НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії

РАДЧУК Володимир Володимирович

УДК 575.2.084:683.2

ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ ХРЕСТОЦВІТНИХ ГЕНАМИ БІОСИНТЕЗУ ЛАНТИБІОТИКУ НІЗИНУ З МЕТОЮ ЇХ ЕФЕКТИВНОГО КОМБІНУВАННЯ У ТРАНСГЕННИХ РОСЛИНАХ

03.00.15 - генетика

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

К и ї в - 2 0 0 0

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у лабораторії фізико-хімічної біології клітини відділу цитофізіології та клітинної інженерії Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України та в Інституті селекції овочевих, ароматичних і лікарських рослин Федерального центру селекційних досліджень культурних рослин, Німеччина.

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України, професор

Блюм Ярослав Борисович

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, зав. відділом

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Галкін Анатолій Павлович

Інститут біоорганічної хімії НАНУ, зав. відділом;

кандидат біологічних наук

Рубцова Мирослава Олексадрівна

Інститут фізіології рослин та генетики НАНУ,

науковий співробітник

Провідна установа: Інститут агроекології і біотехнології УААН

Захист дисертації відбудеться "___"___________ 2000 року о ___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою:

252143, Київ-143, вул. Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: Київ, вул. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий "___" ____________ 2000 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Л.В. Тарасенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За останні десятиріччя помітно зросло практичне використання рослин з роду Brassica (Аватесян, 1981; Dovney et al., 1989). Як олійна культура особливого значення набув рапс, який на сьогодні є другим по валовому збору продуцентом рослинної олії у світі (Murphy, 1996). Велика географічна пластичність цієї культури дозволяє вирощувати її як у Канаді та в Європі, так і в Індії, Китаї та Австралії (Dovney et al., 1989; Kuvshinov et al., 1997). З рапсу отримують харчову і технічну олії (Vlies, Gottenbos, 1989), а вижимки і вегетативну масу використовують у тваринництві як цінний корм. Продукти переробки рапсу широко застосовують у хімічній промисловості (Pryde, Rothfus, 1989). Інші представники роду - білоголовкова і цвітна капуста - є важливими овочевими культурами (Аватесян, 1981; Puddephat et al., 1996).

Вирощуванню рапсу в Україні не придається того значення, на яке він заслуговує. Помітне також відставання у наукових дослідженнях і селекційній практиці як у випадку рапсу, так і у випадку капусти. Однак, швидке розширення площ під цими культурами у світі стало результатом продуктивної селекційної роботи із активним залученням до процесу створення нових сортів результатів досліджень клітинної біології і генетичної інженерії (Puddephat et al., 1996; Poulsen, 1996). Такі ознаки, як стійкість до шкідників і хвороб, біотичних і абіотичних факторів, не можуть бути отримані при застосуванні методів лише класичної гібридизації. Генетична трансформація рослин з роду Brassica дає можливість отримати нові лінії з додатковими господарсько-корисними генами, зберігаючи при цьому всі позитивні характеристики вихідного сорту, і тим самим прискорити селекційний процес. Білоголовкова капуста є більш складним об'єктом для генетичної інженерії, тому існує дуже мало повідомлень про успішне перенесення генів у геном цього виду (Kuvshinov et al., 1997), причому для обмеженої кількості сортів (Puddephat et al., 1996). Через це розробка нових підходів до генетичної трансформації для вже створених промислових сортів і гібридів різних видів рослин, що належать до xрестоцвітних, є важливим питанням.

Не зважаючи на великі зусилля у клонуванні генів і перенесенні їх у геноми рослин, найбільших успіхів досягнуто лише у тих випадках, коли характеристики, що вивчались, були опосередковані одним геном, який і використовували для генетичної трансформації (Chen et al., 1998). Але більшість метаболітів рослинної клітини продукується у довгих шляхах біосинтезу і тому кодується і регулюється багатьма генами (Richter, 1996). Основні господарсько-корисні ознаки також є полігенними по своїй природі (Гершензон, 1986). Наявність системи перенесення багатьох генів в одиничний рослинний геном є необхідною передумовою для забезпечення можливості маніпулювання шляхами біосинтезу речовин у клітині і для перенесення комплексних агрономічних характеристик.

З іншого боку, на сьогодні відчутно нестачу генів, які кодують промислово значущі ознаки, особливо генів стійкості до грибкових і бактеріальних захворю-вань рослин (Strittmatter, 1998). Тому пошук і залучення нових генів, включаючи також і гени мікроорганізмів, до конструювання генетично-модифікованих рослин, є дуже актуальним та перспективним напрямком наукових досліджень.

Саме поєднанням вищезазначених аспектів для розробки нових підходів для генно-інженерних маніпуляцій з представниками родини хрестоцвітних і визначається як теоретичний, так і практичний інтерес до нашої роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводились у лабораторії фізико-хімічної біології клітини (з 2000 р - відділ клітинної біології та біотехнології) відділу цитофізіології і клітинної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України:

з 1993 по 1996 роки - у відповідності з тематичним планом № .3.3.6 "Вивчення молекулярно-генетичних процесів у реконструйованих клітинних системах та трансгенних рослинах";

1996-1999 роки - у відповідності з тематичним планом № .28.2.9 "Вивчення молекулярно-біологічних і генетичних процесів в реконструйованих трансгенних і трансгеномних клітинних лініях і рослинах",

та 1996-1999 роки - у відповідності з планом міжнародного співробітництва Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАНУ з Федеральним центром генетичних досліджень культурних рослин ФРН, що фінансувалось Мініс-терством по розвитку і науці ФРН № ВЕО 022/0311137 (Тема: "Синтез антибіотич-них речовин із бактерій у культурних рослинах: механізм дії, виділення генів і гене-тична трансформація з метою отримання нових продуцентів активних речовин").

