МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КАБАНОВА Тетяна Анатоліївна

УДК: 615.22:015.11

ІНГІБІТОРИ АГРЕГАЦІЇ ТРОМБОЦИТІВ, ПОХІДНІ ЛІНІЙНИХ ПЕПТИДОМІМЕТИКІВ І ГЕТЕРОЦИКЛІЧНИХ СПОЛУК

14.03.05. – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Одеса – 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського (м. Одеса) Національної академії наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Карасьова Тамара Леонідівна, Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, провідний науковий співробітник.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Маслова Наталія Федорівна, Державний науковий центр лікарських засобів МОЗ і НАН України, завідуюча лабораторією ферментних і антиферментних препаратів; доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Жук Ольга Вікторівна, Одеський національний університет ім. І.І. Мечникова МО і Н України, провідний науковий співробітник ПНДЛ-5.

Провідна установа: Інститут фармакології та токсикології, відділ нейро-фармакології АМН України, м. Київ.

Захист відбудеться " 15 " січня 2001 року о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01. при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету МОЗ України (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 3).

Автореферат розісланий " 14 " грудня 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради д. мед. н., професор Годлевський Л.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Захворювання серцево-судинної системи займають значне місце у клініці внутрішніх хвороб. Досить часто причиною таких хвороб стає розлад системи гемостазу. Основною причиною зниження кровотоку в судинах є утворення тромбів завдяки стенозу і ушкодженню судин. Внутрішньо-судинне утворення тромбу починається з осідання тромбоцитів на тромбогенних поверхнях, таких як пошкоджені холестеринові бляшки, після чого тромбоцити агрегують один з одним, що стимулює, кінець кінцем, неконтрольоване зростання тромбу (Cohen M., 1998).

Фармакологія антиагрегаційних засобів постійно збільшує число об'єктів вивчення, які належать до різних класів сполук. Це пов'язано з тим, що існує цілий ряд індукторів агрегації (аденозиндифосфорна кислота (АДФ), адреналін, арахідонова кислота, колаген, тромбін, тощо), які приводять до агрегації тромбоцитів різними шляхами. Найширше застосування в клініці знайшли такі антиагрегаційні агенти, як ацетилсаліцилова кислота, що впливає на цикл арахідонової кислоти, і тіклопедин, який інгібує АДФ-залежний шлях агрегації тромбоцитів (Robarge K.D. et al., 1998). Ацетилсаліцилова кислота також входить до складу комплексних препаратів (Patrono C. et al., 1998). В літературі є відомості про можливість застосування анксіолітиків – похідних 1,4-бенздіазепину, в якості антиагрегантів (Folts J., 1991). Однак, ефективність і селективність дії відомих антиагрегаційних засобів не завжди достатньо високі. Крім того, такі засоби інгібують лише один з можливих шляхів активації кров'яних пластинок, їх агрегація може все одно здійснюватися завдяки іншим шляхам.

Останнім часом інтенсивно проводяться дослідження природних пептидів і пептидоміметиків, які впливають на останній, вирішальний етап агрегації тромбоцитів – зв'язування фібриногену з його рецепторами (GP IIb/IIIa), відповідальними за яке є трипептидні фрагменти Arg-Gly-Asp (RGD), розташовані на a-ланцюгах фібриногену. Однак, до клінічних іспитів дійшла лише мала частка цих речовин, це такі сполуки як ламіфібан, тірофібан, сіброфібан (Vickers S. et al, 1999, Dooley M. et al, 1999). З цієї причини проблема пошуку нових сполук, здатних інгібувати агрегацію тромбоцитів, залишається актуальною і потребує подальших зусиль у її розв'язуванні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилася в зв'язку виконанням досліджень Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України за темами № 196 (№ державної реєстрації 0195V015693), № 223 (№ державної реєстрації 0197V008685), № 234 (№ державної реєстрації 0100V001145) і міжнародною програмою РЕСО-94 (BIOMED, Проект № ERВCIPDCT 940247). Дисертантом безпосередньо були виконані всі біологічні експерименти за згаданими темами.

Мета і задачі дослідження. Мета дисертаційної роботи – пошук нових сполук з антиагрегаційними властивостями серед RGD-пептидоміметиків, потенційних антагоністів фібриногенових рецепторів, і анксіолітиків, похідних 1,4-бенздіазепину і споріднених структур.

Відповідно до мети були поставлені такі задачі:

1. Проведення первинного скринінгу на антигемостатичну дію похідних 1,4-бенздіазепину, арилгідразонів і фенілсемікарбазонів 2-амінобензофенонів в дослідах in vivo.

2. Вивчення антиагрегаційної активності феназепаму, гідазепаму, інших похідних 1,4-бенздіазепину і споріднених структур, а також похідних 3-амінопіперидин-2,6-діонів і 3-амінопіролідин-2,5-діонів в дослідах in vitro на багатій на тромбоцити плазмі крові щурів.

3. Пошук ефективних комбінацій на основі нового денного анксіолітика гідазепаму і ацетилсаліцилової кислоти в дослідах in vivo, in vitrо та ex vivo на щурах.

4. Дослідження in vitro антиагрегаційних властивостей RGD-пептидоміметиків на крові щурів і на крові людини, виявлення активності при пероральному введенні в дослідах ex vivo на щурах і мишах.

5. Вивчення механізму антиагрегаційної дії RGD-пептидоміметиків в дослідах in vitro по інгібуванню зв'язування FITC-міченого фібриногену з його рецепторами на тромбоцитах.

Об'єкт дослідження: тромботичні ускладнення серцево-судинних захворювань, зумовлені агрегаційними властивостями тромбоцитів.

Предмет дослідження: нові сполуки з високою антиагрегаційною активністю.

