НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНCТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Попова Антоніна Федорівна

УДК 531.5:576.331+58.084

ГРАВІЧУТЛИВІCТЬ ОДНОКЛІТИННИХ ОРГАНІЗМІВ

03.00.22 – Клітинна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук

Київ – 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі клітинної біології та анатомії Інституту

ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України.

Науковий консультат – доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Кордюм Єлизавета Львівна, Інститут ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України, заступник директора.

Офіційні опоненти:

·

Карпат НАН України , завідуючий відділом;

·

Михайлівна, Національний ботанічний сад ім. М.М.Гришка, директор;

·

НАН України, головний науковий співробітник.

Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики

НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться "21 " вересня 2000 р. о 14.00 годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.202.01 при Інституті клітинної

біології та генетичної інженерії НАН України, 03143, Київ-143, вул.

Академіка Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту клітинної біології та

генетичної інженерії НАН України, 03143, Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 148.

Автореферат розісланий " 21 " серпня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Тарасенко Л.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

АКТУАЛЬНІСТЬ ТЕМИ. Не дивлячись на актуальність даної проблеми, дослідження ролі сили тяжіння в еволюції і життєдіяльності організмів були неможливі, оскільки гравітація як один із найважливіших геофізичних факторів, від якого не можна екрануватися, постійно діє на Землі. Лише із запуском першого штучного супутника Землі (ШСЗ) відкрилася унікальна можливість проводити експерименти безпосередньо в умовах космічного польоту і вивчати вплив невагомості та прискорень різних за величиною, які імітують величину та направленість гравітаційного вектора, на життєдіяльність організмів.

Постійне перебування організмів в умовах гравітації сприяло тому, що організми реагують на дію гравітації зміною форми, пози чи характеру руху безпосередньо або з допомогою формування спеціальних рецепторів гравітації різного ступеню складності. У спеціалізованих клітинах вищих рослин останні представлені статолітами різних типів (Hodick, 1996; Brown, 1997; Volkmann, Tevinkel, 1996), які можуть переміщатися у клітині в умовах зміни положення відносно напрямку гравітаційного вектора, включаючи механізми передачі гравітаційного сигналу в місця гравітаційної відповіді (Perbal, 1996).

Зовсім не вивченим залишалося принципове питання про гравічутливість організмів, які не мають спеціалізованих органел для гравісприйняття. Стосовно нерухомих одноклітинних, у яких жодна з клітинних органел не виконує спеціалізованої гравірепторної функції, дані про їх грівічутливість взагалі були відсутні. Однак, інформація про гравічутливість організмів та їх адаптаційні можливості в умовах мікрогравітації є необхідною для розробки космічних біотехнологій, пов‘язаних з відбором компонентів автотрофної ланки контрольованих екологічних систем життєзабезпечення людини на космічних літальних апаратах. Причому, в таких системах, поряд з вищими рослинами, одноклітинні рослинні та бактеріальні організми будуть виступати як невід’ємні компоненти фітотрофної ланки (Ресhurkin, 1998). Дослідження гравічутливості, зокрема одноклітинних, також є актуальними для пізнання ролі гравітації в розвитку і життєдіяльності організмів, що наближає нас до розкриття механізмів дії гравітації та її сприйняття на клітинному та субклітинному рівнях і закладає теоретичні основи космічних клітинних технологій. Особливо слід підкреслити, що результати біологічних експериментів з використанням одноклітинних організмів мають фундаментальне значення, оскільки вони базуються на оцінках стану цілісного організму, а не окремих його клітин.

Результати попередньо проведених на початку 60-х років експериментів з одноклітинними організмами, які перебували у стані спокою в умовах космічного польоту (Семененко, Владимирова, 1961; 1962; Ваулина и др., 1978; Bulban, 1961), показали відсутність суттєвого впливу факторів космічного польоту на основні фізіологічні показники одноклітинних, мутаційний процес та репродукцію клітин у післяпольотний період, тому в своїх дослідженнях ми перейшли до експериментів на культурах мікроорганізмів, які знаходилися в умовах мікрогравітації у фізіологічно-активному стані. Розпочаті нами в кінці 70-х років космічні експерименти з фізіологогічно-активними культурами одноклітинних (Кордюм и др., 1976; Ваулина и др., 1978; Сытник и др., 1979; Сытник и др., 1983; Попова, Кордюм, 1991) дозволили оцінити ефекти факторів космічного польоту за широким спектром показників, включаючи ростові, структурні та фізіолого-біохімічні характеристики.

ЗВ‘ЯЗОК ДИСЕРТАЦІЙНОЇ РОБОТИ З НАУКОВИМИ ПРОГРАМАМИ, ПЛАНАМИ, ТЕМАМИ. Основу для написання дисертаційної роботи складають дослідження автора, проведені протягом 1974 -1999 рр. Узагальнені в дисертаційній роботі матеріали було отримано в процесі виконання наукових планових досліджень у відділі клітинної біології і анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України за темами:

1.

2.

1975 р.– IV кв. 1978 р., тема № 62;

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

МЕТА ТА ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ. Метою даної роботи є узагальнення закономірностей впливу мікрогравітації та кліностатування на структурно-функціональні показники одноклітинних організмів – бактеріальні і водоростеві клітини, які не мають спеціалізованого гравірецептора; критичний аналіз власних та літературних даних і розробка концепції про гравічутливість про- та еукаріотичних одноклітинних організмів.