Мета і задачі дослідження. Основною метою досліджень було вивчення можливості ефективного комбінування трьох основних генів, що забезпечують повний шлях біосинтезу лантибіотику нізину у трансгенних рослинах родини Brassicaceae. В зв'язку з цим, необхідно було вирішити наступні основні задачі:

1. Виявити оптимальні умови ефективної трансформації експлантів і розробити методику переносу генів та регенерації трансгенних рослин для різних сортів та гібридів білоголовкової капусти і рапсу, в тому числі і озимих, за допомогою Agrobacterium tumefaciens.

2. Розробити методику для тимчасової експресії генів у протопластах цвітної капусти, а також отримати трансгенні рослини цвітної капусти шляхом прямої трансформації протопластів за допомогою поліетиленгліколю.

3. Отримати трансгенні лінії рапсу, білоголовкової та цвітної капусти, які містять гени біосинтезу нізину, і встановити за допомогою молекулярно-біологічних методів аналізу їх інтеграцію у геноми регенерованих рослин.

4. Вивчити експресію генів біосинтезу нізину в трансформованих рослинах на рівні РНК і білку та провести генетичний аналіз успадкування перенесених генів.

5. Дослідити стійкість отриманих трансформованих рослин до фітопатогенних грибків і бактерій.

6. Розробити метод одночасного переносу декількох генів у геном рослин (на прикладі генів біосинтезу нізину), виходячи з можливостей генетичної трансформації in planta арабідопсису.

Об'єктом дослідження були представники родини хрестоцвітних: рапс (B. L.), білоголовкова (B. L. var. capitata) і цвітна (B. L. var. botrytis) капусти, а також арабідопсис (Arabidopsis thaliana) та їх трансгенні лінії, які містили один або декілька генів біосинтезу нізину.

Предметом дослідження було отримання трансгенних рослин вищезгаданих видів рослин з родини хрестоцвітних, які містили б основні гени біосинтезу лантибіотику нізину nisA, nisB i nisC та встановлення закономірностей взаємодії цих генів при їх гетерологічній експресії у відповідних рослинних геномах.

Методи дослідження. Трансгенні рослини рапсу і білоголовкової капусти отримали за допомогою адаптованої методики генетичної трансформації при використанні агробактерії. Трансгенні рослини цвітної капусти - вперше розробленим методом прямої трансформації мезофільних протопластів. Наявність і копійність перенесених генів підтвердили, використовуючи полімеразну ланцюгову реакцію та гібридизацію за Саузерном. Експресію цих генів встановили при використанні нозерн- та вестерн-гібридизацій. Наслідування перенесених генів визначили по їх розщепленню в наступному поколінні. Плоїдність встановлювали методом проточної цитометрії. Комбінування чужорідних генів досліджували по їх тимчасовій експресії у протопластах, по встановленню наявності зрілого нізину в дослідах, по інгібуванню росту фітопатогена in vitro, та в трансгенних рослинах з двома генами шляху біосинтезу нізину, отриманих в результаті штучного запилення рослин з одиничними чужорідними генами. Трансгенні рослини арабідопсису з трьома генами отримано за допомогою вперше розробленої методики генетичної трансформації дорослих рослин in planta із одночасним застосуванням декількох конструкцій.

Наукова новизна отриманих результатів. При вдосконаленні методики генетичної трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens різних сортів літнього і озимого рапсу та білоголовкової капусти встановлено, що ефективність трансформації була вищою при використанні сегментів гіпокотилів як експлантів, ко-культивації їх з агробактерією на твердому середовищі, а також при застосуванні штамів агробактерії GV3101 i EHA105.

Вперше розроблено методику прямої генетичної трансформації мезофільних протопластів цвітної капусти за допомогою поліетиленгліколю з наступною регенерацією трансгенних рослин. Запропонована методика розширює можливості маніпулювання у даного виду на генному і хромосомному рівнях.

Вперше досліджено, що при трансформації рослин арабідопсису in planta кількома конструкціями одночасно, з високою ефективністю відбувається перенесення кількох генів з різних конструкцій. Встановлено також, що частота переносу генів у геном рослин при використанні агробактерії не залежить від їх довжини. Розроблені підходи створюють теоретичну базу для перенесення багатьох генів і вивчення закономірностей експресії полігенних ознак і шляхів біосинтезу вторинних сполук у трансгенних рослинах.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена методика генетичної трансформації рослин роду Brassica за допомогою агробактерії може бути використана для переносу і інших господарсько корисних генів у геном рослин літніх і озимих сортів рапсу, а також сортів білоголовкової капусти. Всі використані у роботі сорти білоголовкової капусти є комерційно значимими і були трансформовані вперше.

