НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

На правах рукопису

СПІРІДОНОВА Катерина Василівна

УДК 575.2:581. 143. 6

ВИВЧЕННЯ ОСОБЛИВОСТЕЙ ГЕНОМНОЇ МІНЛИВОСТІ
КУЛЬТИВОВАНИХ КЛІТИН РАУВОЛЬФІЇ ЗМІЇНОЇ

Rauwolfia serpentina Benth.

Спеціальність 03.00.15 – генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України

Науковий керівник – член-кор. НАН України, доктор біологічних наук,

професор Кунах Віктор Анатолійович,
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,
завідувач відділу генетики клітинних популяцій

Офіційні опоненти – член-кор. НАН України, доктор біологічних наук,

Малюта Станіслав Станіславович,
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,
завідувач відділу молекулярної генетики–

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Чеченєва Тетяна Миколаївна,
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
відділ молекулярної генетики

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра загальної і молекулярної генетики

Захист дисертації відбудеться “21” грудня 2000 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої ради Д.26.202.01 Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. Акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий “21” листопада 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої ради

кандидат біологічних наук Л.В.Тарасенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Метод культури in vitro рослинних клітин поряд із використанням в фундаментальних дослідженнях знайшов широке практичне застосування у прикладних напрямках експериментальної біології, зокрема, таких як збереження генофонду, створення нових сортів сільськогосподарських культур, розробка принципово нових технологій отримання цінних речовин та медичних препаратів рослинного походження тощо. Ці напрямки застосування потребують більш глибокого знання генетичних особливостей рослинних клітин, що вирощуються в умовах ізольованого росту на штучних живильних середовищах.

На сьогодні рослинний геном в умовах in vitro, особливо на молекулярному рівні, досліджено недостатньо. Знання особливостей і механізмів структурно-функціональної мінливості геномів культивованих клітин і сомаклональної мінливості зокрема, розробка генетичних основ клітинної селекції дозволить цілеспрямовано створювати нові штами-продуценти та сорти культурних рослин. Застосування клітинних штамів–продуцентів цінних метаболітів в біотехнології вимагає знання типів, спрямованості і глибини змін, що відбуваються при тривалому культивуванні сформованих штамів. Сомаклональну мінливість бажано знизити до мінімуму, коли метою служить отримання однорідного матеріалу у випадку мікроклонального розмноження, використання культури рослинних клітин як способу збереження рідкісного або цінного генофонду. Поряд з цим, при потребі додаткової генетичної мінливості при розробці штамів клітин і сортів рослин з підвищеною продуктивністю цінних метаболітів, чи селекції рослин з підвищеною стійкістю до певних захворювань, несприятливих умов навколишнього середовища, тощо, ступінь генетичної варіабельності необхідно збільшити. Дана робота була спрямована на дослідження деяких аспектів геномної мінливості рослинних клітин в культурі in vitro, зокрема в умовах тривалого вирощування. Це особливо актуально з огляду на застосування в біотехнології сформованих штамів рослинних клітин з певними цінними ознаками. Це питання досліджувалось за допомогою молекулярно-біологічних методів (підходів) таких як рестрикційний аналіз, дот-гібридизація шляхом порівняння геномів культивованих клітин R.serpentina, R.verticillata та інтактних рослин деяких видів роду Rauwolfia (R.verticillata, R. serpentina, R.vomitoria, R.caffra, R. canescens).

ЗВ’ЯЗОК РОБОТИ З НАУКОВИМИ ПРОГРАМАМИ, ТЕМАМИ, ПЛАНАМИ. Робота виконувалась у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за бюджетною темою 2.2.4.5. “Вивчення особливостей мінливості рослинного геному в культурі in vitro та пошук шляхів її регуляції”. Частина досліджень проводилась при підтримці Державного фонду фундаментальних досліджень по проекту за темою “Вивчення особливостей сомаклональної мінливості культивованих клітин Rauwolfia serpentina”, реєстраційний номер проекту 5.04/0143.

ПРЕДМЕТОМ ДОСЛІДЖЕННЯ були перебудови геномів культивованих in vitro клітин R.serpentina та міжвидова мінливість серед інтактних рослин представників роду Rauwolfia на молекулярному рівні.

ОБ’ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ складали ДНК культивованих in vitro клітин R.serpentina, R.verticillata та інтактних рослин – представників окремих видів роду Rauwolfia.

МЕТА ТА ЗАДАЧІ ДОСЛІДЖЕННЯ. Метою роботи було вивчити особливості геномної мінливості в популяціях культивованих in vitro клітин високопродуктивних штамів раувольфії зміїної – джерела протиаритмічного алкалоїда аймаліна, та провести порівняльний аналіз геномних перебудов in vitro з міжвидовою мінливістю серед інтактних рослин - представників різних видів роду Rauwolfia.

Конкретними завданнями даного дослідження були:

1. Виділити та провести рестрикційний аналіз ДНК культивованих клітин R.serpentina та інтактних рослин різних видів роду Rauwolfia.

2. Виявити і виділити ділянки геному культивованих клітин, що зазнали перебудов при вирощуванні в умовах ізольованого росту.

3. Виявити і виділити із інтактних рослин фрагменти геномної ДНК, що характеризуються міжвидовою мінливістю.

4. Клонувати фрагменти ДНК культивованих клітин, що зазнали змін при культивуванні в умовах in vitro, а також інтактних рослин, які характеризуються міжвидовим поліморфізмом.