Для досягнення вказаної мети були поставлені основні конкретні завдання:

1)

2)

3)

4)

5)

6)

НАУКОВА НОВИЗНА ТА ПРАКТИЧНА ЦІННІCТЬ РОБОТИ. Вперше на основі комплексних досліджень виявлена гравічутливість одноклітинних організмів, яка проявлялася у змінах ростових та ультраструктурних показників в умовах мікрогравітації, що заперечує нуль-гіпотезу Е.Полларда (Pollard, 1966) про неможливість впливу мікрогравітації на бактеріальні клітини внаслідок їх невеликого розміру. Вперше проведено цитологічний аналіз клітин двох видів зеленої водорості Chlorella в процесі культивування її в авто- та гетеротрофному режимах як монокультури або у складі полікомпонентних систем у різних за тривалістю експериментах в умовах мікрогравітації. На підставі перебудов ультраструктури та метаболізму клітин встановлена закономірність залежності розмаху спектру та глибини змін субмікроскопічної організації клітин від особливостей об‘єкту, попередньо заданих умов експерименту та тривалості культивування одноклітинних організмів в умовах космічного польоту. В модельних дослідах з використанням горизонтальних кліностатів відмічено суттєву подібність спектру ультраструктурних перебудов клітинних компартментів з тими, що спостерігаються у клітинах Chlorella в умовах мікрогравітації, хоча часові характеристики таких перебудов не співпадають. Показано, що як в умовах мікрогравітації, так і симульованої мікрогравітацїі відбуваються перебудови, перш за все, енергетичних органел клітин Chlorella, причому виявляється чітка залежність спектру структурних перебудов від тривалості дії мікрогравітації та кліностатування. Отримано докази щодо посилення функціональної активності енергетичних органел, у першу чергу мітохондрій, на основі одержаних нами даних про їх ультраструктурну організацію, активність ферментів енергетичного обміну – АТФаз, сукцинатдегідрогеназ (СДГ), вміст аденілатів та рівень дихання клітин в умовах кліностатування та мікрогравітації. Вперше встановлено інтенсифікацію гідролізу запасних полісахаридів у хлоропластах клітин Chlorella як в умовах космічного польоту, так і кліностатування, що проявлялося у підвищенні активності та розширенні спектру множинних молекулярних форм (ММФ) амілаз за рахунок розчинних, функціонально активніших форм. Вперше зареєстровано явище посилення інфікування клітин зеленої водорості Сhlorella в умовах мікрогравітації бактеріальними клітинами Pseudomonas sp. На основі узагальнення одержаних експериментальних і літературних даних розроблена концепція гравічутливості одноклітинних організмів.

Результати досліджень використано для написання 69-го тому серії “Проблемы космической биологии” – “Шляпочные грибы и водоросли – объекты космической биологии”, М., Наука, 1991, а також монографій: “Влияние факторов космического полета на развивающиеся организмы“, К., Наук. думка, 1978; “ Микрорганизмы в космическом полете“, К., Наук. думка, 1983; “Результаты исследований на орбитальных станциях “Салют“, М., Наука, 1984. Отримані дані використовуються у навчальних програмах та спецкурсах з клітинної біології та альгології на кафедрі біології природничого факультету Національного університету “Києво-Могилянська Академія“. Встановлені ростові закономірності та особливості життєдіяльності бактеріальних і водоростевих культур на основі оцінки ультраструктури клітин мають цінність для відбору компонентів автотрофної ланки контрольованих екологічно замкнених систем життєзабезпечення людини на космічних літальних апаратах.

АПРОБАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДИСЕРТАЦІЇ. Матеріали дисертації обговорювалися на засіданнях відділу клітинної біології і анатомії та Вченої ради Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України (Київ, 1975-1999 рр.), засіданні відділення Загальної біології НАН України (Київ, 1997), науково-технічних конференціях з електронної мікроскопії (Ташкент, 1976; Рига, 1978; Кишинів, 1981; 1990), 10-ій нараді з питань кругообігу речовин у замкнених системах на основі життєдіяльності нижчих організмів, (Канів, 1976), конференціях “Гравитация и организм“ (Москва, 1974), “Реакции клеток на внешние воздействия“ (Ленінград, 1986), “Биоспутники“ (Москва, 1991), 10-ій конференції “Космическая и авиакосмическая медицина“ (Москва, 1994), 1-ій всесоюзній та 2-ій міжнародній конференціях “Актуальные вопросы альгологии“ (Черкаси, 1986; Київ, 1998), симпозіумах “Ультраструктура растительной клетки“ (Кишинів, 1983; Київ, 1988 ), 2-му та 3-му симпозіумах “Клеточные механизмы адаптации“ (Карадаг, 1985; Чернігів, 1988), а також були представлені на сесіях Міжнародного комітету з космічних досліджень (COSPAR) (Бангалор, 1980; Оттава, 1982; Грац, 1984; Тулуза, 1986; Еспоо, 1988; Гаага, 1990; Вашингтон, 1992; Гамбург, 1994; Бірмінгем, 1996, Варшава, 2000), на конгресах Міжнародної федерації астронавтики (IAF) (Рим, 1981; Будапешт, 1983; Вашингтон, 1989; Дрезден, 1989; Єрусалим, 1993; Осло, 1995; Турин, 1997), на Всесвітньому космічному конгресі (Вашингтон, 1992), 4-му Європейському міжнародному конгресі з клітинної біології (Прага, 1994), на міжнародному конгресі “Человек в космосе“ (Вашингтон, 1997), на міжнародних симпозіумах з гравітаційної фізіології (Рено, 1995; Рим, 1998; Орландо, 1999; Нагоя, 2000).