Методи дослідження: В роботі для оцінки антигемостатичної і профібринолітичної активності досліджуваних сполук використовувалися загальноприйняті скринінгові методи визначення часу кровотечі і природного лізису кров'яного згустку, відповідно. Для оцінки антиагрегаційної активності застосовували фотометричний метод Борна в дослідах in vitro і ex vivo . Оцінку впливу досліджуваних сполук на зв'язування фібриногену з його рецептором на тромбоцитах проводили за сучасним флуориметричним методом.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено наявність антигемостатичної і антиагрегаційної активності у препаратів 1,4-бенздіазепинового ряду (феназепам, гідазепам), деяких нових похідних 1,4-бенздіазепину та інших азотовмісних гетероциклічних сполук. Продемонстрована можливість спільного застосування гідазепаму і ацетилсаліцилової кислоти в малих дозах. Встановлений механізм антиагрегаційної дії нових лінійних високоактивних RGD-пептидоміметиків як антагоністів фібриногенових рецепторів.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані експериментальні результати дають підставу вважати вивчені RGD-пептидоміметики перспективними сполуками з антиагрегаційними властивостями, які в майбутньому можуть бути застосовані в медичній практиці для лікування артеріальних тромбозів та інших видів розладу серцево-судинної системи. Знайдені експериментальним шляхом високоактивні комбінації препаратів гідазепаму та ацетилсаліцилової кислоти є основою для створення нового комплексного антитромботичного засобу, ефективного в малих дозах.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно визначені методичні підходи, згідно з якими особисто виконані всі експериментальні дослідження. Проведені математична обробка одержаних результатів, оформлення їх у вигляді таблиць і графіків, зроблений аналіз результатів, сформульовані висновки роботи, опубліковані основні положення дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на Науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження академіка О.І. Черкеса (Київ, 1994), міжнародному симпозіумі “23-rd European Peptide Symposium” (Брага, Португалія, 1994), Першому національному з'їзді фармакологів України “Сучасні проблеми фармакології” (Полтава, 1995), Українській конференції “Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 1997), XVIII Українській конференції з органічної хімії (Дніпропетровськ, 1998), V Національному з'їзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті” (Харків, 1999), міжнародній конференції “The Second Multidisciplinary Conference on Drug Research” (Єленя гура, Польща, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 14 друкованих робіт, з них 7 – статті у наукових фахових журналах та 7 – тези доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 128 сторінках машинопису та складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і засобів досліджень, 4 розділів власних досліджень, заключної частини, висновків, містить 14 рисунків, 11 таблиць. Бібліографічний список літератури включає 161 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об'єкти та методи досліджень. Досліди проводили на білих нелінійних щурах самцях масою 180 - 220 г і білих нелінійних мишах самцях масою 18 – 22 г розведення віварію Одеського Медичного Університету. Тварини знаходилися на стандартному раціоні віварію і одержували їжу і питво ad libitum. Досліджувані сполуки і препарати вводили внутрішньочеревинно і перорально. В дослідах ex vivo тваринам контрольних груп вводили фізіологічний розчин. В роботі використано 150 мишей і 700 щурів. В дослідах in vitro використовувалася кров людини, отримана від здорових донорів, добровольців середнього віку.

В роботі були досліджені похідні 1,4-бенздіазепинів, арилгідразони, фенілсемікарбазони і оксими бензофенонів, сполуки групи хіназолінів, похідні піперидин-2,6-діонів і піролідин-2,5-діонів, а також RGD-пептидоміметики на основі залишків 5-оксо-5-(4-амідинопіперазин-1-іл)пентанової кислоти і 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти і D,L-b-феніл-b-аланіну. Синтез досліджених сполук було здійснено у відділі хімії біологічно активних речовин Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України (зав. відділом академік НАН України

С.А. Андронаті).

Показники часу кровотечі з хвостової вени щурів в дослідах in vivo визначалися за методом в модифікації Л.Г. Черствової. Досліджувані сполуки вводили тваринам в/чер. за 40 хв. перед дослідом в дозах 0.05 – 2.0 мг/кг. Профібринолітична активність досліджуваних сполук вивчалася за методом визначення природного лізису і ретракції кров'яного згустку (Котовщикова М.А., 1962) в дослідах ex vivo на щурах. Сполуки вводили тваринам в/чер. за 40 хв. перед дослідом в дозах 0.05 – 0.5 мг/кг. Гематокритні показники одержували за допомогою гематокритної центрифуги ЦГ 2-12 ("Тизприбор", Росія).

Антиагрегаційна активність сполук вивчалася за методом Борна (Born G.V.R., 1962) в дослідах in vitro і ex vivo на багатій на тромбоцити плазмі крові щурів, і в дослідах in vitro на багатій на тромбоцити плазмі крові людини. Кров щурів отримували від наркотизованих уретаном (1 г/кг, п/ш) тварин пункцією серця. Кров людини одержували з ліктьової вени здорових донорів середнього віку. Для отримання багатої на тромбоцити плазми крові використовували центрифугу MPW-340 ("Mechanika Precyzyjna", Польща). Кількість тромбоцитів на 1 мл плазми визначали за допомогою камери Горяєва під мікроскопом МБР-1 ("ЛОМО", Росія). Досліджувані сполуки додавали до інкубаційного середовища у розчині вероналового буфера за Овреном у кінцевих концентраціях 10-3 – 10-9 М. В якості індуктора агрегації використовували адинозиндифосфорну кислоту ("Sigma") в кінцевій концентрації 10-5 М – для крові тварин, 10-6 М – для крові людини. Інкубацію багатої на тромбоцити плазми з досліджуваними сполуками проводили протягом 1 хв. при 37°С і перемішуванні. Агрегацію тромбоцитів визначали на агрегометрі THROMLITE-1006А ("БИОХИММАК", Росія) з графічним записом на самописному приладі LINE RECORDER TZ 4100 ("Laboratorni Pristroije", Чехія). Величина IC50 (концентрація, в якій сполука інгібує агрегацію на 50%) визначалася за кривою доза-ефект. При вивченні антиагрегаційної активності ex vivo на щурах (Gerhard S., 1986) досліджувані сполуки або комбінації сполук вводили тваринам перорально в дозі 0.5 мг/кг, двічі: напередодні і за 1 год. перед дослідом.

