НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Галатюк Олександр Євстафійович

УДК 619:616-07:616-084.636.1.13

ІНФЕКЦІЙНА АНЕМІЯ ТА РИНОПНЕВМОНІЯ КОНЕЙ

/ теоретичне та експериментальне обгрунтування засобів діагностики і профілактики /

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті епізоотології Української академії аграрних наук

Науковий консультант - доктор ветеринарних наук, професор Скибіцький Володимир Гурійович, Національний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології і вірусології

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН

Фукс Поліна Павлівна, Інститут експериментальної

і клінічної ветеринарної медицини УААН, директор;

доктор ветеринарних наук Прискока Віктор Андрійо-

вич, Державний науково-контрольний інститут

біотехнології і штамів мікроорганізмів, директор;

доктор ветеринарних наук, професор, дійсний член

Нью-йоркської академії наук Рухляда Валентин

Васильович, Білоцерківський державний аграрний

університет, завідувач кафедри вірусології,

мікробіології та зоології.

Провідна установа: Одеський сільськогосподарський інститут Мінагрополітики України, кафедра мікробіології і вірусології.

Захист відбудеться “ 27 “ вересня 2000 р. о _10__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 004. 03 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету за адресою: 03041, Київ - 41, вул. Героїв оборони, 11, навчальний корпус 10.

Автореферат розісланий “ 22 “ _серпня______ 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої

вченої ради Бортнічук В.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність. Однією з важливих галузей тваринництва агропромислового комплексу України є конярство. Його значення особливо зросло в останні роки у зв’язку з суттєвими змінами у сільському господарстві держави. Розвиток фермерських, орендних, колективних господарств при дороговизні пального і мастил потребує більш дешевої тяглової сили, якою традиційно є коні. Крім того, коней використовують як донорів для біологічної промисловості і як додаткове джерело мяса та молока. Продукт молока кобил - кумис - цінний препарат, який використовує людина при багатьох захворюваннях (туберкульоз і ін.).

Успішне ведення конярства неможливе без якісного ветеринарного забезпечення галузі. В Україні реєструються захворювання коней на інфекційну анемію, ринопневмонію, грип, лептоспіроз, правець, сказ, піроплазмоз, стронгілоїдоз, параскаридоз, стронгілідози, парафіляріоз (В.А. Бусол та ін., 1994).

Однією із серйозних проблем у конярстві є інфекційна анемія (ІНАН) коней, яка реєструється в багатьох країнах світу: США, Китаї, Бразилії, державах південно-східної Азії. Питання патогенезу, діагностики та профілактики ІНАН вивчались багатьма дослідниками (В.Ф. Поляков, 1957; В.Є. Садіков, 1970; К.П. Юров 1969, 1984, 1997; Ф.М. Орлов, 1976; Б.І. Токарик 1977, 1984; Kobayshі R., 1967; Naseka H.D., 1980; Charles J. Іnssel and al., 1988; Mіzanda O., 1989 та ін.). Проте вивчені аспекти цієї проблеми, що стосуються, зокрема, імунітету та інфекційного процесу, особливо при хронічному і латентному перебігу хвороби, досліджені недостатньо. Суттєвого поліпшення потребують також методи індикації та ідентифікації збудника, ретроспективної діагностики хвороби.

Іншою актуальною хворобою для галузі конярства України є ринопневмонія коней (вірусний аборт, герпесвірусна інфекція коней 1), яка дуже поширена у племінних конегосподарствах і завдає значних економічних збитків внаслідок абортів у кобил та ураження верхніх дихальних шляхів (М.К. Олійник, 1956; К. П. Юров, М.Н. Крюков, 1969; К. П. Юров, 1984; E. Doll, 1952; K. Petzold, 1972). Для діагностики і профілактики хвороби запропоновані сучасні методи, які дають можливість значною мірою здійснювати їх контроль. Проте проблема вирішена не повністю - спалахи хвороби реєструються досить часто (М.Н. Крюков, 1970; К. П. Юров, 1984; І. Mumford, 1994).

За попередніми нашими спостереженнями, на деяких кінних заводах України має місце прихований перебіг ринопневмонії з лептоспірозом та стронгілідозами. Сумісний перебіг ринопневмонії з лептоспірозом і стронгілідозами характеризується різноманітним проявом: від безсимптомного до клінічного - абортами, ураженням респіраторного тракту, нервової системи, масовими перегулами у кобил, зниженням статевої потенції у жеребців-плідників. Прихований перебіг ринопневмонії сумісно з гельмінтозами і лептоспірозом гальмує селекційно-племінну роботу, оскільки виникають труднощі в одержанні приплоду від високоелітних жеребців-плідників та кобил. Згадана патологія досить часто виникає на фоні недостатнього рівня неспецифічної резистентності, проте ряд її аспектів у коней різних вітчизняних порід не вивчався.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом завдань:

-“Вивчити структуру інфекційних хвороб коней в Україні, розробити сучасні методи діагностики і профілактики інфекційної анемії коней” (1991-1995рр., № держ. реєстрації УАО 1009818 Р) відповідно до проекту № 14 ”Ветеринарне забезпечення” програми Української академії аграрних наук.

-”Вивчити епізоотичну ситуацію в племінних кінних господарствах, розробити методи контролю інфекційної анемії та ринопневмонії” (1996-2000рр., № держ. реєстрації УАО 0196V024150) відповідно до програми Української академії аграрних наук ”Система захисту сільськогосподарських тварин від захворювань та створення нових лікувально-профілактичних засобів”.

