КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Пасічніченко Олег Михайлович

УДК 612.89.893

ПЕРИФЕРИЧНІ РЕФЛЕКТОРНІ РЕАКЦІЇ

КАУДАЛЬНОГО БРИЖОВОГО ГАНГЛІЯ

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця

Національної Академії Наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, академік

НАН України, професор,

Скок Володимир Іванович,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

завідувач відділу фізіології вегетативної нервової системи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Шуба Ярослав Михайлович,

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України,

провідний науковий співробітник відділу загальної

фізіології нервової системи

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник,

Берегова Тетяна Володимирівна,

Науково-дослідний інститут фізіології імені

академіка Петра Богача Київського національного

університету імені Тараса Шевченка,

старший науковий співробітник відділу фізіології та

фармакології травлення

Провідна установа: Національний медичний

університет ім. О.О. Богомольця

МОЗ України, кафедра нормальної фізіології, м. Київ

Захист відбудеться “30 “ жовтня 2000 р. о “1600“ годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 при Київському

національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою:

01033, Київ-33, вул. Володимирська,

64, біологічний факультет, ауд. 215.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “ 12“ вересня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Л. Давидовська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасні умови життя та праці вимагають від людини значного психо-емоційного напруження, яке супроводжується вираженою активацією симпатичного відділу вегетативної нервової системи. Як наслідок такої активації досить частими є порушення нормальної діяльності внутрішніх органів. У зв’язку з цим, з'ясування ролі вегетативних гангліїв у ре-гуляції вісцеральних функцій як в нормі, так і при розвитку патологічних станів, є однією з основних проблем фізіології вегетативної нервової системи.

Особливу увагу фізіологів та медиків серед вегетативних гангліїв привертає каудальний брижовий ганглій (КБГ), який є дуже важливою і досить самостійною ланкою, по відношенню до центральної нервової системи (ЦНС), у регуляції діяльності внутрішніх органів: шлунково-кишко-вого тракту (ШКТ), сечо-видільної системи та кровоносних судин.

Саме дослідження КБГ зробили найбільш вагомий внесок у з'ясування фізіологічної ролі превертебральних симпатичних гангліїв. Так, класичні роботи по вивченню провідних шляхів КБГ кота [Ноздрачев и соавт., 1970; Скок, 1970; Булыгин, Калюнов, 1971] та дослідження з використанням відведення внутрішньоклітинної активності окремих нейронів КБГ кота та морської свинки [Булыгин, Лемеш, 1971; Crowcroft et al., 1971] показали, що ці структури вегетативної нервової системи є не просто місцем перемикання нервових імпульсів з прегангліонарних волокон на постганг-ліонарні, як це було встановлено Ленглі [Langley, Anderson, 1894], а являють собою складні інтегративні центри, у яких збудження передається з аферентних волокон на еферентні нейрони, що є основою автономної регуляції гангліями діяльності внутрішніх органів за рахунок власних периферичних рефлексів. Подальші дослідження виявили, що інтегративну функцію превертебральних гангліїв забезпечують також явища конвергенції прегангліонарних і вісцеральних волокон на гангліонарних нейронах [Dalsgaard et al., 1983; Keef, Kreulen, 1990a,b], а також спонтанна ритмічна імпульсація останніх [King, Szurszewski, 1984; Gola, Niel, 1993; Miolan, Niel, 1996].

Проте, залишаються малодослідженими електрофізіологічні властивості нейронів КБГ, а також природа синаптичних нейропередавачів.

Виявлення прегангліонарних та вісцеральних аферентних синап-тичних входів до нейронів превертебральних гангліїв дало поштовх до створення гіпотези про роздільне функціонування у цих гангліях спеціалізованих провідних шля-хів від ЦНС до ефекторного органу та периферичних рефлек-торних шляхів [Janig, McLachlan, 1992], передача збудження по яких викликає певні симпатичні ефекти у внутрішніх органах. У зв'язку з цим, виникло припущення про існування в превертебральних гангліях окремих груп ней-ронів, які отримують центральні та периферичні входи. Частково експериментальне підтвердження цієї гіпотези було отримано у дос-лідах на сонячному сплетенні морської свинки [Meckler, McLachlan, 1988]. Встановлено, що у гангліях сонячного сплетення є певний електрофізіологічний тип нейронів, а саме тонічні нейрони, які переважно отримують синаптичні закінчення аферентних волокон вісцерального походження і беруть участь у організації периферичних рефлексів. Що стосується КБГ, то такі дослідження практично не проводились.

Дуже актуальною проблемою є вивчення медіаторних механізмів синаптичної передачі збудження у периферичних рефлекторних шляхах КБГ та ін-ших превертебральних гангліїв. Встановлено, що, крім холінергічної передачі, у КБГ морської свинки відбувається також нехолінергічна передача, наприклад, пептид-ергічна. Результати імуногістохімічних та електрофізіологічних досліджень показа-ли, що найбільш ймовірним кандидатом у медіатори в периферичній рефлекторній дузі є субстан-ція Р (SP) [Tsunoo et al., 1982; Dalsgaard et al., 1983; Peters, Kreulen, 1984, 1986]. Однак, більшість електрофізіологічних досліджень природи синаптичної передачі виконані на ізольованих препаратах КБГ, коли рефлекторні від-повіді в нейронах ганглія отримували при подразненні його периферичних нервів [Dun, Kiraly, 1983; Amman et al., 1988; Hankins, Dray, 1988]. Саме тому невивченим залишається питання про виділення SP у ганглії за нормальних фізіологічних умов, оскільки цей пептид, з класич-ної точки зору, завжди вважався лише медіатором болю [Maggi, 1991]. Крім того, до кінця не з’ясовано участь різних підтипів нейрональних тахікінінових рецепторів у SP-ергічній передачі. Відсутні також дані про участь SP у синаптичній передачі збудження через КБГ інших видів ссавців.