Антиагрегаційна активність в дослідах ex vivo проліків на основі нових RGD-пептидоміметиків вивчалася за допомогою гібридного метода (Weller T., 1996) на мишах та щурах. Мишам вводили досліджувану сполуку перорально в дозі 100 мг/кг за 1 год. перед декапітацією. Послідовні розведення мишачої плазми додавали до БТП крові щурів і визначали об'єм плазми, необхідний для інгібування АДФ-викликаної агрегації на 50%, виходячи з котрого вираховували оральну дозу досліджуваної сполуки, яка викликає інгібування агрегації на 50% (ID50).

Вивчення впливу RGD-пептидоміметиків на зв'язування міченого флуоресцеїном фібриногену (FITC-Fg) з його рецептором GР IIb/IIIa проводили на відмитих тромбоцитах крові людини. Суспензію тромбоцитів отримували з багатої на тромбоцити плазми свіжої крові здорових донорів (Abelson J., 1989). Відмивали кров'яні пластинки за допомогою буфера Тіроде. Для стабілізації суспензії відмитих тромбоцитів використовували 0.1%-вий розчин апірази ("Sigma") і простагландин E1 (PGE1, "ACROS") в кінцевій концентрації 100 нМ. Одержані тромбоцити зберігали активність протягом 3 – 4 год. Фібриноген (Fg, "Sigma") мітили (Hantgan R., 1987) флуоресцеїнізотіоціанатом (FITC, "ACROS"). Виділення міченого фібриногену (FITC-Fg) проводилося хроматографічно на SephadexТ G-25 Superfine ("Pharmacia"). Концентрації FITC-Fg і молярне співвідношення флуоресцеїну до білка (F:P) контролювали за допомогою спектрофотометра СФ-46 ("ЛОМО", Росія). Зв'язування FITC-Fg з його рецептором GP IIb/IIIa проводили при кімнатній температурі в темряві протягом 1 години (Xia Z., 1996) в пластмасовому посуді фірми SARSTEDT (Німеччина). Спочатку тромбоцити інкубували з досліджуваними сполуками в кінцевих концентраціях від 10-6 М до 10-12 М при 37° С протягом 15 хв. Перед внесенням FITC-Fg в кінцевій концентрації 10-6 М додавали АДФ в кінцевій концентрації 2.10-6 М для активації тромбоцитів. Для забезпечення високої точності дозування в роботі використовували дозатори фірми Eppendorf (Німеччина). Для маскування місць неспецифічного зв'язування застосовували бичачий сироватковий альбумін (БСА, "Sigma"). Для виділення тромбоцитів, що зв'язалися з міченим фібриногеном здійснювали центрифугування через 20 %-вий розчин сахарози. Флуориметричні показники одержували на флуориметрі СДЛ-1 ("ЛОМО", Росія). Значення величини IC50 знаходили графічно з кривої доза-ефект.

Статистичну обробку даних (обчислення середніх величин, помилок середніх величин, коефіцієнта кореляції, критерію Ст'юдента) проводили з використанням методів параметричної і непараметричної статистики за допомогою програми “Microsoft Excel” для Windows-2000.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вивчення антигемостатичних і антиагрегаційних властивостей похідних 1,4-бенздіазепину і близьких за структурою сполук. Було проведене дослідження антиагрегаційної і антигемостатичної активності відомих препаратів: феназепаму (1) і гідазепаму (2), а також їх похідних і метаболітів. В якості препаратів порівняння були використані ацетилсаліцилова кислота (АСК) і анксіолітик з антиагрегаційними властивостями альпразолам (Sherry S., 1991). Як показали проведені дослідження антигемостатичної активності, феназепам в дозі 0.07 мг/кг подовжував час кровотечі на 22.1 % у порівнянні з контролем, що відповідає активності відомих препаратів АСК і альпразоламу (Таблиця 1).

Гідазепам (2) за результатами цього ж тесту виявив найбільшу активність в дозі 0.5 мг/кг і при цьому подовжував час кровотечі на 72.2 % у порівнянні з контролем (Рис. 1).

Таблиця 1.

Антигемостатична активність феназепаму і гідазепаму в дослідах in vivo на щурах.

Сполука Кількість тварин Доза, мг/кг Подовження часу кровотечі, % від контролю

Феназепам 11 0.07 22.1 ± 1.4*

Гідазепам 7 0.1 19.4 ± 1.1*

13 0.25 28.4 ± 2.0*

13 0.5 72.2 ± 4.9**

12 0.75 58.7 ± 3.2*

8 1.0 22.1 ± 1.3*

14 2.0 9.6 ± 0.5*

АСК 18 0.5 20.8 ± 1.4**

Альпразолам 7 0.5 22.1 ± 1.5*

Примітка. У даному випадку та надалі: * - р < 0.05, ** - р < 0.01.

Рис. 1. Залежність антигемостатичної активності гідазепаму від дози.

Дослідження антиагрегаційної активності цих двох сполук показало, що вони знижують агрегацію тромбоцитів у дослідах in vitro на 36 %, що відповідає показнику активності АСК.