-”Розробка комплексної програми діагностики та оздоровлення племінних коней від заразних захворювань” (№ державної реєстрації УАО 0197V018313) відповідно до конкурсного проекту з Міністерством України у справах науки і технологій.

Робота виконувалась також згідно з творчими договорами з лабораторією діагностичних препаратів Всеросійського НД і Технологічного інституту біологічної промисловості (Росія, м. Щолково) та кафедрою мікробіології і вірусології Варшавського аграрного університету (Польща, м. Варшава).

Мета і завдання дослідження. Основною метою дисертаційної роботи була розробка теоретичних основ і експериментальне обгрунтування засобів діагностики та профілактики ІНАН і ринопневмонії коней.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі наукові завдання:

-

-

- здійснити експерименти з моделювання інфекційного процесу, зумовленого

вірусом ІНАН на тваринах;

-

-

-

-

- вивчити розвиток епізоотичного процесу при ринопневмонії;

- запропонувати систему профілактики та боротьби з ІНАН і ринопневмонією коней.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведений епізоотологічний аналіз масових хвороб коней на території України, встановлено закономірності виникнення та розповсюдження ІНАН і ринопневмонії в різних регіонах держави. Встановлені закономірності імунних реакцій організму при латентному перебігу ІНАН - зміни в білкових фракціях сироватки крові і титрів специфічних антитіл, що дало можливість обгрунтувати ці показники як тести на виявлення патологічних змін в організмі. Отримано позитивне рішення 06.05.2000р. про видачу патенту на винахід ”Спосіб діагностики коней з наявністю патоморфологічних змін при інфекційній анемії” відповідно пріоритетної довідки № 99105818 від 26.10.1999р. Держпатенту України. В експериментах на домашніх та лабораторних тваринах виявлена можливість використання кролів для індикації вірусу інфекційної анемії, а також вивчення аспектів патогенезу ретровірусної інфекції.

Розроблено методики отримання первинних та субкультур нирок і шкіри ембріона кобили та культивування штаму ”3-К ВНИиТИБП-ВИЭВ” і виготовлення преципітуючого антигену. Штам ”3-К ВНИиТИБП-ВИЭВ” задепоновано у Всеросійському державному НД інституті контролю, стандартизації і сертифікації ветеринарних препаратів - довідка № 1173/24 від 27.08.1999 року. Отримано патент № 2196150 від 15.09. 1999 р. ”Спосіб виготовлення культурального антигену із вірусу ІНАН і набір для індикації антитіл або антигену вірусу ІНАН ” - ВНДІДПЕ Російської федерації. Виявлена можливість культивування штаму ”3-К ВНИиТИБП-ВИЭВ” і отримання антигену при використанні перещеплюваної культури фібробластів шкіри коня.

Встановлено, що епізоотичний процес при ІНАН характеризується повільним розвитком з наявністю стадій передепізоотичної, розвитку епізоотії, яка протікає роками, а також максимального підйому. Без проведення ефективних оздоровчих заходів при ІНАН не спостерігається згасання епізоотії, постепізоотичної і міжепізоотичної стадій.

Експериментально доведено, що для серологічної діагностики ринопневмонії, крім РГГА, можна використовувати РА з антигеном інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) великої рогатої худоби (ВРХ) (ТУ У 46.15.28-97 “Набір антигену і сироваток для діагностики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби”, затверджені Головним управлінням ветеринарної медицини Міністерства АПК України - 25.02. 1997р.). У коней, які позитивно реагують в ланцюговій полімеразній реакції, виявлено герпесвірус коней 1 (ГВК 1) в лімфоцитах крові та встановлено наявність вторинного імунодефіциту.

Вперше розроблено шкалу оцінки імунобіологічної реактивності різних порід вітчизняних коней та встановлено, що незбалансована годівля, висока інтенсивність інвазії гельмінтами, прогресування лептоспірозного процесу та умовно-патогенної мікрофлори (Bacterіa dendrіtіcum), сприяють активізації клінічного прояву ринопневмонії. Розроблено диференційну діагностику нервової форми ринопневмонії та інших хвороб, що супроводжуються ураженням центральної нервової системи. Удосконалено спосіб лікування тварин з ураженням респіраторного тракту, отримано позитивне рішення 10.03.2000р. про видачу патенту на винахід ”Препарат СЕГП для лікування і профілактики респіраторних хвороб коней” відповідно пріоритетної довідки № 99105817 від 26.10.1999 р. Держпатенту України.

Виявлено, що епізоотичний процес при змішаному перебігу ринопневмонії з лептоспірозом і стронгілідозами характеризується класичним сезонним розвитком епізоотії з наявністю 6 стадій розвитку - міжепізоотичної (грудень - січень), передепізоотичної (лютий), стадії розвитку (березень - квітень), максимального підйому епізоотії (травень - червень), стадії згасання (липень - вересень) і постепізоотичної (жовтень - листопад).

Запропоновано концепцію розвитку епізоотичного процесу при латентній формі інфекційної анемії коней та змішаному перебігу ринопневмонії з стронгілідозами і лептоспірозом.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати досліджень доповнюють теоретичне уявлення щодо саморегуляції паразитарних систем, розкривають особливості цього явища в сфері патогенів-збудників заразних хвороб у коней. В результаті вивчення епізоотичної ситуації створені карти розповсюдження заразних хвороб коней в Україні. Розроблена система комплексних клініко-гематологічних, біохімічних, серологічних, копрологічних досліджень забезпечує профілактику абортів, масових перегулів, зниження статевої потенції у жеребців - плідників, респіраторних хвороб у молодняку, високу запліднюваність кобил.

