АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

ШАЯХМЕТОВА Ганна Михайлівна

УДК 615. 356: 557.161.3/32: 616.36-099.1/2

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ ЗАСТОСУВАННЯ АЦЕТАТ-2,5,7,8-ТЕТРАМЕТИЛ-2-(4ў-МЕТИЛПЕНТЕН-3ў-ІЛ)-6-ОКСИХРОМАНУ

ЗА УМОВ ХІМІЧНОГО УРАЖЕННЯ ПЕЧІНКИ

14. 03. 05. - фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фармакології та токсикології Академії медичних наук України

Науковий керівник доктор біологічних наук КОВАЛЕНКО Валентина Миколаївна, Інститут фармакології та токсикології АМНУ, завідуюча відділом загальної токсикології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук ЛЕВИЦЬКИЙ Євген Леонідович, Інститут фармакології та токсикології АМНУ, головний науковий співробітник відділу біохімічної фармакології

доктор біологічних наук ЛЕОНЕНКО Ольга Броніславівна, Інститут медицини праці АМНУ, ведучий науковий співробітник лабораторії медико-біологічних критеріїв професійних впливів

Провідна установа Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра фармакології

Захист відбудеться “ 20 “ грудня 2000 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України (03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

Автореферат розісланий “18 “ листопада 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Екологічний стан в Україні зумовлений дією широкого спектру негативних факторів, серед яких чільне місце посідають хімічні. Існує причинно-наслідковий зв'язок забруднення довкілля із зростанням порушень з боку основних органів та систем організму людини, і в першу чергу печінки, як чутливої ланки впливу ксенобіотиків. Патології гепатобіліарної системи займають значну питому вагу в клініці внутрішніх хвороб (Т.А. Ажунова, 1991; А.Р. Златкина, 1998; А.А. Чиркин, 1992; Б.И. Шулутко, 1993; S. Sherlock et al., 1997).

Аналіз сучасного стану даної проблеми свідчить, що незалежно від етіології, універсальним чинником структурно-функціональних порушень гепатоцитів є активація процесів вільнорадикального окиснення (Е.А. Лужников, 1989, A. Feher, 1991; N. Hiroe et al., 1996; C.S. Lieber, 1997; M.-R. Losser et al., 1996). Система антирадикального та антиперекисного захисту організму здатна забезпечувати зниження токсичної дії активних форм кисню та вторинних перекисних сполук. Разом з тим, тривалий вплив токсичних агентів довкілля, передозування лікарських засобів та інші хімічні фактори приводять до виснаження системи антиоксидантного захисту організму (O. A. Aruoma, 1998).

Вільнорадикальна концепція ураження печінки відкрила нові можливості для використання лікарських засобів з антиоксидантною спрямованістю, серед яких значне місце посідають токофероли.

Підкреслюючи широке використання, самостійно та в складі полівітамінних композицій, а отже, надзвичайну потребу в препаратах вітаміну Е для профілактики та лікування патологічних станів, які супроводжуються активацією ліпопероксидації та порушенням структурно-функціональних властивостей мембран, слід зазначити, що Україна вимушена імпортувати готові лікарські форми вітаміну Е або, на досить невигідних умовах закупати попередники для здійснення заключного етапу синтезу на наших підприємствах. Саме тому останнім часом зросла зацікавленність щодо виявлення залежності біологічної активності модифікованих токоферолів від їх структури з метою пошуку та розробки вітчизняних препаратів, які, за умов спрощення та економічності технології виробництва не поступались би Е-вітамінним засобам.

Нині накопичено певний матеріал по визначенню взаємозвўязку між структурою та антиоксидантними (И.В. Кузьменко и др., 1993, Ю.А. Поскрипко, 1998), мембраностабілізуючими (О.А. Васильченко, 1991), детоксикуючими (В.П. Маковецкий и др., 1987; В.П. Маковецький та ін., 1995; Ю.В. Хмелевський та ін, 1995) властивостями модифікованих токоферолів. Разом з тим, несистематичність та суперечність даних, широта спектру біологічної дії синтезованих сполук, а також відмінності результатів, одержаних в дослідах in vitro та in vivo, вимагають подальшого вивчення залежності “структура-активність”. Зокрема, не знайшла достатнього висвітлення в науковій літературі проблема їхньої ефективності при отруєннях гепатотоксичними речовинами.

З огляду на вищевикладене, нашу увагу привернуло похідне a-токоферолу з модифікованим бічним ланцюгом - ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихроман (робоча назва - "Евіт-1"), технологічний синтез якого (розроблений Інститутом біохімії НАН України спільно з АТ “ Київський вітамінний завод”) значно спрощений порівняно з відомим аналогом.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Інституту фармакології та токсикології АМН України в рамках теми “Дослідження ролі вільнорадикального окислення в патогенезі токсичної дії ксенобіотиків та її корекція похідними токоферолу” (№ державної реєстрації 0195U003201).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було експериментальне вивчення антиоксидантних, мембраностабілізуючих, детоксикуючих та гепатопротекторних властивостей ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихроману за умов хімічного ураженя печінки (тетрацикліном, парацетамолом, тетрахлорметаном та його комбінацією з етанолом).

Для досягнення поставленої мети необхідно було виконати наступні завдання:

1. Дослідити гостру токсичність "Евіту-1";

2. Провести дослідження антиоксидантної активності "Евіту-1" за умов токсичного ураження печінки у порівнянні з a-токоферолацетатом;

3. Вивчити мембранопротекторні властивості "Евіту-1";

4. Дослідити вплив "Евіту-1" на функціонування основних ланок мітохондріального ланцюга траспорту електронів печінки щурів за умов дії ксенобіотиків;

5. З’ясувати вплив "Евіту-1" на процеси детоксикації за умов токсичного гепатиту;

6. Провести порівняльне дослідження гепатопротекторних властивостей "Евіту-1" з фармакопейним вітаміном Е та силібором;

7. Дослідити субхронічну токсичність "Евіту-1".