Далі пошук сполук з антиагрегаційною активністю проводився в ряду похідних 1,4-бенздіазепину. Було вивчено антиагрегаційні властивості активного метаболіту феназепаму - 3-оксифеназепаму (3), а також складних ефірів 3-оксифеназепаму (4 – 7) загальної формули:

Усі досліджені сполуки виявили антиагрегаційні властивості, виражені різною мірою залежно від їх структури. Так, антиагрегаційну активність на рівні ацетилсаліцилової кислоти мають феназепам (1), гідазепам (2) і циназепам (7) (Рис. 2). Найвища активність характерна для 3-оксифеназепаму (3) з подальшим зменшенням її для 1,3-діацетил-3-оксифеназепаму (5) та його 3-ацетильного похідного 6. Значно меншу антиагрегаційну активність порівняно з вивченими сполуками мав нікотинат 3-оксифеназепаму (4). Слід відмітити, що за антиагрегаційною активністю сполуки 3, 5 та 6 не поступаються описаним у літературі похідним 1,4-бенздіазепинового ряду – клоназепаму і діазепаму з аналогічними значеннями ІС50 (Berry C., 1992).

Рис. 2. Інгібування агрегації тромбоцитів у багатій на тромбоцити плазмі крові щурів, виражене у значеннях ІС50 (мМ). Кількість визначень 6 – 8.

Таким чином, одержані експериментальні результати свідчили про перспективність пошуку потенційних антитромботичних засобів серед похідних 1,4-бенздіазепину та близьких за структурою сполук.

Була перевірена здатність впливати на функції тромбоцитів стереоізомерних похідних арилгідразонів і фенілсемікарбазонів 5-бром-2-амінобензофенону (8 – 13) загальної формули:

Всі вивчені сполуки продемонстрували виразну антигемостатичну активність, яка перевищувала активність контрольних сполук в 2–4 рази. Син- і анти-ізомери п-нітрофенілгідразону 5-бром-2-амінобензофенону 8, 9 виявляли найбільшу антигемостатичну активність у порівнянні із стереоізомерними парами фенілсемікарбазонів. За своїми антиагрегаційними властивостями, поданими в значеннях ІС50, досліджені сполуки розташувалися аналогічно. Необхідно відмітити виразну залежність антигемостатичної і антиагрегаційної активності сполук від їх геометрії. У випадку стереоізомерних пар 8, 9 і 12, 13 активнішими виявилися син-ізомери, тоді як у випадку стереоізомерів 10 і 11 більш активним був анти-ізомер. Отримані дані дають підставу для продовження вивчення антиагрегаційної активності і її зв'язку із структурою гетероциклічних сполук, близьких за структурою до бенздіазепинів. З метою пошуку нових потенційних серцево-судинних засобів була досліджена антиагрегаційна активність ряду a- і b-оксимів 2-аміно-5-заміщених бензофенонів (14 – 18), а також хіназолінів (19-24).

В ряді похідних 2-аміно-5-заміщених бензофенонів найбільш активним антиагрегантом виявився a-оксим 14 a (ІС50 = 0.38 мМ). Порівняння антиагрегаційної активності двох пар оксимів (сполуки 14 a, 14 b і 15 a, 15 b), дає підставу відмітити, що a-оксими мають більшу активність, ніж b-оксими. Антиагрегаційна активність хіназолін 3-оксидів 20 – 24 була вище активності відповідних оксидів 14 – 18. Вивчені сполуки виявилися в 2-3 рази більш активними за АСК (ІС50 = 1.1 мМ). Тому їх можна вважати перспективними речовинами в плані вивчення механізму їх антиагрегаційної дії і пошуку нових ефективних серцево-судинних засобів на основі вивчення залежності "структура – активність" сполук, які мають такі властивості.

Пошук фармакологічно активних композицій на основі комбінацій гідазепаму з АСК. Проведено пошук комбінацій гідазепаму з АСК, в котрих застосування гідазепаму дозволило б підвищити антиагрегаційну активність у порівнянні з відомими раніше засобами (Heye B., 1991; De la Cruz J., 1991). Були досліджені антигемостатичні властивості різних комбінацій гідазепаму з АСК у співвідношеннях від 1:0.5 до 1:10. Найбільша активність виявилася у комбінації гідазепам : АСК у співвідношенні 1:1, обидві сполуки у дозі 0.5 мг/кг. Ця комбінація подовжувала час кровотечі на 81.6 %. Перспективними були також комбінації гідазепам : АСК = 1:3 (80.9%), 1:5 (79.0 %), де гідазепам брався у дозі 0.5 мг/кг, АСК у дозі 1.5 мг/кг і 2.5 мг/кг, відповідно. Майже всі варіанти комбінацій гідазепаму з АСК виявили антигемостатичну активність, вищу на 37 – 124 % за активність комбінації альпразоламу з АСК, взятих в їх фармакологічних дозах. Ефект найбільш перспективних комбінацій гідазепаму з АСК перевищував антигемостатичний ефект ацетилсаліцилової кислоти в 3.4 – 3.9 рази, а ефект альпразоламу – в 3 рази. Дослідження профібринолітичної активності комбінації гідазепаму з АСК (1:1) в дозі 0.5 мг/кг ex vivo також виявило синергічність дії препаратів у комбінації. Вивчення антиагрегаційної активності в дослідах in vitro показало, що комбінація гідазепаму з АСК у співвідношенні 1:1 на 82.5% у порівнянні з контролем інгібує агрегацію тромбоцитів, що значно перевишує ефект АСК (31.1 %) і гідазепаму (36.1 %), взятих окремо. Дослідження показало, що гідазепам у дозі 0.5 мг/кг інгібує ex vivo агрегацію тромбоцитів на 36.5 % у порівнянні з контролем, АСК у дозі 0.5 мг/кг - на 56.5 %, а при їх сумісному введенні в дозі 0.5 мг/кг (комбінація 1:1) амплітуда агрегації знижувалася на 71.8 % (Рис 3).