5. Дослідити методами дот-блот гібридизації характер геномних перебудов на рівні послідовностей ДНК в культивованих клітинах R.serpentina та інтактних рослинах різних видів раувольфії.

6. Виявити і вивчити зміни послідовностей нуклеотидів в окремих генах в рослинних клітинах in vitro та в інтактних рослинах різних видів in vivo.

7. Дослідити залежність геномної мінливості в популяціях культивованих клітин від тривалості вирощування в умовах in vitro.

8. Встановити наявність змін метилювання цитозинових залишків в культивованих клітинах.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ: виділення та рестрикційний аналіз ДНК, клонування фрагментів ДНК, дот-, блот-гібридизація.

НАУКОВА НОВИЗНА ТА ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ОДЕРЖАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ. Вперше показано, що геном раувольфії зміїної при тривалому культивуванні в умовах in vitro зазнає значних змін на рівні послідовностей ДНК. Ці зміни зачіпають як фракції повторів (тотальні повтори, миттєво реасоціюючі повтори (“0”-фракція), ДНКазо стійка фракція), окремі фрагменти, так і деякі гени (цитохромоксидази, рибулозо біс-фосфат карбоксилази, алкогольдегідрогенази, р-РНК). Встановлено також зміну метилювання ДНК, яка виявлена на рівні модифікації цитозинових основ в окремих послідовностях.

Показано, що масштабність перебудов в геномах культивованих клітин зростає із збільшенням тривалості культивування.

Вперше виявлені наступні особливості геномної мінливості в культивованих клітинах:

1. Геномні фрагменти, що обумовлюють міжвидовий поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів (ПДРФ), піддаються змінам і в культурі in vitro.

2. Ділянки геному, котрі зазнають перебудов при культивуванні клітин в умовах ізольованого росту, виявляють міжвидові відмінності.

3. Відмічено існування паралелізму між перебудовами в клітинах in vitro і міжвидовими відмінностями, що виникли в процесі еволюції – фрагменти ДНК культивованих клітин, перебудовані в порівнянні з рослиною вихідного виду, нагадують такі у окремих представників інших видів роду Rauwolfia. Це вказує на невипадковий характер змін рослинного геному в умовах ізольованого росту клітин на штучних живильних середовищах.

Вперше виявлена подібність між геномними перебудовами на молекулярному рівні в рослинних клітинах при вирощування in vitro до міжвидових відмінностей між інтактними рослинами в живій природі може служити ще одним підтвердженням закону гомологічних рядів спадкової мінливості, сформульованому М.І. Вавіловим на основі фенотипічних ознак.

Вивчення геномної мінливості блот-гібридизацією із специфічними зондами показало, що ПДРФ може бути використаний як молекулярний маркер при паспортизації різних клітинних штамів та ліній, що має суттєве практичне значення в біотехнологічних дослідженнях.

ОСОБИСТИЙ ВНЕСОК ЗДОБУВАЧА. Дисертаційна робота є завершеним науковим дослідженням Спірідонової К.В. Здобувач освоїв методи дослідження, а саме виділення, рестрикційний аналіз і техніку клонування ДНК, методи дот,- блот-гібридизації. Експериментальні дослідження проведені особисто автором. Здобувач зробив провів аналіз літератури і написав текст дисертації. Включені в дисертацію наукові результати, отримані дисертантом особисто.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Результати роботи були представлені на 10-и конференціях та симпозіумах, з них – на 9-и міжнародних, а саме: на VІ з’їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І.Вавілова (м. Полтава, Україна, 1992), на ІV з’їзді товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І.Вавілова (м. Мінськ, Білорусія, 1992), на ІІ Міжнародній конференції по біології культури рослинних клітин та біотехнології (м. Алма-Ати, Казахстан, 1993), Міжнародному конгресі з молекулярної біології рослин (м. Амстердам, Нідерланди, 1994), на Міжнародному симпозіумі по біотехнології та генній інженерії рослин (м. Київ, Україна, 1994), VII Міжнародній конференції “Биология клеток растений in vitro биотехнология и сохранение генофонда” (м. Москва, Росія, 1997), Міжнародній конференції “ДНК-технологии” (м. Київ, Україна, 1997), Міжнародній конференції “Молекулярная генетика и биотехнология” (м. Мінськ, Білорусія, 1998), на IX Міжнародному конгресі “Plant biotechnology and in vitro biology in the 21st century” (м. Єрусалим, Ізраїль, 1998), II Міжнародному симпозіумі “Plant Biotechnology” (м. Київ, Україна, 1998,) а також опубліковані в журналах “Генетика”, “Цитология и генетика”, “Доповіді НАН України”. Результати приведених в даній роботі досліджень також обговорювались на наукових семінарах відділу генетики клітинних популяцій ІМБіГ НАНУ та сумісному семінарі відділів молекулярної генетики і генетики клітинних популяцій.

ПУБЛІКАЦІЇ. Результати досліджень, проведених за темою дисертації, опубліковані в 11 роботах, з яких 4 статті в фахових наукових журналах та 7 тезових повідомлень до виступів на міжнародних наукових конференціях та конгресах.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об’єктами дослідження служили культивовані in vitro протягом більше 30-и років клітини R.serpentina (різні за рівнем накопичення аймаліну паспортизовані та депоновані штами А, К-20, К-27, М), первинний калюс і калюсні тканини віком до 4-х років R.serpentina i R.verticillata, а також інтактні 4-х річні рослини окремих представників роду Rauwolfia (R.serpentina, R.verticillata, R.caffra, R.vomitoria, R.canescens, R.chinensis).

