НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В.ПАЛЛАДІНА

Корольчук Віктор Ігорович

УДК: 577.151.042.5

Локалізація ділянок зв’язування плазміногену на стрептокіназі

03.00.04. - Біохімія

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2000

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України

Науковий керівник - доктор біологічних наук

Макогоненко Євген Митрофанович,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України,

завідувач відділу структури та функції білка.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Кібірєв Володимир Костянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу хімії білків;

доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України,

завідувач відділу біохімії сенсорних та регуляторних систем.

Провідна установа – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України

(відділ біофізики), м. Київ.

Захист відбудеться “ 27 ” березня 2000 р. о 14.00 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул.Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України ( Київ, вул.Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий “ 24 ” лютого 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко о.в.

Загальна характериситика роботи

Актуальність теми дослідження. Стрептокіназа (СК) - білок бактеріального походження, що продукується різними видами b-гемолітичних стрептококів. Стрептокіназа здатна активувати основний профермент системи фібринолізу плазміноген (Пг) до плазміну (Пм). Завдяки цьому стрептокіназа широко використовується в тромболітичній терапії для лікування інфаркту міокарду, легеневих емболій та інших порушень кровообігу, пов’язаних з тромбоутворенням.

На відміну від фізіологічних активаторів плазміногену, стрептокіназа не є ферментом. Активація плазміногену стрептокіназою відбувається шляхом формування комплексу, у якому плазміногеновий компонент набуває активаторної здатності Активація проферментів серинових протеїназ шляхом зв’язування з іншими білками, які не мають протеїназної активності, відома і для деяких інших проферментів системи зсідання крові, фібринолізу та білків системи компліменту, тому взаємодія стрептокіназа-плазміноген є зручною моделлю для дослідження механізмів неферментативної активації проферментів.

Особливий інтерес представляє дослідження локалізації, функціональної ролі та комплементарності амінокислотних послідовностей молекул плазміногену та стрептокінази, що беруть участь у формуванні активаторного комплексу. Показано, що шість лінійних послідовностей молекули плазміногену взаємодіють зі стрептокіназою під час утворення активаторного комплексу. Одна з ділянок - Val709-Glu724 - має провідне значення для активації плазміногену стрептокіназою, оскільки антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c, яке зв’язується з цією послідовністю протеїназного домену плазміногену, здатне не тільки інгібувати активацію плазміногену стрептокіназою, але й саме здатне активувати плазміноген. Послідовність стрептокінази, комплементарну Val709-Glu724 плазміногену у комплексі Пг-СК, остаточно не встановлено.

СК як бактеріальний білок провокує утворення різноманітних антитіл в організмі людини. Значне розповсюдження стрептококових захворювань призводить до широкої “імунізації” населення, внаслідок чого антитіла до СК можна знайти у переважної більшості людей. Тромболітична терапія з використанням стрептокінази виявляється фактично повторною “імунізацією” організму людини. Дослідженнями динаміки утворення анти-СК антитіл після введення лікувальної дози СК виявлено значне зростання як кількості антитіл, так і нейтралізуючого титру в перші дні після терапії. Високий титр зберігається за різними даними від 12 до 54 місяців, що за необхідності повторної тромболітичної терапії робить неможливим застосування СК у цей період. Тому, вивчення антигенності стрептокінази є нагальною потребою практичної медицини в пошуках підвищення ефективності тромболітичної терапії.

Зв’язок теми дослідження з планом основних наукових робіт.

Дана робота є продовженням структурно - функціональних досліджень білків плазми крові, що проводилися у відділі структури та функцій білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Робота виконувалась з 1996 по 1999 р. у рамках науково-дослідної теми № 2 за проблемою “Біохімія тварин і людини”. Держ. рег. № 01954002946, 01984000345.

Мета і заВДАННЯ дослідження. Метою даної роботи було локалізувати ділянки зв’язування плазміногену в первинній послідовності стрептокінази та з’ясувати їх можливу функціональну роль. В роботі вирішувались такі завдання:

3. Виділити та очистити фрагменти стрептокінази.

3. Дослідити зв’язування плазміногену та міні-плазміногену людини з фрагментами та синтетичними декапептидами стрептокінази.

3. Вивчити зв’язування з синтетичними декапептидами стрептокінази плазміногенів бика та свині, які нездатні активуватися стрептокіназою.

3. За допомогою моноклонального антитіла IV-1c та синтетичних пептидів H-VCNRYIFLNGRVQSTELC-NH2 і H-VCNRYЕFLNG-NH2 локалізувати ділянку стрептокінази, яка взаємодіє з послідовністю плазміногену Val709-Glu724.

3. Виділити та охарактеризувати антистрептокіназні антитіла з сироватки крові людей, які пройшли курс лікування стрептокіназою.

3. Локалізувати ділянки зв’язування антистрептокіназних антитіл людини в первинній структурі молекули стрептокінази.

3. Встановити в первинній послідовності стрептокінази локалізацію ділянок зв’язування антитіл, які знаходяться в локусі та поза локусом міжмолекулярної взаємодії СК з Пг.

Наукова новизна одержаних результатів. З використанням набору синтетичних пептидів, які відповідають амінокислотній послідовності стрептокінази, було локалізовано одинадцять ділянок первинної структури молекули стрептокінази, які можуть брати участь у Пг-СК взаємодії, а саме: Thr43-Ala82, Asn113-Thr126, Gln133-Val158, Thr163-Leu188, Ala203-Ser222, Gln239-Ile264, Tyr275-Leu294, Thr315-Leu340, Thr361-Arg372, Asn377-Glu392, Tyr397-Asn410. Послідовності Thr43-Ala82, Gln133-Val158, Gln239-Ile264, Tyr275-Leu294, Thr315-Leu340, Thr361-Arg372 перекривалися з визначеними раніше іншими авторами ділянками зв’язування для плазміногену. Існування решти послідовностей зі спорідненістю до плазміногену показано вперше.