У зв’язку з вищенаведеним, уявляється актуальним подальше вивчення механізмів замикання периферичних рефлексів у КБГ, зокрема, за умов проведення експериментів, найбільш наближених до нормальних фізіологічних умов.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу було виконано в рамках наукових тем відділу вегетативної нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця: "Функціональна організація і хімічна чутливість нейронів симпатичних і парасимпатичних гангліїв” (1993 – 1998 рр.), номер держреєстрації 0193U018970, і “Дослідження хемокерованих каналів нейронів вегетативних гангліїв” (1996 – 1998 рр.), номер держреєстрації 0196U022952.

Мета та задачі дослідження. Мета роботи полягала у з'ясуванні механізмів периферичних рефлекторних реакцій каудаль-ного брижового ганглія морської свинки і щура.

Головні задачі роботи: 1) провести дослідження провідних шляхів периферичних нервів КБГ морської свинки і щура; 2) дослідити рефлекторні реакції нейронів КБГ морської свинки у відповідь на подразнення механорецепторів товстого кишечника та з'ясувати механізми синаптичної передачі при виконанні цих реакцій; 3) дослідити роль SP у синаптичній передачі збудження в КБГ щура та морської свинки, вивчаючи перебіг периферичних рефлекторних реакцій ганглія під впливом SP та її антагоністів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено сис-тематичне дослідження периферичних рефлекторних шляхів КБГ щура та встановлено замикання у ганглії дуг справжніх периферичних рефлексів. Показано, що організація периферичних рефлекторних шляхів КБГ щура має свої специфічні особливості, у порівнянні з такою КБГ морської свинки.

Вперше проведено порівняльний аналіз деяких електрофізіоло-гічних показників, а саме, величин мембранного потенціалу спокою (МПC) та вхідного опору (Rin), нейронів КБГ морської свинки за умови повної ізоляції ганглія та КБГ, який зберігає нервовий зв’язок з відрізком ободової кишки. За таких умов також встановлено, що іс-нує різниця у співвідношенні фазних і тонічних нейронів в залежності від типу досліджуваного препарата. Крім того, вперше у КБГ морської свинки зареєстровано активність пейсмекероподібних нейронів (ППН), яка проявлялася ритмічними розрядами потенціалів дії (ПД).

Дослідження фонової активності нейронів КБГ морської свинки, за умови збереження нервового зв'язку ганглія з органом-мішенню (відрізок ободової кишки), а також її рефлекторних змін в результаті подразнення механорецепторів кишки, показало, що із дистальних відділів товстого кишечника до нейронів КБГ існують потужні синаптичні входи. При цьому вперше встановлено, що синаптичні закінчен-ня аферентних вісцеральних волокон отримують переважно тонічні нейрони.

Вперше зареєстровано ефект пригнічення синаптичної пе-редачі у периферичних рефлекторних шляхах КБГ щура під дією неселективного блокатора SP-ергічної передачі капсаіцину та селективного антагоніста тахікінінових NK3-рецепторів SR 142801, що свідчить про медіаторну або модуляторну роль SP у синаптичній передачі збудження в цьому ганглії, дія якої, до того ж, може опосередковуватись NK3-рецепто-рами.

Практичне значення одержаних результатів. З'ясування механізмів периферичних рефлекторних реакцій КБГ як важливої ланки у регуляції фізіологічних процесів ШКТ і органів сечовидільної системи має суттєве практичне значення для нев-ропатології, гастроентерології та урології, оскільки ряд розладів моторики цих органів, а також розвиток запальних процесів, пов'язані з порушенням нормальної діяльності КБГ [Bartho, Holzer, 1985; Habler et al., 1992; Janig W., Koltzenburg, 1990]. Результати даної роботи, зокрема ті, що стосуються функціонування периферичних рефлексів, які виникають внаслідок подразнення механорецепторів ободової кишки, дають фізіологічне обгрунтування методу пневмобалонної стимуляції товстого кишечника, що застосовується у клінічній практиці для лікування післяопераційних парезів ШКТ [Скоморовский, 1999].

Інформація про участь NK3-рецепторів у SP-ергічній передачі збудження буде корисною фар-макологам, які розробляють нові фармакологічні препарати для ліку-вання розладів моторики товстого кишечника, пов'язаних із порушеннями симпатичної регуляції з боку КБГ.

Дані про електрофізіологічну неоднорідність нейронів КБГ морської свинки, наявність ППН та участь SP як медіатора у синаптич-ній передачі збудження в периферичних рефлекторних шляхах КБГ мають також вагоме теоретичне значення, оскільки розширюють уявлення про інтегративну роль превертебральних гангліїв.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем самостійно проведено теоретичні пошуки, експериментальні дослідження та аналіз отриманих результатів.