Сумарну ДНК виділяли із калюсних тканин та листків інтактних рослин за методом Rogers S.O. i Bendich A.J. з деякими нашими модифікаціями (Rogers et al., 1985). Виділення фракції помірних повторів здійснювали за допомогою хроматографії на гідроксиапатиті з застосуванням S1-нуклеазної обробки (Britten, Kohne, 1968). Виділення фракції миттєво реасоціюючих повторів проводили, подрібнюючи ДНК ультразвуком з наступним застосуванням S1-нуклеазної обробки. Нуклеазостійку фракцію повторів отримували обробкою ДНК-азою високомолекулярних фрагментів ядерної ДНК, виділених за допомогою імпульсного електрофорезу.

Введення 32Р-мічених дезоксинуклеотидтрифосфатів в ДНК здійснювали методом розсіяної затравки або нік-трансляції, використовуючи стандартний набір реактивів фірми “Amersham”. Дот-гібридизацію проводили за модифікованою методикою Кафатоса (Anderson, Young, 1986). Рестрикційний аналіз, гель-електрофорез, блот-гібридизацію проводили як описано (Маниатис и соавт., 1984).

Клонування фрагментів геномної ДНК здійснювали за допомогою вектора pUC в клітинах E.coli штамів JM101, альфа-dh за описаним методом (Наякшин, 1990). В ролі зондів використовували клоновані фрагменти ДНК інтактних рослин роду Rauwolfia, культивованих клітин R.serpentina, фрагмент гена алкогольдегідрогенази (SAR – скеффолд асоційований регіон), послідовності генів рибулозо біс-фосфат карбоксилази (малої субодиниці), р-РНК, нетранскрибованого спейсера р-ДНК.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

1. Дослідження геномних перебудов в культивованих клітинах R.serpenti та міжвидових відмінностей серед представників роду Rauwolfia методом рестрикційного аналізу

Методом рестрикційного аналізу з застосуванням AluI, EcoRI, HindIII, BamHI ендонуклеаз рестрикції було виявлено наявність геномних перебудов в культивованих клітинах Rauwolfia serpentina. Електрофоретичні профілі рестрикційних фрагментів ДНК культивованих клітин суттєво відрізняються від представника вихідного виду R.serpentina. Загальна тенденція геномів культивованих клітин – це поява мажорних фрагментів в більш низькомолекулярній зоні, ніж це характерно для інтактних рослин. Паралельно з цим встановлено видову індивідуальність рестрикційних профілів ДНК для кожної із вищеназваних ендонуклеаз. На рис.1,2 наведено результати електрофоретичного розділення рестрикційних фрагментів ДНК, отриманих після гідролізу AluI i EcoRI ендонуклеазами рестрикціїї.

Як можна побачити з рисунка електрофоретичні профілі ДНК культивованих клітин характеризуються появою нових “калюсних” фрагментів, не представлених в геномах інтактних рослин. Можна припустити, що такі зміни викликані точковими мутаціями, мікроделеціями чи інсерціями. Вони супроводжуються втратою або зміною локалізації сайтів впізнавання рестриктаз. Також це може бути зв’язано з метилюванням-деметилюванням нуклеотидних залишків в послідовностях ДНК. Поява калюсоспецифічних рестрикційних фрагментів свідчить про зміни геному, які можуть виражатися в ампліфікації послідовностей ДНК.

Виявлені нами відмінності в локалізації сайтів рестрикції деяких ендонуклеаз свідчать про значний розмах геномних перебудов в популяціях культивованих in vitro клітин R.serpentina, паралельно з цим демонструють видоспецифічність набору рестрикційних фрагментів і наводять на думку про можливість різних типів змін в послідовностях ДНК при культивуванні in vitro.

Рис. 1. Електрофоретичні профілі ДНК інтактних рослин різних видів роду Rauwolfia та тривало культивованих клі-тин, гідролізованих AluI ендонуклеазою рестрикції. Стрілками позначено “родо-” та “видоспецифічний” фрагменти.

1. R. chinensis, 2. R. caffra, 3. R. serpen 5. R. verticillata,

4, 6. Культивовані клітини R. serpentina (лінія М), R.verticillata (4-річна калюсна тканина) відповідно.

Рис. 2. Електрофоретичні профілі ДНК інтактних рослин різних видів раувольфії та культивованих тканин R.serpentina, гідролізованих EcoRI рестриктазою. Стрілкою позначено “калюсний” фрагмент.

1. R.verticillata, 2. R. serpentina, 4. R caffra, 5. R.canescens.

3. Культивовані клітини R. serpentina (штам К-27),

М. Маркер довжин фрагментів (ДНК фага , гідролізована PstI – рестриктазою).

На рисунку 3 подано результати дот-гібридизації фракції помірних повторів інтактної рослини R.serpentina з ДНК культивованих клітин первинного калюсу та сформованого штаму, клітини якого перебувають в культурі тривалий час. Як видно з даних експерименту, відмінності між повторами культивованих клітин та рослини вихідного виду перевищують міжвидову мінливість. До того ж цей розрив збільшується із зростанням тривалості культивування.

Рис.3. Перебудови повторюваних послідовностей в культивованих клітинах Rauwolfia serpentina Benth. Залежність змін від тривалості культивування.

Дот-гібридизація сумарних ДНК інтактних рослин роду Rauwolfia і культивованих клітин раувольфії зміїної з фракцією повторів інтактної рослини R.serpentina (Цифрами позначено процент гомології):

1. R. verticillata, 2. R. serpentina,

3, 4. Культивовані клітини R.serpentina (первинний калюс, штам К-20 відповідно).