Об'єкт дослідження. Характер змін про- та антиоксидантної системи, а також структурно-функціонального стану субклітинних мембран печінки щурів за умов гострої та хронічної дії ксенобіотиків-прооксидантів.

Предмет дослідження. Ефективність ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4(-метилпентен-3(-ил)-6-оксихроману за умов експериментального хімічного ураження печінки.

Методи дослідження. На моделях токсичного ураження печінки тетрахлорметаном, тетрацикліном, парацетамолом вивчали вплив ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4(-метилпентен-3(-ил)-6-оксихроману на стан про- та антиоксидантної системи печінки за вмістом супероксиданіонів, гідропероксидів, дієнових і триєнових кон'югатів, швидкістю утворення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою, вмістом глутатіону та a-токоферолу, активністю каталази; мембранопротекторні властивості оцінювали за вмістом загальних фосфоліпідів, холестеролу в мембранних структурах печінки і за осмотичною резистентністю еритроцитів; стан монооксигеназної системи - за N-деметилазною активністю і вмістом цитохромів Р-450 та b5; визначали активність деяких ферментів транспорту електронів мітохондрій печінки; про гепатопротекторні властивості судили за амінотрансферазною і лужнофосфатазною активністю, рівнем білірубіну в сироватці крові, а також за деякими показниками, що характеризують обмін білків, ліпідів, вуглеводів. ЕД50 "Евіту-1" визначали за методом В.Б. Прозоровського. При дослідженні гострої та хронічної токсичності використовували ряд загальноприйнятих токсикологічних, фізіологічних, та біохімічних методів.

Наукова новизна одержаних результатів полягає у тому, що вперше проведено поглиблене вивчення антиоксидантної та мембранопротекторної ефективності ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихроману - нової біологічно активної сполуки - за умов хімічного ураження печінки ксенобіотиками прооксидантної дії і показано, що досліджувана сполука не поступається a-токоферолацетату.

Експериментально доведено переваги використання ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихроману відносно фармакопейного препарату вітаміну Е за умов передозування парацетамолу, які полягають у більш ефективному знешкодженні активних форм кисню і зниженні вмісту первинних продуктів ПОЛ у печінці, вираженій дії на вміст ендогенних тіолів печінки та вищій здатності до активації ІІ фази детоксикації.

При порівняльному аналізі особливостей функціонування дихальних комплексів І-ІІ та І-ІІІ мітохондрій печінки щурів в залежності від тривалості надходження гепатотоксичних сполук вперше встановлено, що за умов хронічного ураження відбувається компенсаторна перебудова мітохондріального окиснення з НАД-залежного на сукцинатзалежний шлях. Ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихроман здатний коригувати біоенергетичні процеси у клітинах печінки, за умов як гострої, так і хронічної дії ксенобіотиків-прооксидантів.

У дослідах in vivo одержано нові дані, які дають уявлення щодо взаємозв’язку будови та біологічної активності в ряду модифікованих токоферолів, зокрема ролі бічного ланцюга в механізмах Е-вітамінної дії. При порівняльному аналізі біологічної активності ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихроману та фармакопейного препарату вітаміну Е доведено, що в реалізації антиоксидантних та мембранопротекторних властивостей токоферолів вирішальну роль відіграє будова хроманолового циклу, а не довжина фітольного ланцюга молекули.

Практична значимість одержаних результатів. Вперше експериментально обгрунтовано доцільність використання ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихроману, як засобу профілактики та комплексної терапії токсичних уражень печінки, що супроводжуються активацією процесів вільнорадикального окиснення. Одержані дані щодо нешкідливості ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихроману та його ефективності за умов токсичних уражень печінки є підгрунтям до впровадження в медицину оригінального вітчизняного аналога вітаміну Е.

За результатами досліджень отримано патент України на винахід №24682А.

Результати проведених досліджень впроваджено в науковий та учбовий процеси на кафедрах фармакології Дніпропетровської державної медичної академії, Національної Української фармацевтичної академії, Луганського державного медичного університету, Вінницького державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто було здійснено патентно-інформаційний пошук, проведено аналіз даних літератури за темою дисертації, відпрацьовано моделі, виконано експериментальні дослідження, а також проведено аналіз, систематизацію та статистичну обробку отриманих результатів і оформлено їх у вигляді таблиць та рисунків, сформульовано основні положення та висновки роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на УІІ Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997); 2-ому Міжнародному конгресі студентів і молодих вчених, (Тернопіль, 1998); науковій конференції “Актуальные проблемы токсикологии” (Київ, 1999); І Українській конференції молодих вчених, присвяченій пам’яті В.В. Фролькіса (Київ, 2000);

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, з них - 8 статей у фахових наукових журналах, 5 тез доповідей, 1 патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи досліджень”, розділу “Результати досліджень та їх обговорення”, заключення, висновків, списку використаних джерел.

Дисертаційна робота викладена на 191 сторінці машинопису та включає 17 рисунків і 35 таблиць. Бібліографія містить 331 джерело, з яких 164 вітчизняних та 167 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліджували ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихроман ("Евіт-1"), який розроблено відділом біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України спільно з АТ “Київський вітамінний завод”.

Дослідження проведено на 350 білих щурах-самцях лінії Вістар масою тіла 160-200 г.

На першому етапі досліджено гостру токсичність "Евіту-1" при внутрішньошлунковому введенні щурам у діапазоні доз 500 – 5000 мг/кг маси тіла. На наступному етапі визначено ЕД50 "Евіту-1" за експрес-методом В.Б. Прозоровського (1994). Крім того, дослідженно субхронічну токсичність "Евіту-1" при введенні в шлунок з розрахунку 10 мг/кг та 50 мг/кг маси тіла протягом 60 діб щоденно.