Апробація результатів роботи. Результати досліджень, на-ведених у дисертаційній роботі, доповідались і обговорювались на семінарах відділу вегетативної нервової системи та загальноінсти-тутських семінарах сектору нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (1995-1998 р.р.), на науковій конференції студентів та молодих науковців біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (1993р.) та XV з'їзді Українського фізіологічного това-риства (Донецьк, 1998 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 робіт (3 статті і тези 2 доповідей).

Структура і обсяг роботи. Робота викладена на 179 сторінках машинописного тексту. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, об’єкта та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел із 209 найменувань. Робота містить 37 рисунків та 1 таблицю.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Об'єкт та методи досліджень

Дослідження проведені у гострих дослідах на 96 морських свинках масою 280 – 300 г після їх умертвіння шляхом зміщення шийних хребців і 65 білих щурах (180-200 г), наркотизованих уретаном (1 г/кг маси тварини) за допомогою внутрішньо-очеревинного уведення.

Одна частина експериментів in vitro виконана на ізольова-них КБГ обох видів піддослідних тварин, а друга – на ізольованих комбінованих препаратах морської свинки, що складались з КБГ та відрізка дистального відділу ободової кишки, які пов'язані між собою поперековими ободовими нервами [Peters, Kreulen, 1996; Parkman et al., 1993]. Для дослідження провідних шляхів КБГ використовували методику відведення сумарних потенціалів дії (СПД) від одних нервів ганглія при подразненні інших його нервів, у поєднанні з фармакологічною блокадою синаптичної передачі антагоністом нейронних нікотинових рецепторів бензогексо-нієм (10-4М). Ізольований КБГ, разом з його нервами, очищали від сполучно-тканинних оболонок і розміщували у камері, яку перфузували (2 – 2,5 мл/хв) розчином Тіроде [Amman et al., 1988] кімнатної температури, насиченим карбогеном (95% О2 і 5% СО2). Нерви утягували в подразнюючий та відвідний скляні електроди-піпетки. Індиферентні хлор-срібні електроди занурювали у фізрозчин поряд із ганглієм. Нерви подразнювали прямокутними імпульсами струму тривалістю 0,5 мс або серіями цих імпульсів від стимулятора ЕСУ-2. Електричні відповіді нервів підсилювали за допомогою підсилювача змінного струму із смугою пропускання 2,2–1600 Гц і фотографували з екрана осцилографа С1-93, використовуючи фотореєстратор ФОР-3. За осцилограмами визначали амплітуду та площу СПД.

В частині експериментів за 7–14 діб до досліду під уретановим (щури) та каліпсоловим (морські свинки; 40 мг/кг) наркозом виконували перерізки нервів КБГ за такою схемою, коли лише один з периферичних нервів залишався інтактним (підчеревний, ободовий або міжбрижовий тракт (МБТ)), а інші, разом з центральними поперековими черевними нервами, – перерізали. МБТ вважали теж "периферичним", оскільки в його складі проходять чутливі волокна периферичного походження [Keef, Kreulen, 1990a,b]. Цей метод забезпечував дегенерацію прегангліонарних волокон і запобігав механізму аксон-рефлексу.

Для розрахунку швидкості проведення збудження по нервових волокнах та величини синаптичної затримки, нерви всмоктували у подразнюючу та відвідну піпетки на різній відстані від ганглія і вимірювали латентні періоди (ЛП) СПД та його складових частин. Синаптичну затримку визначали як різницю між ЛП окремого компонента СПД та часом проведення імпульсу, розрахованим за швидкістю проведення збудження у окремій групі волокон, які викликають цей компонент, беручи до уваги, що швидкість постійна впродовж усієї відстані від місця подразнення до місця відведення [Хируг, 1979].

У дослідах з внутрішньоклітинною реєстрацією активності нейронів, ізольовані ганглії та комбіновані препарати розміщували у камері, перфузованій підігрітим (37оС) та насиченим карбогеном розчином Тіроде, температуру якого підтримували на постійному (+0,50) рівні за допо-могою ультратермостата (1ТЖ-0-03) і контролювали електротермомет-ром.

Щоб отримати комбінований препарат, ганглій і пов'язаний з ним за допомогою ободових нервів сегмент ободової кишки (4 – 5 см), а також каудальну брижову артерію, відпрепарову-вали разом, ізолювали і розміщували у двохсекційній камері. Ганглій фіксували у одному відсіку, а в іншому – відрізок кишки. Нерви перекидали через перегородку камери і накривали шматочком марлі, змоченої фізіологічним розчином. В кожний відсік по проточній системі роздільно подавали збагачений карбогеном та підігрітий розчин Тіроде (37оС).

Для подразнення рецепторів розтягання кишки застосовували роздування її відрізку повітрям. Один кінець відрізка кишки перев’язували, а в другий вставля-ли канюлю, сполучену через трійник зі шприцем, за допомогою якого в порожнину кишки могло нагнітатися повітря, і водяним манометром для контроля тиску у пневматичній системі. Подразнення механорецепторів виконували в діапазоні надлишкового тиску від 5 до 20 см водн.ст.

Реакції окремих нейронів КБГ на пряме подразнення через мікроелектрод та на розтягання кишки вивчали за допомогою стан-дартної методики внутрішньоклітинного відведення. Мостова схема на вході катодного повторювача дозволяла через один і тей же мікроелектрод відводити електричні реакції нейрона і пропус-кати імпульси струму для його прямої стимуляції. Використовували звичайні скляні мікроелектроди, заповнені 2,5 М КСl, які мали опір 60-100 МОм.

