МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

Тернопільська державна медична академія

ім. І.Я.Горбачевського

СИМЧИЧ Антон Володимирович

УДК 616.379-008.64+616-089.843+591.437+615.357+611-013.9

вплив підсадки підшлункових залоз ембріонів курей на цукровий діабет

(експериментально-клінічне дослідження)

14.03.04 – Патологічна фізіологія

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Тернопіль - 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Івано-Франківській державній медичній академії, Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник Заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Геник Степан Миколайович, Івано-Франківська державна медична академія, завідувач кафедри загальної хірургії.

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор Бідюк Мартин Миколайович, Львівський державний медичний університет ім.Данила Галицького, завідувач кафедри патологічної фізіології.

Доктор медичних наук, професор Гоженко Анатолій Іванович, Одеський державний медичний університет, завідувач кафедри патологічної фізіології.

Провідна установа

Інститут ендокринології і обміну речовин ім.В.П.Комісаренка АМН України, м.Київ

Захист відбудеться 28 вересня 2000р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К.58.601.01 Тернопільської державної медичної академії ім.І.Я.Горбачевського МОЗ України ( м.Тернопіль, майдан Волі, 1).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського ( м. Тернопіль, вул. Руська, 12).

Автореферат розісланий 26 серпня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Боднар Я.Я.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Щорічно кількість хворих з цукровим діабетом і його судинними ускладненнями зростає на 5-7%, а кожні 12-15 років подвоюється (Паньків В.І., 1995). Експерти ВООЗ прогнозують, що в 2001 році число хворих вже складатиме близько 239,9 млн.чол (Дедов И.И., 1998).

Сьогодні на Україні нараховується біля 1 млн. хворих. Якщо брати до уваги, що з 25-30 захворівших тільки 10 є клінічно діагностованими, то реальна кількість хворих на цукровий діабет та його судинними вскладненнями складає 2,5-3 млн.чол. (Ефимов А.С., Ткач С.Н., 1997, Тронько Н.Д., Маньковський Б.Н., 1999).

Доведено, що метод вибору в лікуванні діабетичних ангіопатій є комплексний. Він включає як консервативні засоби (Ефимов А.С.,1983; Mehhert H., 1991; Древаль А.В., 1993; Ляпіс М.О. і співавт., 1993; El-Shattawy H.H. et al., 1994; Шідловський В.О., 1997), так і хірургічні методи (Шумаков В.И., 1989; Геник С.М., 1992; Сухарев И.И., 1993; Алферов А.В. и соавт., 1995).

Разом з тим широкого клінічного використання набула підсадка хворим культури острівцевих клітин підшлункових залоз ембріонів людей (Коммисаренко В.П. и соавт., 1983; Шумаков В.И. и соавт., 1995) та новонароджених плодів свиней і кролів (Коммисаренко В.П. и соавт., 1983; Турчин И.С., 1987; Ефимов А.С. и соавт., 1988; Бойко Н.И., Павловский М.П., 1990; Коммисаренко И.В. и соавт., 1991; Morel Ph. et al., 1993; Скалецкий Н.Н. и соавт. 1995; Sutherland D.E.R., 1996; Leone J.R., et al., 1998). Ще на початку 80-х років вчені зауважили, що в патогенезі лікувального впливу з боку підсаджених -клітин грає роль не тільки їх інсулінопродукуюча активність, але і стимулюючий вплив на відновлення функції власної підшлункової залози хворого-реципієнта (Коммисаренко В.П. и соавт., 1980; Бойко Н.І., 1995; Шумаков В.И. и соавт., 1995; Ефимов А.С., Скорбонская Н.А., 1998;).

Прогресуюче збільшення кількості хворих з судинними усклад-неннями при цукровому діабеті, частовиникаюча потреба в виконанні повторних підсадок вимагають пошуку легкодоступного, масового, економічно дешевого джерела ембріональних підшлункових залоз. У цьому плані заслуговують особливої вваги ембріони курей свійської домашньої птиці, починаючи з 13-15 доби інкубації (Лейбсон Л.Г., 1996).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в відповідності з планом Івано-Франківської державної медичної академії і є частиною науково-дослідної теми кафедри загальної хірургії 01.03.015.94п "Проблеми та перспективи лікування облітеруючих захворювань артерій нижніх кінцівок". Робота виконана в відповідності із планами кафедри ендокринології Івано-Франківської державної медичної академії по виконанню заходів Всеукраїнської комплексної програми “Цукровий діабет”, затвердженої президентом України наказом № 545/99 від 21.05.1999 року.

Автор є виконавцем складової частини вказаних науково-дослідних програм, яка представлена цією дисертаційною роботою. Ним сформульовано мету та узгоджено завдання для її досягнення, вибрано напрямки і методи обстеження, здійснено розробку основних теоретичних і практичних досліджень.

Мета дослідження: обгрунтувати патогенетичну доцільність використання вільної підсадки підшлункових залоз ембріонів курей у лікуванні цукрового діабету в експерименті.