Дослідження біологічної активності "Евіту-1" проводили на моделях гострого токсичного ураження печінки тетрахлорметаном (ТХМ), тетрацикліном, парацетамолом (ПА), а також хронічного - ТХМ та комбінацією ТХМ з етанолом (С.М. Дроговоз и соавт., 1994).

В якості препарату порівняння було використано фармакопейний a-токоферол ацетат (АТ “Київський вітамінний завод”, Київ, Україна) та при дослідженні деяких показників гепатопротекторної ефективності – силібор (фірма “Здоров'я”, Харків, Україна).

"Евіт-1" і вітамін Е використовували у вигляді розчину в оливковій олії, яку попередньо витримували при температурі +2000С протягом 2 год. Олійні розчини досліджуваних речовин вводили щурам в шлунок зондом. За умов гострих експериментів "Евіт-1" вводили в ЕД50 - 35 мг/кг, за хронічних – в дозах 10 мг/кг або 20 мг/кг згідно результатів дослідження дозозалежних ефектів "Евіту-1" при тривалому введенні гепатотоксинів. Вітамін Е вводили в еквімолярних дозах, а силібор (у вигляді зависі в 2% розчині крохмального гелю) - з розрахунку 35 мг/кг.

Через 24 год після останнього введення досліджуваних препаратів у щурів під ефірним наркозом брали кров із стегнової вени, після чого їх знеживлювали методом цервікальної дислокації.

Печінку перфузували через воротну вену охолодженим до +4о С 1%-ним розчином КСl та гомогенізували з використанням 0,05 М трис-НСl буферу рН 7,4.

Мітохондріальну та мікросомну фракції печінки отримували за методом диференційного центрифугування (V.C. Schneider, 1948).

Ліпідні екстракти органел одержували згідно В.Г. Колб та співавт. (1976).

Активність вільнорадикальних процесів оцінювали за рівнем супероксиданіонів (B.M. Babior et al., 1973) і гідропероксидів (Л.А Романова и соавт., 1977) у мітохондріальній фракції печінки, вмістом дієнових (ДК) і триєнових (ТК) коньюгатів у гомогенаті печінки (И.Д. Стальная, 1977), швидкістю накопичення продуктів реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) (И.Д. Стальная и соавт., 1977) у мітохондріальній та мікросомній фракціях печінки.

У гомогенаті печінки визначали вміст вітаміну Е (Г.В. Донченко и соавт., 1979) та активність каталази (М.А. Королюк и соавт., 1988).

Стан глутатіонової системи оцінювали за вмістом глутатіону (J. Sedlak et al., 1968) в гомогенаті печінки , активністю глутатіонредуктази (I. Carlberg et al., 1985) і глутатіон-S-трансферази (W.H. Habig et al., 1974) у постмітохондріальній фракції печінки.

Стан монооксигеназної системи аналізували за вмістом цитохромів b5 і P-450 (Omura T. Et al., 1964) та рівнем N-деметилазної активності (И.И. Карузина и соавт., 1977) в мікросомній фракції печінки.

В мітохондріях печінки визначали сукцинатцитохром- та NADH-цитохром с-редуктазну активності відповідно за D.T. Howard (1967) та J. Hatefi et al. (1967), а також сукцинатдегідрогеназну активність за Р.С. Кривченковою (1977).

Досліджували вміст холестеролу в сироватці крові, мітохондріальній та мікросомній фракціях (В.Г. Колб и соавт., 1976), вміст загальних фосфоліпідів у мітохондріальній та мікросомній фракціях печінки (C.H. Fiske, Y. Subbarow, 1925), осмотичну резистентність еритроцитів крові (L. A . Miller, 1972).

Активність аланін- (АлАТ) та аспартатамінотрансфераз (АсАТ), лужної фосфатази (ЛФ), рівень білірубіну і сечовини у сироватці, а також вміст гемоглобіну крові визначали, користуючись біотестами фірми Lachema (Чехія) і НПП “Филисит Диагностика” (Україна).

У печінці досліджували вміст гідроксипроліну (А.Л. Зайдес и соавт., 1964), у печінці та сироватці крові - глікогену та гексоз (S. Seiffer et al., 1950).

Вміст білку в гомогенаті та субклітинних структурах печінки визначали за методом O.H. Lowry et al. (1951), а у сироватці крові - за біуретовою реакцією (Р. Досон и др., 1991).

Кількість еритроцитів та лейкоцитів підраховували на гемоцитометрі ГЦМК-3.

Лейкоцитарну формулу визначали у забарвлених за Май-Грюнвальдом мазках крові.

Дослідження стану серцево-судинної системи проводили на поліграфі П4Ч-02.

Поведінкові реакції вивчали за методом “відкритого поля” (А.В. Калуев, 1998).

Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критерію Ст'юдента. Порівнювані середні арифметичні величини вважали статистично вірогідними при значенні Р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

"Евіт-1", введений щурам одноразово внутрішньошлунково в інтервалі доз 500 – 5000 мг/кг маси тіла не викликав загибелі щурів, не впливав на динаміку маси тіла та коефіціенти внутрішніх органів, що свідчить про його належність до класу практично нетоксичних речовин – ІУ клас небезпеки (Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия) / Под ред. проф. И.В.Саноцкого, 1970).

Визначення ЕД50 "Евіту-1" при внутрішньошлунковому введенні за умов гострого отруєння ТХМ показало, що вона складає 34,2 ± 9,3 мг/кг.