З катодного повторювача досліджуваний сигнал подавався на підсилювач постійного струму, а далі на осцилограф з фотореєстратором.

Статистичну обробку даних проводили з використанням t-критерію Стьюдента і критерію Пірсона (2) за допомогою аналітичних пакетів COPLOT і STATGRAPHICS. Вірогідними вважались результати із рівнем значущості p<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Електрофізіологічні властивості нейронів КБГ морської свинки та щура. За характером відповідей на пряме подразнення через мікроелектрод деполяризуючим імпульсом струму тривалістю 500 мс усі досліджені нейрони КБГ морської свинки у складі препарату "КБГ - кишка" (55 клітин) можна було чітко розділити на два типи: фазні (42% загального числа досліджених нейронів) і тонічні (58%). Як показано на рис.1, фазні нейрони генеру-вали один або декілька ПД лише на початку подачі імпульсу струму (А; 1). Збільшення сили подразнення не впливало на характер відповідей цих нейронів (А; 2). У тонічних нейронів ПД виникали ритмічно впродовж усього періоду стимуляції (Б;1,2), а їхня частота зростала із збільшенням сили імпульсу струму. У 15 тонічних клітин, що мали фонову активність у вигляді високорегулярних ПД, – пейсмекероподібні нейрони (ППН) – при однаковій силі подразнення частота ПД була вищою, ніж у тонічних нейронів без фонової ритмічної імпульсації (В).

Тонічні і фазні нейрони КБГ у складі комбінованого препарату відрізнялись також за деякими іншими електрофізіологічними показниками. Так, існувала вірогідна різниця (р<0,001) між середніми величинами МПС та амплітуди ПД в згаданих групах клітин. Середні значення цих параметрів у фазних нейронів були -37,4+1,0 і 48,3+7,2 мВ (n=23) відповідно, а у тонічних – -52,8+4,4 і 67,6+5,8 мВ (n=32) відповідно. Серед останніх ППН мали найвище значення МПС – у середньому -63,9+3,5 мВ (n=11).

Вхідний опір (Rin) фазних нейронів становив 23,2+4,1 МОм (n=23), що складає у середньому лише 57% Rin тонічних нейронів. Крім того, фазні нейрони відрізнялись більш високими порогами збу-дження.

В суцільно ізольованих КБГ морських свинок доля фазних нейронів становила 63%, а статистичний аналіз показав, що співвідношення обох типів нейронів у ізольованих препаратах вірогідно (p<0,05) відрізняється від такого комбінованих препаратів. Крім того, у ізольованому ганглії МПС фазних і тонічних нейронів був меншим і становив -30.0+2.5 і -43.5+2.0 мВ відповідно.

Нами були також досліджені МПС та внутрішньоклітинні відповіді нейронів КБГ щура. Усі клітини (n=8) ізольованих гангліїв були фазними. Серед 10 нейронів КБГ комбінованих препаратів лише дві клітини виявилися тонічними. Середній МПС нейронів КБГ щура становив -32,3+1,6 мВ (n=18), з коливанням у різних нейронів від -25 до -40 мВ, що менше значень цього показника, отриманих у інших дослідах на КБГ та верхньому шийному симпатичному ганглії щура [Kreulen, 1982; Nishi, 1985]. Середнє значення Rin нейронів дорівнювало 25,5+5,0 МОм (n=18).

Рис. 1. Відповіді фазного (А), тонічного (Б) і тонічного пейсмекероподібного нейронів (В) каудального брижового ганглія морської свинки на їх пряме подразнення через мікроелектрод тривалими прямокутними імпульсами струму різної сили (1 і 2). Силу струму вказано над відмітками його пропускання.

Треба відмітити, що нейрони КБГ щура взагалі були надзвичайно чутливими до якості мікроелектродного відведення, що, ймовірно, обумовлено їхніми малими розмірами [Nishi, 1985].

Таким чином, отримані дані підтверджують наявність у КБГ морської свинки та щура клітин різних електрофізіологічних типів: фазних і тонічних, які відрізняються між собою за основними електричними властивостями. Разом з тим, нами вперше встановлено, що співвідношення обох типів нейронів залежить від наявності зворотніх зв’язків ганглія з органом-ціллю.

Відповіді периферичних нервів КБГ морської свинки і щура на електричне подразнення інших нервів ганглія. Для з’ясування нейрональної будови периферичних провідних шляхів КБГ ми вивчали відповіді його периферичних нервів як на інтактних препаратах, так і на гангліях після хронічної дегенерації прегангліонарних волокон з метою запобігання механізму аксон-рефлексу. Дегенерацію волокон викликали попередньою перерізкою нервів ганглія. Інтактним залишали лише один периферичний нерв КБГ, на подразнення якого реєстрували відповіді інших його нервів.

Після хронічної денервації майже при всіх способах відведення вдалося зареєструвати синаптичні відповіді периферичних нервів КБГ морської свинки. Враховуючи те, що неушкодженими залишалися лише волокна периферичного походження, поза всяким сумнівом – аксони вісцеральних нейронів з швидкістю проведення збудження близько 1 м/с, які потрапляють у ганглій через подразнюваний інтактний нерв, ми дійшли висновку, що такі відповіді є справжніми периферичними рефлексами. За цих умов не зареєстровано відповіді у МБТ на подразнення ободового нерва, а також не виявлено периферичних рефлекторних дуг між підчеревними нервами.