За допомогою різних методичних підходів доведено взаємодію послідовності Thr361-Arg372 С-кінцевого домену молекули стрептокінази з ділянкою Val709-Glu724 плазміногену. Вказана взаємодія показана вперше і її роль у формуванні активаторного комплексу потребує подальших досліджень.

Було ізольовано фракцію антистрептокіназних антитіл із сироватки крові людей, яких лікували стрептокіназою. Антитіла було охарактеризовано за здатністю інгібувати реакцію активації плазміногену стрептокіназою (К50%~6 нМ). Встановлено одинадцять лінійних епітопів досліджуваних антитіл на молекулі стрептокінази, десять з яких перекривалися з ділянками зв’язування плазміногену на стрептокіназі. Три з них, а саме: Thr43-Met70, Thr193-Ser222 та Ser379-Thr390, були доступними у комплексі Пг-СК. Зроблено припущення, що сайт-спрямована заміна амінокислот цих послідовностей може знизити імуногенність стрептокінази без впливу на її активність. Решта послідовностей - Gly139-Gln152, Thr163-Ile190, Phe241-Tyr252, Tyr275-Pro286, Thr315-Leu336, Ile365-Glu376 і Tyr397-Asn410, знаходилася в області міжмолекулярного контакту, що вказує на можливість участі цих ділянок у взаємодії з плазміногеном під час утворення Пг-СК комплексу.

Із сироваток крові людей, які пройшли курс лікування стрептокіназою, виділено та охарактеризовано фракцію антиплазміногенових антитіл, лінійні епітопи яких на легкому ланцюзі плазміну перекриваються з ділянками зв’язування для стрептокінази. Отже, імуногенними ділянками СК-Пг комплексу є місця їх міжмолекулярного контакту.

Теоретичне та практичне значення роботи. Одержані результати дозволяють глибше зрозуміти механізм дії стрептокінази та експонування активного центру у плазміногені _головному проферменті фібринолітичної системи плазми крові, що може мати значення для створення тромболітичних препаратів нового покоління. Дослідження антигенних ділянок стрептокінази створює передумови для розробки нових тромболітиків на основі стрептокінази зі зниженою антигенністю.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна частина роботи виконана дисертантом особисто. Аналіз та обговорення проведено спільно з науковим керівником. Друковані праці пiдготовлено за безпосередньої участі автора.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації було продемонстровано на міжнародних конференціях і симпозіумах: “Тrombosis and Haemostasis” (Флоренція, Італія, 1997),“Fibrinolysis and proteolysis” (Любляна, Словенія, 1998) та конкурсі молодих вчених Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, 1999). Матеріали дисертації доповідали на наукових семінарах Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, 1999).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 3 статті та 3 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 140 сторінках друкарського тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали та методи”, “Локалізація ділянок зв’язування для плазміногену на молекулі стрептокінази”, “Визначення послідовності стрептокінази, що взаємодіє з Val709-Glu724 плазміногену при утворенні плазміноген-стрептокіназного комплексу”, “Локалізація епітопів антистрептокіназних та антиплазміногенових антитіл людини”, “Заключення”, “Висновки” та “Список використаних джерел”, що налічує 200 посилань. Робота ілюстрована 39 рисунками та 2 таблицями.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з чотирьох розділів, в яких висвітлено питання фізіологічного значення фібринолітичної системи, структури та конформаційного стану основних її компонентів, структури та механізму дії екзогенних активаторів плазміногену – стрептокінази та стафілокінази.

Матеріали та методи дослідждення

Препарати плазміногенів людини, бика та свині одержували з плазми крові на лізин-сефарозі 4В (Deutch, Mertz, 1970) з подальшою гель-фільтрацією на сефадексі G-150.

Ліз-плазміноген людини одержували за тим же методом із III2,3 фракції плазми крові за Коном.

Міні-плазміноген одержували еластазним гідролізом Ліз-плазміногену (Sottrup-Jensen et al., 1978). Очистку міні-плазміногену проводили афінною хроматографією на лізин-сефарозі, з подальшою гель-фільтрацією на сефадексі G-75.

Потенційну протеолітичну активність плазміногену визначали за його здатністю гідролізувати казеїн (за Гамерстеном) (Robbins, Summaria, 1979).

Біотинилювання білків проводили за (Gilting et al., 1987). Молярне співвідношення в одержаних препаратах біотин/плазміноген (Green et al., 1968) становило 10/1.

Очистку препарату стрептокінази (Kabikinase) від альбуміну проводили афінною хроматографію на цибакрон-сефарозі CL-6B (Castellino et al., 1976).

Фрагменти стрептокінази одержували обмеженим протеолізом стрептокінази a-хімотрипсином. Очищення фрагментів проводили зворотньофазовою хроматографією на системі HPLC (Knauer, Німеччина) та за допомогою препаративного електрофорезу.

Визначення ділянок зв’язування плазміногену та міні-плазміногену на стрептокіназі проводили за допомогою ковалентно пришитих до полістиролових штифтів (пінів) декапептидів, що відповідали ділянкам первинної послідовності стрептокінази зі зсувом на дві амінокислоти (Norton et al., 1993).

