ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ

Поліщук Валерій Петрович

УДК 578.1

прогнозування та закономірності розповсюдження вірусів рослин в біоценозах україни

03.00.06 - вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

БОЙКО Анатолій Леонідович

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедрою вірусології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник Щербатенко Іван Степанович

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.

Заболотного НАН України,

завідувач відділу фітопатогенних вірусів

доктор біологічних наук, професор

Мітрофанова Ольга Володимирівна

Державний Нікітській ботанічний сад УААН,

завідувач відділу біотехнології

доктор біологічних наук, професор

співробітник Радавський Юрій Леонідович

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії

НАН України, завідувач відділу структури та

функцій білків та пептидів

Провідна установа: Інститут захисту рослин УААН

Захист відбудеться “ 18 ” жовтня 2000 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 252143, м. Київ, вул Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (252143, м. Київ, вул Заболотного, 154).

Автореферат розісланий “ 15 ” вересня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Пуріш Л.М.

Загальна характеристика роботи

Актуальність. Протягом останнього часу в фітовірусології спостеріга-ється значний інтерес до розвитку досліджень на популяційному та еколого-популяційному рівні, і ця тенденція є загальною для багатьох традиційно молекулярно-біологічних дисциплін (Бойко, 1990). Значні успіхи у фіто-вірусо-логії, такі як розшифровки струк-ту-ри генів, білок-білкової та нуклеїнова кислота-білкової взаємодії, встановлення амінокислотних послідовностей та тривимірної будови структурних та регуляторних вірусних білків та ін. контрастують з нашими знаннями відносно поведінки вірусів рослин у природних умовах. Нове покоління діагностичних методів для визначення наявності фітовірусів (таких як ІФА, РІА, DELFIA, RIPA, ПЛР, ЛЛР, та ін.) дало змогу на новому рівні вивчати розповсюдженість фітовірусів у навколишньому середовищі. Актуальність даного питання полягає як в його фундамен-тальності, так і в практичному значенні. Визначення ареалу розповсюд-женості, механіз-мів передачі, кола рослин-господарів, реакції на зміни оточуючого середо-вища дають можливість не тільки більш повно харак-тери-зувати того чи іншого представника царства Vira, але і прогнозу-вати появу та розвиток вірусних хвороб і правильно виробляти стратегію і тактику боротьби з ними – запровад-ження стійких сортів, цілеспрямовану боротьбу з резерван-тами та перенос-никами, отримання безвірусного посадкового матеріалу та ін. (Щерба-тенко, 1996). Перспективними у цьому напрямку є моделювання розвитку хвороб рослин. Однак для більшості вірусних хвороб, на відміну від фітопатогенних грибів та бактерій, адекватні моделі практично відсутні (Nelson, 1999). Віруси, які передаються через ґрунт і зберігають свої інфекційні властивості (Furoviridae, Nepoviridae, Tobamoviridae, Cucumoviridae та ін.) досить інтенсивно вивчалися тільки останнім часом, тоді як епідеміологічне вивчення вірусів, що передаються за допомогою векторів, розвивається швидкими темпами протягом останніх десятиріч (Шпаар, 1995). Класичний підхід до вивчення вірусів у ґрунті передбачає вивчення в першу чергу їх біологічних характеристик; інші віруси, для яких передача через ґрунт та зберігання інфекційних властивостей не доведена, залишаються поза увагою такого підходу (Koenig, 1994). В той же час можливість використання інформації про знаходження того чи іншого антигену вірусу в ґрунті (навіть якщо цей вірус і не може передаватися через ґрунт) може бути використаною для загальної оцінки фітосанітарного стану з точки зору наявності вірусних інфекцій та для прогнозування розвитку вірусних хвороб і попередження втрат від них.

Збільшення антропогенного тиску на навколишнє середовище приво-дить до фізіологічних змін у рослин та їх угрупувань (Гуральчук Ж.З., 1994; Andren O. et all, 1998), що в свою чергу прямо чи опосередковано відбивається на властивостях вірусів рослин. Встановлення можливих взаємозв’язків між наявністю вірусних антигенів в культурних та дико-росту-чих рослинах, ґрунті є дійсно необхідним для розуміння процесів роз-пов-сюдження вірусів рослин та циркуляції їх в ценозах.

Важливим для вивчення шляхів розповсюдження фітовірусів є знання їх взаємодії з представниками дикої флори та бур’янами, що стало предме-том детального вивчення тільки в останній час (Stevens M. et all, 1994). Для встановлення взаємозв’язків між вірусами, культурними рослинами, бур’я-нами, переносниками, ґрунтом потрібно враховувати багато факторів (біо-логію збудника та хазяїна, умови зовнішнього середовища тощо) та оперу-вати даними про ці фактори. Існуючі на сьогодні спроби комп’юте-ризувати моделі часового та просторового розповсюдження збудників хвороб рослин стосуються в першу чергу інфекційних агентів бактеріаль-ного та грибкового походження(Bosch F. et all,1999), для фітовірусів такі моделі практично відсутні (Anderson P.K., 1999). Актуальність створення комп’ютерних моде-лей та баз даних обумовлена великим обсягом інформації, що має тенденцію збільшуватися з кожним роком (Campbell C.L., Madden L.D., 1990). Всі вище перераховані проблеми не можуть бути вирішені без можливості опера-тивного одержання об’єктивної інформації (надійної діагностики вірусних інфекцій). Перспективним та актуальним з цієї точки зору можна вважати методи дистанційної діагностики, що базуються на спектральних парамет-рах рослин та можуть бути отримані за короткий час на значних площах (Шадчина Т.М., Колинько О.А., 1993). В той же час застосування новітніх методів растрової мікроскопії, таких як атомно-силова мікроскопія (АСМ), відкриває нові можливості як для діагностики, так і для отримання принципово нової інформації про структуру і функції вірусів та їх популяцій.