Отримані трасгенні рослини можуть служити джерелом одержання пептиду лантибіотику нізину в комерційних цілях.

Розроблена методика для одночасного переносу кількох генів у геном Arabidopsis thaliana за допомогою методу in planta (трансформація дорослих рослин) дозволить проводити прикладні дослідження по отриманню в трансгенних клітинах різноманітних вторинних речовин, а також по перенесенню полігенних агрономічних характеристик.

Результати роботи і отримані висновки використовуються при читанні курсу лекцій "Генетична інженерія рослин" на кафедрі клітинної біології і генетичної інженерії Київського університету ім. Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача заключається в розробці напрямку і завдань досліджень, проведенні всіх основних експериментів і дослідів, їх обробці та інтерпретації, аналізі літератури, підготовці та написанні наукових статей. Спільно з науковим керівником проведено вибір об'єктів і напрямку досліджень, розробка структури дисертаційної роботи. Генетичні конструкції отримано від А. Фарук і Х. Баумляйн (Інститут генетики рослин, ФРН), штами фітопатогенів надано Е. Грізбах і П. Шольце (Федеральний центр селекційних досліджень, ФРН) у рамках співробітництва у спільному науковому проекті. Викладені у дисертації ідеї, наукові висновки та положення сформульовані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися на: IV-й конференції Німецького товариства по селекції рослин (1998 р., Гіссен, ФРН); IX-му Міжнародному конгресі по культурі рослинних тканин і клітин (1998 р., Єрусалим, Ізраїль); II-му Міжнародному симпозіумі по біотехнології рослин (1998 р., Київ, Україна); II-й Міжнародній конференциї по біотехнології у рослинництві, тваринництві і ветеринарії (2000 р., Москва, Росія), Конференції молодих дослідників "Проблеми фізіології рослин та генетики на рубежі ІІІ-го тисячоліття" (2000 р., Київ, Україна) та Конференції німецької секції IAPTC (2000 р., Бонн, ФРН). Трансгенні рослини і результати досліджень були представлені на Міжнародній сільськогосподарській виставці "Grne Woche" (1998 р., Берлін, ФРН). Отримані результати обговорювались на семінарах Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України та Інституту генетики рослин, Гатерслебен, ФРН. Отримані результати опубліковані у річних збірниках Федерального центру селекційних досліджень культурних рослин (Кведлінбург, ФРН) за 1996, 1998 і 1999 роки.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 11 наукових робіт, в тому числі три статті у провідних наукових журналах і три - у збірниках праць.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із списку умовних скорочень, вступної частини, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень та їх обговорення, висновків і списку літератури, що містить 192 посилання, в тому числі 179 на іноземних мовах. Дисертація викладена на 139 сторінках машинописного тексту і містить 13 таблиць і 23 рисунки.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Як матеріал для досліджень використовували рослини рапсу промислових сортів Westar, Hanna та Ceres; білоголовкової капусти сортів і гібридів Bently, F1 Kalorama, Krautman, F1 Latima, Erdeno, Multition; цвітної капусти cорту Korso та арабідопсису екотипу Columbia.

Використовували генетичні конструкції pBINnisA2, pBINnisB2 і pBINnisC2. Вони були сконструйовані на основі бінарного вектора pBIN19 (Bevan 1984), який містив маркерний ген nptII під промоторною і термінаторною областю гена нопалін-синтетази. В Т-ДНК конструкції pBINnisA2 було клоновано структурний ген біосинтезу антибіотика нізину nisA (Kaletta, Entian, 1989), який регулювався 35S промотором віруса мозаїки цвітної капусти та osc-термінатором. Окрім цього, між геном і сайтом поліаденілювання було вбудовано фрагмент KDEL (Denecke et al. 1992), який направляв накопичення трансгенного білку в мембранних структурах клітини і/або можливу його секрецію в апопласт. Конструкції pBINnisB2 і pBINnisC2 містять гени нізинового оперону nisB і nisC (Engelke et al., 1992), які регулювались тими ж промотором, термінатором і сайтом KDEL, що і ген nisA у векторі pBINnisA2. У дослідах по трансформації рослин рапсу і білоголовкової капусти використовували три штами A. tumefaciens: GV3101C1Rfr з октопіновою Ti плазмідою pGV2260; GV3101C1Rfr з нопаліновою плазмідою pMP90 та EHA105 з агропіново-сукцінамопіновою плазмідою pEHA105. Для генетичної трансформації за допомогою Agrobacterium використовували в якості експлантів гіпокотилі або сім`ядольні листочки сіянців рослин рапсу і білоголовкової капусти. Для удосконалення методики генетичної трансформації вивчали умови адвентивного органогенезу, тип експлантів, умови ко-культивації їх з агробактерією і штам останньої.

Вплив нізину на рослини вивчали за допомогою тесту in vitro (Mller at al., 2000). Додатково встановлювали вплив нізину на ефективність регенерації експлантів рапсу, культивуючи їх на середовищі для регенерації А5, яке містило 0 (контроль); 0,1; 0,5 і 1% комерційного препарату нізину.