ОСОБИСТИЙ ВНЕСОК АВТОРА полягає у постановці завдань, плануванні експериментів, визначенні методів, проведенні експериментальних робіт і інтерпретації результатів, узагальненні отриманих даних.

ПУБЛІКАЦІЇ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ. Матеріали дисертації викладено у 86 публікаціях, у тому числі у 3 монографіях (у співавторстві), статтях у провідних вітчизняних та міжнародних журналах, збірках, матеріалах вітчизняних і міжнародних конференцій, нарад, симпозіумів, із них 33 статті надруковано у реферованих фахових вітчизняних та іноземних журналах.

СТРУКТУРА РОБОТИ. Дисертаційна робота складається зі вступу, восьми розділів, підсумкової частини, висновків, списку робіт дисертанта та списку цитованої літератури (569 бібліографічних джерел). Текст дисертації викладено на 303 сторінках машинописного тексту, включаючи 11 таблиць, 3 гістограми, 2 графіки, 1 схему та 44 рисунки, змонтовані з 99 електронних мікрофотографій.

ОCНОВНИЙ ЗМІCТ РОБОТИ

Вступ містить відомості про необхідність і важливість досліджень гравічутливості одноклітинних організмів, у яких не відомі спеціалізовані гравірецепторні органели (за винятком Loxodes, у якого роль гравірецептора виконує тільце Мюллера) (Neugebauer, Machemer, 1997). На основі теоретичних розрахунків вважалось (Pollard, 1966), що дрібні одноклітинні організми (розміром до 10 мкм), не можуть сприймати гравітацію, оскільки процеси дифузії у невеликому об‘ємі клітини, очевидно, конкурують з конвекцією та Броунівським рухом молекул.

Обгрунтовується доцільність використання для вивчення гравічутливості організмів на клітинному та субклітинному рівнях зручних модельних систем, однією із яких є одноклітинні організми завдяки їх невеликим розмірам, високій здатності до розмноження (завдяки чому протягом короткого періоду можуть сформуватися числені покоління) та досить широкому температурному діапазону для оптимального росту. Підкреслюється, що результати біологічних експериментів із використанням одноклітинних організмів мають фундаментальне значення, оскільки вони базуються на оцінках стану цілісного організму, і тому дають підставу для екстраполяції одержаних результатів з клітинного рівня на організмений. Обговорюється актуальність дослідження гравічутливості для розробки теоретичних уявлень про механізми дії гравітації та сприйняття її на клітинному та субклітинному рівнях, прогнозування поведінки організмів в умовах мікрогравітації на основі їх адаптаційних можливостей, розробки космічних біотехнологій, пов‘язаних з відбором компонентів автотрофної ланки для контрольованих екологічних систем життєзабезпечення людини на космічних літальних апаратах.

Розділ 1. Об‘єкти і методи дослідженнь. Об’єктами дослідження були грамнегативні палочковидні рухомі бактерії Proteus vulgaris Hauser (родина Enterobacteriaceae) (Bergy, 1974) та два види одноклітинної зеленої водорості Сhlorella – Ch. vulgaris Beijer. (штам ЛАРГ-1) та Ch. pyrenoidosa Chick (штам g-11-1). Добре вивчена біологія даного виду бактерій, а також висока швидкість росту (тривалість ділення клітини складає всього 15-20 хвилин), рухливість (окрім звичайних клітин, є ще особлива рухлива форма – швермери з 10-кратно збільшеною кількістю джгутиків) та широкий температурний діапазон росту (від 18 до 37о С) зумовили вибір P. vulgaris для космічних досліджень.

Відібрані штами Сhlorella використовувалися в космічних експериментах завдяки їх високій швидкості росту на різних поживних середовищах, стійкості до коливання зовнішніх факторів, у першу чергу. до змін температури, здатності рости протягом тривалого часу на органічних поживних середовищах, не втрачаючи інтенсивності зеленого забарвлення в умовах темряви (штам ЛАРГ-1). Штам g-11-1, жовтого кольору пігментний мутант, дефіцитний за хлорофілом, виявився зручним об‘єктом для проведення експериментів у гетеротрофному режимі на борту космічних літальних апаратів. Культивування P. vulgaris в аеробних умовах проводили на традиційному м'ясо-пептонному бульоні (МПБ) з додаванням нейтральних полімерів (декстрану-80 або агару Дифко) для подолання осідання клітин (Сытник и др., 1983). Для анаеробного вирощування P. vulgaris також використовували напіврідке поживне середовище (МПБ, розведений дистильованою водою у співвідношенні 1:1 з додаванням нейтральних полімерів). Для чіткої ідентифікації фронту росту бактерій, який у ряді експериментів контролювався космонавтами, в поживне середовище додавали солі тетразолію – 2.3.5 -трифеніл тетразолій бромід (2,3,5-ТФТБ) (Сытник и др., 1983).