Рис. 4. Перебудови фракції миттево реасоціюючих повторів в культивованих клітинах R. serpentina. Блот-гібридизація геномних ДНК культивованих клітин R.serpentina та інтактних рослин роду Rauwolfia, гідролізованих Hindрестриктазою, з фракцією митєво реасоціюючих повторів культивованих клітин R. serpentina (штам К-20).

1. R.verticillata, 2. R.serpentina, 4. R.caffra, 5. R.vomitoria, 6. R.canescens,

3. Культивовані клітини R serpentina (штам К-27).

На рисунках 4, 5 наведено результати блот-гібридизації двох інших типів повторів – миттєво реасоціюючих (інвертованих повторів) та ДНК-азо стійкої фракції, виділених із культивованих клітин R.serpentina. Отримані дані (рис.4) демонструють, що в культурі in vitro інвертовані повтори зазнають значних змін. Тут має місце суттєве зменшення копійності повторів, властивих геномам інтактних рослин. І, поряд з цим, очевидно відбувається ампліфікація інших послідовностей, які присутні в рослині в незначній кількості.

Рис. 5. Перебудови Hind III повторів нуклеазостійкої фракції ДНК культивованих клітин раувольфії зміїної.

Блот-гібридизація ДНК тривало культивованих клітин R.serpentina та інтактних рослин різних видів Rauwolfia, гідролізованих Hindрестриктазою, з нуклеазорезистентними послідовностями калюсного походження.

1. R.verticillata, 2. R.serpentina, 4. R.caffra, 5. R.vomitoria, 6. R.canescens,

3. Культивовані клітини R serpentina. (штам К-27).

На рис. 5 представлено блот-гібридизацію послідовностей ДНК-азо стійкої фракції, виділених із культивованих клітин R.serpentina. Ці послідовності виявляють значну гомологію лише з двома високомолекулярними HindIII фрагментами інтактних рослин різних видів Rauwolfia, в культурі ж вони представлені всім набором рестрикційних фрагментів. Оскільки відомо, що ділянки геному, які входять до складу матрикс асоційованих регіонів (МАР), в силу своєї структурної організації характеризуються підвищеною стійкістю до дії нуклеаз, ми припускаємо, що виділена фракція хроматину належить до МАР послідовностей. В місцях прикріплення петель ДНК до ядерного матриксу локалізована значна кількість регуляторних послідовностей, таких як енхансери, ori-ДНК (у E.coli), фактори регуляції транскрипції, та ін., тобто це функціонально важливі ділянки геному. Таким чином отримані результати свідчать про зміну функціонально важливих ділянок геному в клітинах R.serpentina при культивуванні in vitro впродовж тривалого часу. За своїм розмахом ці зміни переважають міжвидові відмінності, які виникли в результаті еволюції, між представниками окремих видів в межах роду.

Результати досліджень, наведених на рис.3-5, свідчать, що деякі фракції повторюваних послідовностей (помірні повтори, інвертовані повтори, ДНК-азо стійка фракція) зазнають значних змін в культурі in vitro. В культивованих клітинах відбувається зменшення копійності послідовностей у складі окремих фракцій повторів, притаманних інтактній рослині, і паралельно з цим – ампліфікація повторів цих же ж фракцій, але властивих геномам клітин в умовах ізольованого росту. Ми спостерігали зміни якісного складу певних типів повторів. Разом з тим, геномні зміни в культивованих клітинах мають множинний характер (оскільки зачіпають різні класи повторюваних послідовностей) і за своїм розмахом перевищують міжвидові відмінності.

3. Зміни окремих рестрикційних фрагментів ДНК

Крім змін у складі деяких фракцій повторів, в популяціях культивованих in vitro клітин нами були виявлені перебудови окремих фрагментів геномної ДНК. Для деяких з них вони виявлялись у поліморфізмі довжин рестрикційних фрагментів. Це може бути наслідком мікроделецій, вставок (інсерцій) або мікромутацій. Ілюстрацією таких змін служать Alu I фрагменти інтактних рослин. На AluI рестрикційних профілях ми виділили два типи фрагментів (позначені стрілками на рис.1), які за їх міжвидовими відмінностями отримали назву “родо-” і “видоспецифічного”. Ці фрагменти були ізольовані із інтактної рослини R.caffra і застосовані в ролі зондів для гібридизації.

Рис. 6. Міжвидовий ПДРФ Alu I “видоспецифічного” фрагмента R.caffra та його перебудови в культивованих клітинах R.serpentina.

Блот-гібридизація ДНК культивованих клітин R.serpentina та інтактних рослин різних видів раувольфії, гідролізованих AluI рестриктазою з “видоспецифічним” Alu I фрагментом, виділеним із R.caffra.

1. R.verticillata, 2. R.serpentina, 4. R.caffra, 5. R.vomitoria,

3. Культивовані клітини R.serpentina (штам М).

Методом блот-гібридизації було встановлено, що “родоспецифічний” фрагмент зазнає змін в культивованих клітинах R.serpentina і не виявляє міжвидових відмінностей в межах досліджуваних видів. “Видоспецифічний” фрагмент виявився перебудованим в культивованих клітинах раувольфії зміїної, і характеризувався міжвидовим ПДРФ. Заслуговує на увагу невипадковий характер перебудов цього фрагмента – за патерном гібридизації він нагадує представника іншого виду раувольфії, а саме R.verticillata (рис.6). Отже, можна припустити, що AluI “видоспецифічний” фрагмент належить до лабільної частини геному, яка зазнала змін в процесі видоутворення і піддається перебудовам в умовах культивування in vitro. Той факт, що ці перебудови невипадкові наводить на думку про нерівноцінність різних ділянок геному по здатності до мутацій, а також, про нейтральний, чи адаптивний характер даних перебудов.