Поліклональні антиплазміногенові антитіла одержували імунізацією кролів Глу-плазміногеном людини внутрішньом’язово чотирма прищепленнями з двотижневим інтервалом. Антитіла ізолювали афінною хроматографією на протеїн-G сефарозі з наступною хроматографією на Пг-сефарозі.

Моноклональне антиплазміногенове антитіло IV-1c одержували з культурального середовища гібридоми, отриманої к.б.н. Колесниковою І.М. (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України), преципітацією сульфатом амонію з наступною афінною хроматографією на Пг-сефарозі.

Одержання антистрептокіназних і антиплазміногенових антитіл із сироваток крові людей, які пройшли курс лікування стрептокіназою проводили афінною хроматографією на протеїн-А сефарозі з подальшою очисткою за допомогою афінної хроматографії на іммобілізованій стрептокіназі або Глу-плазміногені, відповідно.

Імуноферментний аналіз (ІФА) проводили у мікропланшетах із сорбційною здатністю за стандартною методикою для розчинних білків.

Визначення епітопів антистрептокіназних і антиплазміногенових антитіл проводили з використанням полістиролових штифтів з ковалентно пришитими декапептидами, що відповідали ділянкам первинної послідовності стрептокінази чи Arg561-Asn791 послідовності плазміногену (Norton et al., 1993).

Активацію плазміногену стрептокіназою за присутності антистрептокіназних і антиплазміногенових антитіл людини проводили у комірках мікропланшет для ІФА. Реакційну суміш, що містила 10 мкг/мл плазміногену, 0-50 мкг/мл антитіл, 0,3 мМ субстрату S-2251 і 10 IU/мл стрептокінази, інкубували при 37оС протягом 150 хвилин. Оптичне поглинання вимірювали протягом усього терміну інкубації за довжини хвилі 405 нм на мікроридері Multiskan MC (Фінляндія).

Виснаження антистрептокіназних антитіл проводили двократним пропусканням через колонку з іммобілізованим на лізин-сефарозі СК-Пг комплексом, за молярного співвідношення IgG:СК-Пг комплекс 1:2.

Електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) проводили в системі сечовина/оцтова кислота за кислих значень pH для визначення форми одержаного плазміногену (Panyim, Chalkley, 1969), за присутності додецилсульфату натрію для перевірки чистоти препаратів білків (Laemli, 1970) та у трисин-ДСNa-ПААГ системі для препаративного розділення гідролізату СК і аналізу одержаних фрагментів (Schagger, Von Jagow, 1987).

Вестерн-блотинг для дослідження зв’язування плазміногену і антистрептокіназних антитіл людини з фрагментами стрептокінази проводили відповідно до стандартного протоколу з деякими модифікаціями (Burnette, 1981).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Локалізація ділянок зв’язування для плазміногену на молекулі стрептокінази

З метою визначення послідовностей СК, що мають спорідненість до плазміногену, було проведено досліди зі зв’язування з іммобілізованими на нітроцелюлозній мембрані фрагментами стрептокінази біотинильованого Глу-Пг, який визначали за допомогою стрептавідинфосфатази, та не міченого Глу-Пг людини, який детектували за допомогою антиплазміногенових кролячих антитіл. Зв’язування відбувалося за присутності 10 мМ 6-АГК, а отже саме сериновий протеїназний домен, а не лізин-зв’язуючі ділянки Пг, забезпечували взаємодію. У першій системі було знайдено зв’язування плазміногену з усіма фрагментами стрептокінази. В системі з антиплазміногеновими антитілами не відмічалося зв’язування лише з 11 кДа фрагментом та рівень зв’язування з 7 і 17 кДа фрагментами був менший, ніж з 30, 36 кДа фрагментами і СК (Рис. 1, Б). Три останні фрагменти і СК містять весь центральний домен молекули стрептокінази, де, згідно літературних даних, розташовано основну ділянка зв’язування плазміногену у послідовності СК143-293.

Ряд основних фрагментів, а саме: 36 кДа (СК64-380), 30 кДа (СК64-292 + СК147-380), 17 кДа (СК147-292), 11 кДа (СК288-380) і 7 кДа (СК1-63) було нами ізольовано за допомогою зворотньофазової хроматографії і досліджено на зв’язування з Пг людини за допомогою ІФА (Рис.1, A). Подібно до результатів, одержаних за допомогою Вестерн-блотингу, всі фрагменти з різною спорідненістю зв’язували плазміноген. Зв’язування плазміногену зменшувалося в ряду фрагментів стрептокінази 36 > 30 > 17 > 7 > 11 кДа.

Рис. 1. Зв’язування Глу-Пг людини з фрагментами стрептокінази: А _у дослідах з використанням ІФА; Б _у дослідах з використанням Вестерн-блотингу: 1 _визначення зв’язаного плазміногену за допомогою кролячих анти-Пг IgG, 2 _визна-чення зв’язаного біотинильованого плазміногену за допомогою кон’югованого з пероксидазою хрону стрептавідину.

При цьому зменшувалася кількість зв’язаного Пг, а також його афінність до фрагментів СК. Про це свідчить зростання концентрації півнасичення зв’язування Пг з фрагментами, яка складала 27, 32 і 54 нМ відповідно для 36 і 30, 7 і 17 та 11 кДа фрагментів.