Об'єкт дослідження – експериментальний алоксановий цукровий діабет, а також цукровий діабет І і ІІ типів, ускладнений ангіопатіями судин нижніх кінцівок, як клінічна нозологічна одиниця.

Предмет дослідження – підшлункові залози ембріонів курей 15, 16, 17, 18, 19 і 20 діб інкубації як джерело донорського матеріалу, необхідного для лікування цукрового діабету шляхом підсадки їх реципієнтам, хворим на цукровий діабет – в експерименті і клініці.

Методи дослідження – гістоморфологічними методами (з використанням забарвлення мікропрепаратів гематоксилін-еозином, за способом Малорі, за способом Романовського-Гімзи) проводили порівняльну характеристику морфологічної будови вентральної (кишкової) частини підшлункових залоз ембріонів курей 15-20 діб інкубації; аналогічним чином вивчали стан підшлункових залоз ембріонів курей, які підсаджували в паренхіму печінки щурів-реципієнтів з гострим алоксановим цукровим діабетом в післятрансплантаційному періоді; методом радіоімунологічного визначення імунореактивного інсуліну досліджували інсулінопродукуючу здатність підшлункових залоз ембріонів курей 15-20 діб ікубації in vitro (у поживному середовищі 199); методом реакції з тіобарбітуровою кислотою визначали вміст глікозильованого гемоглобіну в крові реципієнтів з метою виявлення ефективності проведеного лікування; з аналогічною метою досліджували вміст глюкози в крові глюкозооксидазним методом на апараті "Ексан Г", вміст глюкози в сечі – тест-смужками "Глюкотест"; оцінюючи стан жирового і білкового обмінів, вивчали динаміку концентрацій в крові реципієнтів загального холестерину, -ліпопротеїдів, тригліцеридів, загальних ліпідів та загального білка відповідно за методами Ілька, взаємодії з гепариновим реактивом, взаємодії з гідроксидом калію, взаємодії з фосфованіліновим реактивом та біуретовим методом. Окрім того, дієвість проведеного лікування алоксанового цукрового діабету в собак, спрямованого на відновлення здатності підшлункової залози реципієнтів до секреції інсуліну, характеризували за динамікою вмісту в крові С-пептиду. Останній визначали методом імунорадіометричного аналізу, що грунтується на взаємодії молекули С-пептиду з моноклональними антитілами миші.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі завдання:

1.

2.

3.

4.

5.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі комплек-сного морфологічного диференційного аналізу вентральної (киш-ко-вої) частини ПЗЕК 15-20 діб інкубації доведено доцільність ви-ко-ристання їх як донорського матеріалу для лікування алоксанового цукрового діабету.

Вперше виявлено і проаналізовано вплив на реципієнтів та доведена можливість використання підсадки підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16, 17, 18, 19 і 20 діб інкубації як дієвого методу лікування щурів з гострим алоксановим цукровим діабетом.

Вперше на основі гістоструктурного аналізу досліджено стан трансплантатів та явища, якими супроводжується внутрішньо-печін-кова підсадка підшлункових залоз ембріонів курей після пересадки їх щурам-реципієнтам з гострим алоксановим цукровим діабетом.

На основі аналізу клініко-біохімічних та гістоморфологічних даних доведено перевагу комплексної антидіабетичної терапії експе-римен-таль-ного цукрового діабету з використанням підсадки підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації по відношенню до підсадки залоз 18, 19 і 20 діб інкубації. Встановлена дієвість внутрішньом'язової підсадки підшлункових залоз ембріонів курей у лікуванні собак-реципієнтів з хронічним алоксановим цукровим діабетом.

Вперше виконано підсадку підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації в клінічних умовах хворим з діабетичними ангіопатіями судин нижніх кінцівок у прямий м'яз живота. Вивчено первинний ефект у хворих на підсадку їм в прямий м'яз живота малої кількості підшлункових залоз ембріонів курей.

Вперше з'ясований механізм нового підходу у вирішенні проблеми ефективної компенсації цукрового діабету, як першопричини розвитку тяжких судинних ускладнень.

Практичне значення одержаних результатів дослідження. Запропоновано комплексний метод лікування експери-ментального цукрового діабету, який полягає в одночасній внутрішньопечінковій підсадці підшлункових залоз ембріонів курей 15-20 діб інкубації та проведенні короткотривалої інсулінотерапії.

Диференційний патогенетичний аналіз результатів проведених морфологічних та клініко-біохімічних досліджень довів, що для ефективного лікування щурів з гострим алоксановим цукровим діабетом слід використовувати підсадку підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації. Використання залоз 18, 19 і 20 діб інкубації не забезпечує достатньої та тривалої компенсації захворювання.

Встановлено позитивний вплив монотерапії шляхом підсадки підшлункових залоз ембріонів курей 16 доби інкубації в прямий м'яз живота на хронічний алокса-новий цукровий діабет у собак, як філогенетично більш близького до людини виду тварин.

Проведено вивчення ефекту в хворих з цукровим діабетом, ускладненим ангіопатіями судин нижніх кінцівок, на підсадку їм у прямий м'яз живота 1, 2, 3 і 5 підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації.