Космічні експерименти з культурами бактерій Proteus виконано на борту: ШСЗ "Космос-654" (тривалість експерименту 57 год, аеробні умови культивування); космічного корабля (КК) "Союз-19" (експеримент "Ріст мікроорганізмів" згідно з радянсько-американською науковою програмою "Союз-Аполон”, тривалість експерименту 6 діб, анаеробні умови); КК "Союз-22" (тривалість експерименту 7 діб, анаеробні умови).

Експерименти з культурами Chlorella проведені в умовах космічного польоту в процесі вирощування її як монокультури, так і в складі полікомпонентних систем (ПКС). Дані про їх тривалість, місце проведення, поживне середовище та вид Chlorella зведено у таблиці 1.

Інокуляцію культури проводили на Землі за 1-2 доби до старту КК, префіксацію – безпосередньо після закінчення експерименту на борту космічного апарату або через певні проміжки часу після його приземлення. У ряді експериментів інокуляція культури Chlorella та префіксація як бактеріальної, так і водоростевої культур для електронно-мікроскопічного дослідження виконана космонавтами в умовах мікрогравітації з метою запобігання впливу динамічних факторів на культури під час спуску КК. Усі процедури подальшої підготовки матеріалу для цитологічних досліджень після приземлення виконані на базі Інституту медико-біологічних проблем МОЗ Росії (м. Москва). Фіксацію культури здійснювали згідно з розробленою нами для даних об‘єктів методики (Сытник и др., 1983).

У модельних експериментах використано штам ЛАРГ-1, який вирощували на горизонтальних кліностатах зі швидкістю обертання 2 об/хв та 3 об/хв. Тривалість експериментів в умовах кліностатування була різною, в залежності від поставленої мети (від 15 хв до 45 діб).

Ультратонкі зрізи готували за допомогою ультрамікротому LKB-8800 (Швеція, LKB). Зрізи контрастували як цитратом свинцю за Рейнольдсом (Reinolds, 1976), так і насиченим водним розчином уранілацетату протягом 35-40 хв. Зрізи вивчали в електронних мікроскопах JEM-100 B та 1200 ЕХ (Jeol, Японія) при прискорюючій напрузі 60 або 80 кв. Фотографували об‘єкти на негативних фотопластинках типів РА і ОRVO.

Електронно-цитохімічне виявлення локалізації Mg2+-активованих АТФаз виконували за методом Вакстейна-Мейзель у модифікації Н.В. Беліцер (Belitser et al., 1982).

Вміст аденілатів визначали за допомогою високочутливого люциферин-люциферазного методу (люциферин-люцифераза, "Sigma", Німеччина) з використанням поліфункціонального хемілюмінометра ХЛМН-01 (НВО ім. Корольова, Київ) за методикою (Мalik, Thimann, 1980).

Таблиця 1. Експерименти, виконані з культурами Chlorella vulgaris i Chlorella

pyrenoidosa на різних космічних апаратах.

Тривалість експерименту | Космічний апарат | Режим культивування | Поживне середовище | Вид

Chlorella

4.5 діб | ОС " Салют-6 " | Світло | Напіврідке | Сh. vulgaris

5 діб | ОС " Салют-6 " | Темрява | Напіврідке | Сh. vulgaris

7 діб | ОС " Мир " | Світло | Водне, ПКС | Сh. vulgaris

9 діб | ОС " Салют-6 " | Світло | Напіврідке | Сh. vulgaris

9 діб | ОС " Мир " | Темрява | Тверде | Сh. vulgaris

10.5 діб | ОС " Салют-6 " | Темрява | Тверде | Сh. vulgaris

12 діб | БС " Біон-10" | Темрява | Тверде | Сh. vulgaris

13 діб | БС"Космос-1887" | Світло | Водне, ПКС | Сh. vulgaris

18 діб | ОС " Салют-6 " | Темрява | Тверде | Сh. vulgaris

28 діб | ОС " Салют-6 " | Темрява | Напіврідке | Ch. pyrenoidоsa

30 діб | ОС " Мир " | Темрява | Тверде | Сh. vulgaris

4 місяці | ОС " Мир " | Темрява | Тверде | Сh. vulgaris

12 місяців | ОС " Мир " | Темрява | Тверде | Сh. vulgaris

Визначення інтенсивності дихання проводили полярографічним методом (Полякова и др., 1983) на полярографі ВА-2 (Угорщина).

Локалізацію іонізованого кальцію вивчали піроантимонатним методом за Тандлером зі співавторами (Tandler et all., 1971).

Загальну активність СДГ визначали калориметричним методом (Ермаков, 1972). Вимірювання активності СДГ проводили на ФЕК М-56 з зеленим світлофільтром, активність ферменту підраховували в мікрограмах відновленого тетразолію (Сысоева, Краснова, 1967).

ММФ СДГ клітин Chlorella визначали методом диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі при силі струму 4 мА з наступним проявленням ізоформ безпосередньо на гелі (Сафонов, Сафонова, 1971; Brever, 1970). Відносну електрофоретичну рухливість (ВЕР) вимірювали на 4-6 паралельних електрофореграмах. Одержані дані обробляли статистично (Плохинский, 1960). Кількість білку в пробах визначали за Лоурі (Lowry et al., 1953).