У дослідах на щурах вищеописаними методами нами також не знайдено провідних шляхів типу периферичних рефлекторних дуг між підчеревними нервами КБГ та між ободовим нервом і МБТ. Крім того, не виявлено нервових шляхів від підчеревних нервів у напрямку МБТ.

Слід додати, що після попередніх перерізок на подразнення периферичних нервових стовбурів нами не було зареєстровано відповідей у поперекових нервах обох видів піддослідних тварин.

Крім синаптично обумовлених відповідей, між периферичними нервами КБГ морської свинки та щура нами були виявлені безперервні шляхи, які проводять стійкі до 10-4М бензогексонію коротколатентні відповіді, що зникали після попередніх перерізок МБТ, поперекових та підчеревних нервів. Ці дані, а також висока швидкість проведення збудження по цих волокнах (від 7 до 14 м/с) дозволяють зарахувати їх до аферентних волокон соматичного типу, що належать нейронам гангліїв дорзальних спинномозкових корінців.

Таким чином, дослідження проведення збудження між периферичними нервами КБГ морської свинки і щура виявили складні зв'язки даного ганглія з сонячним сплетенням, ШКТ та тазовими органами, які включають дуги справжніх периферичних рефлексів.

Фонова активність та рефлекторні реакції нейронів КБГ морської свинки. У дослідах на комбінованих препаратах в контролі (без роздування кишки) 62% досліджених нейронів (n=55) мали фонову електричну активність (рис.2). Такі нейрони можна було розділити на три групи. До першої групи увійшли нейрони

Рис. 2. Фонова активність трьох нейронів каудального брижового ганглія морської свинки (А – В).

А – “швидкі” збуджуючі постсинаптичні потенціали (шЗПСП) і потенціали дії (ПД); Б – фонові шЗПСП у контролі (1) і через 5 хвилин після уведення 10-4М бензогексонію (2); В – пейсмекероподібна активність (ритмічна генерація фонових ПД) в контролі (1) і її зникнення під час гіперполяризаційного зміщення мембранного потенціалу (2).

(n=5), фонова активність яких складалася із нерегулярних ПД і “швидких” збуджуючих постсинаптичних потенціалів (шЗПСП, А).

До другої групи були віднесені нейрони (n=14) тільки з шЗПСП (Б). Серед-ні значення амплітуди та тривалості шЗПСП в даній групі клітин становили 11,0+3,6 мВ і 28,2+0,5 мс відповідно, а середня частота їхнього виникнення була 4,55+1,4 с-1. Третю групу складали вищезгадані ППН (n=15). Частота ПД цих клітин становила приблизно 12 с-1 (В;1). Ви-никненню кожного ПД передувала фаза повільної деполяризації мембрани, схожої на діастолічну депо-ляризацію в клітинах водіях ритму серця; тому ми й класифікували нейрони даної групи як ППН. Імпульсація в таких клітинах з’являлась періодично. Гіперполяризаційне зміщення МПС припиняло їхню активність (В;2). Останнє дало підстави першим дос-лідникам [Jule, Szurszewski, 1983; King, Szurszewski, 1984], які знайшли подібну популяцію нейронів у КБГ кота і соба-ки, гадати, що ритмічна активність даних клітин має ендогенне поход-ження, і без будь-яких застережень класифікувати їх як пейсмекерні нейрони.

Аплікація 10-4М бензогексонію усувала генерацію фонової активності перших двох груп нейронів (див. рис. 2, Б), але не впливала на таку ППН. В той же час перерізка ободових нервів, які сполучають КБГ з відрізком кишки, подібно до повної ізоляції ганглія на початку досліду, запобігала виникненню ім-пульсації в ППН, однаково як і в нейронах перших двох груп, що свідчить про периферичне походження цього феномена.

Необхідно відзначити, що 75 % тонічних нейронів мали фонову активність у вигляді ПД і шЗПСП, тоді як серед фазних нейронів відсоток ”мовчазних” клітин становив 57%, а спорадичні ПД виникали лише у одному нейроні.

Роз-дування відрізка ободової кишки повітрям у діапазоні тисків від 6 до 20 см водн. ст. викликало рефлекторні зміни фонової активності у 76% досліджених клітин. Така стимуляція механорецепторів призводила до виникнення шЗПСП (середня частота 4,6 + 0,7 с-1) і ПД в "мовчазних" нейронах, а та-кож до більшої активації клітин з фоновою активністю. У останніх середня частота шЗПСП збільшувалась до 8,3+1,8 с-1 (n=11). Якщо у контролі нейрони з фоновою активністю, які не відносились до ППН, генерували ПД лише спорадично, то при роздуванні кишки в них виникали досить стабільні розряди з частотою 1,7 с-1. Бензогексоній (10-4 М) блокував ці реакції таким же чином, як і фонові розряди вказаних клітин в контролі. Перерізка ободових нервів також запобігала появі будь-якої активності в нейронах ганглія.

За нашими даними, приблизно у 66% тонічних нейронів на подразнення механорецепторів відрізка кишки виникала імпульсна активність, яка носила або регулярний, або нерегулярний характер. В той же час лише у 30% фазних нейронів рефлекторно виникали спорадичні ПД. Відзначимо, що ритмічні ПД були зареєстровані тільки у ППН.