Оскільки техногенне навантаження на природне середовище в найближ-чому майбутньому буде скоріш зростати, ніж зменшуватися, а в агроценози будуть приходити все нові й нові, в тому числі і генетично модифіковані, культурні рослини, проблеми екологічного балансу в агроценозі будуть набувати все більшого значення, і питання розповсюдження фітовірусних інфекцій та їх шкодочинності в майбутньому може розглядатися як одне з найгостріших.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові дослід-ження по темі виконано відповідно проектів “Роз-робка комплексної еколого-економічної оцінки території України та системи оп-ти-мі-зації сільськогоспо-дарського виробництва з урахуванням природно-ресурсного потенціалу та еколого-токсикологічної ситуації”, “Науково-методичні основи екотоксико-логічного моніторингу. Підрозділ: Вірусні інфекції” (№ держреєстрації 01.196U012976), “Оцін-ка агроценозів в різних екологічних регіонах України на ураженість фітовірусними інфекціями” (ДКНТ, № 03.11.1/74), “Створення техно-логії оздоровлення сільськогосподарських рослин з метою підви-щення їх продуктивності” (№ 03.01.12/110-92) .

Мета і завдання дослідження. На основі багаторічних обстежень біо-ценозів різних екологічних регіонів України дати оцінку розповсюдженості основних фітовірусних інфекцій, виявити їх закономірності та обґрун-тувати можливості прогнозування розвитку епіфітотій.

У відповідності з поставленою метою було необхідно виконати такі завдання:

– вивчити біологічні властивості та провести діагностику 16 основних шкодочинних фітовірусів, які відносяться до різних таксономічних груп у різних регіонах України; –

проаналізувати динаміку чисельності поширених вірусів рослин в об-стежених ценозах із використанням сучасних вірусологічних методів; –

дослідити взаємозв’язки між збудниками вірусних захворювань та їх можливими резервуарами, такими як одно-, дворічні та багаторічні бур’яни, ґрунт; –

створити базу даних та комп’ютерну модель для прогнозування роз-вит-ку вірусних хвороб рослин у динаміці репродукції патогенів; –

вивчити взаємозв’язок між екологічним станом конкретного ценозу та розповсюдженістю фітовірусних інфекцій у регіонах, розглянути можливі механізми їх взаємодії; –

вивчити біологію збудників рослин закритого ґрунту на моделі орхід-них та розробити технологічну схему отримання оздоровленого без-вірусного посадкового матеріалу; –

на основі спектральних методів відбиття розробити модельну сис-тему дистанційної бездеградаційної експрес-діагностики РНК-вмісних вірусів у динаміці їх взаємодії з різними видами рослин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведена якісна та кількісна оцінка агроценозів та природних екологічних ніш України на наявність шкодочинних вірусів сільськогосподарських культур на основі імуноферментного аналізу з урахуванням біологічних, молекулярних та анти-генних властивостей патогенів. Розкрито взаємозв’язок між частотою знаход-ження антигенів фітовірусів у культурних рослинах, бур’янах і ґрунті та вірогідністю розповсюдження тієї чи іншої вірусної хвороби в наступні роки. Створено комп’ютерну базу даних із застосуван-ням Microsoft Access-2 та на її основі вперше створено систему управління базами даних по аналізу розповсюдженості фітовірусів у культурних рослинах, бур’янах, ґрунті в різних агроценозах України. Показано можливість застосування багато-факторного комп’ютерного аналізу для коротко-, середньо- та довго-строкових прогнозів розвитку вірусних захво-рювань. Встановлена залеж-ність розповсюдження фітовірусних інфекцій від антропогенного наванта-ження на агро- чи біоценоз. Експериментально обґрунтовано та запропо-новано методику оцінки можли-вості розповсюд-ження фітовірусних інфекцій на основі комплексної діагнос-тики рослин та застосування комп’ю-терної бази даних.

Виявлено нові види рослин-резерваторів для деяких вірусів, такі як талабан польовий (Thlaspi arvense) для вірусу слабкого пожовтіння буряку (ВСПБ) та костриця лучна (Festuca pratensis) для вірусу жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ). Описано новий РНК-вмісний бациловидний вірус, що уражує цукрові буряки.

Розроблено технологічну схему контролю для отримання високо-якіс-ного безвірусного посадкового матеріалу орхідей мікроклональним розмно-женням на основі створення здорових рослин-донорів.

Показано відмінності в спектрах відбиття світла між інфікованими та контрольними рослинами. Показана можливість використання спектраль-них параметрів для бездеградаційної дистанційної експрес-діагностики вірусних хвороб рослин в різних умовах їх вирощування.

Розроблено новий спосіб візуалізації віріонів методом атомно-силової мікроскопії (АСМ).

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально обґрун-товано та запропоновано методику оцінки можливості розповсюд-ження фіто-вірус-них інфекцій на основі комплексної діагностики рослин; виявлено нові види рослин-резерваторів для деяких вірусів; розроблено технологічну схему контролю для отримання високоякісного безвірусного посадкового матеріалу орхідей мікроклональним розмноженням; показано відмінності в спектрах відбиття між інфікованими вірусами та здоровими рослинами та можливість застосування спектральних параметрів для бездеградаційної дистанційної експрес-діагностики вірусних хвороб рослин у різних умовах їх вирощування; модифіковано методику обстеження ґрунтів на вірусоносійство за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), що дозволяє швидко та ефективно проводити детекцію антигенів фіто-вірусів в ґрунтах та ґрунтових водах.