За умов гострого та хронічного отруєння щурів гепатотоксичними сполуками було відзначено активацію вільнорадикальних процесів у печінці та її субклітинних фракціях (рис.1, табл.1). При цьому введення "Евіту-1" знижувало швидкість індукованого аскорбатом та НАДФН утворення продуктів реакції з ТБК в мікросомній фракції печінки в

Рис. 1 Швидкість аскорбатзалежного (А) та НАДФН-залежного (В) утворення продуктів реакції з ТБК у мікросомній фракції печінки щурів при використанні різних моделей отруєння гепатотоксичними сполуками та введення “Евіту-1” і фармакопейного a-токоферолацетату

Примітки тут та надалі:

1. За 100% прийнято показники інтактних тварин,

2. *-вірогідні відмінності порівняно з контролем.

1,4-2 рази (рис.1). Крім того, за умов гострого отруєння ПА застосування "Евіту-1" дозволяло знизити на 16-22 % рівень дієнових і триєнових конўюгатів у печінці, а також у 2-2,5 рази вміст супероксидного аніону і гідропероксидів у мітохондріальній фракції печінки (табл.1). Слід зазначити, що "Евіт-1" практично не поступався вітаміну Е за здатністю гальмувати вільнорадикальні процеси та ПОЛ, а у деяких випадках навіть перевершував його, що свідчить про високу антирадикальну та антиоксидантну активність. Можна припустити, що молекулі з вкороченим ізофітольним ланцюгом притаманна більша латеральна, обертальна і трансбішарова рухливість у бішарі, порівняно з класичним a-токоферолом, хроманольний фрагмент якого локалізований у гідрофобній області мембрани, поблизу поверхні розділу фаз (А.Н. Ерин и др., 1988; Н.В. Горбунов и др., 1991), а, отже, вища здатність взаємодіяти з ліпідними радикалами та активними формами кисню.

Було показано, що "Евіт-1" за умов експериментального токсичного гепатиту позитивно впливає на ендогенну антиоксидантну систему печінки. Введення щурам "Евіту-1" і вітаміну Е при гострому отруєнні ТХМ підвищувало рівень a-токоферолу в печінці порівняно з контролем відповідно у 1,9 і 2,7 рази. Оскільки продукт деетерифікації коротколанцюгового похідного a-токоферолу не фіксується хроматографічно, а визначається лише нативний a-токоферол, вміст останнього при введенні "Евіту-1" дещо нижчий порівняно з референсним препаратом, але зберігається на рівні інтактних тварин. За умов гострого отруєння ТХМ так само, як і ПА (табл.1) введення "Евіту-1" і вітаміну Е зберігало печінковий пул відновленого глутатіону на рівні інтактних тварин. Крім того, при передозуванні ПА лікувально-профілактичне застосування "Евіту-1" підвищувало активність каталази в печінці на 20% порівняно з контролем, тоді як вітамін Е виявився неефективним (табл.1).

За умов хронічного отруєння щурів комбінацією етанолу з ТХМ в мікросомній фракції печінки на 15 % зменшувався вміст загального холестеролу, а в мітохондріальній фракції зареєстровано зниження вільного холестеролу і загальних фосфоліпідів в 1,5 рази. Лікувально-профілактичне застосування "Евіту-1" відзначилося нормалізацією вмісту холестеролу та позитивними тенденціями щодо вмісту загальних фосфоліпідів. Причому, вміст вільного і етерифікованого холестеролу в мітохондріальній фракції нормалізувався з одночасним зниженням коефіціенту етерифікації, внаслідок зростання частки вільного холестеролу, в той час як вітамін Е стабілізував лише рівень вільного холестеролу.

Необхідно зазначити , що введення "Евіту-1" за умов хронічного отруєння ТХМ або його комбінацією з етанолом сприяло підвищенню осмотичної резистентності еритроцитів відповідно на 39 та 23 %. Це, разом з позитивним впливом на вміст холестеролу та

Таблиця 1

Деякі показники стану про- та антиоксидантної системи печінки щурів за умов гострого отруєння парацетамолом та лікувально-профілактичного введення “Евіту-1” і фармакопейного a-токоферолацетату (n і 6)

Досліджувані Статистичні Експериментальні групи

показники показ-ники інтактна парацетамол парацетамол + "Евіт-1" парацетамол + вітамін Е

Рівень супероксиданіону в мітохондріальній М+m 1,038±0,126 2,630±0,152 1,250±0,320 2,03±0,036

фракції печінки, p1 <0,001 >0,05 <0,01

нмоль субстрату / p2 <0,01 <0,001

хв . мг білку p3 <0,05

Гідропероксиди в М+m 100±0 229,7 ± 16,7 94,0 ± 0,25 99,25 ± 0,51

мітохондріальній p1 - <0,001 <0,001 >0,05

фракції печінки, p2 - - <0,001 <0,001

% p3 - - <0,001 -

Дієнові конўюгати в М+m 0,293 ± 0,015 0,408 ± 0,027 0,343 ± 0,016 0,340 ± 0,014

гомогенаті печінки, p1 <0,01 >0,05 >0,05

D230 / D215 p2 <0,01 <0,01

p3 >0,05

Трієнові конўюгати М+m 0,140 ± 0,003 0,172 ± 0,005 0,134 ± 0,008 0,144 ± 0,003

в гомогенаті p1 <0,001 >0,05 >0,05

печінки, p2 <0,01 <0,001

D278 / D215 p3 >0,05

Активність М+m 158,2±11,19 87,17 ± 4,23 104,61±6,49 76,47 ± 8,66

каталази в p1 <0,001 <0,05 >0,05

гомогенаті печінки, p2 <0,01 <0,001

ммоль / хв. мг білку p3 <0,05

Відновлений М+m 3,41 ± 0,08 2,88 ± 0,14 3,8 ± 0,23 3,22 ±0,03

глутатіон у p1 <0,01 >0,05 >0,05

гомогенаті печінки, p2 <0,01 <0,05

мкмоль / г тканини p3 <0,05

Примітки:

1. р1 -ступінь вірогідності по відношенню до групи інтактних тварин;

2. р2 -ступінь вірогідності по відношенню до негативного контролю;

3. р3 -ступінь вірогідності по відношенню до групи тварин, що одержували референс-препарат.

