МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

Одеський державний медичний унiверситет

Сарр Сандене

УДК 577.158.4

Використання функціонально зв’язаних вітамінів

з L-аланіном і L-глутаматом для корекції

їх окислювального катаболізму в головному мозку

при гіпоксії замкненого простору

14.03.05 - фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одеса - 2000

Дисертацiєю є рукопис

Робота виконана в Одеському державному унiверситеті ім. I.I. Мечникова, Мiнiстерство освiти та науки України.

Науковий керiвник:

доктор медичних наук, професор

Розанов Анатолiй Якович,

Одеський державний унiверситет ім. I.I. Мечникова МОН України,

професор кафедри бiохiмiї.

Офiцiйнi опоненти:

доктор бiологiчних наук, старший науковий спiвробiтник,

Фiлiпова Тетяна Олеговна,

Одеський державний унiверситет iм. I.I.Мечнiкова МО України, провiдний науковий спiвробiтник проблемної лабораторiї № 5.

доктор бiологiчних наук, старший науковий спiвробiтник,

Володимир Георгiйович Зiнковський,

Одеський фізико-хімічний інститут ім. О.В.Богатського НАН України, провідний науковий спiвробiтник вiддiлу фiзико - хiмiчної фармакологiї.

Провiдна установа:

Iнститут фармакологiї та токсикологiї, вiддiл нейрофармакологiї, АМН України, м. Київ.

Захист вiдбудеться "16" жовтня_2000 року об 11 годинi на

засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д41.600.01 Одеського державного

медичного унiверситету (65026, м. Одеса, пров. Валiховський, 2)

З дисертацiію можна ознайомитися в бiблiотецi Одеського державного медичного унiверситету ( 65026, м. Одеса, пров. Валiховський, 3)

Автореферат розiсланий "3" серпня 2000 року

Вчений секретар

спецiалiзованої ради

доктор медичних наук, професор Годлевський Л.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Амінокислоти є не тільки попередниками нейротрансміттерів, але й джерелами енергії при гіпоксії головного мозку (Волков М.С. и др., 1975; Хухо Ф., 1990), а також володіють багатьма іншими функціями, зокрема метиловий ефір L-аланіну розширює кровеносні судини, звільняючи в ендотелії NO (Al-Swaych. O.A. e.a. 1989), d-аміно-валеріанова кислота та гліцилгліцин володіють протисудорожною дією (Samuels. e. a. 1983). Дикарбонові та аліфатичні амінокислоти включаються до основного енергетичного циклу мітохондрій нейроструктур головним чином після переамінування до a-кетокислот, окислювальне декарбоксилювання яких каталізується В-вітамінними коферментами. Парентеральне введення вітамінно-коферментного комплексу "пентапірувіт" (тіамін, пантотенат, рибофлавін, нікотинамід та ліпоат), розробленого на кафедрі біохімії ОДУ під керівництвом А.Я.Розанова, стимулює окислення a-кетокислот у тканинах старих тварин, при гіпоксичних та інших екстремальних станах як самостійно, так і в поєднанні з іншими фармакологічними засобами (Кравченко Н.А., 1990; Крыжановский Г.Н., Шандра А.А., 1985; Розанов А.Я., 1967, 1970, 1989).

Перспективним є біохімічне обгрунтування метаболітно-вітамінних анти-гіпоксичних препаратів, нетоксичних та ефективних. Вже широко використовуються в медицині калій-магнієві солі L-аспартату, g-амінобутират та його кон'югати з нікотиновою кислотою (Кресюн В.И., 1984). В експерименті показана захисна дія L-аспартату з функціонально-пов'язаними вітамінами та сумісного застосування триптофану та гистидину при гіперкапнічній та гіпобаричній гіпоксії (Абу Асали И.И. и др., 1990; Переверзев В.А. и др., 1977), N-ацетиласпартату, N-ацетил-глутамату при гіпотермії та a-кетоглутарату при іонізуючому опроміненні (Шейхова Р.Г. и др., 1996; Шостаковська І.В. та ін., 1999). Антигіпоксична дія дикарбонових амінокислот явна, проте парентеральне їх застосування на практиці обмежене ушкодженням нейронів у деяких відділах мозку при передозуваннях (Pellegrini-Gianpietro D.E. e.a., 1990). Суміші амінокислот для парентерального введення використовуються в клінічній практиці, зокрема такі, що містять аланін, глутамат, лейцин та інші амінокислоти при стресових станах (Dolp R. e.a., 1979), проте ефективність компонентів не оцінена навіть в експерименті при різних формах гіпоксії. Найбільшу зацікавленність представляє "гіпоксія замкненого простору" (ГЗП), при якій на організм впливає гіперкапнія, аміак, формальдегід та інші леткі продукти обміну, і яка частіше зустрічається (землетруси, обвали в шахтах та ін.). ГПЗ - важлива проблема авіакосмічної медицини, де вона використовується як метод відбору та засіб тренування космонавтів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в плані кафедральної тематики: НДДКР 1.2.6-7 "Вітаміни та коферменти для здоров'я людини", та теми НДР кафедри біохімії ОДУ "Механізми реалізації активності вітамінів" (держреєстраційний №08974008988). Співвиконавець проводив дослідження методичних підходів та арсеналу фармакотерапевтичних засобів для корекції порушень метаболізму головного мозку при екстремальних станах, зокрема – гіпоксія різного генеза.