Рис. 3. Антиагрегаційна активність гідазепаму і його комбінації з ацетилсаліциловою кислотою (1 : 1) в дослідах in vitro (A) і ex vivo (Б) на щурах. Криві, зображені на рисунку, виведені з семи експериментів.

- контроль, ? – гідазепам, ї - АСК, ў - гідазепам / АСК (1:1).

Токсичність комбінації гідазепаму з АСК визначалася через 24 години після введення комбінації препаратів внутрішньо білим мишам. ЛД50 комбінації складала 1600 мг/кг [1500 ё 1850].

Дослідження антиагрегаційних властивостей похідних 3-амінопіперидин-2,6-діонів і 3-амінопіролідин-2,5-діонів. Одним з напрямків пошуку сполук з антиагрегаційними властивостями стало вивчення речовин, що містять гетероциклічні фрагменти. З літератури відомий широкий ряд сполук різноманітної структури, які мають антиагрегаційну активність. Потенційними антиагрегантами є пирідилоксазоли і їх 4,5-дигідроаналоги (Демина О.В., 1995), похідні імідазохінолін-2-ону (Meanwell N., 1993), піперидин-3-карбоксамідів (Zheng X., 1995). З метою знайти більш активні у відношенні до функцій тромбоцитів сполуки було досліджено ряд похідних 3-амінопіперидин-2,6-діонів і їх аналогів - 3-амінопіролідин-2,5-діонів (25 – 35). Як свідчать дані експериментальних досліджень (Табл. 2), всі вивчені сполуки різною мірою інгібують агрегацію тромбоцитів, викликану АДФ. Антиагрегаційна активність 3-амінопіперидин-2,6-діону (25) була в 2.5 рази нижчою за активність АСК. Введення замісників у положення 1 і 3, як похідних піперидину, так і похідних піролідину приводить до отримання сполук, порівняних за антиагрегаційною дією з АСК або перевищуючих її. Очевидно, що найбільший внесок у збільшення активності робить залишок піридину в положенні 1, що узгоджується з літературними даними про позитивний вплив залишків піридину на антиагрегаційну активність

(Демина О.В., 1995).

Об'єднання фрагментів 3-амінопіперидин-2,6-діону і гідазепаму в одну структуру привело до отримання сполуки 36, яка продемонструвала високу антиагрегаційну активність (IC50 = 0.09 мМ), що на порядок перевищувала дію ацетилсаліцилової кислоти.

Таблиця 2.

Антиагрегаційна активність похідних 3-амінопіперидин-2,6-діонів і

3-амінопіролідин-2,5-діонів в дослідах in vitro на БТП щурів.

R1 R2 n m сполука IC50, мМ

H H 1 2 (25) 2.65 ± 0.18*

Boc піридил-2 0 2 (26) 0.80 ± 0.07*

Boc піридил-3 0 2 (27) 0.66 ± 0.05*

Boc піридил-4 0 2 (28) 0.82 ± 0.05*

H піридил-2 2 2 (29) 0.89 ± 0.07*

H піридил-3 2 2 (30) 0.36 ± 0.02*

H піридил-4 2 2 (31) 0.70 ± 0.05*

H піридил-2 2 1 (32) 0.95 ± 0.06*

H піридил-3 2 1 (33) 0.80 ± 0.07*

Pro піридил-2 2 2 (34) 0.80 ± 0.07*

Thz піридил-2 2 2 (35) 1.00 ± 0.09*

АСК 1.1 ± 0.08**

Таким чином, отримані результати свідчать про перспективність вивчення сполук ряду похідних 3-амінопіперидин-2,6-діонів і 3-амінопіролідин-2,5-діонів для виявлення нових антитромботичних речовин.

Дослідження антиагрегаційних властивостей RGD-пептидоміметиків і визначення механізму їх дії. Відомо, що вирішальним етапом агрегації тромбоцитів є зв'язування фібриногену з активованим глікопротеїном IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), розташованим на мембрані тромбоцитів (Xia Z., 1996). В цей час вже знайдено багато антагоністів GP IIb/IIIa, включаючи непептидні інгібітори. Більшість з цих сполук імітують RGD-фрагмент фібриногену. З метою пошуку нових потенційних антагоністів фібриногенових рецепторів були досліджені пептидоміметики 37 і 38 на основі залишку 5-оксо-5-(4-амідинопіперазин-1-іл)пентанової кислоти і D,L-b-феніл-b-аланіну. Також був вивчений ряд RGD-пептидоміметиків на основі 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти і D,L-b-феніл-b-аланіну (39 – 42).

Вплив на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів в дослідах на тваринах був вивчений для сполук 37 – 40. Усі досліджені сполуки за своєю антиагрегаційною активністю перевищували природний RGD-пептид на 1 – 3 порядки (Табл. 3).

Таблиця 3.

Антиагрегаційна активність RGD-пептидоміметиків

в дослідах in vitro на БТП щурів і людини.