Впровадження високоефективного водорозчинного вітамінного препарату АДзЕ - ”Інсолвіт ” дозволило знизити втрати при гострих спалахах вірусного аборту у кобил, масових перегулах, респіраторній формі у молодняку, зниженні статевої потенції у жеребців - плідників. Настанова щодо застосування затверджена 27.07.98 р. № 15 - 14 / 177 Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства АПК України.

Вивчена епізоотична ситуація, розроблені та впроваджені в практику ветеринарної медицини засоби та методи діагностики і профілактики (препарати ”СЕГП ” і ”Сироватка крові кобил реконвалісцентів”, ”Інструкція про заходи з профілактики та боротьби з інфекційною анемією коней”, ”Методичні вказівки з лабораторної діагностики інфекційною анемії коней“, ”Набір компонентів для серологічної діагностики інфекційної анемії коней у реакції дифузної преципітації (РДП)”, методичні рекомендації ”Оцінка імунного статусу коней в нормі і за прихованого перебігу інфекційної анемії ”.) дозволили створити основи моніторингу найбільш актуальних для України інфекційних хвороб коней, запропонувати ”Програму забезпечення епізоотичного благополуччя галузі конярства“, яка затверджена ІІ.05.2000р. №15-1-1-4/468 Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства агрополітики України.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок дисертанта полягає у повністю самостійній організації та виконанні всього обсягу науково-методичної та експериментальної роботи. Частина досліджень проведена спільно з кандидатом біологічних наук Б.І. Токариком (одержання культурального антигену для РДП); професором-асистентом М. Банбурою (діагностика ринопневмонії за допомогою полімеразної ланцюгової реакції); доктором ветеринарних наук, професором В.М. Івченком (ідентифікація мікроорганізму - Bacterіa dendrіtіcum); кандидатом ветеринарних наук В.А. Кісельовим і доктором біологічних наук Г.М. Двойносом (гельмінтологічні дослідження); кандидатом біологічних наук П.Є. Андрійчуком (визначення рівнів вітамінів А, Е у сироватці крові коней та розробка настанови щодо застосування ”Інсолвіту“); кандидатом ветнаук П.Ю.Кривошиєю (визначення вмісту Т-, В-лімфоцитів, теофілінчутливих і теофілінрезистентних Т-клітин, рівня імунних комплексів, показників фагоцитозу, віт.С при ІНАН), кандидатом біологічних наук Л.П. Горальським, старшим науковим співробітником Л. П. Камінською (гістологічні дослідження).х

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на ІІІ Всесоюзній конференції з епізоотології (Новосибірськ, 1991), ІY Міждержавній науковій конференції з теоретичних і прикладних проблем паразитології (Луганськ, 1993), ХІ конференції Українського товариства паразитологів (Київ, 1993), Республіканській науково-практичній конференції ”Проблеми підвищення продуктивності тварин та ефективності їх лікування ” (Дніпропетровськ, 1994), Міжнародній науково-виробничій конференції ”Современные успехи в борьбе и профилактике лейкоза крупного рогатого скота ” (Кишинів, 1994), науково-практичній конференції ”Збереженість молодняку с/г тварин - запорука розвитку тваринництва України” (Б. Церква, 1994), науково-практичній конференції ”Неінфекційна патологія тварин ”(Б. Церква, 1995), Міжнародній науковій конференції ”Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы ”

хАвтор висловлює глибоку вдячність названим вище науковцям.

(Харків, 1995), ІІ Міжнародній конференції ”Молекулярно - генетические маркеры животных ” (Київ, 1996), першій Всеукраїнській науково - виробничій конференції ветеринарних патологів ”Актуальні питання ветеринарної патології ” (Київ, 1996), науково-практичній конференції ”Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми ”(Харків, 1997), Y Міжз’їздівській конференції паразитоцинологів України (Луганськ, 1997), конференції ”Наукова спадщина Луї Пастера і ветеринарна медицина України” (Рівне, 1998), ІІ Міжнародній науково-практичній конференції ”Проблеми неінфекційної патології тварин” (Б. Церква, 1998), науково - практичному семінарі - навчанні державних інспекторів ветеринарної медицини - начальників управлінь державної ветеринарної медицини Автономної Республіки Крим, областей, міст Києва та Севастополя (Київ, 1999), на Міжнародному навчально-практичному семінарі ”Проблемы ветеринарии в коневодстве ” (Київ, 1999) та на засіданнях вченої ради і методичних комісіях ІЕКВМ УААН (Харків, 1991 - 1999 рр.), Інституту епізоотології УААН (Рівне, 1995 - 1999).