загальних фосфоліпідів у мембранних структурах печінки, є свідченням мембранопротекторної ефективності.

При використанні всіх моделей ушкодження гепатотоксинами в мікросомній фракції печінки на 30-50% знижувався вміст цитохрому Р-450. Встановлено, що лікувально-профілактичне введення "Евіту-1" запобігало зниженню даного показника (рис.2).

Рис. 2 Вміст цитохрому Р-450 у мікросомній фракції печінки щурів при використанні різних моделей отруєння гепатотоксичними сполуками та введення “Евіту-1” і фармакопейного a-токоферолацетату

При введенні щурам токсичної дози ПА було відзначено зростання глутатіон-S-трансферазної активності в постмітохондріальній фракції печінки на 20 %. Введення "Евіту-1" та вітаміну Е сприяло подальшому підвищенню її активності порівняно з інтактною групою тварин, особливо при введенні "Евіту-1" ( в 1,9 рази), порівняно з фармакопейним аналогом (в 1,6 рази). Отримані результати доводять, що "Евіт-1" позитивно впливає на індукцію процесів глутатіонової конўюгації. Дана обставина, а також здатність запобігати зниженню рівня цитохрому Р-450, може свідчити про посилення детоксикуючої функції печінки.

При хронічному ураженні печінки щурів ТХМ або його комбінацією з етанолом нами не було виявлено коливань вмісту цитохрому b5, що можна пояснити його локалізацією в гідрофільній ділянці біомембрани (А.И. Арчаков, 1975), а отже, більшою віддаленістю від центрів радикалоутворення. Разом з тим, за умов передозування ПА рівень цитохрому b5 в мікросомній фракції печінки знижувався майже у 2 рази порівняно з інтактною групою. Оскільки однією з ланок в токсикогенезі ПА є ковалентна взаємодія його високореактивного метаболіту - N-ацетил-р-бензохіноніміну з SH-групами білків (E.A. Khairallan et al., 1996), можна припустити, що зниження вмісту цитохрому b5 є результатом ковалентної модифікації його молекули. Введення експериментальним тваринам "Евіту-1" і вітаміну Е запобігало зниженню вмісту цитохрому b5, що уявляється важливим в світлі гіпотези, згідно якої блокування утворення пероксидів ліпідів у мембранах реалізується лише за сумісної дії токоферолу та одного із компонентів редокс-ланцюга, а саме цитохрому b5 (Л.Ф. Дмитриев, 1998).

Було досліджено ефективність "Евіту-1" при дисфункціях ферментних комплексів електронотранспортного ланцюга мітохондрій печінки щурів, викликаних отруєнням гепатотоксичними сполуками. Встановлено, що розвиток гострого отруєння тварин ТХМ, ПА та тетрацикліном супроводжувався зниженням НAФH- та сукцинатцитохром с-редуктазної активності мітохондрій печінки на 25-50 % (рис.3). За умов хронічного введення щурам ТХМ або його комбінації з етанолом нами було показано, що сукцинатцитохром с-редуктазна та сукцинатдегідрогеназна активність мітохондрій печінки підвищувалась

Рис. 3 Активність НАДН-цитохром с-редуктазного (А) та сукцинатцитохром с- редуктазного (В) комплексів мітохондрій печінки щурів при використанні різних моделей отруєння гепатотоксичними сполуками та введення “Евіту-1” і фармакопейного a-токоферолацетату

на 66-118 %, в той час, як функціонування НAД-залежного транспорту електронів інгібувалось (рис.3). Такі результати, очевидно, можна пояснити компенсаторними механізмами “обернення транспорту електронів” під впливом негативних факторів, коли сукцинат "монополізує" дихальний ланцюг (А.А. Корнеев и др., 1994). Як свідчать наведені нами дані (рис.3), при гострому ураженні печінки така перебудова ланцюга транспорту електронів ще відсутня.

Введення "Евіту-1" за умов гострого отруєння ТХМ, ПА та тетрацикліном підвищувало активність НAДH- і сукцинатзалежних ферментів мітохондрій печінки щурів в середньому на 30 % та нормалізувало вказані показники при хронічному отруєнні ТХМ. Інша картина спростерігалася за умов гепатиту, індукованого тривалим введенням комбінації етанолу і ТХМ - активність НAДH-цитохром с-редуктазного комплексу під впливом введення "Евіту-1" практично відновлювалась, тоді як сукцинатцитохром с-редуктазна та сукцинатдегідрогеназна активності виявили тенденцію до подальшого підвищення. Це, на наш погляд, пояснюється тим, що при введенні екзогенного етанолу в клітинах печінки зростає рівень ацетальдегіду (АцА), здатного взаємодіяти з убігідрохіноном. Активація метаболічних шляхів, спрямованих на переважне утворення і використання янтарної кислоти допомагає клітині адаптуватись до дії зростаючих концентрацій АцА (А.А. Корнеев и др., 1994). Саме тому подальша стимуляція активності сукцинатзалежних ферментів при введенні похідних токоферолу розглядається нами як позитивна компенсаторна реакція організму. Але, враховуючи, що за умов хронічного отруєння етанолом зниження рівня вільного АцА є необхідним фактором корекції біоенергетики клітини, доцільним може бути використання хімічних сполук, які мають структурну схожість з убіхіноном і конкурентно взаємодіятимуть з АцА. Ми припускаємо, що коригуючий вплив досліджуваної сполуки щодо активності І комплексу дихального ланцюга пояснюється саме структурною подібністю убігідрохінону та метаболіту "Евіту-1" a-токоферилхінону.