На основі досліджень обґрунтовано стратегію оцінки та створено карту розповсюдженості фітовірусів у ґрунтах у досліджених регіонах України. Її використання дозволяє простежити кореляцію між виявленням антигенів вірусів в рослинах та ґрунті та техногенним навантаженням довкілля іншими полютантами.

Створено рекомендації для сільськогосподарських дослідних станцій та стан-цій захисту рослин для запобігання втрат врожаїв від вірусних інфекцій.

Особистий внесок здобувача. Автором запропонована ідея роботи. Мета і завдання досліджень сформульовані автором особисто. Відбір зразків рослин та ґрунту з різних екологічних регіонів України, виділення та накопичення вірусів, проведення імуноферментного аналізу, електронна, імуноелектронна мікроскопія, аналіз і узагальнення отрима-них результатів, побудова комп’ютерного банку даних були виконані автором особисто та за участю аспірантів і співробітників на базі кафедри вірусології Київ-ського національного університету імені Тараса Шевченка. Проведення досліджень спектральних характеристик відбиття листя та протопластів проводилося на базі Інституту фізіології рослин та генетики НАНУ за участю д.б.н. Т.М.Шадчиної.

Дослідження фізико-хімічних властивостей грунтів проводи-лися в лабораторії оцінки якості сільськогосподарської продукції Інституту агроекології та біотехнології УААН разом з Саженюком А.Д. та Харків-ським Інститутом агрохімії та ґрунтознавства УААН .

Дослідження вірусів в умовах закритого ґрунту та in vitro проводилися на базі Центрального республіканського ботанічного саду за участю к.б.н. А.М. Лаврентьєвої.

Дослідження за допомогою АСМ проводилися в Інституті напівпровід-ників НАНУ за участю к.б.н. Бекетова Г.В.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на: Між-народній конференції “Фундаментальні та прикладні аспекти фіто-вірусо-логії” (Ялта, Україна, травень 1994); Міжнародному симпозіумі “75 років фітопатологічних досліджень в Асершлебені” (Асершлебен, Ні-меч-чина, червень 1995); Всеросійському з’їзді “Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффектив-ность, экологичность” (Санкт-Петербург, Росія, грудень 1995); 10 Між-на-род-ному Конгресі по вірусології (Єрусалим, Ізраіль, серпень 1996); 1-му Європейському фікологічному конгресі (Кьольн, Німеччина, серпень 1996); Європейському симпозіумі “Аерокосмічна дистанційна діагностика” (Лон-дон, Великобританія, вересень 1997); Міжнародній конференції “Лютео-віруси” (Чіренчестер, Великобританія, березень 1997); Міжнародному регіональному семінарі “Охорона довкілля” (Ужгород, травень 1997); Конференції “Збереження біорізноманітності в Україні” (Канів, жовтень, 1997); Міжнародній конференції “Пути решения проблем и перспективы развития биотехнологии в декоративном садоводстве и плодоводстве” (Крим, Ялта, вересень 1997); 2 Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, вересень 1998); 4 Міжнародному Симпозіумі “Забруднення навколишнього середовища в Центральній та Західній Європі” (Варшава, Польща, вересень 1998); 16 Всесвітньому Конгресі з ґрунтознавства (Мон-пельє, Франція, серпень 1998), 7 Міжнародному симпозіумі з епідеміології вірусів рослин (Алмерія, Іспанія, квітень, 1999); 11 Міжнародному конгресі з вірусології (Сідней, Австралія, серпень 1999).

Публікації. За матеріалами дослідження опубліковано 48 робіт, з них 23 – статті у наукових журналах, 25 – матеріали конференцій.

Структура і об’єм роботи. Дисертація складається із вступу; огляду літе--рату-ри, в якому здійснено аналіз сучасного стану досліджень в області епі-де-міології вірусів рослин, прогнозування виникнення епіфітотій та законо-мірностей розповсюдження фітовірусів; опису об’єктів та методів досліджень, п’яти експериментальних розділів; висновків; списку цитованої літератури та трьох додатків. Останні включають карти районів відбору зразків, візуальні симптоми хвороб на рослинах та дослідних полях, схеми циркуляції досліджуваних вірусів. Робота викладена на 288 сторінках маши-но-писного тексту, включає 32 таблиці та 76 рисунків. Список цито-ваної літератури нараховує 515 найменувань, з них 382 іноземних.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень

Відбір та аналіз зразків. Загальний стан поля обстежувався методом рендо-мізованого польового експерименту за такими параметрами: фаза розвитку рослин в онтогенезі, вид рослини, стан посiвiв, кiлькiсть рослин-бур’янiв, відсо-ток рослин з симптомами вiрусних захворювань. Для обсте-ження поля цукрового буряку вибиралися три дiлянки площею 100 м2, де підраховувалась кiлькiсть рядкiв, кiлькicть рослин у кожному рядку i кiлькiсть рослин з симпто-мами вiрусних захворювань на листкових плас-тин-ках у кожному рядку. Пiдра-хунок інших культур, якi мали симптоми вiрусного ураження, проводився: кукурудзи, соняшнику (по три дiлянки площами 100 м2); пшеницi – три дiлянки площею 1 м2. Також реєстрували симптоми, якi переважали.

Для досліджень розповсюдження вірусів з полів сільськогосподарських культур (таких як злакові, цукровий буряк, картопля) та необроблюваних ділянок (заповідників, балок та ін.) відбирали зразки культурних рослин, супутніх бур’янів та ґрунту в трьох повторах з трьох точок методом рендо-мі-зованого польового експерименту та вносили в стерильний пакет для подаль-ших досліджень.