Публікації. Результати експериментальних досліджень опубліковані у 64 друкованих роботах, у тому числі монографії ”Імуноморфофункціональні зміни при ретровірусних інфекціях (лейкоз великої рогатої худоби, інфекційна анемія коней)”, одиному патенті на винахід, 26 наукових статтях у фахових виданнях ”Ветеринарна медицина України”, ”Тваринництво України”, ”Вісник аграрної науки”, Київ; ”Вісник Білоцерківського державного аграрного університету”, Біла Церква; “Ветеринарна медицина” ІЕКВМ, Харків; “Вісник Полтавського державного сільськогосподарського інституту”, Полтава; “Ветеринария”, Москва; в матеріалах тез міжнародних та державних конференцій з ветеринарної медицини, в одній методичній рекомендації.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 317 сторінках машинописного тексту, який включає 56 таблиць і 38 рисунків (фотографії, схеми, діаграми, графіки). Вона складається з вступу, шести розділів, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури, який містить 651 джерело, в тому числі 406 робіт іноземних авторів, і додатків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Вибір напрямків досліджень, матеріал та методи виконання роботи

Робота виконувалась в Інституті епізоотології УААН. Епізоотичну ситуацію та показники прояву епізоотичного процесу вивчали, використовуючи епізоотологічний метод досліджень (С.І. Джупина 1991; С.І. Джупина, А.А. Колосова 1991). При аналізі епізоотичної ситуації в Україні використовувалась звітна документація Державного департаменту ветеринарної медицини, Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини Міністерства агрополітики України, Рівненської, Волинської, Житомирської обласних лабораторій ветеринарної медицини, кінних заводів, лабораторії хвороб коней Інституту епізоотології УААН.

Особливості розвитку епізоотичного процесу за ІНАН вивчались на базі трьох господарств протягом 2,5 - 5 років, а ринопневмонії на базі двох кінних заводів протягом 5 років. Для досліджень використовували проби крові, сироватки, а також патолого-анатомічний матеріал, відібраний від експериментальних та контрольних тварин. Експерименти в пошуках використання сільськогосподарських і лабораторних тварин для моделювання інфекційного процесу, зумовленого вірусом ІНАН, поставлені на 7 телятах, 10 кролях, 6 вівцях, 12 свинях, 10 курях, 12 морських свинках. Лабораторними методами досліджено 3929 голів коней. При вивченні ІНАН експериментальні дослідження проводились на 363 конях.

Гематологічні дослідження (визначення кількості еритроцитів, гемоглобіну, гематокриту, лейкоцитів, виведення лейкоформули) виконувались за загальноприйнятими методами (В.В. Чумаченко, 1990). Постановку РДП з врахуванням титрів специфічних антитіл проводили згідно з ”Тимчасовими методичними вказівками з лабораторної діагностики інфекційної анемії коней”, затвердженими ГУВ МСГ СРСР 25 березня 1983 року № 115 - 62.

Визначення загального білка, альбумінів, альфа-, бета-, гамаглобулінів проводили за методикою В.В. Чумаченка і співавт. (1990). Рівень гуморальних чинників - титр гетерогемаглютининів виявляли за методикою Шиффа в нашій модифікації, а ізоантитіл - за В.О. Бусолом і співавт. (1996). Лізоцимну активність сироватки визначали за методикою П.Н. Смірнова і співавт. (1989), рівня вітаміну С - за Г.А. Красніковим і спів. (1985), кількості імунних комплексів- за Ю.А. Греневичем і спів. (1986). Кількість Т- і В-лімфоцитів у кpові визначали за феноменом pозеткоутвоpення. Постановку реакції і визначення Т- і В- лімфоцитів, теофілінчутливих і теофілірезистентних Т-лімфоцитів здійснювали за методикою Е.Ф. Чернушенко і співав. (1988).

Вакцинний штам СВ/69 культивували на культурі клітин нирки або трахеї теляти і після титрування використовували як антиген для постановки реакції гальмування гемаглютинації (РГГА). Лабораторні дослідження на ринопневмонію проводились згідно з ”Методичними вказівками з лабораторної діагностики ринопневмонії ”, затвердженими ГУВ МСГ СРСР 27 серпня 1980 р., а на лептоспіроз - відповідності до ”Методичних вказівок з лабораторної діагностики лептоспірозу тварин”, затверджених ГУВ МСГ СРСР 15 жовтня 1985 року. Гельмінтокопрологічні дослідження проводились за методом Фюлєборна (Н.В.Демидов, 1987). Вміст рівнів вітамінів А, Е у сироватці визначали згідно з методичними рекомендаціями С. М. Паєнка та співавторів (1978), малонового диальдегіду - за І. В. Владіміровим і О. І. Арчаковим (1972), рівнів кальцію і фосфору - калориметрично, рівнів імуноглобулінів - за допомогою 18го розчину сульфіту натрію. Визначення параметрів фізіологічної норми у коней проводили відповідно до розробленої нами шкали оцінки. Бактеріологічні дослідження виконувались загальними методами (Н.В. Коротченко і співав., 1987).

Для отримання культури клітин з ембріонів було відібрано і забито 11 жеребних кобил. Первинно-трипсинізовані культури з органів і тканин ембріонів 3 - 11- місячного віку одержували за В.М. Сюриним і співавт. (1991). Вирощування клітинних культур проводили в культуральних матрацах об’ємом 50, 100, 250, 500, 1500 см3 при температурі 37,5С. Субкультури одержували шляхом пересівів клітин через 3-10 днів в міру формування моношару. Моношар знімали розчином версену з трипсином у співвідношенні 3:1. Кріоконсервування клітин здійснювали згідно з рекомендацій В.С. Білоконя і співавт. (1990). Життєздатність клітин визначали з допомогою фарбування 0,2%-ним розчином трипанового синього. Морфологічний контроль проводили шляхом щодобового розгляду культур візуально під мікроскопом. Для зараження культур клітин використовували штам ”З-К ВНИИТиБП - ВИЭВ ” вірусу ІНАН. Наявність вірусу в культуральній рідині визначали в реакції гемаглютинації (РГА) з еритроцитами коня. Преципітуючий антиген у змивах інфікованих культур виявляли в РДП після обробки їх ефіром. Концентрацію вірусу і отримання антигену проводили за Б.І. Токариком (1977), Б.І. Токариком і співавт. (1984). Як позитивний контроль використовували набір антигену і антисироватки для діагностики ІНАН в РДП виробництва Щолківського біокомбінату (Росія). Активність антигену в зливах визначали з допомогою контрольної позитивної сироватки, а якісно- в РДП з допомогою стандартної тест - системи антиген - антисироватка і оцінювали за чотирибальною системою: +- низька; ++ -задовільна; +++- середня; ++++- висока.