Сполука БТП щурів, IC50, мкМ БТП людини, IC50, мкМ

37 0.016 ± 0.0008* -

38 0.032 ± 0.002* -

39 0.0087 ± 0.00005* 0.033 ± 0.002*

40 0.57 ± 0.03* -

41 - 0.99 ± 0.05*

42 - 0.0015 ± 0.0001*

RGD 3.61 ± 0.29* -

Вплив на агрегацію тромбоцитів, викликану АДФ, сполук 39, 41 і 42 був вивчений в дослідах на БТП крові людини. Сполука 39 при цьому продемонструвала таку ж високу антиагрегаційну активність, що і в дослідах на тваринах, з IC50 = 0.033 мкМ. Заміна залишку фенілу в b-положенні b-аланіну на залишок b-фторфенілу знизила активність сполуки 41 (IC50 = 0.99 мкМ), в той час як заміщення згаданого залишку фенілу 3,4-диметоксифенілом навпаки привело до підвищення антиагрегаційної активності на порядок (IC50 = 0.0015 мкМ). Цей факт, певно, можна пов'язати з впливом замісників на куполоподібну залежність "ліпофільність – антиагрегаційна активність", наявність якої була продемонстрована Акіто Танака із співавторами для RGD-пептидоміметиків – похідних FK 633 (Tanaka A., 1996). Наступним кроком в дослідженні стало визначення механізму дії нових сполук.

Дві з досліджених сполук, найбільш активні за антиагрегаційною дією, 39 і 42, були вивчені в дослідах по інгібуванню специфічного зв'язування FITC-міченого фібриногену з його рецепторами на суспензії відмитих тромбоцитів крові людини. Обидві сполуки виявили високу активність в цих дослідах (Рис. 4). Пептидоміметик 39 витісняв фібриноген з місць специфічного зв'язування з IC50 = 22 нМ, сполука 42 виявилася на порядок активнішою (IC50 = 0.7 нМ), що також узгоджується з ефектом антиагрегаційної дії цих двох речовин. Токсичність досліджуваних пептидоміметиків виявилася низькою (ЛД50 > 500 мг/кг). Одержані дані свідчать про те, що нові пептидоміметики 39 і 42 є високоактивними антагоністами фібриногенового рецептора GP IIb/IIIa.

Рис. 4. Вплив пептидоміметиків 39 (·) та 42 (ѕ) на специфічне зв'язування FITC-фібриногену с рецепторами на тромбоцитах.

З літератури відомо, що для поліпшення антиагрегаційної активності при пероральному введенні RGD-пептидоміметиків використовується такий підхід, як синтез проліків на основі високоактивних пептидоміметиків (Klein S.I., 1998). З метою підвищення активності при пероральному введенні був синтезований метиловий естер сполуки 39. Антиагрегаційна активність одержаного естера за умов перорального введення була вивчена в гібридному досліді ex vivo на мишах і щурах. Досліджена сполука виявилась активною при пероральному введенні , при цьому значення ID50 дорівнювало 10 мг/кг.

Отже, проведений пошук речовин з антиагрегаційними властивостями дозволив виявити ряд сполук, активних в інгібуванні функцій тромбоцитів, серед препаратів і сполук різної хімічної структури.

ВИСНОВКИ

1. Показана наявність високої антигемостатичної і антиагрегаційної активності у психотропних препаратів 1,4-бенздіазепинового ряду і їх похідних: феназепаму, гідазепаму, сполук із снотворною і анксіолітичною дією – циназепаму, 3-оксифеназепаму і його ацетильних похідних.

2. Виявлено, що арилгідразони і фенілсемікарбазони 2-амінобензофенонів і споріднені з ними за структурою a- і b-оксими 2-аміно-5-заміщених бензофенонів і дигідрооксихіназолін-3-оксиди в дослідах in vivo та in vitro мають антигемостатичну і антиагрегаційну активність, яка значною мірою залежить від їх геометрії і перевищує активність АСК. Відмічено, що в більшості випадків син-ізомери вищенайменованих сполук продемонстрували більш високу антиагрегаційну активність, ніж їх анти-ізомери.

3. Продемонстрована можливість спільного застосування АСК і денного анксіолітика гідазепаму і виявлені нові фармакологічно активні композиції, які мають високу антигемостатичну і антиагрегаційну активність в дослідах in vivo, in vitro і ex vivo. Рекомендована композиція АСК і гідазепаму, максимальний синергічний ефект котрих відмічається при їх спільному застосуванні в малих дозах у співвідношенні 1 : 1.

4. Виявлено, що найбільший внесок у підвищення антиагрегаційної активності похідних 3-аміно-піперидин-2,6-діону і 3-аміно-піролідин-2,5-діону робить залишок піридину в першому положенні піперидинового і піролідинового кілець. Введення фрагменту гідазепаму в молекулу 3-аміно-піперидин-2,6-діону на порядок збільшує антиагрегаційну активність одержаної сполуки у порівнянні з вихідною.

5. Виявлено, що нові лінійні RGD-пептидоміметики виявляють високу антиагрегаційну активність в дослідах in vitro на плазмі крові щурів і людини з ІС50 в межах 10-7 – 10-9 М і являють собою перспективні сполуки в якості антиагрегаційних засобів для лікування серцево-судинних захворювань.

6. Показана перспективність пошуку активних при пероральному введенні антиагрегантів в ряді похідних RGD-пептидоміметиків.

7. Установлено, що нові лінійні RGD-пептидоміметики є ефективними антагоністами фібриногенових GP IIb/IIIa рецепторів, внаслідок чого інгібують специфічне зв'язування міченого флуоресцеїном фібриногену з його рецепторами на тромбоцитах, виділених з плазми крові людини, з ІС50 порядку 10-8 – 10-10 М.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Andronati S.A., Kabanov V.M., Karaseva T.L., Korotenko T.I., Mazurov A.A., Kabanova T.A. and Krysko A.A. Pseudopeptides with antithrombotic activity // In book "Peptides 1994", Ed. by Y.L.S. Maia. Proceedings of the Twenty-Third European Peptide Symposium. -ESCOM, Leiden. - 1995. - Р. 383-385.

2. Andronati S.A., Karaseva T.L., Kabanova T.A., Pavlovsky V.I., Yavorsky A.S. Arylhydrazones and phenylsemicarbazones of 2-aminobenzophenones as antithrombotic agents. // Die Pharmazie. - 1995.- Vol.50, H.9. - P. 632-633.