Розроблений підхід у лікуванні експериментального цукрового діабету є можли-вим як для використання у подальших експери-ментальних дослід-женнях, так і для вивчення можливості та патогенетичного обгрунтування застосування у практичній роботі відділення судинної хірургії та відділення ендокринології обласної клінічної лікарні міста Івано-Франків-ська. Основні положення дисертації використо-вуються при читанні лекцій і проведенні практичних занять на кафедрі загальної хірургії, ендокринології, патологічної фізіології, гістології і ембріонології, факультетської хірургії Івано-Франківської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Автору належить розробка основних тео-ретичних і практичних напрямків роботи, проведений аналіз літератури, розроблена технологія ви-ко-нан-ня дисертації, сформульовані мета та завдання дослідження. Автором самостійно проведені клі-нічні та морфологічні методи дослідження, їх аналіз, статистична обробка ма-теріалу, сформульовані основні положення і висновки, підготовлені матеріали до опу-блі-ку-ван-ня.

Автор оволодів сучасними ме-то-дами виявлення вмісту у крові глюкози, загального холестерину, тригліцеридів, -ліпопротеїдів, загального білку, альбумінів, глобулінів, гліко-зи-льо-ваного гемоглобіну, імунореактивного інсуліну, С-пептиду. Виготовлення мікропрепаратів та інтерпретація результатів гістологічного дослідження проводив на кафедрі гістології та ембріології Івано-Франківської державної медичної академії.

Апробація результатів дослідження. Основні положення роботи викладені та обговорені на XIV з'їзді тера-пев-тів України (м.Київ, 1998), на XIX з'їзді хірургів України (м.Харків, 2000), на між-на-род-но-му Конгресі Молодих Вчених Укра-їн-ців (м.Івано-Франківськ, 1995), на студентсь-ких наукових конференціях (м.Івано-Франківськ, 1995, 1996, 1999), на 29 обласній науковій конфе-ренції молодих вчених-медиків (м.Івано-Фран-ківськ, 1997), на між-на-род-ній науково-виробничій кон-фе-ренції, присвяченій пам'яті заслуженого ді-яча науки, доктора біоло-гічних наук, професора П.О.Ковальського (м.Біла Церква, 1998), на Всеукраїнській науково-практичній конференції "Проблеми імунології в хірургічній патології. Нові технології в хірургії." (м.Івано-Франківськ, 1999), на лікарських конференціях клініки су-дин-ної хірургії ОКЛ м.Івано-Фран-ківська (1998, 1999), на спільному засіданні кафедр загальної хірургії, факультетської хірургії, ендо-крино-логії, гістології і ембріології, патологічної фізіології, терапії сто-ма-то-ло-гіч-ного факультету, кардіології, шпитальної терапії, соціальної гігієни, онкології, біофізики, фармакології Івано-Франківської державної медичної академії (1999).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 15 статей, 4 - у фахових наукових виданнях. З них 2 - самостійні, 2 - у співавторстві. Одержано 1 патент на винахід, отримано 2 свідоцтва на рацпропозицію.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на сторінках і складається із вступу, 6 розділів, 4 додатків. Робота ілюстрована таб-лицями, які займають сторінок, рисунками, які займають сто-рінок. Список використаних джерел включає 248 найменувань.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Виконана робота об'єднує експериментальну частину та вивчення первинного ефекту у хворих на підсадку їм малих кількостей підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації. Експерименти проведено з використанням ембріонів курей свійської домашньої птиці неселекційних порід, яких забирали для дослідження на 15, 16, 17, 18, 19 і 20 доби інкубації в термостаті ТС-80М-2 при t +38,30С із стаціонарним зволоженням; білих інбредних щурів-самців масою 150-200 г та безпорідних собак-самців, масою 8-15 кг. У щурів і собак викликали відповідно гостру та хронічну форми цукрового діабету шляхом дом'язової (у щурів) та довенної (у собак) ін'єкції 5-10% водного розчину алоксану гідрату в діабетогенних дозах.

Експериментальна частина включала три серії експериментів. У першій серії вивчалась морфологічна характеристика кишкової частини залоз за вмов норми; інсулінопродукуюча здатність залоз у поживному середовищі 199 in vitro; інсулінопродукуюча здатність окремих структурних частин залоз (вентральної та дорзальної). У цій серії використали 42 підшлункові залози ембріонів курей 15-20 діб інкубації.

У другій серії, щурів з гострим алоксановим цукровим діабетом, починаючи з 3 доби після індукції захворювання, лікували короткотривалим курсом введення свинячого інсуліну короткої дії Actrapid*MC – 0,05-0,1 ОД на 100 г ваги тіла тварини, дом'язово, 1 раз на добу, з 3 по 7 день включно після введення алоксану. Стан тварин порівнювали з таким у здорових щурів (І контрольна група), та в нелікованих тварин (ІІ контрольна група).