За допомогою рестрикційного аналізу EcoRI ендонуклеазою було виявлено в культивованих клітинах R.serpentina “калюсний” фрагмент, (наявний в клітинах різних за продуктивністю та іншими характеристиками штамів), але не представлений на електрофоретичних профілях продуктів рестрикції ДНК інтактних рослин окремих видів раувольфії (рис.2). Неповним картуванням встановлено, що він складається із низькомолекулярних AluI повторів

Як було показано методом блот-гібридизації, фрагмент зазнав перебудов в процесі культивування in vitro і паралельно з цим характеризувався міжвидовим поліморфізмом за сайтами рестрикції деяких ендонуклеаз (рис.7, 8).

Рис. 7. Міжвидова мінливість Eco R I “калюсного” фрагмента та його перебудови в культивованих клітинах R.serpentina.

Блот-гібридизація ДНК культивованих клітин R.serpentina та різних видів роду Rauwolfia, гідролізованих Eco R I ендонуклеазою рестрикції, з “калюсним” EcoRI фрагментом.

1. R.caffra, 2. R.vomitoria, 3. R.canescens, 4.5. R.serpentina,

6. Культивовані клітини R.serpentina (штам К-27).

В даному випадку ми знову зіткнулися з невипадковістю геномних змін в культурі in vitro. За довжиною рестрикційних фрагментів “калюсна” послідовність нагадувала інтактну рослину R.canescens (при обробці ДНК EcoRI ендонуклеазою рестрикції) (рис.7), за HindIII сайтами рестрикції – представника іншого виду – R.caffra (рис.8), а при гідролізі досліджуваних ДНК TaqІ рестриктазою в культивованих клітинах були виявлені низькомолекулярні фрагменти, аналогічні до R.vomitoria, R.canescens, та більш високомолекулярний, наявний в інтактній рослині R.caffra. Також було встановлено, що перебудови “калюсного” фрагмента залежать від тривалості перебування клітин в умовах ізольованого росту. В первинних калюсах, які походять від рослин двох різних видів (R.verticillata, R.serpentina), на відміну від тривало культивованих клітин (трьох штамів) цей фрагмент не зазнав змін.

Рис. 8. Перебудови HindIII рестрикційних фрагментів “калюсного” EcoRI фрагмента в геномах культивованих клітинах R.serpentina та окремих представників роду Rauwolfia

Блот-гібридизація ДНК різних видів раувольфії та культивованих клітин раувольфії зміїної, гідролізованих Hind III ендонуклеазою рестрикції, з EcoRI фрагментом, виділеним із клітин штаму А.

1. R. serpentina, 3. R.caffra, 4. R.canescens,

5. R vomitoria,

2. Культивовані клітини R.serpentina (штам К-27);

Поряд з цим було виділено послідовність, які зазнає іншого типу перебудов – зміни копійності. Це – BamHI фрагмент сконструйованої нами геномної бібліотеки R.serpentina. В порівнянні з рослиною вихідного виду, в культивованих клітинах спостерігається значне зменшення кількості копій фрагмента. За BamHI сайтами рестрикції міжвидових відмінностей не виявлено, але спостерігається варіабельність по копійності. Слід зауважити, що за кількістю копій in vitro цей фрагмент подібний до інтактної рослини іншого виду – R.vomitoria.

Отже, в геномах культивованих in vitro клітин R.serpentina відбуваються різні типи перебудов окремих фрагментів ДНК. Вони проявляються (виражаються) у зміні копійності та довжини фрагментів рестрикції. Ці зміни невипадкові – фрагменти, що зазнали змін в культурі in vitro, характеризуються міжвидовою варіабельністю, а ті фрагменти, для яких характерна міжвидова мінливість, піддались змінам в культивованих клітинах.

4. Перебудови окремих генів в умовах культивування in vitro

На відміну від повторюваних послідовностей, задіяних в організації структури хромосом та процесах поділу і реплікації, характерною рисою яких є значна міжвидова варіабельність, більшість рослинних генів належить до малокопійних послідовностей, яким властива висока консервативність, в основному кодуючих ділянок (Комарницький, 1999, Созинов, 1996). Тому в подальших дослідженнях ми вивчали перебудови життєво необхідних генів – р-РНК, цитохромоксидази, алкогольдегідрогенази, рибулозо біс-фосфат карбоксилази, продукти яких забезпечують основні процеси обміну в клітині.

Рис. 9. Перебудови гена цитохромоксидази (СохІ) в культивованих клітинах R.serpentina при тривалому вирощуванні на штучних живильних середовищах in vitro.

Блот-гібридизація CoxI гена з ДНК, гідролізованими HindIII рестриктазою.

1. R.serpentina, 3. R.caffra, 4. R.vomitoria,

2. Культивовані клітини R.serpentina (штам К-27).

При вивченні гена цитохромоксидази спостерігали зміни HindIII рестрикційних фрагментів в культурі in vitro, і поряд з цим відмічався міжвидовий ПДРФ. В культивованих клітинах було відмічено появу фрагмента розміром 2.5 т.п.н., характерного для інтактних рослин R.caffra, R.vomitoria (Рис.9).

