harder & van Dijken, 1975]; ключовими метаболітами, через які здійснюється розгалуження на дисимілятивні та асимілятивні вуглецеві потоки, були прийняті формальдегід та гліцеральдегід-3-фосфат (GAP); вихід біомаси за АТР, тобто маса клітин (в г), утворюваних із GAP на 1 моль затраченої ATP, був прийнятий рівним 11,0 [Harder et al., 1981]. Проведений аналіз показав більшу енергетичну ефективність циклічного шляху дисиміляції метанолу: останній, порівняно із лінійним дисимілятивним шляхом, має вищі показники як коефіцієнта вуглецевої конверсії (0,62 проти 0,55), так і максимального виходу біомаси (0,48 проти 0,43 г клітин/г метанолу).

Слід відмітити, що розроблена нами концепція про дисимілятивний обмін метанолу у метилотрофних дріжджів отримала ряд незалежних підтверджень в роботах німецьких, американських та японських дослідників. Так, Маркуске та ін. [Markuske et al., 1990] підтвердили функціонування ЦТК у клітин дріжджів, вирощених як метилотрофно, так і на суміші глюкози з метанолом, показавши включення мітки в СО2 із 14С-ацетату. Джоунс і Белліон [Jones & Bellion, 1991] за допомогою методу 13С-ЯМР показали на клітинах дріжджів H. polymorpha, інкубованих із 13С-метанолом, що мічений форміат появляється серед клітинних метаболітів тільки за екстремальних умов в середовищі (наприклад, при високій концентрації метанолу) і практично відсутній при нормальному метилотрофному рості, і зробили висновок, що лінійний шлях окислення не є основним потоком в окисленні метанолу, а його основною функцією може бути детоксикація формальдегіду. Зовсім недавні дослідження по клонуванню структурного гена форміатдегідрогенази FDH1 у метилотрофних дріжджів C. boidinii і конструюванню делеційного мутанта fdh1 показали, що цей мутант здатний засвоювати метанол, проте ріст його сповільнюється нагромаджуваним у середовищі форміатом [Sakai et al., 1997]. На підставі цього автори зробили висновок про переважно детоксикаційну роль форміатдегідрогенази в метилотрофному обміні.

На завершення доцільно відмітити, що наша концепція про принаймні двоваріантний характер дисиміляції метанолу у дріжджів узгоджується із загальною теорією про надлишковий характер у функціонуванні і регуляції біологічних систем [Fraenkel, 1992]. Можливо, саме тому поширений так званий “редукціоністський” методичний підхід, який полягає в оцінці важливості того чи іншого елемента в системі за наслідком його вилучення (виключення), при аналізі метаболізму має свої обмеження. Цим, у сумарному підсумку, можна пояснити неоднозначність впливу введених нами мутацій на характер метаболізму метанолу у мутантних штамів. І якщо багато суджень в генетиці та молекулярній біології залежить від відповіді типу “так/ні” (інактивований ген, точкові заміни, індукція або репресія), то в метаболізмі, на жаль, ключові методичні підходи дають скоріше кількісні, ніж однозначно альтернативні висновки [Fraenkel, 1992].

Вивчення альтернативних шляхів детоксикації ПЕроксиду водню у метилотрофних дріжджів

Для з’ясування ролі в метилотрофному метаболізмі дріжджів деяких альтернативних каталазі детоксикаційних систем, зокрема, цитохром с пероксидази і глутатіонпероксидази, використано принципи генетичного конструювання штамів метилотрофних дріжджів із генетичним порушенням каталазного шляху розщеплення пероксиду водню із наступним аналізом фізіологічних та біохімічних наслідків таких змін.

Модельним об’єктом послужив сконструйований нами мутантний штам H. polymorpha К-105 (gcr1 catX) із повною відсутністю каталазної активності та конститутивним синтезом алкогольоксидази на глюкозному середовищі [Gonchar et al., 1990a]. Мутантні клітини ростуть на суміші глюкози з метанолом після тривалого лаг-періоду, необхідного для адаптації клітин до пероксиду водню, що генерується в культурі, проте не здатні засвоювати метанол як єдине джерело вуглецю та енергії. Вперше були отримані супресорні штами Mth+ gcr1 catX scd1, здатні засвоювати метанол при збереженні каталазного дефекту (scd означає suppressor of catalase defect). Такі клітини не продукують навіть слідів пероксиду водню при рості на метанолі, проте дають менший вихід біомаси (приблизно на 30 %) порівняно із вихідним батьківським штамом 33 (рис. 3). Ці дані свідчать, що каталаза не є облігатною для забезпечення метилотрофного росту і може бути замінена іншою ферментною системою детоксикації пероксидних сполук.