Після цього формували ще 8 груп щурів. З них 2 знову були контролем (здорові і неліковані тварини), та 6 груп – дослідними. В останніх, щурам з гострим алоксановим цукровим діабетом, на 3 добу після індукції захворювання, поряд з початком вищевказаної екзогенної інсулінотерапії одночасно підсаджували підшлункові залози ембріонів курей 15-20 діб інкубації. Підсадку виконували через серединну лапаротомію, в паренхіму печінки, з розрахунку 2 залози (без розділу на вентральну та дорзальну частини) кожної (від 15 до 20) доби інкубації на одну тварину. У цій серії використано 206 підшлункових залоз ембріонів курей 15-20 діб інкубації та 203 щурі.

У третій серії досліджень собак з хронічним алоксановим цукровим діабетом лікували методом підсадки підшлункових залоз ембріонів курей 16 доби інкубації в прямий м'яз живота, з розрахунку 1 залоза на 1 кг маси тіла тварини. У цій серії використали 59 залоз та 14 собак. Останніх розділили на 3 групи: 1 контрольна група (4 собаки) – здорові тварини; 2 контрольна група (5 собак) – тварини з нелікованим діабетом; 3 дослідна група (5 собак), яким підсаджували залози 16 доби інкубації.

Ефективність лікування оцінювали за загальним станом та активністю реципієнтів, за динамікою вмісту глюкози в крові (з допомогою апарату “Ексан Г”, який призначений для експрес аналізу глюкози в пробах цільної крові, і в інших біологічних рідинах), вмісту глюкози в сечі (з допомогою тест-смужок для експрес аналізу глюкози в сечі “Глюкотест – Норма”), за вмістом в крові загального білка (визначали за уніфікованим методом “біуретової реакції”), глікозильованого гемоглобіну (визначали уніфікованим методом “реакції з тіобарбітуровою кислотою”), загального холестерину (визначали за методом Ілька), тригліцеридів (визначали за реакцією з метилацетоном і амонієвими іонами як жовтий 3, 5 – диацетил-1, 4 – дигідролутидин і оцінювали фотометрично), -ліпопротеїдів (визначали уніфікованим методом “реакції з гепариновим реактивом”), загальних ліпідів (визначали за уніфікованим методом “реакції з фосфованіліновим реактивом”) та С-пептиду (дослідження кількості імунореактивного інсуліну in vitro (в першій серії експериментів) та С- пептиду в крові собак проводили радіоімунологічним методом) – до лікування, на 1-10, 14, 21, 30, 40, 50, 60, 70 і 85 доби після початку лікування (у щурів), та на 7, 14 і 21 доби після лікування (у собак). Антибіотико- та імуносупресивну терапію не застосовували.

Усі експериментальні дослідження виконувалися із строгим дотри-ман-ням правил гуманного та бережливого ставлення до піддослідних тварин.

Лабораторні обстеження та аналізи виконані з допомогою стандартних пристроїв та наборів реактивів, які використовуються в лабораторних і клінічних умовах для визначення вказаних показників.

На основі результатів експериментальних досліджень, проводили вивчення первинного ефекту у хворих з цукровим діабетом І і ІІ типів на підсадку їм в прямий м’яз живота малих кількостей підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації. 5 пацієнтам було підсаджено відповідно 1 залозу 16 доби інкубації, 1 – 17, 2 – 17, 3 – 16 і 5 залоз 15 доби інкубації. При цьому вивчали загальний стан хворих та активність, температуру тіла, загальний аналіз крові, показники системи гемокоагуляції, місцеву реакцію організму на введення залоз, динаміку вмісту в крові глюкози, динаміку доз екзогенної цукрознижуючої терапії. Історії хвороби хворих, задіяних для клінічної апробації знаходяться в архівах міської та обласної клінічних лікарень міста Івано-Франківська.

Результати дослідження та їх обговорення. Виконаний гісто-структурний аналіз кишкової частини підшлункових залоз ембріонів курей 15-20 діб інкубації довів наявність добре сформованого ендокринного відділу в усі досліджувані терміни інкубації ембріонів. Разом з тим, морфометричні показники свідчать про процес кількісного перерозподілу - і - клітин як у острівцях, так і поза ними (табл.1).

Таблиця 1

Співвідношення кількості - клітин до кількості - клітин

Показник | Термін інкубації ембріона, (доба)

15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20

/ | 1/2 | 1/1,7 | 1/1,1 | 1,3/1 | 2/1 | 2,2/1

Тобто, на 15, 16 і 17 доби інкубації, ендокринний апарат кишкової частини підшлункових залоз ембріонів курей містить у своїй більшості інсулінсекретуючі клітини. Дифузно розташовані ендокриноцити, тяжі або трабекули - і - клітин, перебуваючі на етапах формування та вже сформовані острівці Лангерганса, зустрічаються в усі досліджувані терміни інкубації ембріонів. Слід відмітити появу біполярних острівців, починаючи з 17 доби інкубації, великих острівців Лангерганса, які найчастіше зустрічаються на 18 добу, велику кількість позаострівцевих форм групування ендокриноцитів на 19 добу інкубації.