З метою визначення ділянок первинної послідовності стрептокінази, залучених до взаємодії з молекулою плазміногену, було проведено досліди зі зв’язуванням біотинильованого Глу-плазміногену людини з іммобілізованими декапептидами стрептокінази за присутності 10 мМ 6-АГК. Як свідчить рис.2, А, можна визначити 11 ділянок первинної послідовності стрептокінази (Thr43-Ala82, Asn113-Thr126, Gln133-Val158, Thr163-Leu188, Ala203-Ser222, Gln239-Ile264, Tyr275-Leu294, Thr315-Leu340, Thr361-Arg372, Asn377-Glu392 і Tyr397-Asn410), що мають спорідненість до плазміногену та досить рівномірно розміщені впродовж усього поліпептидного ланцюга молекули. Аналогічні результати було одержано у дослідах, де плазміноген визначали за допомогою поліклональних кролячих анти-Пг антитіл, що підтверджує коректність використання біотинильованого плазміногену для визначення ділянок зв’язування на декапептидах СК. Втрата плазміногеном усіх лізин-зв’язуючих ділянок, розташованих у кринглах К1-К4, не впливає на його зв’язування зі СК декапептидами, оскільки ділянки зв’язування з декапептидами СК для біотинильованого міні-плазміногену та Глу-плазміногену співпадають.

Було визначено ділянки зв’язування на СК плазміногенів свині та бика, які здатні зв’язуватися зі стрептокіназою, але не здатні активуватися нею. Порівняння діаграми зв’язування для плазміногену бика (рис. 2, Б), свині (дані не показано), і людини, (рис. 2, А), дозволяє зробити висновок, що ділянки зв’язування для всіх аналізованих плазміногенів співпадають. Отже, на рівні первинної структури не спостерігаються відмінності у взаємодії СК з плазміногенами бика, свині та людини. Цілком очевидно, що нездатність плазміногену бика та свині активуватися стрептокіназою обумовлена не відсутністю їх зв’язування з певними ділянками первинної структури, а іншими чинниками, що діють на рівні вторинної чи третинної структури молекули стрептокінази.

Рис. 2. Діаграми зв’язування плазміногенів людини (А) та бика (Б) з синтетичними декапептидами стрептокінази та за присутності 10 мМ 6-АГК.

Відповідно до доменної організації молекули СК та робіт, де описано ділянки зв’язування для плазміногену на стрептокіназі, одержані в наших дослідах послідовності можна розподілити за А, В і С доменами стрептокінази. Так, послідовність Thr43-Ala82 належить до першого домену стрептокінази, а, також, частково (Thr43 - Lys59) входить до складу N-кінцевого 7 кДа фрагмента, який було виділено як самостійну ділянку зв’язування (Nihalani, Sahni, 1995). За даними рентгеноструктурного аналізу у взаємодії з плазміногеном беруть участь лише декілька амінокислотних залишків першого домену стрептокінази, а саме: Val19, Glu39, та Glu134 (Wang et al., 1998). З них Glu134 входить до складу послідовності Gln133-Val158, що має спорідненість до плазміногену, як показано в наших експериментах. Існування ділянки зв’язування у послідовності Asn113-Thr126 раніше не було показано.

П’ять ділянок розташовано у центральній частині _ В домені _ молекули стрептокінази (СК143-293), яку було визначено як основну ділянку зв’язування плазміногену (Rodriguez et al., 1994, Nihalani, Sahni, 1995). За допомогою коротких синтетичних пептидів було визначено поліпептидну послідовність Ile234-Lys293, два фрагменти якої _Ile234-Arg253 та Tyr274-Lys293 _брали участь у міжмолекулярній взаємодії з плазміногеном під час утворення активаторного комплексу (Nihalani et al., 1997). Ці ділянки перекриваються з визначеними в наших експериментах послідовностями Gln239-Ile264 та Tyr275-Lys294. Послідовності Thr163-Leu188 та Ala203-Ser222 не було визначено в попередніх роботах як окремі ділянки зв’язування і функціональну роль їх не встановлено.

Три послідовності зі спорідненістю до Пг розташовано у С-кінцевому домені СК. Існування ділянки зв’язування у області Thr315-Leu340 узгоджується з даними (Wang et al., 1998), за якими ця послідовність взаємодіє з “кальцій - зв’язуючою петлею” (Пг622-628) та “петлею автолізу” (Пг692-695) плазміногену. Жодна з наступних ділянок у С-кінцевій області за даними рентгеноструктурного аналізу не бере участі у взаємодії з плазміногеном. Однак, вилученням С-кінцевого пептиду стрептокінази продемонстровано істотне значення для взаємодії з плазміногеном ділянки, що перекривається з визначеною в наших дослідах послідовністю Thr361-Arg372 (Kim et al., 1996, Fay, Bokka, 1998). Існування ділянок зв’язування у послідовностях Asn377-Glu392 та Tyr397-Asn410 раніше не було показано. Вилучення С-кінцевого фрагменту, що містить ці послідовності, не призводить до втрати стрептокіназою активаторної здатності. Спорідненість плазміногену до цих ділянок може пояснюватися певною гомологією з послідовностями інших ділянок зв’язування стрептокінази.

2. Визначення послідовності стрептокінази, що взаємодіє з Val709-Glu724 плазміногену при утворенні плазміноген-стрептокіназного комплексу

У попередньому дослідженні було встановлено існування 6 лінійних послідовностей молекули плазміногену, що беруть участь у взаємодії зі СК при утворенні активаторного комплексу (Яковлєв, 1997). Одна з ділянок - Val709-Glu724 - мала істотне значення для активації Пг СК, оскільки антиплазміногенове моноклональне антитіло (МКА) IV-1c, що зв’язується лише з цією послідовністю протеїназного домену плазміногену, здатне не тільки інгібувати активацію Пг стрептокіназою, але і саме здатне активувати Пг (Яковлєв, 1997). Про важливу роль послідовності Val709-Glu724 Пг для здатності активуватися стрептокіназою і стафілокіназою свідчать, також, дослідження з використанням сайт-спрямованих замін Arg719, що входить до складу вказаної послідовності (Dawson et al., 1994, Jespers et al., 1998).