Здатність "Евіту-1" значною мірою попереджати порушення ключових ланок функціонування печінки сприяла тому, що рівень маркерних ферментів ураження паренхіми даного органу - АлАТ та АсАТ у сироватці крові при його введенні знижувався в 1,5-2 рази, як при гострих, так і при хронічних гепатитах (табл.2). Крім того, введення "Евіту-1" знижувало в середньому в 1,4 рази активність ЛФ та вміст загального білірубіну сироватки крові, що свідчить про обмеження холестазу та нормалізацію кон’югаційної та транспортної функції печінки. За показниками гепатопротекторної ефективності "Евіт-1" практично не поступався вітаміну Е і силібору.

Було досліджено субхронічну токсичність "Евіту-1". Показано, що "Евіт-1", введений внутрішньошлунково протягом 60 діб у дозах 10 та 50 мг/кг, не викликав загибелі та змін інтегральних, фізиологічних і біохімічних показників стану щурів. Це свідчить про безпечність застосування даної сполуки щодо основних органів та систем організму тварин.

Сукупність одержаних нами результатів вказує на відсутність принципових розбіжностей у механізмах реалізації антиоксидантних та мембранопротекторних властивостей між a-токоферолом та його коротколанцюговим аналогом. Але слід зазначити, що за рядом показників - здатністю до обмеження утворення активних форм кисню (супероксиданіонів в мітохондріях печінки) та первинних продуктів ПОЛ (триєнових кон’югатів у печінці, гідропероксидів у мітохондріях печінки); рівнем відновленого глутатіону,

Таблиця 2

Аланінамінотрансферазна активність (мкмоль/ (мл х год) сироватки крові щурів при використанні різних моделей хімічного ураження печінки та введення “Евіту-1” і референсних препаратів

Моделі ураження Статистичні Експериментальні групи

печінки показ-ники інтактні контроль "Евіт-1" вітамін Е силібор

Гостре отруєння М+m 2,40±0,30 6,60 ±0,73 4,67± 0,28 4,40±0,49 3,96 ± 0,12

тетрахлормета- p1 <0,001 <0,05 <0,01 <0,001

ном p2 <0,05 <0,05 <0,01

p3 >0,05

p4 <0,05

Гостре отруєння М+m 1,34 ± 0,15 5,64 ±0,22 3,41 ± 0,09 3,4 ± 0,12 -

парацетамолом p1 <0,001 <0,001 <0,001 -

p2 <0,001 <0,001 -

p3 >0,05 -

Хронічне М+m 1,88±0,28 11,04±1,2 5,90±0,88 - 9,24 ± 0,86

отруєння p1 <0,001 <0,01 - <0,001

тетрахлормета- p2 <0,01 - >0,05

ном p3 - - -

p4 <0,05 - -

Хронічне отруєн- М+m 1,56±0,2 3,38±0,28 2,44±0,29 2,75±0,49 -

ня комбінацією p1 <0,001 <0,05 <0,05 -

тетрахлорметану p2 <0,05 >0,05 -

з етанолом p3 >0,05 -

Примітки:

1. р1 - ступінь вірогідності по відношенню до групи інтактних тварин;

2. р2 - ступінь вірогідності по відношенню до негативного контролю;

3. р3 - ступінь вірогідності по відношенню до групи тварин, яким вводили "Евіт-1";

4. р4 - ступінь вірогідності по відношенню до групи тварин, яким вводили силібор.

глутатіонтрансферазною та каталазною активністю у печінці, аспартатамінотрансферазною активністю сироватки при отруєнні парацетамолом, а також сукцинатцитохром с-редуктазною активністю при гострому ураженні ТХМ і рівнем вільного холестеролу в мітохондріях печінки при повторних введеннях ТХМ з етанолом, "Евіт-1" виявився ефективнішим.

Таким чином, висока антиоксидантна та цитопротекторна активності, здатність запобігати виснаженню антиоксидантної системи і координувати роботу мембранозв’язаних ферментів, а отже, в цілому, сприяти підтримці структурно-функціонального гомеостазу органу, обумовлює доцільність розробки та впровадження на основі ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-іл)-6-оксихроману засобу профілактики та комплексної терапії токсичних уражень печінки, які супроводжуються активацією процесів вільнорадикального окиснення.

ВИСНОВКИ

1. “Евіт-1”, введений у шлунок щурам за умов гострого хімічного ураження печінки тетрахлорметаном, тетрацикліном, парацетамолом та за хронічної дії тетрахлорметану або його комбінації з етанолом сприяє зниженню швидкості НАДФН- і аскорбатзалежного утворення малонового диальдегіду в мікросомній фракції печінки (в 1,4-2 рази), а також рівня супероксиданіону (в 2,5 рази) і гідропероксидів (в 2 рази) у мітохондріях шурів, отруєних парацетамолом, що є свідченням його антиоксидантних властивостей.

2. Лікувально-профілактичне введення щурам “Евіту-1” в дозі 35 мг/кг при гострому отруєнні тетрахлорметаном та парацетамолом приводить до зростання в печінці вмісту a-токоферолу і глутатіону майже вдвічі, а каталазної активності - на 20 %, тобто запобігає виснаженню антиоксидантної системи печінки.

3. За умов хронічного отруєння тетрахлорметаном в комбінації з етанолом “Евіт-1”, введений у дозі 10 мг/кг, нормалізує рівень холестеролу в мітохондріях і мікросомній фракції, підвищує вміст загальних фосфоліпідів (в 1,6 рази) у мітохондріях печінки та сприяє зростанню осмотичної резистентності еритроцитів на 23 %, що свідчить про його мембранопротекторні властивості.

4. “Евіт-1” за умов гострої та хронічної дії гепатотоксичних сполук проявляє регуляторний вплив на біоенергетичні процеси, підвищуючи НАДН-цитохром с-редуктазну активність на 30 % та модифікуючи процеси сукцинатзалежного транспорту електронів мітохондрій печінки щурів.