Екзокринний відділ кишкової частини підшлункових залоз ембріонів курей на 15-17 добу інкубації перебуває на стадії дозрівання, тобто ще не готовий до нормального функціонування. І тільки на 18, 19 і 20 добу він набуває своєї остаточної диференціації та здатності до повноцінної функціональної діяльності. Виявлено подібність морфологічної структури кишкової частини підшлункових залоз ембріонів курей 15-20 діб інкубації з морфологічною будовою підшлункових залоз ембріонів людини на 14-22 тижні внутрішньоутроб-ного розвитку плода.

Встановлено, що інсулінопродукуюча здатність in vitro найбільш виражена в залоз 15, 16 і 17 діб інкубації. Разом з тим виявлено здатність поживного середовища 199 зв’язувати in vitro антитіла до інсуліну людини.

Лікування щурів з гострим алоксановим цукровим діабетом тільки методом короткотривалої інсулінотерапії дозволило зменшити темпи зростання рівнів глікемії і глюкозурії в порівнянні з такими в нелікованих тварин. У цілому, в цих щурів протягом 10 діб (з 3 по 12 доби включно після введення алоксану), рівень глюкози в крові зріс від 26,320,30 ммоль/л до 38,870,45ммоль/л, що становить 43,02% (p<0,001), у сечі відповідно складав більше 2%. Тоді як у нелікованих щурів ІІ контрольної групи таке зростання рівнів глікемії і глюкозурії сталося протягом 3 діб (з 3 по 5 добу включно після введення алоксану). Рівень глюкози в крові збільшився від 27,160,26 ммоль/л до 38,130,24 ммоль/л, що становило 40,30% (p<0,001), у сечі відповідно складав більше 2% (p<0,001). Аналогічною була динаміка показників глікозильованого гемоглобіну, тригліцеридів, загального холестерину та -ліпопротеїдів. У тварин, яким вводили інсулін, прогресування вказаних величин було менш вираженим, ніж у нелікованих щурів ІІ контрольної групи, проте тенденція до наростання спостерігалася протягом усього дослідного періоду. Застосування короткотривалої інсулінотерапії дозволило незначно призу-пи-нити прогресування захворювання в піддослідних щурів ІІІ групи і збільшити вдвічі термін виживання в порівнянні з нелікованими тваринами. Останні гинули від гіперглікемічної коми в перші 7 діб після введення алоксану, тоді як усі ліковані щурі загинули з тієї ж причини до 12-13 доби після введення алоксану. Це доводить, що навіть за допомогою 5-денного введення інсуліну короткої дії, щурі не здатні самостійно компенсувати прогресування гострого алоксанового цукрового діабету.

Тому було створено 6 дослідних груп тварин з гострим алоксановим цукровим діабетом, яким, окрім курсу короткотривалої інсулінотерапії, на 3 добу після введення алоксану підсаджували по 2 підшлункові залози ембріонів курей 15, 16, 17, 18, 19 і 20 діб інкубації в паренхіму печінки.

У групі, де підсаджували залози 15 доби інкубації, для перших 15-18 діб характерним був хвилеподібний перебіг захворювання. Вміст глюкози в крові за цей період коливався в межах від 24,600,95 ммоль/л до 11,340,24 ммоль/л (p<0,05), у сечі, відповідно, від 2% до 1,070,02% (p<0,05). Проте з 20-21 доби лікування стан тварин був стійким, рівні глікемії і глюкозурії зменшилися до таких, що у здорових щурів 1 контрольної групи і коливалися від 5,090,05 ммоль/л (p>0,05) до 5,200,10 ммоль/л (p>0,05), у сечі глюкози не виявлялося. Компенсація захворювання тривала до 70-75 доби лікування. У наступному показники глюкози в крові та сечі набували характеру незворотного зростання і поступово тварини переходили в фазу декомпенсації процесу. Отриманий лікувальний ефект доводився також даними вмісту в крові глікозильованого гемоглобіну та тригліцеридів. На 21 добу після підсадки концентрація глікозильованого гемоглобіну складала 3,290,10 мкмоль фруктози/гНb проти 9,730,05 мкмоль фруктози/гНb до лікування (p<0,001); вміст тригліцеридів становив 1,460,02 ммоль/л проти 4,890,20 ммоль/л на момент підсадки залоз (p<0,001). У цілому, завдяки проведеному лікуванню, максимальна тривалість життя в даній групі склала 83 доби з моменту початку лікування або 86 діб після введення алоксану.