Дослідження перебудов послідовностей генів алкогольдегідрогенази, рибулозо біс-фосфат карбоксилази та р-РНК проводилось паралельно із вивченням метилювання цитозинових залишків в CCGG сайтах з застосуванням для гідролізу ДНК пари ізошизомерів MspI, HpaII (ендонуклеаза, чутлива до метилювання цитозину в другому положенні сайту рестрикції). Відомо, що метилювання переважно цитозинових залишків приймає участь в регуляції експресії (Razin A., 1998), з іншої сторони – існують припущення, що в процесі метилювання-деметилювання С залишків в молекулах ДНК можуть виникати точкові мікромутації (шляхом заміни С на Т) (Phillips R.L. et al., 1994). В результаті проведених досліджень було виявлено, що в культивованих клітинах мають місце зміни копійності Msp, Hpa високомолекулярних фрагментів як гена алкогольдегідрогенази (adhI) (рис.10), так і рибулозо біс-фосфат карбоксилази (Rubisco) (рис.11). Для гена Rubisco ці зміни корелюють з міжвидовими відмінностями.

Паралельно з цим було встановлено, що перебудови високомолекулярних фрагментів вищеназваних генів залежні від метилювання цитозину в CCGG сайтах.

Рис. 10. Зміни гена алкогольдегідрогенази в культивованих клітинах Rauwolfia serpentina.

Блот-гібридизація ДНК інтактної рослини та культивованих клітин R.serpentina, гідролізованих HpaII (1-3 доріжки) та MspI (доріжки 4-6) ендонуклеазами рестрикції, з послідовністю SAR adhI (кукурудзи).

1, 4. R.serpentina, 2, 5. Культивовані клітини (штам К-20), 3, 6. Культивовані клітини (штам К-27).

Рис. 11. Міжвидова мінливість та геномні перебудови гена Rubisco в інтактних рослинах різних видів раувольфії та культивованих клітинах R.serpentina. Їх зв’язок з метилюванням.

Блот-гібридизація з ДНК гідролізованими MspI (панель А) та HpaII (панель Б) ендонуклеазами рестрикції.

1. R.canescens, 2. R.caffra, 3. R.serpentina; 4 - 6. Культивовані клітини R.serpenri штамів К-20, К-27 та М відповідно.

Щодо послідовностей генів р-РНК, нами виявлено, що в культурі in vitro перш за все спостерігається зменшення їх копійності. Це було показано при блот-гібридизації з клонованою послідовністю р-ДНК (гороху) (рис.12) та нетранскрибованого спейсера р-ДНК (лимона) (рис.13).

Рис.12. Перебудови генів рибосомальної РНК в культивованих клітинах сформованих штамів R.serpentina та їх міжвидовий поліморфізм.

Блот-гібридизація ДНК гідролізованих MspI (А) та HpaII (Б) рестриктазами, відповідно, з р_ДНК гороху (pHAI).

1, 2. R.caffra, R.serpentina. (біля 4мкг ДНК в пробі) 3_. культивовані клітини R.serpen штамів К-20, К-27, М, (10мкг ДНК в пробі) відповідно.

Рис.13. Перебудови нетранскрибованого спейсера рДНК в клітинах R.serpentina при культивуванні в умовах in vitro та його міжвидова варіабельність.

Блот-гібридизація ДНК інтактних рослин та культивованих клітин, гідролізованих Hind III рестриктазою, з нетранскрибованим спейсером рДНК (лимона).

1. R.verticillata, 2. R.serpentina, 4. R.caffra, 5. R.vomitoria, 6. R.canescens,

3. Культивовані клітини R.serpentina (штам К-20).

Поряд з цим в культивованих клітинах R.serpentina ми спостерігали ПДРФ в послідовностях ДНК рибосомальних генів по MspI, HpaII сайтах (рис.12). Причому низькомолекулярні фрагменти ДНК тривало культивованих клітин співпадали з такими ж у представника іншого виду (R.caffra) і не виявлялись в інтактній рослині вихідного виду. Патерни гібридизації з гідролізованими HpaII ендонуклеазою ДНК культивованих клітин характеризувались наявністю високомолекулярних фрагментів, відсутніх в MspI гібридизаційних профілях (рис. 13, панель А).,

Крім того було встановлено, що послідовність нетранскрибованого спейсера р-ДНК в культурі in vitro зазнає змін, і за характером гібридизації нагадує інтактну рослину іншого виду - R.vomitoria. (рис. 13). Цілком можливо, що виявлений ПДРФ в р-ДНК зумовлений змінами послідовностей нуклеотидів в районах спейсерних ділянок, оскільки відомо, що саме ці ділянки характеризуються значною міжвидовою варіабельністю (Комарницький, 1999, Созинов, 1994).

Отже, як і у випадку з AluI, Bam HI фрагментами ДНК інтактних рослин, та EcoRI “калюсного” фрагмента, зміни в послідовностях генів в культивованих клітинах мають невипадковий характер і відбуваються “каналізовано”, тобто таким чином, що перебудовані в умовах in vitro фрагменти нагадують (повторюють) такі ж в окремих представників інших видів роду Rauwolfia.

На основі проведених досліджень геномних змін в культивованих клітинах R.serpentina, ми беремо на себе сміливість вважати, що і в культурі in vitro на молекулярному рівні діє положення закону гомологічних рядів спадкової мінливості Вавілова М.І., сформульованого на основі фенотипових ознак, згідно якого:

“Види і роди генетично близькі характеризуються подібними рядами спадкової мінливості з такою правильністю, що, знаючи низку форм в межах одного виду, можна передбачити наявність паралельних форм в інших видів і родів. Чим ближче розміщені в загальній системі роди і види, тим повніша буде подібність в рядах їх мінливості...”