Результати досліджень опрацьовували методами варіаційної статистики за Р.Ф. Сосовим і співавт (1974). При математичному опрацюванні результатів досліджень використовували ЕОМ і застосовували комп’ютерні програми статистичної обробки Mіcrosoft Exсel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Епізоотична ситуація в конегосподарствах України

Вивчення епізоотичної ситуації в товарних господарствах щодо інфекційних хвороб коней (1986-1999р.р.) дозволило створити карту їх поширення в Україні. Встановлено, що найбільш розповсюдженими і проблемними захворюваннями коней є ІНАН, ринопневмонія, грип, мит, правець, інфекційний енцефаломієліт. З них найчастіше трапляється ІНАН, яка з 1986 року реєструється в 15 областях України. В 1986-1988 роках захворюваність у зоні Полісся становила 4,10-7,08, Лісостепу - 0,64-1,5, Степу - 0,11-0,41%, а в 1998-1999рр. в зоні Полісся - 3,13, Лісостепу - 0,73 і Степу 0%. Виявлено деяке зменшення інфікованості коней (з 2,70 % у 1986 р. до 1,39-0,70% у 1998-1999рр. Рис.1). В 1986-1991 роках в РДП досліджували від 30 000 до 60 000 коней. З 1992 року кількість серологічних досліджень різко знизилась. В 1994-1996 роках в РДП було досліджено 21 565-18 256 голів, в 1997-1998 - 14 390-11 932, а в 1999 році лише 7841. Це повязано з недостатньою кількістю діагностикуму та обсягом коштів, виділених на його придбання. Найбільший відсоток захворюваності відмічався у Волинській, Житомирській і Сумській областях. Окремі випадки захворювання спостерігались у Херсонській, Харківській, Вінницькій, Дніпропетровській областях. Вивчення закономірностей розповсюдження ІНАН на території Рівненської, Житомирської, Волинської, Хмельницької областей дало можливість встановити, що суттєве зниження поголів’я коней і проведення масштабних заходів в 1950-1970 рр. сприяло ліквідації ІНАН, яка протікала в надгострій, гострій, підгострій формах. Ігнорування факту, що інфекційна

Рис.1 - Результати серологічних досліджень конепоголів’я на ІНАН ( в РДП)

анемія - стаціонарно-вогнищеве захворювання та відсутність на той час надійних методів ранньої серологічної діагностики призвело до того, що в багатьох неблагополучних господарствах залишились не виявленими коні з хронічною або латентною формою хвороби. Останнє зумовило створення стаціонарних епізоотичних вогнищ ІНАН в господарствах, розташованих у болотисто-лісистій місцевості. Встановлено, що хвороба при виникненні в господарстві, реєструється постійно і характеризується поступовим поширенням у регіоні.

Результати вивчення епізоотичної ситуації в племінних кінних господарствах дозволили створити карту поширення заразних хвороб (Рис. ). З неї видно, що основний племінний генофонд розміщений у 83 господарствах, де в кожному утримується від 20 і більше племінних кобил. У всіх племінних конегосподарствах спостерігаються такі паразитарні хвороби, як стронгілоїдоз, стронгілідози, параскаридоз, оксиуроз, гастрофільоз. У кінних заводах періодично з інтервалом 3-5 років відмічається клінічний прояв ринопневмонії у формі абортів на 8-11-ому місяцях жеребності. Встановлено, що серопозитивність в РГГА на ринопневмонію у 8 кінних заводах становить від 58 до 100%. Виявлена висока інфікованість верхових (45-80%) і рисистих (76,5%) коней порівняно з ваговозною (28%) породою і аборигенними кіньми (6,3%).

Рисунок 2 - Карта-схема епізоотичної ситуації щодо заразних хвороб коней

в племінних господарствах

Таким чином, аналіз отриманих даних свідчить про нерівномірне поширення ІНАН на території України. Найбільш неблагополучні зони - Полісся та Лісостеп, де зареєстровані стаціонарні вогнища хвороби. В зоні Степу ІНАН не реєструється. Поширенню хвороби сприяють перш за все тварини - вірусоносії з латентним чи хронічним перебігом хвороби, несвоєчасне проведення діагностичних досліджень та профілактичних заходів. Ринопневмонія дуже поширена в кінних заводах України, і становить проблему для ведення племінного конярства.

Діагностика і заходи боротьби з ІНАН коней

Розробка технологій культивування штаму “З-К ВНИиТИБП” вірусу ІНАН та отримання преципітуючого антигену для РДП

Через те, що в Україні не налагоджено виробництво діагностикуму для постановки РДП, наші дослідженння були спрямовані на розробку такого діагностикуму. Виконавши серію досліджень, нам не вдалось отримати преципітуючий антиген для постановки РДП з матеріалів, відібраних від хворих коней (з селезінки, легень, печінки, сироваток крові), що зумовлено недостатньою концентрацією вірусу в органах і тканинах тварин з хронічним і латентним перебігом ІНАН. Тому нами проведені дослідження з метою отримання культуральних антигенів. При культивуванні лейкоцитів, отриманих від коней з безсимптомним перебігом хвороби, лише від тварин з високим титром в РДП (1:32) вдавалось отримувати лейкоцитарний антиген, який після концентрації і екстракції ефіром можна використовувати для постановки РДП. Однак даний спосіб не придатний для отримання промислових серій діагностикуму.