Дослідження проводилися в чотирьох регіонах України, таких як: Во-лин--ська область (Шацький Національний парк); Київська область (Богу-славський полігон), Харківська область (район Зміївської ДРЕС) та Одеська область (район Комінтерново).

Після відбору зразки ґрунту гомогенізували з буфером (0,01М фосфат-но-сольовим буферним розчином (ФСБР), рН 7,2-7,4) в шутель-апараті протягом ночі. Потім проводили виділення та очистку вірусу. Для цього розчинений у буфері зразок рослин або ґрунту піддавали серії центри-фугувань: низько-швидкісне центрифугування на центрифузі РС-6 (5000 g, 20 хв); одержаний надосад піддавали високошвидкісному центри-фугу-ванню на центрифузі фірми “Beckman” (70000 g, 60 хв), після чого одер-жаний осад ресуспенду-вали в буфері. Частину отриманого матеріалу вико-ристовували для зараження рослин-індикаторів, а частину – для досліджень за допомогою ІФА та електронної мікроскопії (ЕМ). Проби з рослин-індикаторів від-биралися для імуносорбентної електронної мікроскопії (ІСЕМ) та ЕМ.

Біологічні властивості вірусів вивчали за допомогою спектру загально-прийнятих рослин-індикаторів, таких як: Chenopodium amaranticolor (некротична реакція для типового штаму ВТМ), Datura stramonium, Nicotiana tabacum cv. Samsun (некрози та деформації для ВТМ), N. glutinosa (некротична реакція для ВТМ), N. tabacum cv. Trapeson (системна реакція), N. debneyі (системна реакція), N. sylvestris L (системна реакція) та Plantago major L. (некротична реакція для подорожникових штамів ВТМ), Triticum durum, Lycipersicon esculentum, Capsicum annum, Agropiron repens, Gomfrena globosa та ін. Ураження проводили механічно для таких вірусів як ВТМ, ВОМ, ХВК, УВК, ВШМЯ. Матеріал інокулювали за допомогою абразиву (карборунд) з концентрацією вірусного препарату в діапазоні 50-200 мкг/мл у 0,1М ФСБР, рН7,4 у трьохкратному повторенні на стадії чотирьох справжніх листків.

Накопичення ВТМ здійснювали на рослинах Nicotiana tabacum сорт Самсун. Виділення вірусного матеріалу проводили за модифікованою нами методикою шляхом гомогенізації свіжозаморожених інфікованих рослин в 0,1М калій – фосфатному буфері, pН7,4 з додаванням 0,01М Na2SO3, освітленням вірусного екстракту хлороформом у співвідно-шен-ні 1:7 та подальшим низькошвидкісним центрифугуванням 20 хв при 4 тис. об/хв на центрифузі РС-6. Концентрацію препарату проводили за допомогою інкубації надосадової рідини на магнітній мішалці з додаван-ням 5% поліетиленгліколю 6000 (“Serva”, США) та 1,2% NaCl протягом 60 хв при 4 0С. Після інкубації матеріал центрифугували при 10 тис об/хв протягом 15 хв. Осад ресуспендували в 0,01М калій-фосфатному буфері, рН7,4 з подальшим високошвидкісним центрифугуванням його в режимі 30 тис. об/хв – 1,5 год на центрифузі “Beckman”, ротор SW-40. Осад відбира-ли, знову ресуспедували в 0,01М калій-фосфатному буфері та проводили центрифугування в градієнті сахарози при 30 тис. об/хв протягом 2,5 год у тому ж роторі. Осад ресуспендували в 0,01М тріс-НСІ буфері, рН7,6 та діалізували протягом ночі при 4 0С проти того ж буферу. При роботі з вірус-ним матеріалом використовували буфери, що не містять солей натрію для зручності подальшого виділення нуклеїнової кислоти та білку. Кон-цент-рацію вірусу визначали спектрофотометрично за формулою:

С = А260N/Ке

де С – концентрація вірусу в мг/мл,

А260 – екстинкція при довжині хвилі 260 нм,

N – розведення вірусного препарату,

Ке – коефіцієнт екстинкції, що для ВТМ становить 2,7.

Для отримання числових результатів на стадії обробки польових зразків використовували непрямий метод das-ELISA (Гнутова, 1993).

Для його проведення використовували антитіла, специфічні до 18 вірусів (Табл. 1).

Таблиця 1.

Перелік специфічних антитіл, які були використані в роботі

Аналіз проводили в 96-лункових планшетах (“Labsystems”, Фінляндія).

Крім того, використовувався tas-ELISA (triple antibody sandvich), який проводили за загальноприйнятою методикою. Як антивидові використо-вували антитіла, мічені пероксидазою з хрону та лужною фосфатазою.

Для вивчення морфології вірусів застосовувалися трансмісійні електрон-ні мікроскопи JEM-1200 (JEOL, Японія) JEM-100B (JEOL, Япо-нія), ЕМ-75, ЕМ-125 (Суми, Україна) з негативним контрастуванням вірусних часто-чок. Для виготовлення плівок-підкладок використовували 0,2% роз-чин формвару (полівінілформальдегіду) в хлороформі. Для негативного контра-с-тування зразків використовували 2% розчин фосфорновольфра-мової кислоти (ФВК) рН7-7,4 та 2% розчин уранілацетату (Миронов, 1994).

Електрофорез досліджуваних зразків проводили за Laemmli з викорис-танням 14% розділяючого поліакриламідного гелю та 5% концентруючого гелю.