ММФ амілаз вивчали методом диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі (Сафонов, Сафонова, 1971). Вміст моно- та дисахаридів визначали в наважках ліофільно висушеної біомаси культури Chlorella калориметричним методом з використанням антронового синього (Борш, Степанова, 1966).

Відносний об’єм органел та складових компонентів пластид (строми, крохмальних зерен та тилакоїдів) розраховували за методом О.В.Кисельової зі співавторами (1974) з використанням негативів або фотографій зрізів цілих клітин Chlorella при збільшеннях 35000 та 60000. Для підрахунку брали по 100 клітин з кожного варіанту. Одержані емпіричні дані відносно об’єму різних органел та структурних компонентів клітин, товщини оболонок та площини зрізів клітин обробляли як за стандартними статистичними методами (Плохинский, 1960; Урбах, 1964; Бейли, 1970), так і за статистичними комп’ютерними програмами Statistica (for MS Word) та EXCEL Anova.

Розділ 2. Експерименти з одноклітинними організмами в умовах космічного польоту. У даному розділі наведено дані літератури про результати космічних експериментів, виконаних з одноклітинними організмами, зокрема бактеріями, найпростішими, дріжджами та водоростями, у яких вивчали інтенсивність росту культур та загальний приріст біомаси, виживання спор у залежності від тривалості перебування їх в умовах мікрогравітації, фагопродукцію бактеріальних культур, життєздатність, морфологічні та ультраструктурні особливості клітин, гравікінез, фото- та гравітаксис рухомих одноклітинних організмів. Показано досить широкий спектр змін різних параметрів одноклітинних організмів, які перебували в умовах космічного польоту.

Розділ 3. Cтруктурно-функціональна характеристика клітин Proteus vulgaris в умовах стаціонарного контролю. Описано ультраструктурні особливості клітин P. vulgaris за аеробних умов вирощування. Показана наявність у центральній частині клітин зони нуклеоїда, в якій чітко розрізняються осміофільні фібрили ДНК, встановлена присутність у клітині дрібногранулярних включень, простої форми інвагінацій цитоплазматичної мембрани, додаткових шарів клітинної оболонки. Відмічено, що в клітинах Proteus vulgaris, які виросли в анаеробних умовах, зона нуклеоїда не так чітко виділяється, спостерігається посилення гірозності клітинної оболонки та наявність на її поверхні матеріалу середньої електронної щільності. Не виявлено відмінностей в ультраструктурі клітин P. vulgaris між двома варіантами контролю (Київ – лабораторний контроль, Байконур – транспортний контроль), вирощених у аеробному та анаеробному режимах.

В умовах додавання у поживні середовища (МПБ та МПА) 2.3.5 -ТФТБ у клітинах P. vulgaris як в аеробних, так і анаеробних умовах відмічалося утворення гранул формазану яскраво-рожевого кольору в різних зонах клітини, причому в анаеробних умовах спостерігалася більша різноманітність топографії преципітату. За різним ступенем насиченості цитоплазми клітин рибосомами, відносним об‘ємом гранул формазану та їх різної локалізації, наявністю фібрилярно-гранулярних та мембранних включень виділено 7 типів клітин.

Для оцінки функціонального стану клітин P. vulgaris як факультативного анаероба були вибрані дегідрогенази, зокрема СДГ, яка є найважливішим показником рівня біологічного окислення як в аеробних, так і в анаеробних умовах (Авакян и др., 1982). Проведені дослідження з використанням різних солей тетразолію показали, що в процесі ферментативного відновлення утворюється лише важкорозчинний формазан у місцях, де проявляється активність СДГ. У випадку використання 2.3.5-ТФТБ як індикатора дегідрогеназ, локалізація продукту реакції та розмір гранул, які мають вигляд електронно-прозорих зон внаслідок вимивання продукту реакції підчас зневоднення, дає підставу зробити висновок, що такі відкладення формазану є результатом його неферментативного відновлення внаслідок неспецифічної реакції зв’язування солей тетразолію. Найінтенсивніша реакція на СДГ проявлялася в клітинах у логарифмічній фазі росту культури.

Розділ 4. Ультраструктура клітин Proteus vulgaris в умовах космічного польоту

4.1. Ультрастрктурна організація клітин P. vulgaris, вирощених в аеробних умовах на борту ШCЗ "Космос-654". На основі порівняльних електронно-мікроскопічних досліджень встановлено відмінності між клітинами P. vulgaris, вирощеними в умовах космічного польоту, та контрольними за рядом показників, зокрема, наявністю в дослідних клітинах нетипових для даного виду бактерій різної форми компактних нуклеоїдів (тісно згруповані фібрили ДНК у таких нуклеоїдах розташовані майже паралельно одна до одної). У залежності від щільності групування фібрил ДНК виділено два типи нуклеоїдів. На основі вимірювання площі зрізів клітин, дрібногранулярно-фібрилярних включень та товщини клітинних оболонок встановлено достовірну різницю між дослідними та контрольними клітинами. Електронно-мікроскопічний аналіз показав, що дослідні клітини характеризувалися: 1) меншим розміром; 2) наявністю компактно розташованих фібрил ДНК (у 7% клітин); 3) більш рівномірним розподілом рибосом у цитоплазмі клітин і відсутністю чітко вираженої зони нуклеоїда в центральній частині клітин; 4) збільшенням відносного об‘єму дрібногранулярно-фібрилярних включень та більшою частотою трапляння їх на зрізах клітин; 5) посиленою гірозністю клітинної оболонки; 6) розширенням периплазматичного простору; 7) меншою кількістю гранулярно-фібрилярного матеріалу на поверхні клітинних оболонок, аж до його повної відсутності.