Тому нами було відпрацьовано методики отримання чутливих до культурального штаму ”З-К ВНИиТИБП-ВИЭВ” вірусу ІНАН первинно-трипсинізованих моношарових клітинних культур з нирок і шкіри ембріона кобили. Встановлена можливість та оптимальні умови тривалого (до 6 міс.) пасажування обох клітинних субкультур у лабораторних умовах. Як видно з матеріалів, поданих у таблиці 1, найвища концентрація вірусу спостерігається на рівні 4-8 суб-пасажів. Найбільш придатними для зараження виявились первинні культури та субкультури до 6-8-ого пасажу. При цьому висока концентрація вірусу ІНАН, яка придатна для виготовлення культурального антигену, відмічається у зливах з 24 до 66-ої доби культивування.

Також розроблені оптимальні методики культивування перещеплюваної культури фібробластів шкіри коня, яку нами вперше завезено в Україну. Адаптовано культуральний штам вірусу ІНАН до даної культури і вивчена динаміка його репродукції. Одержані дані свідчать про можливість використання перещеплюваної культури фібробластів шкіри коня для культивування штаму ”З-К ВНИиТИБП-ВИЭВ” і отримання антигену, придатного для діагностики ІНАН в РДП. Виявлена можливість використання сироватки коней з хронічною формою хвороби як антисироватки при постановці РДП.

Таким чином, нами розроблена технологія вирощування культурального вірусу в культурах клітин і виготовлення преципітуючого антигену вірусу ІНАН, придатного для постановки РДП. На підставі отриманих даних розроблені ТУ У на “Набір компонентів для серологічної діагностики інфекційної анемії коней у реакції дифузної преципітації (РДП)”,

Таблиця 1

Оптимальні строки отримання преципітуючого антигену та культивування культур клітин

№ |

Культура | Вірусні зливи з високою концентрацією | Кількість діб продукування вірусу | Кількість діб

культивування

п/п | клітин | перший | останній | перша | остання | культури

1. | КНЕК

п= 11 | 4,190,82 | 7,471,98 | 244 | 4615 | 7928

2. | КШЕК

п=8 | 4,130,65 | 81,75 | 254 | 5313 | 10231

3. | КФШК

п=3 | 50,31 | 6,330,33 | 322 | 413 | 446

Мм | 4,541,90 | 7,261,35 | 273 | 4710 | 7521

Примітка: КНЕК-культура нирки ембріона кобили; КШЕК-культура шкіри ембріона кобили; КФШК-культура фібробластів шкіри коня.

а також отримано патент № 2196150 від 15.09. 1999 р. ”Спосіб виготовлення культурального антигену з вірусу ІНАН і набір для індикації антитіл або антигену вірусу ІНАН”.

Пошук експериментальної моделі для відтворення інфекційного процесу і індикації вірусу ІНАН

Чимале зацікавлення викликає вивчення особливостей розвитку експериментального інфекцйного процесу, зумовленого вірусом ІНАН коней. Експериментальне відтворення інфекційного процесу, за даними літератури, можливе тільки на однокопитних ( лошата, поні, віслюки). Експериментальне зараження молодняку коней проводять для отримання тканинного антигену, який також використовують в РДП. Нами ж виконані експерименти з метою зараження телят, овець, поросят, курей, морських свинок, кролів. Тваринам вводили сироватку крові коней, хворих ІНАН, з розрахунку 1 см3 на 1 кг маси тварини. Гематологічні, біохімічні і серологічні в РДП дослідження робили до введення матеріалу та на 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180-ту добу після введення.

Проведеними дослідженнями встановлено, що для індикації вірусу ІНАН можна використовувати кролів, у яких на 7-14-ту добу після інокуляції вірусного матеріалу спостерігається незначний лейкоцитоз з лімфоцитозом. Пік титру антитіл відмічався на 14-21-шу добу на рівні 1:2 - 1:8 в РДП. При прогресуванні клінічного прояву хвороби, що призводить до загибелі тварини, антитіла в сироватці крові до вірусу ІНАН виявлються протягом життя кроля. У клінічно хворих кролів спостерігали анемічність слизових оболонок, кахексію, конюнктивіти, параліч задніх кінцівок, зниженя кількості еритроцитів до 3,4 Т/л, підвищення в 3 рази вмісту -глобулінів.

Телята, вівці, поросята, кури та морські свинки не придатні для моделювання інфекційного процесу, зумовленого вірусом ІНАН.