3. Кабанова Т.А., Андронаті К.С., Бєлікова М.В., Павловський В.І., Карасьова Т.Л. Антиагрегаційні властивості феназепаму та його похідних. // Фармацевтичний журнал. - 1997. - № 4. - С.69-71.

4. Крысько А.А., Кабанов В.М., Кабанова Т.А., Беликова М.В., Мазепа А.В. Синтез и антиагрегационная активность производных 3-аминопиперидин-2,6-дионов и 3-аминопирролидин-2,5-дионов // Хим.-фарм. журн. – 1997. - Т. 32, № 6. – С.18-20.

5. Карасева Т.Л., Беликова М.В., Павловский В.И., Андронати К.С., Кабанова Т.А. Влияние in vitro производных 1,2-дигидро-3Н-1,4-бенздиазепин-2-она на агрегацию тромбоцитов и перекисное окисление липидов у крыс // Укр. біохім. журн. – 1998. – Т. 70, № 5. – С.81-85.

6. Павловский В.И., Куликов О.В., Карасева Т.Л., Кабанова Т.А., Мазепа А.В., Андронати С.А. Синтез и антиагрегационные свойства оксимов 2-амино-5-замещеных бензофенонов и 1,2-дигидрохиназолин 3-оксидов // Укр. хим. журн. – 1998. –Т. 64, № 12. – С. 123-128.

7. Андронати С.А., Крысько А.А., Карасева Т.Л., Кабанов В.М., Кабанова Т.А., Павловский В.И. Синтез и антиагрегационные свойства нового пептидомиметика - 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)-бутирилглицил-b-фенил-b-аланина и его метилового эфира как перорально активного пролекарства // Фізіол. акт. речовини. – 1999. -№ 2 (28). – С. 6-11.

8. Andronati S.A, Kabanov V.M., Karaseva T.L., Kabanova T.A., Krysko A.A. Pseudopeptides with antithrombotic activity // 23-rd European Peptide Symposium. – Braga (Portugal). - 1995. - Р. 154.

9. Андронаті С.А., Яворський О.С., Кабанова Т.А., Карасьова Т.Л., Павловський В.І. Антигемостатична та профібринолітична активність деяких похідних 1,4-бенздіазепинів у щурів // Школа академіка О.І.Черкеса: ідеї, розвиток, перспектива. Наукова конференція, присвячена 100-річчю з дня народження академіка О.І.Черкеса. – Київ. – 1994. –С. 102-103.

10. Павловський В.І., Кабанова Т.А. Антитромботична активність арилгідразонів та фенілсемікарбазонів 2-амінобензофенонів // “Сучасні проблеми фармакології”. Тез. доп. Першого національного з'їзду фамакологів України. – Полтава. – 1995. - С. 125.

11. Андронаті С.А., Павловський В.І., Крисько А.А., Кабанов В.М., Кабанова Т.А. Синтез RGD-пептидоміметика на основі 1,4-бенздіазепину // Тез. докл. Укр. конф. “Хімія азотовмісних гетероциклів” (ХАГ- 97). – Харків. –1997. – С. 16.

12. Андронаті С.А., Крисько А.А., Кабанова Т.А., Кабанов В.М., Павловський В.І., Карасьова Т.Л., Мазепа О.В., Поліщук П.Г. Синтез нового ефективного RGD-міметика // Тез. доп. XVIII Укр. конф. з орг.хімії. – Ч. 1. - Дніпропетровськ. – 1998. - С. 16-17.

13. Андронати С.А., Карасева Т.Л., Кабанова Т.А., Кабанов В.М., Крысько А.А., Павловский В.И., Мазепа А.В. Синтез и биологическая активность новых RGDF-пептидомиметиков на основе 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)-бутановой кислоты // “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті”. Матеріали V Національного з'їзду фарма-цевтів України. – Харків: Золоті сторінки, УкрФа. – 1999. – С. 403-404.

14. Andronati S.A., Krysko A.A.., Kabanov V.M., Karaseva T.L. Kabanova T.A. Synthesis and properties of peptidomimetics – platelet aggregation inhibitors. // The Second Multidisciplinary Conference on Drug Research, MKNOL-2000. - Jelenja gora – Cieplice (Poland). – 2000. – W-7.

АНОТАЦІЇ

Кабанова Т.А. Інгібітори агрегації тромбоцитів, похідні лінійних пептидоміметиків і гетероциклічних сполук. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. – Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2000.

Проведене вивчення антитромботичних властивостей похідних 1,4-бенздіазепину і сполук спорідненої структури, похідних піперидин-2,6-діону і піролідин-2,5-діону, а також лінійних RGD-пептидоміметиків. Встановлено, що похідні 1,4-бенздіазепину, арилгідразони, фенілсемікарбазони і оксими бензофенонів, а також хіназоліноксиди мають виразну антигемостатичну і антиагрегаційну активність, порівняну з активністю ацетилсаліцилової кислоти або більшу. На тому ж рівні інгібують агрегацію тромбоцитів і похідні піперидин-2,6-діону і піролідин-2,5-діону. В дослідах in vivo, in vitro і ex vivo вивчена антигемостатична і антиагрегаційна дія комбінацій гідазепаму і ацетилсаліцилової кислоти. Встановлено, що найбільший ефект дає комбінація 1:1 в малих дозах. Нові лінійні RGD-пептидоміметики виявили високу антиагрегаційну активність в дослідах in vitro на крові людини. Механізм їх дії полягає в інгібуванні зв'язування фібриногену з його рецептором (глікопротеїновий комплекс GP IIb/IIIa) на тромбоцитах, що дозволяє розглядати вивчені пептидоміметики як антагоністи фібриногенових рецепторів.