Таким чином, на основі порівняльних досліджень ультратруктури клітин Proteus vulgaris, які виросли в аеробних умовах на борту ШСЗ "Космос-654" та в умовах стаціонарного лабораторного контролю, виявлено більш прискорений ріст культури в умовах космічного польоту, що свідчить про зміни рівня клітинного метаболізму, які корелювали з появою ряду ультраструктурних змін дослідних клітин порівняно з контрольними.

4.2. Ультраструктурна характеристика клітин P. vulgaris, вирощених в анаеробних умовах на борту космічного корабля "Cоюз-19". Наявність таких модифікуючих факторів, як анаеробіоз та додавання в поживне середовище 2.3.5 -ТФТБ, суттєво впливала на структуру та форму дослідних клітин. Виділено різні типи клітин стосовно їх форми, розміру та форми відкладень формазану в усіх чотирьох каналах приладу "Ріст-3" (ріст бактерій в них проходив: 1) лише в умовах космічного польоту; 2) частково у космосі; 3) продовження росту було вже на Землі або 4) лише на Землі). Аналіз розподілу різних типів клітин у різних каналах приладу "Ріст-3" показав, що кількість клітин 1-го типу (які не мають гранул формазану) значно менша в усіх каналах польотного варіанту порівняно з контрольними. У 2-ому каналі, де клітини росли лише в умовах космічного польоту, клітин 1-го типу було майже у 2 рази менше порівняно з контролем. Відмічено, що ряд інших показників клітин, які виросли у польотному варіанті, маскувалися анаеробіозом, зокрема, гірозність оболонки, збільшення об’єму дрібногранулярних включень у цитоплазмі клітин та частоти трапляння їх на зрізах.

Таким чином, на основі порівняльних досліджень ультраструктури клітнн P. vulgaris, які виросли в умовах космічного польоту та стаціонарного контролю на Землі, встановлено відмінності між варіантами як за частотою зустрічаємості клітин різних типів, так і за топографією локалізації відкладень важкорозчинного формазану. Аналіз частоти трапляння клітин різних типів показав певне пригнічення росту клітин P. vulgaris як в анаеробних умовах в орбітальному польоті, так і в післяпольотний період на Землі.

4.3. Ультраструктурна організація клітин Р. vulgaris у приладах "Ріст -3" в анаеробних умовах на борту космічного корабля "Cоюз-22". Аналіз ультрастуктурних особливостей клітин 1-го та 2-го каналів (враховуючи 7-добову тривалість експерименту, культура Р. vulgaris знаходилася у кінці стаціонарної фази росту), показав значну варіабельність клітин за щільністю цитоплазми, наявністю дрібногранулярно-фібрилярних включень та їх об‘ємом, а також за об‘ємом відкладень легкорозчинного формазану. Встановлена значна подібність клітин, які виросли в умовах мікрогравітації протягом даного експеримету, з такою в експерименті "Ріст мікроорганізмів" (КК "Союз-19"). Це пояснюється безперечно, в першу чергу, наявністю модифікуючих факторів (анаеробіоз, додавання у поживне середовище індикатора росту 2.3.5 -ТФТБ). Особливості росту культури у даному експерименті проявилися, перш за все, у прискореному старінні культури, оскільки морфологічні ознаки її співпадали з такими клітин, які були характерні для стаціонарної фази росту.

Проведені дослідження на клітинах популяції бактерій Р. vulgaris, які знаходилися в умовах космічного польоту у функціонально-активному стані, показали, що за оптимальних умов росту культури Р. vulgaris спостерігається поява чітких відмінностей за ультраструктурними показниками порівняно з клітинами контрольнмих варіантів на фоні прискореного ділення клітин в умовах космічного польоту. Зміна умов культивування бактерій при мікрогравітації (шляхом додавання в поживне середовище індикаторів росту та створення умов анаеробіозу) викликала ультраструктурні перебудови клітин, які не реєструвалися за оптимальних умов вирощування культури. Аналіз частоти трапляння різних типів клітин показав певне інгібування росту клітин Р. vulgaris за несприятливих умов вирощування бактерій в мікрогравітації, тобто, ступінь прояву ефектів космічного польоту залежав, значною мірою, від умов проведення експерименту, що чітко спостерігалося на структурному рівні.