Мета та задачі дослідження. Вивчити деякі фармако-біохімічні механізми захисної дії L-аланіну, L-глутамату з функціонально-пов'язаними вітамінами та коферментами при ГЗП у щурів. Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Вивчити динаміку змін вмісту вільних амінокислот в головному мозку та в сироватці крові щурів при ГЗП та в умовах попереднього введення L-аланіну та L-глутамату.

2. Учинити кінетичний аналіз катаболізму до СО2 L-аланіну, L-лейцину та L-глутамату та відповідних a-кетокислот у відділах головного мозку при ГЗП, для оцінки основного шляху окислення досліджуваних амінокислот.

3. Вивчити фармакодинаміку L-аланіну та L-глутамату, їх катаболізм у головному мозку, вплив на активність функціонально-пов'язаних ферментів та тривалість життя щурів при ГЗП.

4.Дослідити коригуючу дію вітамінно-коферментного комплексу "пентапірувіт" на метаболічні та фізіологічні ефекти L-аланіну та L-глутамату при ГЗП.

Об'єкт дослідження. Амінокислотний обмін за умов ГЗП.

Предмет дослідження. Фармакологічна корекція ГЗП L-аланіном, L-глутаматом и пентапірувітом.

Наукова новизна. Уперше показано, що при ГЗП в головному мозку щу-рів підвищується активність АЛТ, АСТ та ГДК і підвищується швидкість катаболізму до 14СО2 мічених по a-карбоксилу L-аланіну та L-глутамату. Вперше виявлено, що ін'єкція L-аланіну або L-глутамату в умовах ГЗП призводить до посилення швидкості їх катаболізму в головному мозку та збільшує тривалість життя, а додаткове введення "пентапірувіту" посилює ці ефекти.

Практична цінність роботи. Обгрунтовано використання ін'єкційних препаратів, що містять аланін, з урахуванням його метаболічних ефектів з метою досягнення максимального ефекту при ГЗП. Апробований новий варіант амінокислотно-вітамінного комплексу, що містить "пентапірувіт", аланін та глутамат, який може стати основою для відповідної фармакологічної розробки.

Особистий внесок здобувача. Основні та істотні дослідження виконані автором. У сумісних радіоізотопних роботах автором проведений кинетичний аналіз результатів, їх узагальнення та обміркування.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації обнародовані на VII Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997р.), в доповідях на науковому семінарі кафедри біохімії ОДУ (1998, 1999рр.) та на засіданні Одеського відділення українського товариства біохіміків (1999р.).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в матеріалах VII Українського з'їзду біохіміків, 1997, 5-ти наукових статтях, з яких 3 - у фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 137 сторінках друкованого тексту і складається з вступу, п`яти розділів, висновків, списку використаної літератури з 110 робіт вітчизняних і 125 зарубіжних авторів. У роботі представлена 21 таблиця і 12 малюнків, які займають 37 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження.

Об'єктом дослідження служили білі щури, самці лінії Вістар, масою 180-220 г. Тварин утримували на стандартному раціоні віварія. Щурів розміщували в герметичні індивідуальні камери місткістю 1066 см3. Реєстрували тривалість життя тварин, починаючи з моменту їх розміщення в гермокамеру до часу наставання останнього агонального вдоху. Підвищення температури в гермокамерах було незначним: до 28°С.