У дослідах по прямій трансформації цвітної капусти використовували мезофільні протопласти, які ферментативно виділяли із листків 4-х тижневих рослин. Культивування і регенерацію протопластів проводили за Ryschka et al., 1996. Методику прямого перенесення генів за допомогою ПЕГ розробили, базуючись на протоколі за Negrutiu et al., 1987. Вивчали вплив умов теплового шоку, концентрації ПЕГ і порядок проведення селективного відбору на ефективність прямої трансформації.

Стабільну інтеграцію перенесених генів установлювали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і гібридизацією за Саузерном (Southern, 1975). Експресію гену nisA на рівні РНК визначали за допомогою нозерн-гібридизації (Sambrook et al., 1989), а на рівні пептиду - методом вестерн-блотингу білкової фракції із апопластичної рідини, яку виділяли за Sjimons et al., 1990.

Плоїдність регенерованих рослин визначали методом проточної цитометрії. Успадкування і розщеплення перенесених генів вивчали у наступному поколінні, статистично обробляючи результати за класичним 2 аналізом (Гершензон, 1986).

Встановлювали стійкість трансформованих рослин до грибкових захворювань, які спричиняються Alternaria brassicicola, A. brassicea, Phoma lingam i Plasmodiophora brassicea (методика по Scholze et al., 1999), і до фітопатогенної бактерії Xanthomonas campestris (по Griesbach et al., 1999).

Для вивчення комбінування генів провели дослідження впливу сумішей білкових фракцій, виділених із трансгенних рослин, які містили nisA, nisB i nisC гени, на ріст фітопатогенної бактерії Clavibacter michiganensis spp. michiganensis. Можливість комбінування генів вивчали також, використовуючи тимчасову експресію генів у протопластах після їх трансформації сумішшю векторних плазмід. Для отримання декількох генів в одиничному геномі провели штучні схрещування між рослинами, які були трансгенні відповідно по генам nisA i nisC.

A. thaliana використовували для трансформації за допомогою in planta вакуум-інфільтрації. Насіння висівали в грунт у горщики і рослини вирощували до цвітіння. Первинні квітконоси зрізали, а рослини з вторинними квітконосами використовували для трансформації.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3.1. Вплив антибіотику нізину на рослини. Насіння рапсу пророщували in vitro з додаванням 0,5% промислової суспензії нізину. Через 2-3 тижні проводили аналіз можливості накопичування рослинами нізину із середовища, використовуючи витяжку з листків дослідних і контрольних рослин. Встановлено, що екстракти з дослідних рослин інгібували ріст фітопатогенної бактерії Cl. michiganensis. Ці тести показали, що нізин у концентрації до 0,5% суттєво не впливав на проростання і подальший ріст проростків, він вбирався коренями і його активність практично не змінювалась під впливом внутрішнього середовища рослини. Однак, у дослідах по регенерації встановлено, що формування калусу сильно пригнічувалось на середовищі з 0,5% нізину, а в присутності 1%-ного розчину комерційного нізину експланти гинули. Тому для уникнення інгібуючого ефекту нізину на регенерацію рослин після трансформації, векторні конструкції були створені таким чином, щоб направити накопичення продуктів біосинтезу перенесених генів з цитоплазми у цитоплазматичний ретикулум з подальшим виділенням в апопластний простір.

Оптимізація умов регенерації та трансформації за допомогою агробактерії експлантів рапсу і капусти. Для адаптації методики генетичної трансформації сортів рапсу і білоголовкової капусти дослідили такі фактори, як використання AgNO3 і гіберелової кислоти, тип гелюючого агента, концентрації антибіотиків, спосіб кокультивації експлантів з агробактерією і штам останньої. Встановлено, що органогенез з гіпокотильних експлантів успішніше проходив на середовищі А5 (Deet al., 1989) при використанні AgNO3 (5-7,5 мг/л) і фітагелю (3 г/л). Для ряду сортів ефективність регенерації була близькою до 100%.

У дослідах по отриманню трансгенних рослин кращі результати отримано при застосуванні фрагментів гіпокотилів, ніж експлантів з сім'ядольних листочків. Кокультивація експлантів з агробактерією відбувалась успішніше на твердому середовищі, ніж у рідкому. Ефективність трансформації дуже залежала від штаму агробактерії і була найвищою при застосуванні штамів GV3101 i EHA105 (Табл. ).

Таблиця 1. Ефективність трансформації різних сортів рапсу і білоголовкової капусти в залежності від штаму Agrobacterium tumefaciens (%)

Культура/сорт | Штам A. tumefaciens

GV2260 | GV3101 | EHA105

Рапс/Westar

Рапс/Hanna

Рапс/Ceres

Капуста/Erdeno

Капуста/Kalorama

Капуста/Krautman | 0,80,4

0

1,00,6

0

0

- | 6,53,1

4,41,4

4,62,2

1,81,0

31,6

21,3 | 6,42,9

-

4,02,5

-

-

-

Появу перших зелених калусів після трансформації спостерігали приблизно через 20 днів. Диференціація калусів краще проходила на неселективних середовищах. Регенерацію перших пагонів спостерігали приблизно через два місяці після трансформації. Трансгенні рослини вкорінювали, переносили у грунт і вирощували у теплиці до утворення насіння. Вперше були одержані трансгенні рослини нових комерційних сортів: озимого рапсу Ceres і білоголовкової капусти Kalorama, Erdeno і Krautman.