5. При експериментальному токсичному гепатиті “Евіт-1” сприяє збереженню рівня цитохрому Р-450 та зростанню глутатіон-S-трансферазної активності в 1,9 рази, тобто посилює детоксикуючу функцію печінки щурів.

6. При внутрішньошлунковому введенні “Евіту-1” за умов гострого та хронічного хімічного ураження печінки в сироватці крові щурів відбувається зниження активності амінотрансфераз (маркери гепатоцитолізу) в 1,5-2 рази, лужнофосфатазної активності та рівня білірубіну (показники холестазу) - на 20-50%, що є свідченням його гепатопротекторної ефективності.

7. “Евіт-1” належить до класу практично нетоксичних речовин; введення його щурам протягом 60 діб у дозах 10 та 50 мг/кг не змінює функціональний стан життєвоважливих органів та систем.

8. При гострому та хронічному токсичному ураженні печінки щурів “Евіт-1” не поступається за ефективністю фармакопейному вітаміну Е і перевершує його за такими показниками, як рівень супероксиданіонів та гідропероксидів, активність сукцинатцитохром-с-редуктази і каталази, вміст відновленого глутатіону в печінці; вміст холестеролу в мембранах мікросом і мітохондрій, тобто, структурна модифікація a-токоферолу в бік зменшення довжини ізопреноїдного ланцюга не знижує його біологічну активність.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Корекція вільнорадикальних процесів за допомогою аналога вітаміна Е / співавт. Коваленко В.М., Волошина О.С., Кузьменко І.В., Г.М. Донченко Г.В. // Ліки. - 1997. - № 6. - С. 65-69.

2. Влияние производного a-токоферолацетата на некоторые показатели обмена белков, углеводов и липидов при химическом поражении печени / соавт. Л.Б.Бондаренко, И.В. Кузьменко, В.Н. Коваленко // Совр. пробл. токсикол. - 1998. - №3. - С.45-47.

3. Влияние альфа-токоферолацетата и его производного на перекисное окисление липидов и содержание некоторых компонентов мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени при экспериментальном токсическом гепатите / соавт. Л.Б. Бондаренко, Е.С.Волошина, В.Н. Коваленко, Г.В. Донченко // Совр. пробл. токсикол. - 1999. - №2. - С.42-44.

4. Влияние антиоксидантов на каталитическую активность дыхательной цепи транспорта электронов митохондрий печени крыс при отравлении парацетамолом / соавт. И.С. Блажчук, В.Н. Коваленко, А.К. Воронина, И.В. Кузьменко // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т.15, №4. - С.390-394.

5. Коррекция производным a-токоферилацетата активности некоторых ферментов цепи транспорта электронов митохондрий печени крыс при токсических поражениях печени / соавт. В.Н. Коваленко, И.С. Блажчук, И.В. Кузьменко// Укр. біохім. журн. - 1999. - Т.71, №4. - С.31-34.

6. Гепатопротекторна дія аналогу вітаміну Е в експерименті / співавт. О.С.Волошина, І.В. Кузьменко, В.М. Коваленко // Ліки. - 1999. - №3-4. - С.75-78.

7. Вплив похідного a-токоферолу з укороченим бічним ланцюгом на процеси детоксикації в печінці щурів, отруєних парацетамолом / співавт. В.М. Коваленко, А.К. Вороніна, О.С. Волошина // Медична хімія. - 2000. - Т.2,№1. - С.35-39.

8. Антиоксидантна ефективність похідного a-токоферолацетату з вкороченим бічним ланцюгом за умов гострого отруєння щурів парацетамолом / співавт. В.М. Коваленко, Л.Б. Бондаренко, І.В. Кузьменко// Укр. біохім. журн.-2000.- №2. С.61-67.

9. Пат. 24682А Україна, 6 А 61 К 31/355. Антиоксидант / співавт. Г.В. Донченко, І.В. Кузьменко, В.М. Коваленко, О.С. Волошина. (Україна) Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. - №97073579; Заявл. 16.10.97; Опубл. 04.08.98.

10. Вплив коротколанцюгового похідного вітаміну Е на біохімічні показники сироватки крові щурів за умов гострого токсичного ураження печінки / співавт. В.М. Коваленко, І.В. Кузьменко // УІІ Український біохімічний з’їзд, ч.ІІІ, Київ. - 1997. - С.170-171.

11. Гепатопротекторна ефективність похідного вітаміну Е з модифікованим бічним ланцюгом // 2-й Міжнародний конгрес студентів і молодих вчених, 6-8 травня 1998 р., Тернопіль, С.92

12. Корекція гепатотоксичних ефектів парацетамолу похідним a-токоферолу / співавт. Коваленко В.М. // Науч. конф. “Актуальные проблемы токсикологии”, Киев, сентябрь 1999г. - 1999. - С. 87.

13. Влияние производного a-токоферола с укороченной боковой цепью на детоксицирующую функцию печени крыс при отравлении парацетамолом / соавт. В.Н. Коваленко, Е.С. Волошина // І Українська конференція молодих вчених, присвячена пам’яті академіка В.В. Фролькіса. Київ, 31 березня -1 квітня 2000 р. - 2000. - С. 123-124.

14. Антиоксидантна ефективність ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-іл)-6-оксихроману за хімічної дії ксенобіотиків / співавт. Коваленко В.М., Охрименко В.О., Бишовець Т.Ф., Сайфетдінова Г.А. // Матеріали науково-практичної конференції "Вчені України – вітчизняній фармації". –Харків. – 2000. – С.269-270.

АНОТАЦІЇ

Шаяхметова Г.М. Експериментальне обгрунтування застосування ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-іл)-6-оксихроману за умов хімічного ураження печінки. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05. - фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2000.