Ключові слова: агрегація тромбоцитів, антиагрегаційна активність, антигемостатична активність, похідні 1,4-бенздіазепину, фібриноген, глікопротеїновий комплекс GP IIb/IIIa, RGD-пептидоміметики, антагоністи фібриногенових рецепторів.

Кабанова Т.А. Ингибиторы агрегации тромбоцитов, производные линейных пептидомиметиков и гетероциклических соединений. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Одесский государственный медицинский университет МЗ Украины, Одесса, 2000.

Проведено изучение антитромботических свойств производных 1,4-бенздиазепина (в том числе психотропных препаратов феназепама и гидазепама) и соединений родственной структуры, производных пиперидин-2,6-диона и пирролидин-2,5-диона, а также линейных RGD-пептидомиметиков.

Установлено, что препараты феназепам и гидазепам обладают выраженной антигемостатической и антиагрегационной активностью, превышающей активность ацетилсалициловой кислоты. Значение концентрации полуингибирования, в которой соединение на 50% снижает амплитуду агрегации тромбоцитов по сравнению с контролем (IC50) для ацетилсалициловой кислоты составляет 1.1 мМ. В ряду других производных 1,4-бенздиазепина наиболее активными антиагрегантами оказались: соединение со снотворным эффектом циназепам и обладающий высокой анксиолитической активностью метаболит феназепама – 3-оксифеназепам, а также его ацильное производное (IC50 для производных 1,4-бенздиазепина находится в пределах 0.5 – 2.5 мМ). Изучение рядов производных арилгидразонов, фенилсемикарбазонов и оксимов аминобензофенонов, а также хиназолиноксидов выявило наличие существенной антиагрегационной активности (IC50 в пределах 0.4 – 0.9 мМ), в определенной степени зависящей от геометрии молекул.

В опытах in vivo, in vitro и еx vivo на животных изучены различные комбинации совместного применения ацетилсалициловой кислоты и дневного анксиолитика гидазепама. Обнаружено, что максимальный синергический эффект данных препаратов при проверке антигемостатической и антиагрегационной активности проявляется при их одновременном применении в малых дозах в соотношении 1:1, причем результаты, полученные в опытах in vitro, подтверждаютс данными еx vivo экспериментов. Показано, что токсичность комбинации низкая, ЛД50 составило 1600 мг/кг.

В ряду производных пиперидин-2,6-дионов и их аналогов, производных пирролидин-2,5-дионов, обнаружены соединения, обладающие антиагрегационной активностью, сравнимой с активностью ацетилсалициловой кислоты либо превышающей ее. К повышению активности приводит наличие пиридинового заместителя в первом положении кольца. Введение в молекулу 3-аминопиперидин-2,6-диона фрагмента гидазепама повышает его активность более, чем на порядок (IC50 = 0.09 мМ).

Новые линейные RGD-пептидомиметики, изученные в опытах in vitro на крови животных и человека, по влиянию на агрегацию тромбоцитов оказались высокоэффективными антиагрегантами с IC50 в пределах 1 – 100 нМ. Была также показана возможность получения на их основе соединений с высокой антиагрегационной активностью при пероральном введении. Изучение влияния вышеназванных пептидомиметиков на специфическое связывание флуоресцеин-фибриногена с его рецепторами на тромбоцитах крови человека позволило выявить механизм действия этих соединений и показало, что они являются антагонистами фибриногеновых рецепторов (гликопротеиновый комплекс GP IIb/IIIa). Исследованные RGD-пептидомиметики вытесняют фибриноген из мест его специфического связывания с рецепторами на тромбоцитах с высокими показателями IC50 для связывания, порядка 10-9 – 10-10 М.

Ключевые слова: агрегация тромбоцитов, антиагрегационная активность, антигемостатическая активность, производные 1,4-бенздиазепина, фибрино-ген, гликопротеиновый комплекс GP IIb/IIIa, RGD-пептидомиметики, антагонисты фибриногеновых рецепторов.

Kabanova T.A. Antiaggregants, derivatives of linear peptidomimetics and heterocyclic compounds. – The manuscript.

Thesis for a candidate's degree in Biological Sciences on speciality 14.03.05 – pharmacology. – Odessa State Medical University of Ministry of Public Health of Ukraine, Odessa, 2000.

The antithrombotic properties of 1,4-benzodiazepine derivatives and related structures, piperidine-2,6-dione and pyrrolidine-2,5-dione derivatives, and linear RGD-peptidomimetics were investigated. It was established that 1,4-benzodiazepi-ne derivatives, arylhydrazones, phenylsemicarbazones and oximes of benzo-phenones, and quinazolineoxides possessed a distinct antihaemostatic and anti-aggregative activities equal to these of acetylsalicylic acid or higher ones. Piperidine-2,6-dione and pyrrolidine-2,5-dione derivatives inhibited the platelet aggregation on the same level. Antihaemostatic and antiaggregative effects of guidazepam and acetylsalicylic acid combinations were investigated in experiments in vivo, in vitro and ex vivo. The low dose combination 1:1 was recognized as the most effective. The novel linear RGD-peptidomimetics exhibited high antiaggregatory potency in bioassays on human blood. The mechanism of their action was proved to be the inhibition of fibrinogen binding to its platelet receptor (glycoprotein complex GP IIb/IIIa). It permitts to consider the investigated peptidomimetics as fibrinogen receptor antagonists.

Key Words: platelet aggregation, antiaggregative activity, antihaemostatic activity, 1,4-benzodiazepine derivatives, fibrinogen, glycoprotein complex GP IIb/IIIa, RGD-peptidomimetics, fibrinogen receptor antagonists.