Вираженим антидіабетичним впливом супроводжувалася підсадка залоз 16 доби інкубації. Як і в випадку підсадки залоз 15 доби інкубації, післяопераційний період у перші 16-18 діб мав хвилеподібний перебіг. Як загальна активність, так і рівень в крові глюкози, глікозильованого гемоглобіну, тригліцеридів, вміст глюкози в сечі характеризувалися зниженням їх на 4 та 10 добу, і підвищенням – на 7 та 14 добу лікування. Починаючи з 18-20 доби, стан тварин залишався стабільним. Ознак діабету не відмічалося. Компенсація захворювання підтверджувалася наступними даними: на 21 добу після підсадки глікемія складала 3,060,13 ммоль/л (p<0,001), глюкозурія – не виявлялося; вміст глікозильованого гемоглобіну – 2,290,10 мкмоль фруктози/гНb (p<0,001), вміст тригліцеридів – 1,350,03 ммоль/л (p<0,001). Лікувальний ефект був настільки вираженим, що в частини реципієнтів розвивалися тяжкі гіпоглікемічні стани і вони гинули від гіпоглікемічної коми. Поясненням цьому, на нашу думку, може бути тільки надмірний вплив трансплантату на реципієнта, на фоні повної компенсації захворювання. Аргументами на користь такого твердження є те, що в 2 контрольній групі, де алоксановий цукровий діабет у щурів нічим не лікували, подібних гіпоглікемічних станів не відмічалося жодного разу. Причиною розвитку цих явищ не могла бути і короткотривала інсуліно-терапія, оскільки її виконували протягом перших 5 діб після підсадки залоз, а розвиток гіпоглікемій починався з 18-19 доби після початку лікування. Максимальний термін життя тварин у групі склав 67 діб з моменту початку лікування або 70 діб після введення алоксану.

Підсадка залоз 17 доби інкубації мала менш виражений лікувальний ефект у порівнянні з використанням залоз 15 і 16 діб інкубації. Проте характерним був більш стабільний перебіг захворювання. Показники глікемії, глюкозурії, глікозильованого гемоглобіну, тригліцеридів поступово знижувалися і на 21 добу лікування складали: глікемія – 9,720,87 ммоль/л (р<0,05), глюкозурія – 0,900,03% (р<0,05), глікозильований гемоглобін – 5,600,20 мкмоль фруктози/гHb (р<0,05), тригліцериди – 1,790,07 ммоль/л (р<0,05). У стані субкомпенсації щурі перебували протягом 49-52 діб, після чого захворювання знову прогресувало і тварини гинули від гіпер-глікемічної коми. Максимальний термін життя в групі склав 57 діб з моменту підсадки або 60 діб з моменту введення алоксану.

Застосування залоз 18 доби інкубації дозволило перевести захворювання в фазу субкомпенсації, що підтверджувалося динамікою вмісту глюкози в крові і сечі, динамікою рівнів глікозильованого гемо-глобіну та тригліцеридів. Проте такий ефект був не тривалим. Максимальний час життя тварин у даній групі склав 48 діб від початку лікування або 51 добу з моменту введення алоксану.

Значний антидіабетичний вплив, який проявлявся субкомпенсацією захворювання, спостерігався при підсадці залоз 19 доби інкубації. Проте він тривав тільки перші 25-28 діб після підсадки. Так, на 30 добу лікування, вміст глюкози в крові вже складав 31,951,15 ммоль/л проти 27,600,24 ммоль/л (р<0,05) на початку лікування, у сечі – 1,980,02% проти 2% (р>0,05) на момент підсадки. Схожою була динаміка глікозильованого гемоглобіну та тригліцеридів. Таким чином, максимальний термін життя реципієнтів даної групи склав 36 діб з моменту початку лікування або 39 діб з моменту введення алоксану (р<0,001).

Підсадка підшлункових залоз ембріонів курей 20 доби інкубації не супроводжувалася таким лікувальним впливом, як підсадка залоз 15-19 діб інкубації. Тільки на 4 добу лікування відмічалося вірогідне зниження рівнів глюкози в крові і сечі: глікемія – 17,800,18 ммоль/л проти 27,600,35 ммоль/л до лікування (р<0,05), глюкозурія – 1,750,03% проти 2% на момент підсадки (р<0,05). Зменшення вмісту глікозильованого гемоглобіну та тригліцеридів відмічалося на 21 добу лікування, проте воно було не вірогідним – 9,230,30 мкмоль фруктози/гHb проти 9,700,10 мкмоль фруктози/гHb на початку лікування (р>0,05); тригліцериди – 5,500,08 ммоль/л проти 5,700,08 ммоль/л до лікування (р>0,05). Не дивлячись на маловиражену антидіабетичну дію, підсадка залоз 20 доби інкубації зумовила вірогідне збільшення терміну виживання реципієнтів у порівнянні з нелікованими тваринами – максимальна тривалість життя склала 33 доби з моменту початку короткотривалої інсулінотерапії та підсадки залоз або 36 діб з моменту введення алоксану (р<0,001).

Середня тривалість життя в усіх дослідних групах була вірогідно більшою від такої в нелікованих тварин 2 контрольної групи (рис.1)

Рис. 1. Середня тривалість життя реципієнтів:

2 – контрольна група (неліковані тварини);

3 – 8 – дослідні групи (тварини, ліковані підсадкою підшлункових залоз ембріонів курей відповідно 15-20 діб інкубації і короткотривалим курсом інсулінотерапії).