Розділ 5. Cтруктурно-функціональні особливості клітин Chlorella vulgaris i Chlorella pyrenoidosa в умовах стаціонарного контролю

5.1. Ростові показники. У зв’язку з тим, що вирощування культури Chlorella проводили на різних за консистенцією поживних середовищах (рідкому, напіврідкому та твердому агаризованому) в умовах стандартної інокуляції та інокуляції методом окремих колоній (залежно від мети експерименту), було вивчено закономірності росту культури в цих умовах. Показано, що ріст культури Chlorella протягом логарифмічної та стаціонарної фаз у рідкому та напіврідкому поживних середовищах як у автотрофному, так і гетеротрофному режимах здійснювався згідно із закономірностями, що описуються S-подібною кривою. На твердому агаризованому середовищі тривалість як лаг-фази, так і логарифмічної та стаціонарної фаз значно подовжувалася, вихід культури на плато спостерігався після 25-30 діб її росту з моменту інокуляції. На основі вимірювання розміру колоній та підрахунку кількості клітин у колоніях однакового діаметра не встановлено достовірної різниці за кількістю клітин в умовах вертикального і горизонтального положення чашок Петрі в процесі вирощування культури.

5.2. Ультраструктура клітин Chlorella vulgaris і Chlorella pyrenoіdosa. У даному розділі наведені результати порівняльного електронно-мікроскопічного аналізу клітин обох штамів Chlorella, вирощених в авто- та гетеротрофному режимах на різних за консистенцією поживних середовищах. Виявлено певні відмінності у субмікроскопічній організації клітин, перш за все хлоропластів, в умовах росту культури в рідкому, напіврідкому та твердому поживних середовищах. Показано, що клітини обох штамів містять усі основні органели, які властиві для рослинної клітини, у тому числі для водоростевих клітин (Rosen et al., 1984) – ядро з ядерцем, мітохондрії, диктіосоми, нечисленні канали ендоплазматичного ретикулуму та дрібні вакуолі. Штам ЛАРГ-1, який відноситься до типу крохмалоносних, характеризується наявністю масивного хлоропласта чашовидної форми (40-60% об’єму клітини) з великою кількістю крохмалю. Мембранна система хлоропласта представлена пучками тилакоїдів. Загальний об’єм зерен крохмалю в хлоропласті клітин у логарифмічній фазі росту культури складає, в основному, 23,7% від загального об’єму, в стаціонарній фазі – 45-64%, що співпадає з його вмістом у клітинах інших видів Chlorella (Dodge, 1973).

Для хлоропласта клітин Chlorella штаму ЛАРГ-1 характерна наявність 1-2 піреноїдів з відносно великою амілогенною обкладкою із крохмальних зерен лінзовидної форми. Ядро клітин Chlorella відноситься до еухроматинового типу. Мітохондрії клітин Chlorella нечисленні, ортодоксальної конфігурації, з вузькими кристами, розташованими без будь-якої впорядкованості. У цитоплазмі клітин обох штамів відмічається наявність 1-2 диктіосом, мікротілець типової для водоростей структури, дрібних вакуолей та ліпідних крапель.

У клітинах штаму ЛАРГ-1, вирощених в автотрофному режимі, виявлено цікаву особливість, не описану в літературі, а саме, утворення цитоплазматичною мембраною на окремих її ділянках різних складок у вигляді петель різної форми, локалізованих переважно в периплазматичному просторі. У стаціонарній фазі росту культури відмічалася інтенсивніша вакуолізація клітин, збільшення кількості ліпідних крапель у цитоплазмі, зниження активності апарату Гольджі та ступеню розвитку ендоплазматичного ретикулуму, утворення локальних розширень перинуклеарного простору та поява дрібногранулярного матеріалу високої електронної щільності як у периплазматичному просторі, так зрідка і в складках цитоплазматичної мембрани.

Клітини пігментного мутанта штаму g-11-1 відрізняються від клітин автотрофного штаму ЛАРГ-1, перш за все, ультраструктурною організацією пластид, мембранна система яких представлена у вигляді поодиноких ламел та везикул різного розміру. Піреноїд клітин Ch. pyrenoidosa порівняно зі штамом ЛАРГ-1 має менший розмір, його матрикс не так чітко відмежовано від цитоплазми.

Таким чином, ультраструктурна організація клітин двох видів Chlorella – штам ЛАРГ-1 і штам g-11-1, використаних нами для досліджень, виявляє значну подібність за багатьма показниками. Основні відмінності спостерігаються у субмікроскопічній організації пластид.

Розділ 6. Cтруктурно-функціональні особливості клітин Chlorella vulgaris i Chlorella рyrenoidosa в умовах космічного польоту

6.1.

Експеримент тривалістю 4,5 доби.. Культура штаму ЛАРГ-1, яка виросла в умовах космічного польоту, за інтенсивністю забарвлення та ультраструктурною організацією клітин була подібна до контрольних. Проте, в багатьох клітинах дослідного варіанту відмічено зменшення амілогенної обкладки піреноїда та посилення вакуолізації у порівнянні з контролем (в 5% клітин – прогресуючу вакуолізацію). Порівняльний аналіз відносного об’єму клітинних органел показав статистично достовірні відмінності між дослідними та контрольними клітинами за об‘ємом пластид та вмістом у них крохмалю (55.74.2% – політ, 62.54.6% – контроль, 22.4 2.5% та 29.13.0%, відповідно).

Експеримент тривалістю 9 діб. Ультраструктурні показники ядра, ядерця, мітохондрій та апарату Гольджі клітин дослідного варіанту, в основному, були подібні таким контрольних варіантів. Однак, у дослідних клітинах відмічено зменшення кількості і розміру зерен крохмалю; потоншення амілогенної обкладки піреноїдів хлоропласта; появу в стромі останнього електронно-прозорих зон, не обмежених мембраною, повністю позбавлених рибосом; посилення вакуолізації не лише сформованих вегетативних клітин, але і автоспор.