Особливості розвитку інфекційного процесу при безсимптомному перебігу ІНАН коней

Особливості розвитку інфекційного процесу та показники імунобіологічної реактивності організму недостатньо вивчені при латентному перебігу хвороби. Тому нами зроблено дослідження у 332 коней віком від 6 місяців до 20 років. З віком у клінічно здорових тварин і у хворих ІНАН спостерігається тенденція до зменшення кількості лейкоцитів, відносної кількості лімфоцитів і збільшення нейтрофілів. У хворих коней 4-9, 10 років і старших порівняно зі здоровими помічено незначне зменшення кількості еритроцитів, гемоглобіну та підвищення кількості лейкоцитів. У здорових і хворих тварин з віком у периферійній крові зменшується кількість глобулінів і підвищується вміст альбумінів. У здорових коней знижується рівень -глобулінів, у хворих, навпаки, відмічається зворотна тенденція. Вміст загального білка у здорових і хворих тварин поступово зростає до 10-річного віку, а потім зменшується. Рівень нормальних антитіл у здорових коней з віком зростає з 6,25 до 12,02 ум.од. У хворих же коней він знижується з 10,6 ум.од. у 3-х річному віці відповідно до 6,26 та 8,07 у 4-9 і 10-річному віці. Із старінням організму спостерігається деяке зниження фагоцитарної активності, фагоцитарного числа і фагоцитарної ємкості, вмісту віт. С, лізоцимної активності, Т- і В- лімфоцитів, теофілінрезистентних і підвищення вмісту теофілінчутливих Т-клітин. Дані свідчать про зниження гуморальних факторів захисту у хворих коней старшого віку. У таких коней помітною стає тенденція підвищення рівнів ізоантитіл до власних еритроцитів та імунних комплексів, що свідчить про імунодепресивний вплив вірусу ІНАН на організм та розвиток аутоімунного процесу при латентному перебігу хвороби.

Із підвищенням рівня специфічних антитіл від 1:2 до 1:32 спостерігається зниження рівня еритроцитів, гемоглобіну та незначне збільшення лейкоцитів і нейтрофілів. З розвитком інфекційного процесу зменшуються фагоцитарні активність, індекс, число і ємкість. При цьому статистично вірогідна різниця встановлена у зниженні фагоцитарного індексу (р 0,001, р 0,05). Зростання титрів специфічних антитіл супроводжується зменшенням рівня альбумінів і зростанням вмісту -глобулінів, В-лімфоцитів, титрів ізоантитіл і теофілінчутливих лімфоцитів.

При спонтанному латентному перебігу хвороби із зростанням віку коней відмічається тенденція до збільшення кількості інфікованих тварин, а також рівнів преципітинів в РДП, що свідчить про підвищення напруженості інфекційного процесу. Разом з тим, наявність 25-50% здорових тварин серед популяцій коней з довготривалим латентним перебігом хвороби вказує на певну природну резистентність до зараження і низьку вірулентність вірусу при прихованому перебігу хвороби.

Проведення динамічних комплексних досліджень у 27 коней з безсимптомним перебігом хвороби протягом 2-2,5 років показало, що циклічні зміни рівнів імунологічних показників зумовлені індивідуальними особливостями організму і стадією розвитку хвороби. При цьому титри антитіл до вірусу ІНАН в сироватці крові змінювались динамічно - знижувались, підвищувались до 1:16-1:32 ум. од., а потім знову знижувались. У окремих тварин спостерігали “випадіння титрів в РДП” на період до 6 місяців, а потім їх появу, що на нашу думку, звязано з особливостями розвитку інфекційного процесу при ІНАН коней. Прогресування інфекційного процесу в окремих хворих коней супроводжується зниженням захисних функцій організму і розвитком аутоімунного процесу, однак імунна система стримує розвиток патологічного процесу при безсимптомному перебігу хвороби. За хронічного і латентного перебігу ІНАН створюється деяка рівновага між персистенцією інфекційного агента і функціонуванням гуморальних і клітинних чинників захисту, що відбувається протягом всього життя тварини. Разом з тим, такі коні є прихованим джерелом збудника хвороби і сприяють перезараженню інших, чим обумовлюють підтримання неблагополуччя епізоотичних вогнищ на певній території.

Спонтанний інфекційний процес за безсимптомного перебігу хвороби характеризується динамічним розвитком з циклічним підвищенням і зниженням рівнів специфічних антитіл протягом життя тварини. РДП є високоспецифічною реакцією, яка дозволяє виявляти тварин на ранніх стадіях захворювання і характеризується стабільністю. Таким чином, безсимптомний перебіг ІНАН характеризується хвилеподібним розвитком інфекційного процесу.

Показники імунобіологічної реактивності коней при сумісному перебігу ІНАН зі стронгілідозами

Оскільки 60-80% коней постійно заражені стронгілідами, то певний інтерес представляє вивчення показників імунобіологічної реактивності при сумісному перебігу ІНАН зі стронгілідозами.

Встановлено, що у коней при сумісному перебігу ІНАН зі стронгілідозами спостерігається тенденція до зниження рівня гемоглобіну, лейкоцитів, абсолютної кількості лімфоцитів, загального білка, альбумінів, -глобулінів, нормальних антитіл, Т- і В-лімфоцитів. Після проведення лікування таких коней фенкуром (в дозі 7,5 мг/кг) у них зростає рівень альбумінів, нормальних антитіл, абсолютної кількості лімфоцитів, зменшується рівень теофілінчутливих клітин, що свідчить про нормалізацію рівня показників резистентності організму.

Одержані результати свідчать про негативний вплив гельмінтів на організм коней.