Ферментний аналіз виявив, що відновлення метилотрофного росту Mth+-ревертантів тісно корелює із суттєвим (у 3-4 рази) збільшенням активності цитохром с пероксидази (СсР), яка може відновлювати пероксид водню за рівнянням:

2 cyt c (Fe2+) + H2O2 + 2 H+ = 2 cyt c (Fe3+) + 2 H2O

відновлений окислений

Окислення цитохрому с пероксидом водню повинно супроводжуватись вилученням електронів із третьої ланки дихального ланцюга, зменшуючи ефективність окисного фосфорилювання і знижуючи тим самим вихід АТР під час росту мутантів на метанолі. Це мало б приводити до зменшення виходу біомаси на цьому ростовому субстраті, що і спостерігається експериментально.

Теоретичний розрахунок можливого впливу на вихід біомаси заміни каталазної реакції детоксикації пероксиду водню на цитохром с пероксидазну показав [Гончар, 2000], що за циклічно-лінійного шляху дисиміляції метанолу зниження виходу біомаси не перевищує 19 % (проти 26 % у випадку лінійного шляху). Експериментально спостережуване зниження виходу біомаси при рості ревертантів на метанолі (приблизно на 30 %) дещо є більшим, ніж теоретично очікуване. Можливо, це свідчить про те, що заміна каталази на СсР не є повноцінною і супроводжується більш істотними енергетичними втратами, ніж просто випаданням третьої ланки окисного фосфорилювання.

Оскільки у Mth+-супресорних безкаталазних штамів спостерігається підвищений рівень синтезу СсР і цитохрому с, вони послужили джерелом для препаративного виділення цих гемопротеїнів у високоочищеному стані [Gonchar et al., 1997; Borsari et al., 2000]. Нами вперше проведено детальну фізико-хімічну характеристику цитохрому с із метилотрофних дріжджів (табл. 2). На рис. 4 зображено 1Н-ЯМР-спектри цього гемопротеїну в окисленому стані при різних значеннях рН. Порівняння цих спектрів із спектрами інших цитохромів с дозволило зробити висновок про низькоспіновий стан заліза у ферицитохромі с H. polymorpha, консервативність гемового оточення, а також виявити різкий структурний перехід у лужній області рН, який супроводжується заміною 6-ого аксіального ліганда – залишку метіоніну – на інший амінокислотний залишок білка, найвірогідніше, лізину. Слід відмітити порівняно високе значення редокс-потенціалу сyt c H. polymorpha – 302 мВ (для білка S. cerevisiae він складає 275 мВ [Barker & Mauk, 1992], а для сyt c тварин - 260 10 мВ [Mathews, 1985]). Це пояснює високу стабільність відновленої форми виділеного білка і, можливо, має фізіологічне значення.

Виділений препарат цитохром с пероксидази метилотрофних дріжджів охарактеризовано спектрально і електрофоретично. Молекулярна маса білка, визначена за умов електрофорезу в присутності додецилсульфату натрію, складає 374 кДа. рН-Оптимум дії фермента в реакції з цитохромом с спостерігається в діапазоні рН 6,0-6,5. Фермент, порівняно із аналогічним білком із пекарських дріжджів, має вищу у 20 разів питому активність – до 1060 мкмольхв-1мг-1.

Уперше показано наявність у клітин метилотрофних дріжджів активності глутатіонпероксидази, яка, можливо, теж залучена в систему клітинного захисту від пероксидного стресу при метилотрофному рості.

Аналіз останніх даних літератури показує, що клітинні системи захисту від пероксидного хімічного стресу є надзвичайно складними і включають багато компонентів. Так, наприклад, для пекарських дріжджів на підставі аналізу змін у профілі експресії генів при адаптаційній відповіді клітин на присутність пероксиду водню запропоновано концепцію про існування “Н2О2-стимулону”, який включає по меншій мірі 115 білкових продуктів [Godon et al., 1998]. Отже, необхідні подальші дослідження по ідентифікації нових (альтернативних чи доповнюючих) компонентів системи детоксикації пероксидних сполук