Таким чином, на основі електронно-мікроскопічного та морфометричного аналізів встановлена значна подібність ультраструктури клітин дослідного та контрольного варіантів в умовах нетривалого вирощування Chlorella в автотрофному режимі в умовах космічного польоту, що дозволяє зробити висновок про відсутність суттєвого інгібуючого ефекту факторів космічного польоту на ріст культури та ультраструктуру клітин під час короткочасної дії мікрогравітації. Відмічені, в основному, зміни кількості запасних полісахаридів у хлоропластах та посилення вакуолізації свідчать про порушення вуглеводного обміну та високу активність автолітичних процесів у дослідних клітинах.

6.2.

Експеримент тривалістю 5 діб. Як за інтенсивністю забарвлення культур обох варіантів, так і за ультраструктурою виявлена значна подібність контрольних і дослідних клітин. Основні відмінності клітин, які виросли в умовах космічного польоту, від контрольних полягали у формуванні більш складних профілів ев- та інвагінацій цитоплазматичної мембрани, які на зрізах мали різну форму (у вигляді петель різного розміру, неправильно закручених чи міеліноподібних структур або не зовсім паралельних складок на певних відрізках чи купки мембран, розташованих як у периплазматичному просторі, так і в периферійних шарах цитоплазми). Крім того, відмічали появу в стромі хлоропластів електронно-прозорих зон, позбавлених рибосом. На основі морфометричного аналізу структурних компонентів хлоропласта зареєстровані достовірні відмінності за об’ємом фотосинтетичних мембран, який у дослідних клітинах зменшувався (14.01.6%) порівняно з варіантами двох лабораторних контролів (24.02.4% і 24.82.6%) та двох транспортних контролів (23.32.3% і 31.13.1%), тоді як відносні об’єми зерен крохмалю та строми пластид в усіх варіантах експерименту достовірно не відрізнялися.

Експеримент тривалістю 9 діб. Ультраструктура клітин 9-добової культури була типовою для клітин, які вирощуються за гетeротрофним режимом. Відмічалося інтенсивне нагромадження зерен крохмалю різного розміру, проте його кількість у дослідних клітинах була нижча, ніж у контролі (21.02.2% та 47.03.7% відповідно). Крім того, спостерігали потоншення амілогенної обкладки піреноїдів, посилення вакуолізації дослідних клітин, появу мітохондрій більшого розміру (0.9 -1.0 мкм у повздовжній вісі) із щільнішим, ніж у контролі, матриксом та більшою кількістю інтрамітохондріальних гранул. Наявність ультраструктурних перебудов деяких клітинних органел, перш за все хлоропластів клітин, під час нетривалого вирощування культури Chlorella в умовах космічного польоту свідчить про зміну метаболізму клітин, у першу чергу, про порушення їх вуглеводного обміну. Eкспериментальне підтвердження одержаних цитологічних даних отримано нами в результаті біохімічного дослідження культури, коли було виявлено зміни в активності амілаз та різний вміст моно- та дицукрів у дослідних клітинах порівняно з такими у контрольних.

Експеримент тривалістю 10,5 діб. Субмікроскопічна організація дослідних клітин за структурою ядра, диктіосом, ендоплазматичного ретикулуму була, в основному, подібна до такої клітин контрольних варіантів. Проте, спостерігалися певні відмінності, переважно в ультраструктурі енергетичних органел, зокрема, поява мітохондрій збільшеного розміру з розширеними кристами, а також різного розміру електронно-прозорих зон у сторомі хлоропластів, які інколи поширювалися і на пучки тилакоїдів, посилення вакуолізації клітин та порушення процесу цитокінезу.

Експеримент тривалістю 12 діб. Клітини мали ультраструктурну організацію, характерну для темнових умов вирощування культури. Загальний об’єм крохмалю в клітинах, згідно з морфометричним аналізом, досягав 53.44.1%. Клітини, які виросли в умовах космічного польоту, відрізнялися від обох варіантів контролю, перш за все, за вмістом крохмалю (14.01.5%). Електронна щільність строми хлоропластів більшості дослідних клітин знижувалася порівняно з такою у контролі. Суттєво змінювалися також ультраструктура і форма мітохондрій – збільшувався їх розмір (1.3 -1.5 мкм довжиною) та розмір крист, підвищувалася електронна щільність матриксу, зростав загальний об’єм мітохондріому (5.30.1%, контроль – 2.50.3%). Певна кількість клітин (до 7%) польотної популяції містили ядра з більшою кількістю конденсованого хроматину. Відмічалися нерівномірні розширення на певних ділянках периплазматичного простору.

Порівняльний аналіз структури дослідних клітин і клітин контрольного варіанту, виконаного згідно термограми польотного варіанту (з урахуванням підвищення температури до 30о С на борту біосупутника "Біон-10" в останній день експерименту), показав, що спектр ультраструктурних перебудов органел в умовах космічного польоту був ширшим у порівнянні з даним варіантом контролю, що свідчить про високу стабільність клітин Chlorella до дії підвищеної температури.

Експеримент тривалістю 18 діб. Ультраструктура клітин усіх варіантів (дослідного та двох варіантів контролю) була типовою для темнових