Компонентом рефлекторних відповідей частини тонічних нейронів була повіль-на деполяризація з середньою амплітудою 11,5+3,8 мВ, яка була стійка до

10-4М бензогексонія, однак, пригнічувалась 10-6М атропіну, що свідчить про її мускаринову холінергічну природу.

На адекватне подразнення механорецепторів кишки 80% ППН генерували як регулярні, так і нерегулярні ПД (рис.3, А,Б). Така активність п’яти ППН супро-воджувалась повільними коливаннями МПС, і відповідними варіаціями амплітуди

Рис. 3. Рефлекторні відповіді пейсмекероподібного нейрона КБГ морської свинки.

А, Б – при різній тривалості періоду роздування сегмента кишки. В – через 5 хв після початку аплікації бензогексонія. Г – через 10 хвилин одночасної аплікації бензогексонію і атропіну. Всі записи отримано від одного і того ж нейро-на. Під записами активності стрілочками позначено час роздування сегмен-та ободової кишки та інтенсивність такої стимуляції, см водн. ст.

та частоти ПД (від 7 до 16 с-1). Періодично характер подібної викликаної імпульсації нагадував ритмічну фонову активність таких клітин, а бензогексоній лише частково блокував їхні відповіді (рис.3, В). Наступна сумісна аплікація бензогексонію і 10-6 М атропіну усувала виникнення ПД в ППН (рис.3, Г). Ці результати свідчать про те, что ППН отримують мно-жинні холінергічні периферичні входи, які базуються і на нікотиновій, і на мускариновій переда-чі збудження.

У двох ППН рефлекторно виникала ритмічна імпульсація, яка супроводжувалась повільною депо-ляризацією мембрани нейронів, нечутливою до холінолітиків. Після перерізки ободових нервів, яка усувала можливість виникнення рефлек-торних відповідей, аплікація 10-7 М субстанції Р призводила до появи ритмічних ПД на фоні тривалої деполяризації мембрани нейронів і збільшення її вхідного опору.

Таким чином, за умов, близьких до фізіологічних (комбінований препарат) показано, що нейрони КБГ отримують аферентні механочутливі входи від дистальних відділів товстого кишечника, за участю як нікотинової і мускаринової, так і, ймовірно, пептидергічної передачі, що є свідченням замикання у ганглії справжніх периферичних рефлексів. Встановлено, що певний електрофізіологічний клас нейронів КБГ морської свинки, а саме тонічні нейрони, є основним елементом нейрональної організації провідних шляхів від рецепторів розтягання.

Нами вперше показано наявнісь у КБГ морської свинки нейронів з пейсмекероподібною активністю. Повна відсутність будь-яких реакцій цих клітин після перерізки ободових нервів свідчить про те, що їхня активність має синаптичне походження. На нашу думку, за умови збереження нервових зв’язків КБГ з сегментом кишки, за рахунок спонтанної моторики останньої можливе виділення з пресинаптичних закінчень аферентних вісцеральних волокон або ацетилхоліну [Keef, Kreulen, 1990a,b], або, наприклад, пептидів [Parkman et al., 1993], які здатні змінювати властивості мембрани деяких нейронів, у результаті чого вони генерують ритмічні ПД. Подібна активність, як ми відмічали, характерна для ППН.

Таким чином, очевидно, справжні пейсмекерні нейрони у КБГ морської свинки відсутні, що узгоджується з точкою зору інших дослідників [Gola, Niel, 1993; Miolan, Niel, 1996] .

Дослідження ролі субстанції Р (SP) у синаптичній передачі збудження через КБГ морської свинки та щура. Перфузія КБГ морської свинки розчином SP (10-6М) викликала у нейронах ганглія стійку тривалу деполяризацію з середньою ампліту-дою 10±2 мВ (n=9). Максимального значення деполяризація досягала приблизно на третій хвилині після уведення SP. Від-мивка протягом 30 хвилин призводила до відновлення контрольних значень МПС.

У семи з 9 досліджених нейронів розвиток деполяризації під впливом SP супроводжувався вірогідним збільшенням вхідного опору мембрани нейронів у середньому на 35±5% (p<0,05), що виявлялось у зростанні амплітуди зміщень МПС, які викликались прямокут-ними гіперполяризуючими імпульсами струму. Крім того, у двох тонічних нейронів на фоні по-вільної деполяризації виникали ритмічні ПД, подібно до ППН.

Під впливом 10-6М SP змінювалась також збудливість нейронів обох типів. Фазні нейрони, які за звичаєм генерують один-два ПД на почат-ку пропускання через мікроелектрод прямокутного імпульсу струму, під впливом SP починали генерувати ПД впродовж усього періоду подразнення, подібно до тонічних клітин. Із збільшенням сили стимуляції частота ПД усіх фазних нейронів зростала.

Під впливом SP відзначалося збільшення частоти ПД тонічних нейронів при однаковій силі подразнення. У діапазоні сил струму подразнюючого імпульсу від 0,2 до 0,35 нА таке збільшення бу-ло вірогідним (p<0,05, n=5). При цьому зменшувалась амплітуда слідової гіперполяризації нейронів, яка супроводжувала ПД, на 27±2% (n=5, p<0,05).

Отримані результати свідчать про те, що збільшення частоти ПД нейронів КБГ морської свинки у відповідь на пряме подразнення три-валим імпульсом струму було пов'язане з пригніченням під впливом SP струмів, які роблять внесок у розвиток слідової гіперполяризації.