ВИСНОВКИ

1. Популяції культивованих in vitro клітин раувольфії зміїної характеризуються значними змінами геному. Геномні перебудови зачіпають різні фракції ДНК - повторювані послідовності, окремі фрагменти, деякі гени. Розмах мінливості зростає із збільшенням тривалості культивування клітин в умовах ізольованого росту на штучних живильних середовищах.

2. Методами рестрикційного аналізу, дот-, блот-гібридизації зі специфічними пробами виявлено, що в умовах культури in vitro спостерігаються різні типи геномних перебудов, які виражаються в зміні копійності (ампліфікаціях/делеціях) послідовностей, точкових мутаціях, модифікаціях нуклеотидних залишків (зокрема шляхом метилювання/деметилювання цитозину), що приводить до зміни локалізації сайтів впізнавання рестриктаз, і виражається в поліморфізмі довжин рестрикційних фрагментів.

3. В деяких випадках геномні зміни, які спостерігаються в рослинних клітинах при культивуванні in vitro за своїм розмахом перевищують міжвидову мінливість, що виникла в процесі еволюції при утворенні окремих видів.

4. Зміни в культурі, щонайменше деяких послідовностей, мають невипадковий характер, тобто, в умовах in vitro перебудовуються ті послідовності, для яких характерна міжвидова варіабельність (які характеризуються міжвидовими відмінностями).

5. Зміни, принаймні деяких фрагментів ДНК в популяціях культивованих клітин, відбуваються “каналізовано”. Це означає, що перебудовані в культивованих клітинах R.serpentina фрагменти подібні до таких в окремих (інших) представників роду Rauwolfia, а не до рослини вихідного виду. Такий тип перебудов ДНК дозволяє вважати, що і в культурі in vitro на молекулярному рівні діє закон гомологічних рядів спадкової мінливості М.І. Вавілова, сформульований на основі фенотипових ознак.

ПЕРЕЛІК РОБІТ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Соловьян В.Т., Спиридонова Е.В., Кунах В.А. Геномные перестройки в культивируемых клетках Rauwolfia serpentina. Множественный характер геномных изменений // Генетика. – 1994. – 30, №2. – C.250 – 254.

2. Соловьян В.Т., Спиридонова Е.В., Кунах В.А. Геномные перестройки в культивируемых клетках Rauwolfia serpentina. II. Связь с межвидовой изменчивостью // Генетика. – 1994. – 30, №3. – C.399 – 403.

3. Соловьян В.Т., Спиридонова Е.В., Кунах В.А. Особенности геномной изменчивости культивируемых клеток Rauwolfia serpentina // Цитология и генетика. – 1994. – 28, №5. – C.21 – 25.

4. Спірідонова К.В., Андреєв І.О., Солов’ян В.Т., Кунах В.А. Особливості перебудови деяких генів в культурі клітин in vitro раувольфії зміїної R.serpentina Benth. // Доповіді Національної Академії наук України. – 2000. – N2. – С.165-170.

5. Kunakh V.A., Gubar S.I., Solovyan V.T., Alkhimova E.G., Zakhlenyuk O.V., Alpatova L.K., Spyrydonova K.V. Genome variability and accumulation of indole alkaloids in Rauwolfia serpentina Benth. tissue culture // Alma-Aty, II Internat. confer. “Biology of plant cell cultures and Biotechnology”. Abstr. Reports. – 1993. — p.162.

6. Solovyan V.T., Spyrydonova K.V., Kunakh V.A. Genome rearrangements in Rauwolfia serpentina cultured cells may resemble the interspecies genome changes // Abst. 4th Int. Congr. of plant mol. biol., Amsterdam, June 19–24. – 1994. – p.1353.

7. Solovyan V.T., Spyrydonova K.V., Kunakh V.A. Probable parallelism between genome rearrangements in Rauwolfia serpentina cultured cells and interspecies genome differences // Int. Symp. Plant Biotecnology and Genet. Engineering, Abstr. Kiev, Ukr. 3-6 Octob., 1994. – p.153.

8. Спиридонова Е.В., Соловьян В.Т., Кунах В.А. Канализованый характер изменений генома в популяциях культивируемых клеток раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina) // Межд. конф. “ДНК-технологии”. Тез. докл., Киев, 1997. –С.11—12.

9. Спиридонова Е.В., Андреев И.О., Соловьян В.Т., Кунах В.А. Канализованный характер геномных перестроек в популяциях культивируемых клеток раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina) // Мат. межд. конф. “Молекулярная генетика и биотехнология”. – 6-8 апреля 1998. Минск. – 1998. – С.105.

10. Spiridonova K.V., Andreev I.O., Solovyan V.T., Kunakh V.A. Genetic variability in Rauwolfia serpentina cells culture // Plant biotechnol. and in vitro biology in the 21st century. IX Internat. congress on plant tissue and cell culture, Jerusalem, Israel, June 14-19, 1998, Abstr. – P.89.

11. Spiridonova K.V., Solovyan V.T., Andreev I.O., Zelensky A.N., Kunakh V.A. The rearrangement of ribosomal genes in the longterm passaged cells of Rauwolfia serpentina // II Internat. Symp. on Plant Biotechnology, 4-8 October 1998, Kyiv, Ukraine, Abstr. – P.13.