Макроскопічна оцінка стану підсаджених підшлункових залоз ембріонів курей 15-20 діб інкубації в печінку не виявила жодних змін як печінкової тканини, так і підсадки. Гістоструктурний аналіз показав, що на 4 добу після підсадки центральна частина трансплантату представлена ділянками некрозу, оточених великою кількістю нейтрофільних грануло-ци-тів. У периферійній зоні відмічалися залишки ацинарних структур та окремі еле-менти ендокринного відділу залози. На 7 добу після підсадки спосте-рі-галося заміщення центральної частини підсадки молодою спо-луч-ною ткани-ною і формування бар'єру між залозою і печінкою. У пери-фе-рій-ній зоні ми виявили втворення вторинних епітеліальних трубочок та форму-ван-ня вторинних ациноподібних структур. Разом з тим відмічалися клітини з базофільною та ацидофільною зернистістю, схожі на - і -клітини під-шлун-кових залоз ембріонів курей за вмов норми. На 14 добу центральна частина підсадки була представлена молодою сполучною тканиною. Фібро-зна капсула навколо трансплантату була потоншеною або зовсім відсут-ньою. По периферії підсаджених залоз відмічалося проростання судин, наяв-ність сформованих вторинних ацинарних структур та острівцево-подібних утворів, заповнених - і -клітинами, що доводило збереженість під-сад-жених залоз (периферійної частини) після підсадки.

Лікування собак з хронічним алоксановим цукровим діабетом методом підсадки підшлункових залоз ембріонів курей 16 доби інкубації в прямий м'яз живота довело, що підшлункові залози ембріонів курей 16 доби інкубації здатні самостійно (без додаткового введення екзогенного інсуліну) компенсувати діабетичний стан. Підтвердженням цьому стала позитивна динаміка показників вмісту глюкози, загального холестерину, -ліпопротеїдів, тригліцеридів, загальних ліпідів, загального білку і глікозильованого гемоглобіну в крові. Вагомим доказом ефективності проведеного лікування була зміна рівня С-пептиду – на 14 добу після підсадки він складав 120,0210,83 пМ, проти 36,725,40 пМ на момент підсадки залоз (р<0,01) (рис.2).

Рис. 2. Динаміка вмісту С-пептиду в усі досліджувані терміни спостереження:

1 – на момент введення алоксану; 2 – на момент підсадки залоз (30 доба після введення алоксану); 3 – 7 доба після підсадки залоз; 4 – 14 доба після підсадки залоз.

Окрім того, така динаміка С-пептиду свідчить про відновлення інсулінопродукуючої здатності власної підшлункової залози реципієнтів. Середня тривалість життя від моменту індукції діабету в лікованих собак склала 83,402,70 діб проти 57,801,70 діб у нелікованих тварин (р<0,001).

У зв'язку з відсутністю даних літератури, а також власного досвіду, клінічну апробацію методу підсадки підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації, хворим з діабетичними ангіопатіями судин нижніх кінцівок ми розпочали з вивчення первинного ефекту у хворих на підсадку їм залоз у малих кількостях (від 1 до 5) в прямий м'яз живота. В усіх випадках ми не відмічали жодних патологічних змін чи ускладнень ні з боку загального стану організму, ні з боку досліджуваних лабораторних показників крові, ні в місці підсадки залоз як в перші години, так і в віддалені терміни (14-21 доби) після підсадки. Даний метод є атравма-тичним, безболісним і не викликає розвитку вторинних ускладнень.

На основі результатів власних експериментальних досліджень, а також даних літератури, нами з’ясований механізм антидіабетичної дії підсаджених залоз; сформульовано патогенетичний механізм розвитку вперше виявленого цукрового діабету та необхідного при цьому нового підходу в його лікуванні.

Висновки

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у пошуку масового, широко розповсюдженого дешевого та ефективного джерела ембріональних підшлункових залоз, які використовуються як донорський матеріал при хірургічному лікуванні цукрового діабету в експерименті і клініці. Ця наукова проблема вирішена шляхом використання підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації для лікування гострого і хронічного алоксанового цукрового діабету відповідно у білих інбредних щурів та безпорідних собак. Метод лікування – підсадка підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації тваринам-реципієнтам з алоксановим цукровим діабетом. У клінічних умовах доведено відсутність первинної реакції хворих з цукровим діабетом і його судинними ускладненнями на підсадку їм малої кількості підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації; ця реакція є аналогічною до реакції при розв'язанні наукової проблеми шляхом використання для підсадки підшлункових залоз ембріонів людини, новонароджених плодів свиней і кролів.

Призначення наукової задачі – удосконалення та підвищення ефективності комплексного лікування цукрового діабету і його судинних ускладнень в експерименті і клініці.

Таким чином, у результаті вирішення наукової задачі зроблено наступні наукові і прикладні висновки.

1.

2.

3.

4.

5.

6. Підшлункові залози ембріонів курей 15, 16 і 17 діб інкубації є оптимальним джерелом масового, легкодоступного та економічно деше-вого донорського високоефективного матеріалу при хірургіч-ному лікуванні експериментального цукрового діабету.