З метою визначення послідовності СК, компліментарної Val709-Glu724 Пг, нами було проведено досліди, в яких визначення Пг людини, що зв’язувався з декапептидами СК за присутності 10 мМ 6-АГК, проводили за допомогою МКА IV-1c. Як свідчить Рис.3, було знайдено десять послідовностей СК, що зв’язували плазміноген в умовах цих дослідів – Thr43-Ala82, Asp111-Thr126, Phe135-Val158, Thr163-Leu188, Ala203-Ser222, Gln239-Ile264, Lys273-Lys294, Thr315-Leu340, Asn377-Glu392, Tyr397-Asn410. Порівняно до встановлених у дослідах зі зв’язування біотинильованого Пг (Рис. 2, А), одна з ділянок – Thr361-Arg372 – не взаємодіяла з Пг. Аналогічні результати було одержано у дослідах, де зі СК декапептидами інкубували попередньо преформований комплекс Пг-IV-1c. Очевидно, що Пг, зв’язаний з декапептидами СК за участю послідовності Val709-Glu724, є недоступним для взаємодії з IV-1c, а, отже, можна припустити, що відповідна послідовність СК є комплементарною ділянці Val709-Glu724.

Для перевірки цього припущення нами було проведено досліди, в яких для визначення зв’язаного з ізольованими фрагментами стрептокінази плазміногену застосовували дві системи детекції: поліклональні анти-Пг антитіла та МКА IV-1c. Згідно Рис. 4, плазміноген зв’язувався з усіма іммобілізованими фрагментами та нативною СК, що визначали за допомогою поліклональних антитіл. У той же час Пг, зв’язаний зі СК47 і СК11, не узнавався IV-1c. Такий результат свідчить про наявність у послідовності СК288-380 ділянки, що взаємодіє з Val709-Glu724 плазміногену під час утворення активаторного комплексу, що узгоджується з даними, одержаними з використанням СК декапептидів (Рис. 3).

Рис. 3. Діаграми зв’язування Глу-плазміногену людини з синтетичними декапептидами стрептокінази та за присутності 10 мМ 6-АГК: А – визначення за допомогою IV-1c, Б – зв’язування за присутності синтетичного пептиду H-VCNRYEFLNG-NH2 (Пг Val709-Gly718).

Два синтетичних пептиди: H-VCNRYIFLNGRVQSTELC-NH2 (Пг Val709-Cys726) і H-VCNRYEFLNG-NH2 (Пг Val709-Gly718), які були здатні інгібувати взаємодію СК з послідов-ністю Val709-Glu724 плазміногену, було використано для локалізації плазмі-ногензв’язуючої ділянки СК, компле-ментарної Val709-Glu724 Пг. Так у дослідах, в яких зв’язування Глу-Пг людини зі СК декапептидами проводили за присутності синтетичного пептиду H-VCNRYEFLNG-NH2 (Рис. 3, Б) встанов-лено відсутність зв’язування з Thr361-Arg372 стрептокінази, що узгоджується з результатами, одержаними у попередніх експериментах з використанням МКА IV-1c (Рис. 3, А).

Рис. 4. Зв’язування Глу-Пг людини з фрагментами СК у дослідах з використанням ІФА: 1 – визначення зв’язаного Пг за допомогою полікло-нальних анти-Пг IgG, 2 – визначення зв’язаного Пг за допомогою МКА IV-1c.

У дослідах, в яких мічений біотином Val709-Gly718 зв’язували зі стрептокіназою та її ізольованими за допомогою препаративного електрофорезу фрагментами (Рис. 5) було встановлено, що взаємодія біотинильованого пептиду зі СК відбувається з невисокою спорідненістю, за що свідчить відсутність характеру насичення кривої зв’язування навіть за концентрації пептиду 10 мкг/мл _7,7x10-6 М. Водночас концентраційно-залежне зв’язування спостерігали, також, для СК288-380 (з подібною до СК47 спорідненістю) та для СК64-380 (слабша взаємодія). Для зв’язування зі СК і фрагментами використовували, також, пептид Val709-Gly718, кон’югований з сироватковим альбуміном людини (ЛСА) за допомогою глутарового альдегіду. Одержана діаграма (Рис. 6) демонструє переважне зв’язування кон’югованого пептиду з нативною стрептокіназою та послідовністю СК288-380. В умовах Вестерн-блотингу зв’язування біотинильованого ЛСА-Val709-Gly718 зі СК чи будь-яким з її фрагментів не було, очевидно, з причини низької спорідненості такої взаємодії.

Рис. 5. Зв’язування біотинильованого синтетичного пептиду H-VCNRYEFLNG-NH2 (Пг Val709-Gly718) зі СК та її фрагментами.

Рис. 6. Зв’язування біотинильованого кон’югату H-VCNRYEFLNG-NH2 (Пг Val709-Gly718)-ЛСА зі СК та її фрагментами.

Таким чином, згідно даних експериментів прямого зв’язування Val709-Gly718 Пг з фрагментами стрептокінази ділянка, що взаємодіє з указаною послідовністю плазміногену знаходиться у 11 кДа фрагменті СК288-380, що являє собою С-кінцевий домен. Використанням стрептокіназних декапептидів вдалося локалізувати цю ділянку у послідовності СК Thr361-Arg372.