Трансформація протопластів за допомогою ПЕГ і регенерація трансгенних рослин. Для адаптації методики прямого переносу ДНК у мезофільні протопласти цвітної капусти вивчали умови теплового шоку, концентрацію ПЕГ і початок застосування селективного тиску. Протопласти залишались життєздатними і компетентними для проникнення ДНК при дії теплового шоку на протязі 5 хв. при 420С. У попередніх дослідах спостерігали високий рівень тимчасової експресїї репортерного гену uidA при використанні ПЕГ 4000 у концентрації 15%, яку і використали у подальших дослідженнях. Час старту селекції і порядок її проведення виявились критичними для виживання колоній. При додаванні канаміцину до середовища одразу після трансформації спостерігали масову загибель протопластів. Кращі результати були отримані тоді, коли селекцію починали з низької концентрації канаміцину (25 мг/л) на стадії кількох клітинних поділів. Потім концентрацію канаміцину поетапно доводили до 35 і 50 мг/л одночасно з кондиціюванням середовища. У результаті трьох незалежних експериментів по трансформації протопластів було отримано 9 канаміцин-стійких калусів, з яких регенерувало 7 рослин. Відносна ефективність трансформації протопластів цвітної капусти за допомогою ПЕГ склала близько 6%. Абсолютна частота трансформації протопластів знаходилась в межах (2,5-5)х10-5 трансформант/протопласт.

Молекулярно-біологічний аналіз регенерованих рослин. Регенеровані рослини спершу аналізували за допомогою ПЛР, ампліфікуючи їх ДНК з праймерами до nptII гена. Відбирали лінії, у яких були виявлені фрагменти, що відповідали фрагменту цього гена. Для цих ліній проводили ПЛР аналіз для підтвердження переносу відповідно nisA, nisB i nisC генів. Для всіх ліній було показано інтеграцію двох генів з відповідних Т-ДНК у рослинні геноми. Для виключення можливості контамінації регенерованих ліній агробактерією проводили додатковий ПЛР аналіз, використовуючи праймери до агробактеріального гену virD1, який знаходиться поза Т-ДНК. Ампліфікований фрагмент отримали лише із ДНК A., тоді як відповідний фрагмент був відсутній у всіх зразках ДНК трансформованих рослин.

Виходячи з сучасних вимог (Birch, 1997), необхідним і достатнім доказом трансформованості рослин є їх аналіз за Саузерном і вивчення успадкування перенесених генів у Т1 поколінні. Після Саузерн-гібридизації геномної ДНК отриманих нами трансгенних рослин було виявлено від 1 до 7 зон гібридизації з фрагментом nptII гену (Рис. 1) (Табл. ).

Присутність продуктів транскрипції перенесеного nisA гена у трансгенних лініях встановлювали за допомогою нозерн-гібридизації загальної РНК із зондом до гена nisA (Рис. 2). Рівень експресії даного гену значно відрізнявся у залежності від лінії. Не спостерігали кореляції між числом перенесених копій гену (Табл. 2) і кількістю РНК даного гена. Однак, гібридизацією цього ж фільтру з пробою до рДНК було підтверджено, що кількість РНК у кожному зразку приблизно однакова (Рис. 2).

Результати вестерн-аналізів фракцій білку з апопластичної рідини трансгенних ліній показали наявність відповідного пептиду (Рис. 3). Зона, яка зв'язувалась з моноклональними антитілами до нізину, відповідала розрахованій і знаходилася на тому ж рівні, що і пренізин із продуцента L. та із комерційної суміші нізину. Не виявлено пептиду відповідної величини у апопластичній рідині контрольної рослини. Рівень акумуляції пептиду дещо варіював в залежності від лінії.

Білоголовкова і цвітна капусти є диплоїдними росли-нами (2n=16). Однак встанов-лено, що ряд отриманих регене-рантів мали змінену плоїдність. Жодної диплоїдної лінії не виявлено серед трансформованих рослин цвітної капусти: три лінії були тетраплоїдними, а дві - октаплоїдними. Близько третини трансгенних рослин білоголов-кової капусти, отриманих після трансформації агробактерією, також були тетраплоїдними. Одним із пояснень утворення поліплоїдних рослин капусти при регенерації із калусів може бути припущення, що диплоїдні види роду Brassica є поліплоїдного походження (Quiras et al., 1987). Отримання трансгенних рослин із зміненою плоїдністю є небажаним, оскільки більшість таких рослин не зав'язує насіння. Тому всі регенеровані рослини диплоїдних видів роду Brassica мають бути перевірені за їх рівнем плоїдності перед проведенням подальших дослід-жень, і лінії із зміненою плоїдністю вибракувані.