При випробовуванні антигіпоксичної дії використовували амінокислоти, вітаміни та коферменти: L-глутамат (хроматографічно чистий "Реахим"), L-ала-нін (ч.д.а. "Reаnal"), які вводили підшкірно в дозі 2,0 ммоля/кг, у вигляді 0,2 М розчинів в об'ємі 1,0 мл на 100 г живої ваги. Вивчали також вплив пірідоксаль-5-фосфату (3,0 мг/кг "Reаnal"), комплексу вітамінів (пентапірувіт), що містить тіамінпірофосфат (кокарбоксилазу фармакопейну, 1,0 мг/кг), ліпоат фармако-пейний (4,0 мг/кг), 4-фосфопантотенат натрію (отриманий з НПО "Витамины", 12 мг/кг), нікотинамід фармакопейний (7,5 мг/кг) та рібофлавінмонофосфат фармакопейний (3,5 мг/кг). Молярні долі кожного вітаміну та коферменту співвідносилися в цілому комплексі як 0,2:3:5:8:1 відповідно. Всі досліджувані амінокислоти та вітамінно-коферментні комплекси, попередньо нейтралізовані NaHCO3 до рН 7,2-7,4, вводили тваринам підшкірно за 2 хвилини до розміщення в камеру та ураховували середню тривалість життя (СТЖ) в умовах ГЗП.

В експериментах (in vitro) визначали катаболізм до 14СО2 гомогенатами головного мозку наступних мічених субстратів: 1-[14C]-2-оксоглутарат (динатрієва сіль), 1-[14C]-піруват, 1-[14C]-a-оксоізокапронат, 1-[14C]-L-глутамат, 1-[14C]-L-аланін та 1-[14C]-L-лейцин ("Amersham") з питомою радіоактивністю 2,16-2,18 ГБкЧммоль-1. Тварин забивали декапітацією. Гомогенати готували в малому тефлон-скляному гомогенізаторі (в розведенні 1:4, 1000 обертів за 1 хвилину) з К, Na фосфатним буфером 0,06 М, рН - 7,2. Час від моменту забою до отримання гомогената складав не більше 4-5 хвилин, всю роботу проводили на льоді. Аліквоту гомогенату розміщували в інкубаційні посудини, додавали мічені субстрати до кінцевих концентрацій від 0,05 мМ до 0,8 мМ (в об'ємі 50-200 мкл). Загальний об'єм інкубаційного середовища 1,2 мл, об'єм герметичної посудинки 6 мл. Інкубаційні посудини герметизували та інкубували 10 хв при 37°С при постійному перемішуванні. Реакцію зупиняли додаванням розчину трихлороцтової кислоти (ТХО) через бокову голку до кінцевої концентрації 7,5%, після чого проби інкубували при 37°С та безперервному вструшуванні ще 10 хв для повного виділення 14СО2 із розчину та вловлення фільтром з поглиначем. Фільтри висушували на протязі 3-5 годин при кімнатній температурі. Радіоактивність вбирача (паперового фільтра стандартних розмірів, змоченого 1N NaOH) визначали за допомогою газопроточного лічильника 2154-1-1М "Протока". Враховували ступінь гасіння b-випромінення фільтровальним папером та коефіцієнт вбирання 14СО2 з об'єму посудинок. Інтенсивність катаболізму розраховували в нмолях виділяємого 14СО2 на г-1 тканиниЧхв-1.

При вивченні фармакодинаміки парентерально введених мічених аміно-кислот до 1-14С-L-аланіну або 1-14С-L-глутамату додавали немічений L-аланін або L-глутамат та вводили тваринам підшкірно в дозі 2,0 ммоля на кг ваги. Контрольних тварин забивали декапітацією через 20 та 40 хвилин після введення мічених амінокислот. Тварин, підлеглих дії ГЗП, забивали через 20 хвилин після ін'єкції міченого препарату та розміщення в камеру, а також в агональному стані (36-48-а хвилина перебування в гермооб'ємі). В момент декапітації збирали кров з шийної рани, витягували головний мозок та печінку, гомогенізували у співвідношенні 1:10 в 0,05 N розчині NaOH, кров розводили тим же розчином у тій же пропорції. Гомогенати наносили на мішені з нержавіючої сталі з площею активної плями 3,14 см2 та радіоактивність враховували за допомогою газопроточного b-лічильника "Протока" з урахуванням коефіцієнта поглинання b-випромінення 14С попередньо визначенного. Розраховували накопичення загальної мітки в тканинах, а також співвідношення мітки кров/мозок.

Вивчали активність основних ферментів дегідрогеназ (піруватдегідро-генази (ПДК), a-кетоглутаратдегідрогенази (a-КГДК), амінотрансфераз (аспар-татамінотрансферази, АСТ) та аланінамінотрансферази (АЛТ), а також глутаматдекарбоксилази (ГДК). Визначення вмісту вільних амінокислот та активності ГДК в мозку здійснювали за методом Ситінського І.А. та співробітників (1965). Вільні амінокислоти в сироватці крові визначали за методом Пасхіної Т.С. (1964).