Для вивчення впливу важких металів на перебіг вірусної інфекції прово-дили серію експериментів на рослинах Nicotiana tabacum та Datura stramonium та (з ВТМ та ХВК відповідно). Рослини піддавали сукупній дії вірусів та солей важких металів (Ni, Zn, Pb, Cu), в концентра-ціях, визна-чених експериментально в ґрунтах Харківської області.

Вимірювання спектрів відбиття та поглинання у інфікованих рослинних тканин. Для лабораторних досліджень відбиття світла рослинами вико-ристовували оснащений інтегруючою сферою двопроменевий реєстру-ючий спектрофотометр СФ_. Для приготування зразків вико-рис-то-вували середні частини листків. Швидкість розгортки складала 90 нм/хв. Відтво-рюваність запису одного й того ж зразка по абсцисі (довжина хвиль) скла-дала 1 нм, по ординаті (коефіцієнт відбиття) – 0,3%.

Результати у цифровому вигляді паралельно передавались на ЕОМ, сполучену із спектофотометром СФ_. За допомогою ЕОМ проводили математичну та статистичну обробку результатів (Кочубей и др., 1990).

Визначення концентрації хлорофілу у витяжках проводили спектро-фотометрично. Вміст хлорофілу розраховували за формулою:

C = D652V/34.5S,

де D652 – оптична густина при довжині хвилі 652 нм;

V – об’єм одержаного екстракту, мл;

S – площа висічки, дм2;

34.5 – сталий коефіцієнт.

При ААС для переведення зразку в розчин застосовували способи, які використовуються при аналізі мінеральної сировини.

Дослідження морфології виконувались на атомно-силовому мікроскопі (Nanoscope D 3000, Digital Instruments, USA). У дослідах використовували вірус тютюнової мозаїки, який мав концентрацію 0,8 мг/мл. Краплину розчину (25 мкл) наносили на свіжосколоту слюду, через 20-30 хв препарат промивали водою та поступово висушували на повітрі в закритій чашці Петрі. В іншій модифікації препарат наносили на слюду, витриману 10 с в 0,2% розчині формвару (полівінілформальдегіду ) в хлороформі.

Коротка характеристика бази даних і програм їх аналізу. В процесі оброб-ки структури даних їх типи змінюються, таким чином, вони потребу-ють нової структури для свого збереження. Структурами, що зберігають дані, є таблиці. В таблиці “Ukraine” зберігаються необроблені дані, тобто детальні описи всіх зразків, результати ІФА і т.п. При семантизації цих даних отриму-вали нову структуру (масив) даних: замість цифрових даних ІФА – дані логічного формату типу “Так / Ні”, причому дані контролів відсівалися і в подальшому не приймали участь в ієрархії об’єктів.

Модуль “UpDate_Table” містить процедуру автоматизації введення даних та перевірки їх синтаксичної вірності (наприклад, забороняє вводити у комірку числового значення символьні дані).

Основну роботу по введенню, відбору, обробці даних виконують форми. Форма – це складний об’єкт, що містить власне форму та пов’язаний з нею модуль – сукупність процедур та функцій на “Access Basic”, що беруть участь у обробці даних форми.

“AreaSelect” – пропонує обрати: роботу із необробленими даними; оброб-ку семантизованих (логічних) даних та відкриває форми “Plate”; “Area”.

“Choice” – пропонує обрати вид роботи: відкрити об’єкт звіту, редагу-вати та друкувати його або відкрити форму “AreaSelect” (якщо передбача-ється робота з необробленими даними).

“Plate” – головна форма, статично пов’язана із об’єктом, забезпечує введення, сортування, перевірку синтаксису, пошук, друк, редакцію даних та поновлення (“Update”) даних таблиці “Ukraine”. Відкриває форму “AreaSelect”.

“Area” – форма, статично пов’язана з таблицею “Ukraine”, модуль цієї форми, базуючись на її даних створює (поновлює) таблицю “Tkriterium”, тобто займається обробкою даних ІФА. Форма враховує кількість контролів, що потрібно брати до уваги, сортує, друкує, редагує дані таблиці “Tkriterium”. Відкриває форму “SearchCompound” або “AreaSelect”.

“SearchCompound” – створює нові об’єкти. Модуль цієї форми заванта-жує ключові слова з таблиці “KeyWords” і при потребі їх поновлює; дина-міч-но зв’язує форму з новими об’єктами; за допомогою метода OLE (Object Linking & Embeding – зв’язування та будова об’єктів) інкрустує форму об’єктами “CompoundForm” або “LastForm”, поновлює в них дані, понов-лює власні дані, сортує, редагує, поєднує, відбирає, групує, друкує власні та інкорпоровані дані. Відкриває об’єкт звіту (що в свою чергу відкриває інкрустований) об’єкт запиту, що в свою чергу відкриває об’єкт “LastTable”) або форму “Plate”.

Форми, що лишились не описані, виконують деякі внутрішні функції (поєднання об’єктів, роблять користування базою більш зручним та зрозумілим). Звіт – об’єкт, що статично пов’язаний з об’єктом запиту, групує та готує дані до друку.

Запит – спеціалізована структура (об’єкт) описана мовою SQL. Робить запит до таблиці “LastTable” і вертає віртуальний об’єкт, що містить всі унікальні записи таблиці. Цей об’єкт далі використовують форма “LastTable” та звіт “LastTableReport”.

Макроси виконують послідовний набір нескладних команд, в тому випадку, коли стандартними засобами це зробити неможливо, а викорис-тання SQL або Access Basic недоцільно.

Модулі утримують процедури та функції на Аccess Basic та SQL – аналоги. З цими процедурами пов’язані всі арифметичні операції, операції сортування, групування, редагування і т.п.