Окрему серію експериментів було проведено на 12 ідентифіко-ваних ППН, у яких після проколу реєструва-ли фонову високорегулярну активність. Середня частота ПД цих нейронів становила 14,2 ± 2,5 с-1 (n=12). Як і у попередніх дослідах, роздування сегмента кишки (тиск – 15 см водн. ст.), в період спокою ППН, викликало у них складну імпульсну активність, яка проявлялась у вигляді шЗПСП та ПД (див. рис. 3). Тривалість імпульсації цілком залежала від тривалості періоду подразнення механорецепторів кишки. При цьому середня частота ПД цих нейронів становила 16,5 ± 5,5 с-1 (n=12).

У чотирьох з 12 досліджуваних ППН аплікація 10-8М блокатора SR 142801 тахікінінових NK3-рецепторів приз-водила до вірогідного (p<0,05) зменшення частоти ПД при черговому роздуванні сегмента кишки. Зменшення частоти ПД під дією SP-антагоніста розпочиналось приблизно на 5 хвилині пер-фузії, досягаючи свого максимуму в середньому на 20 хвилині. Середня частота викликаних ПД досліджуваних нейронів у контролі дорівнювала 14,5 ± 3,7 c-1 (n=4), а на 20 хвилині перфузії ганглія блокатором SR 142801 зменшувалась до 6,8 ± 2,3 с-1 (n=4).

Таким чином, рефлекторні відповіді частини досліджуваних ППН були обумовлені, очевидно, також збуджуючим впливом SP, яка виділяється у ганглії із закінчень аферентних волокон при подразненні механорецепторів кишки. До того ж, як свідчать ре-зультати наших дослідів, збуджуюча дія SP на ППН може опосередковуватись NK3 - рецеп-торами.

Для з’ясування ролі SP у передачі збуд-ження через КБГ щура було досліджено дію екзогенної SP, а також її антагоніста капсаіцину і блокатора тахікінінових NK3 - рецепторів SR 142801 на електричні відповіді нервів цілого ганглія при подразненні інших його нервів. Вивчали дію вказаних речовин як на контрольний СПД (частота подразнення 1 Гц), так і на відповіді, які отримували під час або після ритмічної стимуляції нервів з частотою 10 та 15 Гц, оскільки відомо, що саме ритмічна стимуляція нервів КБГ спричиняє виділення SP у ганглії із пресинаптичних закінчень колатералей аферентних С-воло-кон, які проходять через нього від внутрішніх органів до спинного мозку [Tsunoo et al., 1982].

Перфузія ізольованого КБГ щура капсаіцином (5 10-5 М) протягом 40 – 50 хвилин призводила до незначного, але вірогідного зменшення амплі-туди чутливого до 10-4М бензогексонію СПД ободового нерва на подразнення лівого підчеревного нерва поодинокими поштовхами струму, яка склада-ла 82,7±5,6% від контролю. Це свідчить про те, що капсаіцин у концентрації, достатній для блокування SP-ергічної передачі у ганглії [Amman et al., 1988], здатний також пригнічувати і холінергічну передачу. Тому, щоб розділити ефекти капсаіцину на швидку холінергічну і SP-ергічну передачу збудження, ми застосували збільшення частоти стимуляції нерва до 10–15 Гц. Це виявилося у більш виразнішому і статистично вірогідному (p<0,05) зменшенні амплітуди відповідей під дією капсаіцину. Так, через 15 секунд від початку стимуляції з частотою 10 і 15 Гц амплітуда СПД становила відповідно 72,2%±9,4 та 35,0% ± 6,5% контрольних відповідей (n=4, p<0,05), отриманих при тих же інтенсивностях стимуляції. Після відмивки протягом 60 – 90 хвилин амплітуда СПД відновлювалася до контрольних зна-чень. Пригнічуюча дія капсаіцину частково усувалася при подальшій перфузії КБГ протягом 35 – 45 хв розчином, в якому крім капсаіцину знаходилась SP у концентрації 5 10-7 М. В інших дослідах SP збуджуючим чином діяла на си-наптичну передачу між периферичними нервами КБГ в діапазоні кон-центрацій від 510-7 до 110-8 М. Так, 510-7М SP викликала збільшення амплітуди СПД на 35%.

Блокатор тахікінінових NK3-рецепторів SR 142801 також зменшував загальну площу СПД ободового нерва на поодиноке подразнення МБТ, які відводили відразу після ритмічної стимуляції останнього (ЕС50 = 0,240,01 мкМ), не впливаючи на контрольні відповіді, одержані без попередньої стимуляції з високою частотою. Так, під впливом 510-7М блокатора відзначалось вірогідне (p<0,05) зменшення загальної площі потенційованої відповіді приблизно на 63%.

Застосований нами метод збільшення частоти подразнення продемонстрував, що тільки при високій частоті стимуляції периферичних нервів капсаіцин та блокатор тахікінінових NK3-рецепторів SR142801 викликали пригнічення рефлекторних відповідей. На нашу думку, останнє відбувається тому, що при подразненні з високою частотою, з одного боку, відбувається виснаження АХ у пресинаптичних закінчен-нях, проте, з іншого боку, пригнічення швидкої холінергічної пере-дачі частково компенсується SP, яка, можливо, виділяється при високочастотній стиму-ляції з С-аферентів, модулюючи холінергічну передачу шляхом підвищення збудливості нейронів КБГ, що виявляється, як показали наші досліди з прикладенням SP до нейронів КБГ морської свинки, у розвитку повільної деполяризації їхньої мембрани та спонтанній появі ПД. Саме тому, аплікація блокаторів SP, ймовірно, викликає пригнічення синаптичної передачі, усуваючи збуджуючий вплив ендогенного пептиду.