При визначенні активності основних дегідрогеназ та амінотрансфераз циклу Кребса тварин декапітували, швидко витягували головний мозок та гомогенізували при t=0°С у співвідношенні 1:10 в 0,25 М розчині сахарози, що містить 0,2 М Трис-НС1 та 1 мМ ЕДТА (рН 7,4). Гомогенат центрифугували 10 хв при 4000 об/хв (t=0 - +2°С). Поверхосадову рідину знову центрифугували 10 хв при 14000 об/хв, при t=0°С. Поверхосадову рідину залишали в льоді, осад мітохондрій промивали в 5 мл 0,2 М трис-НС1, що містить 0,25 М сахарози (рН 7,4), та знову центрифугували 10 хв при 14000 об/хв. Другу поверхосадову рідину додавали до першої та використовували для визначення активності цитоплазматичних форм ферментів АСТ та АЛТ. Осад гомогенізували в 2 мл 0,2 М трис-НС1 буфері, що містить 0,25 М сахарози та 0,1%-го розчину тритону Х-100, та залишали на 30 хв в льоді для повного руйнування мітохондрій. Після цього визначали активність АСТ і АЛТ за стандартною методикою (Осадчая Л.М., 1982), активність ПДК та a-КГДК за методом Єщенко Н.Д. (1982).

Результати оброблені статистично (Рокитський П.Ф., 1973).

Динаміка вільних амінокислот в головному мозку при гіпоксії замкненого простору та після ін'єкцій L-аланіну, L-глутамату та L-лейцину.

Глутамінова кислота вже давно успішно використовується для лікування кисневої нестачі при серцево-судинних захворюваннях, нестачі мозкового кровообігу та як профілактичний засіб при асфікації плода. В експериментах на щурах введення глутамата при гіпоксії гальмує виснаження резервів глікогену та макроенергетичних сполук в печінці, скелетному та серцевому м'язах та головному мозку. Вважають, що ці ефекти обумовлені в значній мірі стимуляцією глутаматом нейроендокринної системи та носять неспецифічний характер. В цих експериментах був використаний глутамат натрію в дозі 1 г на кг живої ваги підшкірно за 30 хвилин до гіпобаричної (висота 8000 м) гіпоксії (Волков М.С. и др., 1975). При вивченні захисної дії аспартата при ГЗП більш ефективною була доза 100 мг на кг живої ваги, ін'єктована за 2-5 хвилин до розміщення мишей в гермокамеру (Абу Асали И.И. и др.,1990).

Таблиця 1.

Вплив ін'єкції L-глутамату, L-аланіну або L-лейцину (2,0 ммоля/кг) на вміст (мМ) основних вільних амінокислот в головному мозку щурів при ГЗП