3. Локалізація епітопів антистрептокіназних та антиплазміногенових антитіл людини

У восьми пацієнтів, які пройшли курс лікування стрептокіназою, збирали кров через 25-30 днів після введення тромболітика, коли передбачався найвищий титр антитіл. Імуноферментним аналізом фракцій IgG, одержаних за допомогою афінної хроматографії на іммобілізованій стрептокіназі, виявлено високоспецифічну взаємодію зі СК (з К50% ~ 10-8 М) тільки для фракції, елюйованої за рН 2,2. Надалі використовували саме цю фракцію, середній вміст якої становив близько 1,8% від загальної кількості імуноглобулінів, одержаних хроматогра-фією на протеїн-А сефарозі. Антитіла інгібували реакцію активації Пг СК з К50% ~ 6 нМ. Максимум інгібування (97%) спостерігали за ~30 кратного молярного надлишку антитіл над стрептокіназою.

Рис. 7. Зв’язування поліклональних анти-СК антитіл людини з хімотрипсиновими фрагментами СК.

У дослідах по зв’язуванню антистрептокіназних антитіл зі СК та її фрагментами з використанням ІФА виявлено зниження взаємодії у ряду СК (47 кДа)>36>30>1711>7 кДа (Рис. 7). Згідно наведених даних, епітопи одержаних анти-СК антитіл розміщено в усіх трьох доменах СК: N-кінцевому (7 кДа фрагмент N-кінцевого домену має невисоку спорідненість до антитіл), центральному і С-кінцевому (17 кДа і 11 кДа фрагменти зв’язують антитіла з майже однаковою афінністю). Значно вищий рівень спорідненості антитіл до 36 і 30 кДа фрагментів стрептокінази можна пояснити або наявністю епітопу (епітопів) у послідовності СК64-147 N-кінцевого домену СК, відсутнього (відсутніх) у фрагментах з меншою молекулярною масою, або існуванням просторових (нелінійних) епітопів. Останнє узгоджується з даними (Parhami-Seren et al., 1995), згідно яких доведено існування нелінійного епітопу анти-СК антитіл людини у послідовності СК1-253.

З метою детальнішої локалізації епітопів досліджуваних антитіл було використано синтетичні декапептиди, іммобілізовані на полістиролових пінах. Типову діаграму зв’язування анти-СК антитіл з декапептидами наведено на Рис. 8, А. Встановлено існування 10 лінійних епітопів, характерних для всіх обстежених фракцій антитіл: Thr43-Met70, Gly139-Gln152, Thr163-Ile190, Thr193-Ser222, Phe241-Tyr252, Tyr275-Pro286, Thr315-Leu336, Ile365-Glu376, Ser379-Thr390, Tyr397-Asn410; зв’язування з N-кінцевою послідовністю СК Ile1-Ser12 було характерним лише для частини антитіл (Табл. 1). Існування епітопу анти-СК антитіл у послідовності Thr43-Met70 узгоджується з даними щодо існування антигенної ділянки стрептокінази Lys59-Phe63, одержаними з використанням бібліотеки пептидів, експонованих на поверхні фагу (Parhami-Seren et al., 1997). Крім того ділянка Thr43-Met70 перекривається з епітопом Leu42-Phe47 антитіл, одержаних з плазм крові хворих на ревматизм (Gonzalez-Gronow et al., 1993). N-кінцева амінокислотна послідов-ність Ile1-Val13, локалізована попередніми дослідженнями (Parhami-Seren et al., 1995), була антигенною тільки для частини обстежених антитіл, як і встановлена у наших дослідах ділянка Ile1-Ser12. Решта антигенних послідовностей молекули стрептокінази раніше не була локалізована.

Розподіл антитіл за епітопами визначали як відсоток оптичного поглинання, що відповідало окремому епітопу, від сумарного поглинання усіх епітопів (100%). Найбільший відсоток антитіл (38,3%) зв’язувався з послідовністю стрептокінази Thr43-Met70. Переважна більшість антитіл (близько 70%) взаємодіяли з цією та двома іншими послідовностями: Thr315-Leu336 (13,2%) і Tyr397-Asn410 (17,7%). Процентний вміст антитіл, що взаємодіяли з іншими послідовностями не перевищував 10% (Табл. 1). Якщо брати за основу тридоменну структуру молекули СК, з N- і C-кінцевими доменами взаємодіє подібна кількість антитіл, відповідно 45,2% і 36,8%. Центральний домен містить епітопи значно меншої кількості антитіл (14,4%).

Рис. 8. Зв’язування анти-СК антитіл людини до (А) та після (Б) виснаження Пг-СК комплексом з іммобілізованими синтетичними декапептидами СК.

За допомогою виснаження проти комплексу Пг-СК афінно очищених антитіл було одержано фракцію антитіл, епітопи яких екранувалися плазміногеном (виснажених антитіл). По виснаженні проти іммобілізованого комплексу в розчині залишалося близько 15-20% від усієї кількості наявних антитіл, що визначали за концентрацією білка. Функціональну активність виснажених комплексом Пг-СК антистрептокіназних антитіл вивчали у дослідах з активації Пг стрептокіназою за присутності антитіл. У дослідах, де анти-СК антитіла та стрептокіназу попередньо інкубували протягом 15 хв за 37оС (Рис. 9), виснажені антитіла мали у 5 разів вищу інгібіторну активність (К50% ~ 1,2 нМ), що є зайвим доказом розташування їхніх епітопів на тих ділянках поліпептидного ланцюга стрептокінази, які беруть безпосередню участь у формуванні комплексу Пг-СК.