Захищається наукова праця, яка містить дані щодо протекторної дії похідного a-токоферолу з вкороченим бічним ланцюгом - ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-іл)-6-оксихроману за умов уражень печінки ксенобіотиками-прооксидантами. Показано, що у механізмах реалізації антиоксидантних властивостей a-токоферолу та його коротколанцюгового похідного відсутні принципові розбіжності, що є свідченням на користь теорії про ключову біологічну роль гідроксогрупи хроманольного ядра токоферолів. Експериментально доведена висока антиоксидантна ефективність, здатність запобігати виснаженню антиоксидантної системи і координувати роботу мембранозв’язаних ферментів, а отже, в цілому, сприяти підтримці структурно-функціонального гомеостазу органу, що обумовлює доцільність розробки на основі субстанції ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-іл)-6-оксихроману засобу профілактики та комплексної терапії токсичних уражень печінки, які супроводжуються активацією процесів ПОЛ.

Ключові слова: похідне a-токоферолу з вкороченим бічним ланцюгом, хімічне ураження печінки, перекисне окиснення ліпідів, мікросоми, мітохондрії.

Шаяхметова А.М. Экспериментальное обоснование применения ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихромана в условиях химического поражения печени. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05. - фармакология. - Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2000.

Защищается научная работа, которая содержит данные о протекторном действии производного a-токоферола с укороченной боковой цепью - ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4ў-метилпентен-3ў-ил)-6-оксихромана (рабочее название "Евит-1") при поражениях печени ксенобиотиками-прооксидантами.

Актуальность данного направления обусловлена тем, что несмотря на сложную экологическую обстановку и большую потребность в a-токофероле для профилактики и лечения патологий, сопровождающихся активацией процессов ПОЛ, Украина вынуждена импортировать готовые лекарственные формы витамина Е или на достаточно невыгодных условиях закупать предшественники для осуществления заключительного этапа его синтеза на отечественных предприятиях.

Целью настоящей работы было экспериментальное обоснование антиоксидантных, мембранопротекторных, детоксицирующих и гепатопротекторных свойств короткоцепочечного производного a-токоферола при химических поражениях печени.

Исследование было проведено на моделях острого токсического поражения печени крыс тетрахлорметаном, парацетамолом, тетрациклином и хронического - тетрахлорметаном и его комбинацией с этанолом. "Евит-1" вводили в виде масляного раствора внутрижелудочно в лечебно-профилактическом режиме из расчета 35 мг/кг при острых гепатитах и 10 мг/кг - при хронических. Эффективность производного a-токоферола сравнивали с действием фармакопейного a-токоферола и традиционного гепатопротектора силибора.

Антиоксидантную эффективность "Евита-1" оценивали по способности тормозить процессы ПОЛ в печени и ее субклеточных фракциях, а также, предупреждать истощение антиоксидантной системы на основании оценки следующих показателей: уровня генерации супероксидных анионов, содержания ДК, ТК, гидроперекисей, скорости образования продуктов реакции с ТБК, содержания восстановленного глутатиона и эндогенного a-токоферола в печени, активност каталазы. По уровню цитохромов Р-450 и b5, активности глютатион-S-трансферазы в микросомальной фракции печени судили о влиянии производного a-токоферола на процессы детоксикации. Для изучения влияния "Евита-1" на функционирование основных звеньев электронотранспортной цепи митохондрий печени определяли активность НАДH- и сукцинатзависимых ферментов. Гепатопротекторную эффективность оценивали по активности АлАТ, АсАТ, ЩФ и уровню билирубина в сыворотке крови.

Введение отравленным гепатотоксинами животным "Евита-1" выявило его способность эффективно тормозить процессы пероксидации в печени, как на стадии образования активных форм кислорода (супероксиданионов) и первичных продуктов ПОЛ (ДК, ТК, гидроперекисей), так и на конечных этапах образования продуктов взаимодействия с ТБК. Показано, что введение исследуемого вещества при остром отравлении тетрахлорметаном и парацетамолом способствовало сохранению содержания восстановленного глутатиона на уровне интактных животных, почти вдвое увеличивало содержание эндогенного a-токоферола и способствовало повышению на 20% активности каталазы в печени. Производное a-токоферола с укороченной боковой цепью практически не уступало фармакопейному a-токоферолацетату по способности стабилизировать процессы ПОЛ, а при отравлении парацетамолом было более эффективным по таким показателям, как ограничение уровня генерации супероксидных анионов и образования первичных продуктов ПОЛ (гидроперекисей, ТК), активность каталазы, содержание восстановленного глутатиона в печени

Показано, что применение "Евита-1" при отравлениях гепатотоксическими соединениями предупреждало снижение содержания цитохрома Р-450 в микросомах печени, что наряду с возрастанием в 1,9 раза глутатион-S-трансферазной активности свидетельствует о повышении детоксицирующей функции печени.

Развитие острых гепатопатий сопровождалось снижением НAДH- и сукцинат-цитохром с-редуктазной активности митохондрий печени в среднем на 30 %. При сравнительном анализе особенностей функционирования дыхательных комплексов I-II и I-III митохондрий печени в зависимости от длительности поступления гепатотоксинов установлено, что при хронической интоксикации происходит компенсаторное переключение митохондриального окисления с НAДH- на сукцинатзависимый путь. При остром поражении печени подобной перестройки цепи транспорта электронов еще нет. "Евит-1" выявил корригирующее влияние в отношении указанных ферментных комплексов, как при острых, так и при хронических поражениях печени.

Лечебно-профилактическое применение "Евита-1" при всех использованных моделях гепатита снижало в сыворотке крови активность АлАТ и АсАТ в 1,5-2 раза, а активность ЩФ и уровень общего билирубина - на 20-50 %, что свидетельствует об ограничении цитолиза и холестаза, нормализации коньюгационной и транспортной функции печени. По основным показателям гепатопротекторной эффективности "Евит-1" не уступал фармакопейному прототипу и силибору.

Совокупность полученных данных указывает на отсутствие принципиальных