Таблиця 2. Результати гібридизацій за Саузерном i генетичний аналіз трансгенних рослин рапсу в Т1 поколінні

Но-мер лiнii | Кількість гібри-дизаційних зон до гена nptII на фільтрах з ДНК, обробленою | Кiлькiсть тестова-ного насiння (шт.) | Схо- жiсть насiння

(%) |

Кіль-кість рослин | Очіку-ване спiввiд-ношен-ня |

2 |

Ймовір-ність

EcoRI | HindIII | с | ч

A3

А5

A8

A9

A11

A12

A13

A16

A25

A26

A30

A32

A34

А36 | 1

1

1

1

2

3

1

7

1

6

-

1

4

1 | -

3

-

1

3

1

1

4

5

1

-

2

3

1 | 70

100

100

50

50

70

50

50

50

50

50

50

50

70 | 88,6

81,0

85,0

84,0

58,0

91,4

98,0

96,0

92,0

96.0

98,0

66,0

80.0

92,8 | 0

76

62

30

21

55

38

45

36

36

36

5

31

52 | 62

5

23

12

8

19

11

3

10

12

13

28

9

13 | -

15:1

3:1

3:1

3:1

3:1

3:1

15:1

3:1

3:1

3:1

3:1

3:1

3:1 | -

0,065

0,153

0,222

0,08

0,018

0,265

0,089

0,377

0,028

0,048

61,48

0,233

1,021 | -

0,9-0,75

0,75-0,5

0,75-0,5

0,9-0,75

0,9-0,75

0,75-0,5

0,9-0,75

0,75-0,5

0,9-0,75

0,9-0,75

не дост.

0,75-0,5

0,5-0,25

Примітка. Кількість стійких i чутливих до канамiцину сіянців позначено як с i ч.

Генетичний аналіз наслідування перенесених генів у поколінні Т1 провели відносно маркерного гену nptII для всіх фертильних ліній рапсу. Сегрегаційний аналіз показав, що у більшості ліній ген стійкості до канаміцину успадковувався по Менделєвському принципу і в наступному поколінні давав розщеплення у співвідношенні 3:1 або 15:1, що відповідає одному або двом незалежним локусам у геномі (Табл. 2). Ці дані не строго корелювали з числом перенесених генів, підрахованих за допомогою Саузерн-аналізів. Лінія А32 показала незвичне розподілення, а у лінії А3 взагалі не виявилось канаміцин-стійких нащадків.

Стійкість трансгенних рослин до фітопатогенів. Базуючись на припущенні, що пренізин, який експресується геном nisA, може мати антифітопатогенні властивості, дослідили стійкість трансгенних рослин до різних фітопатогенів. Використовували по 6-12 рослин кожної лінії. Стійкість рослин вивчали до патогенних грибків Alternaria brassicicola, A. brassicea, Phoma lingam i Plasmodiophora brassicea, і бактерії Xanthomonas campestris. Всі трансгенні лінії, які містили ген пренізину nisA, так як і контрольні рослини, були високо чутливі до враження фітопатогенами, які вивчали. Лінії дещо відрізнялись між собою по толерантності до конкретного збудника хвороби, однак ці значення були статистично недостовірними і коливались у межах допустимої похибки. Встановлено, що пренізин не пригнічує розвиток фітопатогенів, які досліджували, і не може бути використаний для контролю за їх розвитком у випадку переносу гену nisA у геном рослин. Однак, оскільки зрілий нізин інгібував ріст контрольної фітопатогенної бактерії, провели дослідження по отриманню рослин, які б містили всі три основні гени біосинтезу і процесингу нізину.

Комбінування перенесених генів шляху біосинтезу нізину спершу провели, використовуючи суміш екстрактів сумарного білку, які виділяли з рослин, що експресували гени nisA, nisB, nisC на рівні РНК. Однак, інгібування росту фітобактерії C. michiganensis не спостерігали. Досліди по тимчасовій експресії генів після трансформації протопластів цвітної капусти сумішшю конструкцій pBINnisA2, pBINnisB2 i pBINnisC2 також не виявили інгібування росту тестового фітопатогена. Можливо, що концентрація зрілого нізину в ектрактах була надто низькою для прояву його активності у тестах in vitro.

З метою одержання рослин, які містили б гени nisA i nisC в одиничному геномі, виконали 10 комбінацій запилень між різними лініями трансгенних рослин. Отримані сіянці дослідили на стійкість до фітопатогену X. campestris. Було відібрано 26 рослин з ознаками толерантності з двох гібридних сімей. Це дозволяє стверджувати, що толерантність до фітопатогенної бактерії була викликана наявністю двох генів біосинтезу нізину в геномі цих рослин і їх взаємодією. Тобто, штучна гібридизація трансгенних рослин може використовуватись для вивчення взаємодії чужорідних генів у рослинному геномі. Недоліком методу є те, що для рослин з тривалим життєвим циклом необхідний довгий період часу, поки бажані гени будуть перенесені в одиничний геном. Так, за два роки нами було проведено схрещування і аналіз рослин, які містять лише два із трьох генів, потрібних для посттрансляційних модифікацій нізину.

Вивчення взаємодії багатьох генів у рослинній клітині стримується через відсутність системи для їх переносу у геном. Остання частина роботи присвячена розробці такого методу, який дозволив би за короткий час отримати рослини, які містили б всі гени шляху біосинтезу конкретної речовини.