Моніторинг вірусних захворювань сільськогосподарських культур в агроценозах регіонів України

Першим етапом нашої роботи було обстеження областей України для порівняльної оцінки ризику розповсюдження фітовірусних епідемій в залежності від конкретних характеристик регіону.

У кожній області обстежувалися від 10 до 15 полів з сільськогосподар-ськими культурами та супутніми бур’янами. Зведені дані статистичної обробки результатів візуальної оцінки посівів цукрового буряку наведені на рис. 1. Встановлено, що 15-76% рослин цукрових буряків мають симпто-ми вірусних або вірусоподібних захворювань.

%

Рис. 1. Результати обстежень посівів цукрового буряку в різних регіонах України на симптоми вірусних захворювань.

Аналіз результатів дослiджень впродовж декількох польових сезонів дає можливiсть розглянути деякi факти збереження i розповсюдження вiрусiв, що уражують сiльськогосподарськi культури. Порівнюючи резуль-тати детектування антигенів вірусів у культурних рослинах (агроценоз) та диких рослинах (біоценоз) досліджуваних аграрних регіонів та наявність їх у ґрунтах, відмічається взаємозв’язок між знаходженням антигенів у ґрунті та рослині: ХВК, УВК, ВМБ, ВШМЯ, ВТМ – у Волинській області; ХВК, УВК, ВМБ, ВСПБ, ВТМ, ВОМ, ВЖКЯ, ВШМЯ – у Київській області; ХВК, УВК, ВМБ, ВЖКЯ, ВШМЯ, ВТМ – у Харківській області. Розгляда-ючи ці результати в динаміці, звертає на себе увагу факт не тільки кореля-ції між знаходженням антигенів вірусів в ґрунті та рослині, але й деякі законо-мірності динаміки виявлення вірусів у ґрунті. Так, наприклад, на полі під картоплею (Б-6) ХВК детектувався тільки на рослинах, у ґрунті не виявлявся, що могло бути пов’язане з ранніми етапами онтогенезу рослини (під час від-бо-ру зразків). У наступні роки антигени цього вірусу вже детектувалися в ґрунті, не дивлячись на те, що на полі вирощувалася пшениця. Однак в тих ценозах, які не використовувалися під сільськогосподарські угіддя (Б-5 – екологічна балка), відбувалося більш-менш стабільне детектування вірусів, як у рослинах, так і в ґрунті.

Такий патоген, як вiрус смугастої мозаїки пшеницi, детектувався у Волин-ськiй, Київській та Одеській областях як у ґрунті, так i на пшеницi; у Харків-ській області тільки на пше-ниці (рис.2). Спiвпадає з лiтературними даними той факт, що вірус огір-ко-вої мозаїки зустрічається в ґрунті (у Харкiвськiй, Одеській та Київськiй областях).

Рис. 2. Порівняння результатів ідентифікації деяких вірусів злакових методом ІФА (ELISA) в різних регіонах України (по областях).

На полях пiд цукровим буряком виявлялася зовсiм iнша картина (рис.3). В Харкiвськiй та Київській областях частіше всього зустрічався вірус жовтяниці буряку, антиген якого детектувався як в рослинах, так і в ґрунті. На полях Харківської областi крiм антигенів вірусу жовтяниці буряку вiдмiчено також вiрус мозаїки буряку, вiрус слабкого пожовтiння буряку та вiрус штрихуватої мозаїки ячменю (або серологiчно близький до нього). Слiд вiдмiтити, що практично всi обстеженi поля цукрового буряку в Харкiвськiй областi є зволожуваними. Характерно, що цi ж вiруси детектувалися i на цукровому буряку, однак фактiв передачi вірусу мозаїки, жовтухи та слабкого пожовтіння буряку через ґрунт в лiтературi не зустрiчається. Якщо порiвнювати в цiлому, то Харкiвська область знову звертає на себе увагу наявнiстю вiрусiв цукрового буряку в “диких” ценозах, що може мати зв’язок з загальним забрудненням середовища. Загалом якраз у Харкiвськiй областi в обстежених “диких” ценозах найширше представленi вiруси рослин (рис. 4).

Рис. 3. Порівняння результатів ідентифікації деяких вірусів цукрового буряку методом ІФА (ELISA) в різних регіонах України (по областях).

При дослiдженнi бiоценозiв Волинської областi також спостерігалась кореляцiя мiж наявнiстю вiрусiв у рослинах та ґрунті. Були одержанi позитивнi результати IФА в окремих точках на віруси жовтяниці та мозаїки буряку, Y-вірус картоплі та вірус тютюнової мозаїки. Однак деякі вiруси зустрiча-лися або тiльки в рослинах, або тiльки в ґрунті в залежностi вiд мiсця вiд-бору зразків. Антиген вірусу слабкого пожовтіння буряку був дiагносто-ваний тiльки в ґрунті.

Рис.4. Порівняння результатів ідентифікації деяких вірусів з природних ценозів методом ІФА (ELISA) різних областей України.

Обстеження лiсостепових зон Одеської областi, якi не використовуються для сiльськогосподарських потреб, виявило слабку кореляцію мiж знаход-женням вiрусiв в рослинах та ґрунті. Виявленi вiруси знаходились, в основному, тiльки в рослинах (Y-вірус картоплі, вірус мозаїки буряку, вірус тютюнової мозаїки). Цi вiруси накопичуються в лободi (Chenopodium album L.), лопуху (Arctium lappa L.), кульбабi (Taraxacum officinale Wigg.), що співпадає з літературними даними. В осотi (Cirsium arvense L.) жоден з вiрусiв, дiагностика яких проводилася, не був виявлений, а в ґрунті був виявлений тiльки антиген вiрусу жовтяницi буряку.