Патоморфологічні зміни при ІНАН

При проведенні діагностичного забою 25 коней з латентною та хронічною формою хвороби у 60% тварин з титрами антитіл в РДП до - 1:4 не виявлено патоморфологічних змін, характерних для хворих. У 28% коней з титрами преципітинів 1:8 - 1:16 відмічали зміни в органах і тканинах, які проявлялись вогнищевою лімфоїдною проліферацією органів і тканин та незначним порушенням характерної будови органів. У селезінці спостерігали потовщення капсули, лімфоїдні вузлики без різких меж переходили в червону пульпу. Відмічали незначний набряк м’язових волокон міокарду. В окремих тварин міжальвеолярні стінки легень були потовщені, альвеоли стиснуті. В печінці, в ділянках тріад виявлені вогнищеві скупчення клітин лімфоїдного ряду, між якими виявились і гістоцити. У 12% тварин з титрами антитіл 1:32-1:64 і одночасним зниженням відношення альбумінів до імуноглобулінів від 1,310,40 до 0,380,12 ум. од. встановлені патолого-анатомічні і гістологічні зміни, характерні для хворих тварин. Патологічними дослідженнями були виявлені незначні крововиливи у селезінці, збільшення і кровонаповнення печінки. Гістологічні дослідження показали ураження лімфовузлів (капсула розпушена, з ознаками набряку, малюнок згладжений), селезінки (гіперплазія пульпи), серця (вогнищеві інфільтрати лімфоїдних клітин між м’язовими волокнами, стінки коронарних судин потовщені, ендотелій місцями злущений), легень (емфізематозне розширення легеневої тканини, потовщення альвеолярних перетинок внаслідок інфільтрації лімфоїдними клітинами та гістіоцитами), печінки (вогнищеві та дифузні інфільтрати лімфоїдними клітинами і гістіоцитами паренхіми, гепатоцити, як і їх балки, дещо атрофовані, місцями накопичення дрібнозернистого бурого і темно-коричневого кольору пігменту, наявність зернистої дистрофії та інкапсульованих некрозів, фарбуванням за Персом виявлено зерна гемосидерину між гепатоцитами, а також в купферовських клітинах), нирок (зменшення об’єму ниркових канальців в результаті інфільтрації лімфоїдними клітинами, зерниста дистрофія).

Таким чином, за спонтанного хронічного і латентного перебігу хвороби при наростанні рівнів специфічних антитіл в сироватці крові і зниженні відношення альбумінів до глобулінів, поступово розвиваються патологічні зміни в органах і тканинах.

Профілактика та заходи боротьби з ІНАН

Проведені нами дослідження на ІНАН в РДП коней приватних власників, які проживають на території населених пунктів раніше неблагополучних господарств вказують на те, що від 1,12 до 5,5% тварин реагують позитивно, що свідчить про наявність і формування стаціонарних вогнищ захворювання. Тому в неблагополучних районах доцільно проводити профілактичні дослідження конепоголівя як в селянських спілках, так і приватних господарствах. Встановлено, що епізоотичний процес при ІНАН характеризується повільним розвитком з наявністю стадій: передепізоотичної, розвитку епізоотії, яка протікає роками, а також максимального підйому. Без проведення ефективних оздоровчих заходів при ІНАН не спостерігається згасання епізоотії, постепізоотичної і міжепізоотичної стадій.

Організація оздоровчих заходів в неблагополучних господарствах з допомогою РДП свідчить, що при низькому рівні інфікованості (до 10%) проведення 4-5 серологічних досліджень в РДП з інтервалом 30-45 днів, своєчасна ізоляція і забій хворих, проведення ветеринарно-санітарних заходів дають можливість оздоровити господарство. Проведення серологічних досліджень 2 рази на рік з інтервалом 6 місяців, ізоляція і забій хворих затягують строки оздоровлення. При виконанні серологічних досліджень 1 раз на рік забій лише частини непродуктивних коней, продовження експлуатації інфікованих разом із здоровими сприяє прогресуванню епізоотичного процесу. Інцидентність за кожний наступний рік зростає і становить від 7% до 15%. При високому ступені інфікованості (25-70%) можливе тимчасове створення (на 2-3 роки) групи чи ферми серопозитивних коней для подальшої експлуатації. Розрахунок ефективності оздоровчих заходів у господарствах з різним рівнем інфікованості підтвердив, що питома вага збитків на одного інфікованого коня в господарстві з вищою інфікованістю становить 70 грн. при серопозитивності в РДП 16% і 42,5 грн. при серопозитивності в РДП - 7%. Економічна ефективність на одну грн. витрат вища в господарстві з інфікованістю 7% і становить 26,48 грн. проти 5 грн. при інфікованості 16%. Тобто питома вага економічних збитків, які завдає ІНАН, залежить від неблагополуччя та ступеня інфікованості. Результати власних досліджень свідчать, що своєчасна ізоляція і забій інфікованих тварин сприяють зниженню захворюваності і оздоровленню господарства.

Діагностика і основи профілактики ринопневмонії коней

Культивування вакцинного штаму СВ/69, удосконалення діагностики ринопневмонії

З метою удосконалення серологічної діагностики ринопневмонії коней нами відпрацьована технологія культивування вакцинного штаму СВ/69 на культурах клітин нирки та трахеї теляти. Вірусний матеріал використовувався для постановки РГГА, а також для постановки реакції непрямої бактеріальної аглютинації (РНБА), де носієм вірусу використовували St. albus. Проведені порівняльні вивчення РГГА з РНБА, РА з антигеном ІРТ ВРХ, РНБА з антигеном ІРТ ВРХ засвідчило, що поряд з РГГА для ретроспективної серологічної діагностики ринопневмонії можна з успіхом використовувати антиген ІРТ ВРХ (збіг 71%, r = 0,43). Тому нами розроблені методичні підходи для застосування антигену ІРТ ВРХ в РА при використанні “Набору антигену і сироваток для діагностики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби”.

Дослідження проб лімфоцитів у ланцюговій полімеразній реакції дозволили виявити 9% тварин з наявністю серотипу ГВК-1 в організмі тварин. У таких коней відмічалось