Spiridonova K.V. Characterization of the genome variability in Rauwolfia serpentina Benth. tissue culture. – Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by the speciality 03.00.15 – genetics. Institute of Cell Biology and Genetic Engineering National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

Extensive employment of the cultured in vitro plant cells in applied fields of the experimental biology, specifically in such ones as the conservation of the genofund, generation of the novel cultivars of the agricultural crops, development of the principally new technologies for production of the economically valuable substances and medicinal drugs of plant origin etc, would require in-depth understanding of the processes and characteristics of the genome variability to occur in the cells during maintenance in conditions of isolated growth on the artificial nutrient media. Insight into the details and mechanisms of the structural and functional variation of the in vitro cells, elaboration of the genetical basis for cell selection would allow purposefully device new strains – producents of the valuable metabolites and crop varieties. Similarly, the use of the cell-producents of the economically valuable compounds would necessitate the knowledge on the patterns, nature and extent of advancement for the changes taking place within the genome during the established strains long-term culturing.

At the cytological level (chromosome number and structure) the genetics of the cultured plant cells is explored rather circumstantially. Molecular and biological characteristics of the changes in plant genome in vitro concerning the specific DNA fractions and sequences need for additional, more detailed investigations. This work is focused on the bringing out of the peculiarities in the genome variability of cultured in vitro R.serpentina cells – the raw material known to serve as a source of the anti-arrhythmic alkaloid ajmaline, widely used in the medicinal practice. Studies were performed by comparison of the specific sections of the genome in cultured R.serpentina cells with the parallel ones in the intact plants of some species from Rauwolfia genus.

Through the restriction analysis, dot, blot-hybridization the genome rearrangements at DNA sequence level in cultured in vitro R.serpentina cells have been demonstrated. Correlation of the changes' magnitude with the duration of the plant cells culturing in vitro was established. Occasionally the genome changes to occur in plant cells during culturing in vitro by their range may exceed the interspecies variation to arise during evolution upon origin of the individual species.

It was established that liable to changes were the specific fractions of the repeated sequences such as the moderate repeats, inverted reiterations (immediately reassociating), DNAse-resistant fraction, individual fragments (the restriction analysis revealed AluI "genus"- and "speciesspecific" in the genome of the intact R.caffra plant, BamHI sequence in the intact R.serpentina plant, "callus" EcoRI fragment in the long-term cultured R.serpentina cells) and certain genes (the sequences of the cytochromeoxidase, ribuloso bis-phosphate carboxilase, alcoholdehydrogenase and m-RNA were scrutinized). Plant genome in conditions in vitro was found to exhibit various DNA rearrangement patterns, namely, changes in the copy number of some fractions and fragments, mutations and micromutations (after the insertion or deletion pattern and the nucleotide replacement) that result in RFLP both in the individual fragments of the genome DNA and in some structural genes. There also may occur changes in the methylation pattern for the cytosine residues within CG duplexes of some genes. This seems to result in their changed activity (translation), while generating micromutations by the principle of cytosine residues replacement for timine ones.

The comparison of the genome rearrangements behavior in culture in vitro with the interspecies variability revealed that the genome changes display non-random pattern. Specifically, the fragments amenable to rearrangements in cultured cells appeared to exhibit the interspecies polymorphism, while the fragments distinguished by the interspecies variations proved to be rearranged in cell culture. Parallelism between the genome changes in culture in vitro and interspecies variation among intact plants, members of Rauwolfia genus, was brought out. Changes in some DNA fragments (this holds true for the genes involved) in culture in vitro seem to proceed in such a way that resemble the particular members of other species within the genus. Speculation that some genome changes in cultured cells may occur according to the law of the homology raws for hereditary variability by M.I.Vavilov.

Dependence of the changes scope on the duration of cell culturing in conditions in vitro was documented. In isolated cases the genome changes in the populations of cultured cells by the range seem to exceed the interspecies variability.

Key words: Cultured cells, genome, genome changes, Rauwolfia serpentina, restriction analysis, DNA, dot-, blot-hybridization, repeated sequences, genes, DNA fragments, restriction fragment lengths polymorphism.

Спірідонова К. В. Вивчення особливостей геномної мінливості культивованих клітин раувольфії зміїної Rauwolfia serpentina Benth. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 – генетика, Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2000.

Методами рестрикційного аналізу, дот-, блот-гібридизації ДНК зі специфічними зондами (з певними послідовностями в ролі зондів) виявлено, що в культивованих in vitro клітинах Rauwolfia serpentina відбуваються значні зміни геному, які за масштабністю перевищують міжвидові відмінності. Перебудови зачіпають різні ділянки геному, такі як окремі фракції повторюваних послідовностей, деякі фрагменти, і навіть окремі структурні гени. Вони виражаються в ампліфікації/зменшенні копійності послідовностей, зміні місцезнаходження сайтів впізнавання деяких рестриктаз (що свідчить про мікромутації, делеції або вставки), зміні характеру метилювання. Встановлено, що геномні зміни в культивованих клітинах, щонайменше деяких із досліджуваних послідовностей, мають невипадковий характер: в умовах in vitro перебудовуються перш за все ті послідовності, які зумовлюють міжвидові відмінності. Вони змінюються таким чином, що в результаті нагадують представників інших видів даного роду. Висувається положення про те, що деякі геномні зміни в культивованих клітинах відбуваються згідно закону гомологічних рядів спадкової мінливості М.І. Вавілова.

Ключові слова: культивовані клітини,