З метою визначення процентного вмісту антитіл до кожного епітопу, розташованого на функціонально активній ділянці молекули СК, за 100% брали сумарне значення поглинання, одержане у дослідах зі зв’язування з декапептидами сумарних антитіл. Для цього досліди зі зв’язування виснажених антитіл з декапептидами СК проводили за умов, ідентичних до умов дослідів з антитілами до виснаження, що й дало змогу співставити результати двох різних експериментів (Рис. 8). Встановлено значне зниження відсотку антитіл до деяких епітопів: Ile1-Ser12 (зменшення у 50 разів), Thr43-Met70 (у 35 разів), Thr193-Ser222 (у 5 разів), Ser379-Thr390 (у 3,5 разів).

Епітопну характеристику анти-СК антитіл до та після виснаження наведено у Табл.1. Особливий інтерес становить порівняння визначених за допомогою синтетичних декапептидів лінійних епітопів анти-СК антитіл з послідовностями СК, спорідненими до плазміногену. Ділянка Ile1-Ser12 стрептокінази не взаємодіяла з плазміногеном у вказаних дослідах, що узгоджується з її доступністю у комплексі для зв’язування специфічних антитіл. Десять інших епітопів антитіл повністю або частково перекривалися з послідовностями, що мали спорідненість до плазміногену. Три з них, а саме: Thr43-Met70 (Thr43-Ala82), Thr193-Ser222 (Ala203-Ser222), Ser379-Thr390 (Asn377-Glu392), були доступними у комплексі Пг-СК, що свідчить за відсутність або невисокий рівень взаємодії молекули Пг з наведеними ділянками.

Табл. 1. Епітопи досліджуваних анти-СК антитіл людини і відповідні їм послідовності молекули СК, що мали спорідненість до Пг у дослідах з використанням синтетичних декапептидів. Показано процентний вміст антитіл до та після виснаження проти комплексу Пг-СК. Жирним шрифтом виділено епітопи, відсоток антитіл до яких суттєво зменшувався після виснаження антитіл проти комплексу.

Лінійні епітопи антитіл на молекулі СК | Відповідні плазміноген зв’язуючі ділянки СК | Процентний вміст епітопів антитіл | Процентний вміст епітопів виснажених антитіл

Ile1-Ser12* | - | 4,0% | 0,05%

Thr43-Met70 | Thr43-Ala82 | 38,3% | 1,1%

Gly139-Gln152 | Gln133-Val158 | 2,9% | 3,4%

Thr163-Ile190 | Thr163-Leu188 | 5,9% | 8,7%

Thr193-Ser222 | Ala203-Ser222 | 4,8% | 0,9%

Phe241-Tyr252 | Gln239-Ile264 | 2,5% | 2,4%

Tyr275-Pro286 | Tyr275-Leu294 | 1,4% | 1,4%

Thr315-Leu336 | Thr315-Leu340 | 13,2% | 10,2%

Ile365-Glu376 | Thr361-Arg372 | 2,0% | 1,7%

Ser379-Thr390 | Asn377-Glu392 | 3,9% | 1,1%

Tyr397-Asn410 | Tyr397-Asn410 | 17,7% | 18,2%

* - зв’язування фіксували тільки для частини обстежених фракцій антитіл

Як зазначалося вище, 38,3% загальної кількості анти-СК антитіл розпізнають епітопи, розташовані на послідовності Thr43-Met70. Ймовірно, що сайт-спрямована заміна певних амінокислот цієї послідовності дасть змогу значно знизити антигенність стрептокінази без зниження її активності. Решта послідовностей (Gly139-Gln152, Thr163-I190, Phe241-Tyr252, Tyr275-Pro286, Thr315-Leu336, Ile365-Glu376 і Tyr397-Asn410) потенційно знаходиться в області міжмолекулярного контакту, що є ще одним доказом взаємодії вказаних ділянок з плазміногеном під час утворення Пг-СК комплексу.

Із сироваток крові людей, що пройшли курс лікування стрептокіназою, нами також було ізольовано фракцію антиплазміно-генових антитіл. Середній вміст IgG цієї фракції становив близько 0,15% від загальної кількості імуноглобулінів, тобто, вміст цих антитіл був приблизно у 10 разів нижчим від вмісту антистрептокіназних антитіл.

Рис. 9. Активація Пг стрептокіназою за присутності анти-СК антитіл людини до та після їхнього виснаження Пг-СК комплексом. Реакцію ініціювали додаванням попередньо інкубованої з анти-СК антитілами СК.

У дослідах з активації плазміногену стрептокіназою за присутності хромогенного субстрату плазміну та різних концентрацій досліджуваних антитіл, не встановлено значного інгібіторного ефекту антитіл (<10% інгібування) за двократного молярного надлишку антитіл (35 мкг/мл) над плазміногеном (Рис. 10). Надлишок концентрації плазміногену (200 мкг/мл) над концентрацією антиплазміногенових антитіл (15 мкг/мл) у сироватках крові не дозволяє припустити скільки небудь значимого інгібуючого впливу цих антитіл на активацію Пг стрептокіназою за фізіологічних умов.

Рис. 10. Активація плазміногену стрептокіназою за різних концентрацій антиплазміногенових IgG людини.