При електронномікроскопічному вивченні ізолятів вірусів, отриманих з досліджених агроценозів, за морфологією та розміром вірусні частки практично не відрізнялися між собою та від стандартних показників, що підтверджується також і даними седиментаційного аналізу.

Оскільки з одного боку віруси детектуються в сільськогосподарських рослинах, а з другого боку в ґрунті, стає можливим використовувати факти наявності антигенів тих чи інших вірусів як для загальної оцінки агроцено-зу, так і для прогнозування можливостей розвитку вірусних захворювань рослин в наступні роки. Як приклад, можна розглянути точку Б-2 в Київ-ській області. В перший рік досліджень ВЖКЯ та ВШМЯ детектуються як в ґрунті, так і в рослинах кукурудзи, причому в ґрунт ці віруси могли потрапити з попередньо вирощуваних рослин (в даному випадку це куку-рудза гібридна). Виходячи з біології збудників ВЖКЯ (група лютеовірусів) та ВШМЯ (група гордеівірусів), ми не можемо припустити інфікування рослин через ґрунт. Так, ВЖКЯ має широке коло господарів з родини Gramineae, передається за допомогою попелиць персистентним шляхом, не розмножується у цьому векторі, не передається трансоваріально, не передається механічно (в тому числі й через ґрунт), не передається контак-том між рослинами, не передається насінням та пилком. Передача до нових рослин-господарів відбувається за рахунок попелиць Rhopalosiphum maidis. Rh. padi, Myzus persicae та ін. В свою чергу ці попелиці в умовах температурного режиму досліджуваних регіонів (абсолютний мінімум температури січня – 32-41°С) зимують виключно в стадії яєць, а не імаго (дорослої особини), таким чином передавати лютеовіруси в умовах України попелиці можуть тільки в разі прямого контакту з резервуарами вірусних інфекцій (багаторічні бур’яни або дерев’янисті рослини), оскільки віруси не можуть передаватися через яйця. При сприятливих погодних умовах розвитку цих векторів можуть відбуватися масові ураження чутливих сільськогосподарських посівів, що в свою чергу призводить до значних економічних збитків. Однак, як було сказано вище, при рості, розвитку рослин та при збиранні врожаїв віруси та (або) їх антигенні детермінанти можуть слугувати сигналом про наявність стійкої циркуляції цього вірусу в даному агроценозі, даючи змогу прогнозувати несприятливий розвиток подій та запобігати цьому. Розглядаючи цей агроценоз в динаміці, ми можемо бачити, що після того, як вірус детектувався в рослинах (кукурудза) і ґрунті, на наступний рік при висіві цукрових буряків вірус детектувався тільки у ґрунті. І дійсно, виходячи з літературних даних та власних експери-мен-тів, відомо, що ВЖКЯ не уражує цукрові буряки, маючи вузьке коло господарів з родини Gramineae, хоча існує багато спільних для цукрових буряків та пшениці шкідників – векторів цих вірусів (Rhopalosiphum padi, Myzus persicae, Acyrtosiphon dirhodum, Macrosiphum avenae та ін). Однак дослідження наступного року (коли висіяли пшеницю) показали наявність ВЖКЯ тільки на рослинах пшениці, що якраз і є доказом можливості використання детекції антигенів в ґрунті, як прогнозуючого фактору роз-вит-ку інфекції в залежності від сівозмін та погодно-кліматичних умов.

На Волині в точці В-6 антигени ХВК детектувалися в ґрунті, коли виро-щу-вали пшеницю (перед цим була картопля), і наступного року при культи-ву-ванні картоплі вона була інфікована цим вірусом. ХВК належить до групи потексвірусів, уражує багато сільськогосподарських та диких рослин з 16 родин. Передається контактом між рослинами, механічно, не передається за допомо-гою векторів. Може передаватися насінням бур’янів, а також зооспо-рами збудника рака картоплі (Synchiytrium endobioticum). У деяких випад-ках картопля може уражуватись через коріння ХВК. Не переда-ється пилком. Тож цілком природно, що вірус може інфікувати рослини картоплі, які будуть висаджені в контамінований ХВК ґрунт, або безпо-середньо через корені, або при контакті бур’янів-резерваторів та культур-них рослин, або за допомогою векторів-комах, що могли інфікуватися з су-пут-ніх бур’янів, і такий перебіг подій можливо прогнозувати та поперед-жувати шляхом своєчасної детекції антигенів вірусів.

У точці Х-1 (Харківська область) ми можемо простежити “міграцію” антигену ВМБ (група потівірусів). У перший рік досліджень антигени ВМБ детектувалися тільки на цукрових буряках (попередня культура – пшениця). Наступного року антиген ВМБ визначаєтьсяє і у ґрунті, і в сільсько-господарських рослинах (в даному випадку капусті). Виходячи з біології збудника відомо, що ВМБ уражує рослини 13 родин, в тому числі і Brassicaceae. Вірус передається неперсистентно більш ніж 28 видами попелиць, механічною інокуляцією; за допомогою щеплень; не передається контактом між рослинами; насінням та пилком. Через дуже широке коло рослин-резерваторів (в більшості бур’янів) існує велика ймовірність попа-дання вірусних антигенів в ґрунт з рослинними залишками. Наступ-ного року при посіві пшениці вірус детектувався тільки в ґрунті. Взагалі для поті--вірусів не доведена передача через ґрунт, але, як видно з проведених дослід-жень, ґрунт може виступати одним з найперших факторів визначення мож-ли-вої циркуляції цих вірусів при коротко-строкових прогнозах.