Практичні рекомендації

1.

2.

3.

список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Геник С.М., Симчич А.В. Трансплантація острівцевих клітин при цукровому діабеті // Галицький лікарський вісник. – 1997. – Т. 4, №3. – С. 73-75.

2. Симчич А.В. Ксенотрансплантація ембріональних підшлункових залоз – як складова комплексного лікування експериментального цукрового діабету // Галицький лікарський вісник. – 1998. – Т. 5, №3. –С. 79-81.

3. Симчич А.В. Антидіабетична дія трансплантації підшлункових залоз ембріонів курей в поєднанні з короткотривалим введенням екзогенного інсуліну в експерименті //Шпитальна хірургія. – 1999. - №3. – С. 86-89.

4. Геник С.М., Дєльцова О.І., Голубєв В.Г., Семак А.О., Фреїшин М.М., Симчич А.В. Ксенотрансплантація підшлункових залоз ембріонів курей як ефективний засіб лікування експериментального цукрового діабету //Галицький лікарський вісник. – 1999. – Т. 6, №3. – С. 88-89.

5. Геник С.М., Дєльцова О.І., Симчич А.В. Морфологія острівців Лангерганса курячих ембріонів //Вісник Білоцерківського державного аграрного вніверситету. – 1998. – Вип. 6, №1. – С. 139-141.

6. Спосіб лікування гострого алоксанового цукрового діабету в експерименті: С. на рац. проп. / С.М.Геник, О.В.Пиптюк, А.В.Симчич (ІФДМА).- № 8/2374; Заявлено 01.08.99; Опубл. 09.09.99. – 1с.

7. Спосіб лікування хронічного алоксанового цукрового діабету в експерименті: С. на рац. проп. / С.М.Геник, О.В.Пиптюк, А.В.Симчич (ІФДМА).- № 9/2375; Заявлено 01.08.99; Опубл. 09.09.99. – 1с.

8. Пат. 24374 Україна, МПК 6 А 61В 17/00, А61М 31/00.Спосіб лікування цукрового діабету в експерименті: Пат. 24374 Україна, МПК 6 А 61В 17/00, А61М 31/00/А.В.Симчич, С.М.Геник, Я.І.Василюк; Реєстр. номер заявки - № 96093677; Заявл. 24.09.96; Опубл. 07.09.98. – 2 с.

9. Симчич А.В. Лікувальний ефект при трансплантації ембріональних підшлункових залоз курей тваринам з цукровим діабетом //Галицький лікарський вісник. – 1998. – Т. 5, №3. – С. 82-85.

10. Симчич А.В. Вивчення інсулінопродукуючої активності ембріональних підшлункових залоз курей 15-20 дня інкубації // Сб. науч. р.: Новые технологии в хирургии. – Киев: Арт График, 1997. – С. 136.

11. Симчич А.В. Комплексна терапія цукрового діабету, нові аспекти в вирішенні проблеми //Матеріали ХІV з'їзду терапевтів України. – Переяслав-Хмельницький: Пальміра, 1998. – С. 561-562.

12. С.М. Геник, О.І. Дєльцова, В.І. Боцюрко, С.Б. Геращенко, В.Г. Голубєв, А.В. Симчич. Лікування цукрового діабету з використанням ксенотрансплантації підшлункових залоз ембріонів курей //Матеріали XIX з'їзду хірургів України (21-14 трав. 2000р.): Зб. наук. ст. – Харків: Контраст, 2000. – С. 276-277.

13. Симчич А.В. Вивчення можливості використання ембріональної підшлункової залози курчат для комплексного лікування експе-риментального цукрового діабету //Збірник праць 29 обласної наукової конференції молодих вчених Івано-Франківської державної медичної академії. – Івано-Франківськ: ІФДМА. - 1997. – С. 7-8.

14. Василюк Я.І., Любацька Т.М., Симчич А.В. Зниження гіпер-глікемії панкреатектомованих собак ксенотрансплантацією фрагментів підшлункової залози // Тези доповідей Міжнародного конгресу Молодих Вчених Українців. - Івано-Франківськ: ІФДМА . – 1995. – С. 72.

15. Гох Ю.В., Симчич А.В., Вівсяник О.М., Петраш Т.Р. Порівняльна характеристика макро- та мікроструктурної організації ембріональної підшлункової залози курей та щурів // Тези доповідей 65 конференції студентського наукового товариства. - Івано-Франківськ: ІФДМА. – 1996. – С. 19.

Анотація

Симчич А.В. Вплив підсадки підшлункових залоз ембріонів курей на цукровий діабет (експериментально-клінічне дослідження). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 – патологічна фізіологія. Тернопільська державна медична академія імені І.Я.Горбачевського, Тернопіль, 2000.

Дисертацію присвячено хірургічному лікуванню тварин з гострим і хронічним алоксановим цукровим діабетом методом підсадки підшлункових залоз ембріонів курей 15, 16, 17, 18, 19 і 20 діб інкубації та вивченню