Визначення лінійних епітопів антиплазміногенових антитіл людини проводили за допомогою іммобілізованих на полістиролових пінах синтетичних декапептидів, які перекривалися з первинною послідовністю легкого ланцюга плазміну. Було встановлено існування шести послідовностей легкого ланцюга плазміну, які мали спорідненість до досліджуваних антитіл (Рис. 11), а саме: Trp574-Val599, Lys608-Leu619, Val636-Asp661, Gln690-Lys699, Phe716-Glu725 і Pro772-Ile785. Усі послідовності перекривалися з визначеними попередніми дослідженнями ділянками, які мали спорідненість до стрептокінази (Яковлєв, 1997). Отже, очевидно, що саме ділянки міжмолекулярної взаємодії плазміногену та стрептокінази є імуногенними у СК-Пг комплексі.

Рис. 11. Зв’язування антиплазміноге-нових антитіл людини з іммобілізова-ними синтетичними декапептидами.

ВИСНОВКИ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

1.

Перелік робіт, що опубліковані за темою дисертації

1.

1.

1.

1.

1.

1.

АНОТАЦіЯ

Корольчук В.І. Локалізація ділянок зв’язування плазміногену на стрептокіназі. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 _Біохімія. _ Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Київ, 2000.

Дисертацію присвячено дослідженню локалізації на молекулі активатора плазміногену неферментної дії _стрептокінази _ділянок зв’язування плазміногену та епітопів антистрептокіназних антитіл людини. Встановлено існування одинадцяти ділянок первинної структури молекули стрептокінази зі спорідненістю до плазміногену (Thr43-Ala82, Asn113-Thr126, Gln133-Val158, Thr163-Leu188, Ala203-Ser222, Gln239-Ile264, Tyr275-Leu294, Thr315-Leu340, Thr361-Arg372, Asn377-Glu392, Tyr397-Asn410). За допомогою різних методичних підходів доведено взаємодію послідовності Thr361-Arg372 С-кінцевого домену молекули стрептокінази з ділянкою Val709-Glu724 плазміногену. Обгрунтовано припущення, що вказана взаємодія є необхідною для формування активаторного комплексу. Встановлено одинадцять лінійних епітопів антистрептокіназних антитіл людини на молекулі стрептокінази, десять з яких перекривалися з ділянками зв’язування плазміногену на стрептокіназі. Три з них (Thr43-Met70, Thr193-Ser222 та Ser379-Thr390) були доступними у комплексі плазміноген-стрептокіназа, що свідчить про відсутність взаємодії молекули плазміногену з наведеними ділянками. Ймовірно, що сайт-спрямована заміна амінокислот цих послідовностей може дати змогу знизити імуногенність стрептокінази без впливу на її активність. Решта послідовностей знаходилася в області міжмолекулярного контакту, що вказує на їх можливу участь в утворенні активаторного комплексу.

Ключові слова: стрептокіназа, Glu-, Lys-, міні-плазміноген, IgG, фрагменти, синтетичні пептиди, активаторний комплекс, ділянки зв’язування, епітопи, активація.

АННОТАЦИЯ

Корольчук В.И. Локализация участков связывания плазминогена на стрептокиназе. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – Биохимия. – Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины. Киев, 2000.

Диссертация посвящена исследованию локализации на молекуле активатора плазминогена неферментного действия _стрептокиназы – участков связывания плазминогена и эпитопов антистрептокиназных антител человека. Установлено существование одиннадцати участков первичной структуры молекулы стрептокиназы со сродством к плазминогену (Thr43-Ala82, Asn113-Thr126, Gln133-Val158, Thr163-Leu188, Ala203-Ser222, Gln239-Ile264, Tyr275-Leu294, Thr315-Leu340, Thr361-Arg372, Asn377-Glu392, Tyr397-Asn410). С помощью различных методических подходов доказано взаимодействие последовательности Thr361-Arg372 С-концевого домена молекулы стрептокиназы с участком Val709-Glu724 плазминогена. Показано, что данное взаимодействие является необходимым для формирования активаторного комплекса. Установлено существование одиннадцати линейных эпитопов антистрептокиназных антител человека на молекуле стрептокиназы, десять из которых перекрывались с участками связывания плазминогена на стрептокиназе. Три из них (Thr43-Met70, Thr193-Ser222 та Ser379-Thr390) были доступными в комплексе плазминоген-стрептокиназа, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия молекулы плазминогена с этими участками. Вероятно, что сайт-направленная замена аминокислот этих последовательностей может позволить снизить иммуногенность стрептокиназы без влияния на ее активность. Остальные последовательности находились в области межмолекулярного контакта, что указывает на их возможное участие в образовании активаторного комплекса.

Ключевые слова: стрептокиназа, Glu-, Lys-, мини-плазминоген, IgG, фрагменты, синтетические пептиды, активаторный комплекс, участки связывания, эпитопы, активация.

SUMMARY

Korolchuk V.I. Localisation of plasminogen binding sites on streptokinase. – Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – Biochemistry. – A.V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv, 2000.

The thesis is devoted to the investigation of plasminogen binding sites and epitopes of human IgG on the molecule of nonenzymatic plasminogen activator – streptokinase.

The plasminogen binding with chymotryptic fragments of streptokinase and streptokinase decapeptides, modeling the primary structure of molecule, have been investigated. Chymortyptic fragments of streptokinase _36 kDa (SK64-380), 30 kDa (SK64-292 + SK147-380), 17 kDa (SK147-292), 11 kDa (SK288-380) and 7 kDa (SK1-63) _were isolated using reverse-phase chromatography and PAAG-SDS electrophoresis. Using Western-blotting and ELISA technique it was shown that in the presence of 10 mM 6-aminohexanoic acid plasminogen binds to all chymotryptic streptokinase fragments with the decreasing affinity in set of fragments: 36>30>17>7>11 kDa. It was followed by a decrease both in the amount of bound plasminogen and in its affinity to streptokinase fragments. This is