In planta трансформація рослин арабідопсису сумішшю агробактерій. Після вакуум-інфільтрації in planta суцвіть 20-ти рослин арабідопсиса сумішшю трьох A., які мали три різних конструкції, pBINnisA2, pBINnisB2, pBINnisC2, було отримано 2,1 г (близько 105 тис. штук) насіння. Після його висіву, в результаті селекції і аналізів за допомогою ПЛР було відібрано 68 рослин, трансгенних мінімум по одному із генів, що застосовувались для трансформації (Рис. 4). Це відповідає ефектив-ності трансформації на рівні 0,065%. Теоретична частота отри-мання трансформованих рослин, які містили б гени з різних Т-ДНК, є близькою до нуля. Наші досліди суперечать цим розрахункам. В результаті одночасної трансфор-мації трьома конструкціями 23 лінії (34%) містили гени більш як з однієї Т-ДНК, а 6 рослин (9%) ма-ли у своїх геномах всі гени з трьох різних Т-ДНК. Раніше не повідом-лялось про таку високу частоту переносу двох і більше генів у оди-ничний рослинний геном при ко-трансформації.

Гени, які використовували для трансформації, значно відріз-няються один від одного по дов-жині: nisA містить 173 п.о., nisB - 2981 п.о., nisC - 1244 п.о. Однак, частота переносу генів не залежа-ла від їх довжини (Рис. ). Ймовір-ність інтеграції довгих генів у рослинний геном була практично така ж, як і коротких. Тобто, інтеграція чужорідних генів у геном рослин залежить не від довжини генів, які переносяться, а від компетентності реципіентних клітин.

В И С Н О В К И

1. Отримано трансгенні рослини з родини хрестоцвітних, які містили і експресували гени біосинтезу нізину та встановлено, що комбінування перенесених генів можливе при їх стабільній інтеграції в рослинні геноми.

2. Удосконалено методику генетичної трансформації ряду сортів білоголовкової капусти, літнього та озимого рапсу з використанням Agrobacterium tumefaciens. Підвищення ефективності трансформації для досліджуваних сортів було досягнуто за рахунок використання гіпокотилів як експлантів та їх ко-культивації з агробактерією на твердому середовищі.

3. Ефективність трансформації рослин рапсу і білоголовкової капусти значно залежала від штаму A. tumefaciens. Найвищу ефективність трансформації спостерігали при застосуванні агробактеріальних штамів GV3101 і EHA105.

4. Розроблено методику прямого переносу генів до геному мезофільних протопластів цвітної капусти за допомогою поліетиленгліколю та здійсено подальшу регенерацію трансгенних рослин.

5. Вперше отримано трансгенні рослини рапсу і білоголовкової капусти, які містять гени біосинтезу лантибіотику нізину (гени nisA, nisB i nisC), а також рослини цвітної капусти з геном nisA. Доведено наявність експресії структурного гену пренізину nisA у трансгенних рослин на рівні транскрипції і трансляції.

6. За допомогою молекулярно-біологічних методів аналізу (полімеразна ланцюгова реакція та блотинг-гібридизація ДНК по Саузерну) підтверджено стабільну інтеграцію чужерідних генів у геномах отриманих рослин. Шляхом генетичного аналізу встановлено, що перенесений маркерний ген nptII успадковувався, як правило, по Менделєвському принципу.

7. Вперше використано методику генетичної трансформації in planta рослин Arabidopsis thaliana для одночасного переносу генів, які розміщені в трьох різних Т-ДНК, і показано, що встроювання декількох генів у одиничний рослинний геном відбувається з дуже високою ефективністю. Так, 34% трансгенних рослин містило по два види Т-ДНК із різних конструкцій, а 9% рослин мали всі три види Т-ДНК із конструкцій, які застосовували для генетичної трансформації. Розроблений метод одночасного переносу багатьох генів в одиничний рослинний геном при трансформації in planta розширює можливості вивчення шляхів біосинтезу вторинних сполук і полігенних ознак, які кодуються рядом генів.

8. Встановлено, що перенос генів до геному арабідопсису при застосуванні генетичної трансформації in planta залежить не від їх розміру, а головним чином, від компетентності реципієнтних клітин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ОСНОВНИХ РОБІТ

1. Радчук В.В., Блюм Я.Б., Рышка У., Шуманн Г., Клоке Э. Изучение регенерации и получение трансгенных растений у различных сортов белокочанной капусты // Физиология растений. - 2000. - Т. 47. - № 3. - С. 453-460.

2. Радчук В.В., Клоке Э., Радчук Р.И., Нойманн М., Блюм Я.Б. Получение трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) c помощью Agrobacterium tumefaciens // Генетика. - 2000. - Т. 36. - № 7. - С. 932-941.

3. Radchuk V.V., Klocke E., Ryschka U., Neumann M. Optimierung des Agrobacterium-vermittelten Gentransfers bei verschiedenen Brassicaceae // Vortr. fr Pflanzenzchtung. - 1998. - Vol. 42 - P. 107-109.

4. Radchuk V.V., Klocke E., Neumann M. Synthesis of antibiotic substances from bacterias into cultivated plants // Jahresbericht der Bundesanstalt fr Zchtungsforschung an Kulturpflanzen. - Quedlinburg: Druck GmbH, 1996. - S. 162.

5. Neumann M., Klocke E., Ryschka U., Radchuk V.V., Krmer R., Scholze P. Synthesis of antibiotic substances from bacterias into cultivated plants. Cooperation, adoption and transfer of gene cassettes into Brassicaceae // Jahresbericht der Bundesanstalt fr Zchtungsforschung an Kulturpflanzen. - Halberstadt: Koch Druck. - 1998. - S. 189-190.