Таким чином, результати нашого дослідження вказують на те, що у КБГ морської свинки та щура, крім холінергічної передачі збудження, може відбуватись також нехолінергічна передача за допомогою субстанції P. Разом з тим, застосування селективного антагоніста тахікінінових NK3-рецепторів SR 142801 дозволило нам вперше показати, що збуджуюча дія SР може опосередковуватись тахікініновими рецепторами NK3-типу нейронів КБГ. Ці результати доповнюють вже відомі літературні дані про наявність NK3-рецепторів на нейронах інших симпатичних гангліїв [Seabrook, Main, 1992 , Zhao, 1995].

ВИСНОВКИ

1. Відомо, що вегетативні ганглії здатні регулювати функції внутрішніх органів за рахунок власних периферичних рефлексів. Проте, залишаються малодослідженими механізми синаптичної передачі збудження у периферичних рефлекторних дугах, в тому числі, природа синаптичних передавачів.

2. За характером відповідей на пряме подразнення через мікроелектрод деполяризуючим імпульсом струму нейрони каудального брижового ганглія (КБГ) морської свинки і щура можна розділити на два електрофізіологічні типи: фазні і тонічні. Фазні нейрони генерують один або декілька потенціалів дії (ПД) лише на початку подразнення, а тонічні – впродовж всього періоду стимуляції. Крім того, тонічні нейрони мають вище значення мембранного потенціалу спокою (МПС) і амплітуди ПД, а також нижчий поріг збудження, ніж фазні нейрони. МПС нейронів ізольованого КБГ морської свинки менший, ніж у ганглії, пов’язаному ободовим нервом з відрізком товстої кишки.

3. В ізольованому КБГ морської свинки фазні нейрони складають 63%, тоді як у ганглії при збереженні нервового зв’язку з кишечником їхня доля зменшується до 42%, що може бути обумовлено полегшуючим впливом з боку рецепторів відрізка кишки на нейрони ганглія.

4. Методом хронічної денервації та фармакологічної блокади синаптичної передачі у КБГ встановлено наявність периферичних рефлекторних шляхів, які проходять у міжбрижовому тракті, підчеревних та ободовому нервах і замикаються у ганглії. Не виявлено у КБГ морської свинки та щура периферичних рефлекторних дуг між обома підчеревними нервами, між ободовим нервом і МБТ та синаптично перервних шляхів до спинного мозку. У ганглії щурів відсутні також рефлекторні зв'язки між підчеревними нервами і МБТ. Крім нервових шляхів, що синаптично перемикаються, у КБГ проходять транзитні аференти до спинного мозку.

5. При збереженні нервового зв’язку з кишечником 62% нейронів КБГ морської свинки виявляють фонову активність у вигляді “швидких” збуджуючих постсинаптичних потенціалів (шЗПСП) і ПД. Адекватне подразнення механорецепторів відрізка ободової кишки рефлекторно змінювало активність 76% досліджуваних клітин – у “мовчазних” нейронах виникали шЗПСП та ПД, збільшувалась частота імпульсації нейронів з фоновою активністю. Фонова активність і рефлекторні реакції мають холінергічну природу. При цьому виявлено, що синаптичні закінчення вісцеральних аферентів характерні переважно для тонічних нейронів; ці клітини є основою еферентної ланки периферичної рефлекторної дуги.

6. У КБГ морської свинки до 27% нейронів виявляють ознаки пейсмекерних клітин. Пейсмекероподібні нейрони (ППН) в фоновій активності мають високорегулярні ПД, які є результатом екзогенних впливів. При подразненні механорецепторів ободової кишки виявлені множинні аферентні входи до ППН, які включають як холінергічну, так і пептидергічну передачу за допомогою субстанції Р (SP).

7. Екзогенна SP спричиняла повільну деполяризацію нейронів КБГ морської свинки, на фоні якої у більшості нейронів виникали ритмічні ПД. Крім того, SP полегшувала передачу збудження у периферичних рефлекторних шляхах КБГ щура. Антагоніст SP капсаіцин та специфічний блокатор тахікінінових NK3-рецепторів SR 142801 пригнічували таку передачу.

8. Отримані результати показу-ють наявність потужних периферичних синаптичних входів до нейронів КБГ морської свинки та щура за участю як нікотинової і мускаринової, так і SP-ергічної передачі збудження, що є основою для здійснення ганглієм периферичної рефлекторної регуляції внутрішніх органів. При цьому, SP відіграє подвійну роль у синаптичній передачі збудження в периферичних рефлекторних шляхах КБГ – з одного боку, як медіатора, що зумовлює тривале збудження нейронів КБГ, а з іншого, – як модулятора швидкої холінергічної передачі. Вперше встановлено, що збуджуюча дія SP на нейрони КБГ морської свинки та щура може опосередковуватися тахікініновими NK3 -рецепторами.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Скок В.І., Пасічніченко О.М. Ефекти субстанції Р та капсаіцину на синаптичну передачу у периферичних рефлекторних шляхах каудального брижового ганглія щура //Фізіол. журн. – 1994. – Т.40, № 3-4. -