При культивуванні кукурудзи протягом всього періоду досліджень вірусні антигени представлені дуже широко в перший рік мають тенденцію до збільшення протягом наступних двох років. Це може бути пов’язане з погір-шенням санітарного стану посівів та збільшенням контамінації віру-сами ґрунту. Антигени ВШМЯ у 1994 році детектувалися в рослинах куку-рудзи; в 1995 – тільки в ґрунті; в 1996 – і в рослинах, і в ґрунті. Такий па-то-ген, як ВШМЯ, належить до групи гордеівірусів. Він може уражувати рослини з 3 родин, таких як Chenopodiaceae, Gramineae та Solanaceae. Передається механічною інокуляцією, за допомогою насіння (до 90-100%), пилком на рослини, які запилюються. З рослинами або пилком вірус та/або антиген може потрапляти у ґрунт та підтримувати епідемічний ланцюг.

На прикладі ВТМ та ВЖКЯ показано, що концентрація вірусних антигенів у рослинах та ґрунті залежить також і від зміни культурних рослин в агроценозах (рис. 5), в той час як у природних ценозах цей рівень концентрації знахо-диться на більш менш постійному рівні.

%

Рис. 5. Залежність концентрації вірусу тютюнової мозаїки від зміни рослин-господарів: WL – природний ценоз; Ag – агроценоз; 1994 – томати, 1995 – кукурудза, 1996 – пшениця, 1997 – пшениця, 1998 – томати.

Роль супутніх рослин (бур’янів та дикоростучих) та ґрунту у предикції фітоепідемій. Зв’язок фітовірусного навантаження агро- та біоценозів із забрудненням довкілля полютантами техногенної природи

У результаті обстежень агроценозів України на вміст антигенів вірусів серед бур’янів методом ELISA було встановлено, що практично всі бур’яни в агроценозах давали позитивні результати на ті чи інші вірусні антигени. Наприклад, вірус мозаїки цукрового буряку ідентифікувався на Cirsium arvensis, Amaranthus caudatus, Chenopodium gybridum, Ch. album, Ch. rubrum, хоча і з різною частотою (рис. 6). Приймаючи до уваги отримані результати, як предиктор розповсюдження цього вірусу в агроценозі можуть бути використані Cirsium arvensis та Amarantus caudatus, які чутливі до більш вузького спектру вірусів, ніж інші перераховані бур’яни.

Аналогічно визначався вміст антигенів ХВК, ВШМЯ та ВЖКЯ в бур’я-нах досліджуваних регіонів.

Виявлено, що акумуляція ХВК на Convolvulus arvensis, може впливати на розповсюдження даної інфекції, так як C. arvensis є резервантом даного вірусу на території агроценозу завдяки своїй чутливості до даного вірусу та є багаторічною рослиною. Циркуляція вірусу жовтяниці цукрового буря-ку пов’язана з наявністю в агроценозі Cirsium arvensis, а для вірусів штриху-ватої мозаїки ячменю та жовтої карликовості ячменю важливим є факт присутності на посівах Elytrigia intermedia та Phleum pratence.

%

Рис. 6. Вміст вірусу мозаїки цукрового буряку на бур’янах та культурних рослинах (інтегральний показник всіх обстежених регіонів за резуль-татами ІФА).

На рис. 7. представлені результати порівняльного аналізу бур’янів, в яких детектувалися антигени вірусної природи (ВЖБ, ВСПБ, ВТМ, УВК), які демонструють різну чутливість рослин-господарів до вірусів.

Аналіз отриманих результатів також показав як різну частоту виявлен-ня ВСПБ, ВЖКЯ, ВСЛК в обстежених агроценозах, так і залежність цієї величини від зміни культурних рослин-господарів та їх фітосанітарного стану. Частота виявлення розраховувалась як співвідношення позитивних результатів ІФА усіх зразків з ценозу до загальної кількості протестованих зразків. Найбільше у відсотковому відношенні як ВЖКЯ, так і ВСПБ, зустрі-чалося в агроцено-зах Харківської області (до 60% порівняно з 30% в Одеській, 20% в Київській та 15% у Волинській) для ВЖКЯ, приблизно такий самий рівень відзна-чався і для ВСПБ (70, 20, 15, 0% відповідно). ВСЛК діагносту-вався тільки епізодично в супутніх бур’янах. Це, скоріше за все, пов’язано з відсутністю картоплі в змінах культурних рослин-господарів обстежених агроценозів. Однак у Волин-ській області на експериментальних полях, де всі три роки висаджувалась картопля, вірус ідентифікувався в усіх зразках картоплі та бур’янах-резер-вантах (Amaranthus albus L., Solanum nigrum L.). За результатами досліджень двох різних агроценозів Харківської та Київ-ської областей можна відзначити залежність частоти вияву вірусів від зміни культурних рослин-господарів та наявності тих чи інших супутніх бур’янів. Так для ВЖКЯ резервантами можна вважати Elytrigia intermedia N., Chenopodium album L., що здатні навіть після сівозміни (цукрових буря-ків) призвести до нового циклу поши-рення вірусу (вже на озимій пшениці). Для ВСПБ такими резервантами можуть виступати Senesio vulgaris L., Chenopodium amaranticolor L. та Datura stramonium L. Особливо слід відзначити реєстрацію (як електронно-мікроскопічним, так і імунофер-ментним аналізом) високої концентрації вірусу слабкого пожовтіння буряку в талабані (Thlaspi L.). Талабан польовий (T. arvensis) і талабан ранній (T. praecox) широко зустрі-ча-ються як у вигляді бур’янів на полях цукрового буряку, так і в необроблюваних ділянках