6. Klocke E., Radchuk V.V., Ryschka U., Krmer R., Scholze P. Synthesis of antibiotic substances from bacterias into cultivated plants; transfer and combination of single genes of nisin synthesis // Jahresbericht der Bundesanstalt fr Zchtungsforschung an Kulturpflanzen. - Halberstadt: Koch Druck. - 1999. - S. .

7. Radchuk V.V., Klocke E., Ryschka U., Schumann G., Neumann M. Direct DNA uptake into cauliflower protoplasts and recovery of transgenic plants // Abstr. of IXth Int. Congress on Plant Tissue and Cell Culture. - Jerusalem. - 1998. - p. 157.

Радчук В.В. Генетична трансформація хрестоцвітних генами біосинтезу лантибіотику нізину з метою їх ефективного комбінування у трансгенних рослинах. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15-генетика. - Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присв'ячено розробці методів отримання трансгенних рослин у родині хрестоцвітних і дослідженню взаємодії перенесених генів у трансформованих лініях. Оптимізовано методику генетичної трансформації за допомогою агробактерії трьох сортів рапсу і трьох сортів білоголовкової капусти. Вперше розроблено методику прямого переносу генів у мезофільні протопласти цвітної капусти з наступною регенерацією трансгенних рослин. Наявність і експресію чужорідних генів у трансформованих рослинах встановили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, Саузерн-, нозерн-, вестерн-гібридизацій. Розроблено метод одночасного переносу кількох генів у геном арабідопсису шляхом трансформації in planta.

Ключові слова: рапс, білоголовкова капуста, цвітна капуста, арабідопсис, Agrobacterium, регенерація, протопласт, генетична трансформація.

Радчук В.В. Генетическая трансформация крестоцветных генами биосинтеза лантибиотика низина с целью их эффективного комбинирования в трансгенных растениях. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15-генетика. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена разработке методов получения трансгенных растений в семействе крестоцветных и исследованию взаимодействия перенесенных генов в трансформированных линиях. Оптимизирована методика генетической трансформации при помощи агробактерии трех сортов рапса и трех сортов белокочанной капусты. Впервые разработана методика прямого переноса генов в мезофильные протопласты цветной капусты с подальшей регенерацией трансгенных растений. Наличие и экспрессию чужеродных генов в трансформированных растениях определили при помощи полимеразной цепной реакции, Саузерн-, нозерн-, вестерн-гибридизациями. Разработан метод одновременного переноса нескольких генов в геном арабидопсиса посредством трансформации in planta.

Ключевые слова: рапс, белокочанная капуста, цветная капуста, арабидопсис, Agrobacterium, регенерация, протопласт, генетическая трансформация.

Radchuk V.V. Genetic tranformation in Brassicaceae with genes of nisin biosynthetic pathway and their effective combination in transgenic plants. - Manuscript.

Thesis for Ph.D. degree (Biology) by speciality 03.00.15.-Genetics. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The thesis is devoted to the development of the methods on ontaining the transgenic plants in Brassicaceae and study co-ordinated action of tranferred genes in transformed lines.

The efficiency of adventitious organogenesis in oil-seed rape and cabbage cultivars was investigated on various culture media. The regeneration frequency depended on the of the medium used and gelling agents. A regeneration frequency of nearly 100% was obtained.

The method on genetic transformation by using of Agrobacterium has been optimized for three oil-seed rape and three cabbage cultivars. The optimal conditions for production of transgenic plants were determined. The transformation of plants was accomplished using three different A. strains, GV , GV , EHA , bearing the binary constructions with the genes of nisin biosynthetic pathway, nisA, nisB, nisC. Transgenic plants were obtained with a transformation frequency of 0,8-6,5% for oil-seed rape and 2-3% for cabbage.

For the first time the method for direct gene transfer in mesophyll cauliflower protoplasts has been worked out and transgenic plants have been regenerated. The efficiency on DNA uptake depended on heat shock conditions and PEG concentration. The start and timing of selection were critical for surviving of transformed calli and producing of stable transgenic plants after protoplast transformation.

The integration of introduced genes into regenerated plants was revealed by polymerase chain reactions. Southern-hybridizations estimated the integration from 1 to 7 copies of foreign genes into plant genomes. Northern-blot analyses showed the availability of nisA gene expression on RNA level, and western-hybridizations revealed the presence of corresponding peptide. The study on inheritance of foreign gene in the next generation determined its integration mainly in one or two genetic loci, with inheritance conforming of 3:1 or 15:12 Mendelian ratio. All of cauliflower and 30% of cabbage plants obtained after transformation possessed higher ploidy level as entired lines, what could be a result either of protoplast fusion or later duplication rearragements.

The co-ordinated action of several transferred genes in a plant genome was studied by in vitro phytopatological tests, transient gene expression in protoplasts and producing the hybrids by cross pollinations. The interaction of foreign genes is possible after their stable introduction into simple plant genome.

The method on simultaneous transfer of several genes in Arabidopsis genome by using of in planta transformation was elaborated. 34% of the R0 plants contained more than two, and near 9% all three, of the target genes. The most plants containing several genes displayed normal morphologies and set viable seeds. All target genes have been integrated with the same likelihood, indicating that neither the nature of the coding region nor the length had an effect on the efficiency of integration. Since the total number of plant cells exposed to Agrobacterium exceeds the