Хвилини після ін'єкції та ГЗП Глутамат ГАМК Аспартат Аланін Лейцин

Контроль n=22 9,11±0,04 4,09±0,26 2,54±0,18 0,51±0,04 0,25±0,02

ГЗП, 20' n=12 8,76±0,61 5,13±0,38* 2,22±0,16 0,46±0,03 0,19±0,02

ГЗП, 35-45' n=12 10,97±0,76 5,41±0,32* 2,83±0,23 0,62±0,05* 0,29±0,03

Глу, 20' n=8 14,32±0,18* 4,81±0,35 5,49±0,39* 1,21±0,09* 0,27±0,03

Глу, 40' n=8 11,13±0,76 4,15±0,76 4,00±0,47* 1,07±0,08* 0,25±0,03

Глу+ГЗП, 20' n=8 17,13±1,56** 6,08±0,72** 6,21±0,43 1,50±0,12 0,32±0,04

Глу+ГЗП, 36-48'n=8 18,34±1,84** 7,20±0,88** 6,13±0,32 1,81±0,14** 0,29±0,03

Ала, 20' n=8 12,51±1,17* 4,12±0,30 3,88±0,31* 1,26±0,20* 0,26±0,03

Ала, 40' n=8 10,54±1,12 4,09±0,27 3,56±0,23* 1,08±0,10* 0,26±0,04

Ала+ГЗП, 20' n=8 14,05±1,60 5,67±0,44 4,54±0,42** 1,55±0,12** 0,33±0,05

Ала+ГЗП, 36-48'n=8 15,16±1,17** 6,85±0,78** 4,06±0,43 1,62±0,18** 0,30±0,04

Лей, 20' n=8 12,95±1,26* 4,09±0,31 3,76±0,32 1,13±0,10* 0,87±0,07*

Лей, 40' n=8 10,48±1,14 4,03±0,36 3,60±0,30* 0,98±0,12* 0,76±0,03*

Лей+ГЗП, 20' n=8 13,84±1,40 5,45±0,66** 4,43±0,58 1,54±0,11** 1,62±0,15**

Лей+ГЗП, 36-48'n=8 14,76±1,15** 6,52±0,63** 3,90±0,47 1,61±0,15** 1,07±0,06**

*p<0,05 в порівнянні з контролем; **p<0,05 при дії ГЗП+ін'єкції амінокислот

Враховуючи ці роботи та вважаючи доцільним використовувати еквімолярні дози ін'єкцюємих амінокислот, ми застосували дозу 2,0 ммоля на 1 кг живої ваги. Тварин брали до досліду через 20 хвилин після розміщення їх в гермокамеру та в агональному стані.

Резюмуючи результати цих досліджень (табл.1), можна зробити наступні висновки: 1. Вміст вільного глутамату та аспартату в головному мозку щурів достовірно не змінюється навіть в агональному стані при гострій ГЗП, а вміст ГАМК та аланіну незначно збільшується. 2. Після ін'єкції L-глутамату його вміст в головному мозку максимально збільшується через 20 хвилин на 57%, а після ін'єкції еквімолярних доз L-аланіну та L-лейцину їх вміст в головному мозку збільшується в значно більшій мірі. 3. При ГЗП інтенсифікується накопичення ін'єкцьованих амінокислот та їх метаболізм до аспартату, глутамату та ГАМК в головному мозку щурів.

Кінетика катаболізму до 14СО2[1-14C]-L-аланіну та інших мічених по

a-карбоксилу субстратів гомогенатами відділів головного мозку щурів.

Структурно та функціонально-пов'язані мультиензимні комплекси дегідрогеназ 2-оксокислот, АЛТ та АСТ в мітохондріях виконують важливу роль в енергетиці клітин головного мозку та синаптосом.

Метою цих досліджень було порівнювальне вивчення кінетичних характеристик, розрахованих за координатами Лайнуівера-Берка Vmax, утворення 14СО2 з [1-14C]-L-глутамату, [1-14C]-L-аланіну та [1-14C]-L-лейцину та їх 2-оксоаналогів: [1-14C]-2-оксоглутарату, [1-14C]-пірувату та [1-14C]-2-оксоізокапронату гомогенатами із основних відділів головного мозку щурів in vitro в аеробних умовах без додавання коферментів. Таким чином, супряжені реакції забезпечувалися ендогенними ПАЛФ, КоА та іншими коферментами, при використанні кінцевих концентрацій субстратів, зіставлених з вмістом пірувату, аланіну та лейцину в головному мозку. Результати досліджень показали, що Vmax найбільша для [1-14C]-a-кетоглутарату та [1-14C]-L-глутамату у півкулях головного мозку щурів, досягаючи 780 та 1250 нмолей 14СО2 за хвилину на 1 г тканини та найменша для [1-14C]-a-ізокапронату та [1-14C]-L-лейцину: 13,2 та 12,9 нмолей 14СО2 хв-1Чг-1 відповідно. Різниця на 2 порядки. Аналогічні співвідношення спостерігалися і при дослідженні інших відділів головного мозку щурів, не дивлячись на те, що Vmax утворення 14СО2 із [1-14C]-a-кетоглутарату та [1-14C]-L-глутамату в гомогенатах із "стовбура мозку" та мозжечку значно менше, ніж у півкулях головного мозку. Таким чином, катаболізм [1-14C]-L-глутамату до 14СО2 перевищує максимальну швидкість утворення 14СО2 при окислювальному декарбоксилюванні [1-14C]-a-кетоглутарату в усіх досліджуваних відділах головного мозку щурів, що відображує долі безпосереднього його декарбоксилювання до ГАМК при участі ГДК. Vmax при окислювальному декарбоксилюванні до 14СО2 [1-14C]-пірувату в гомогенатах з відділів головного мозку щурів завжди перевищує утворення 14СО2 із [1-14C]-L-аланіну, що свідчить про неістотність реакцій прямого декарбоксилювання останнього та про аміноферазний шлях його метаболізму. Ці величини були найбільшими в півкулях та меншими у "стовбурі мозку" та мозжечку (417, 416 та 462 нмолейЧхв-1Чг-1 для [1-14C]-пірувату та 294, 192 та 190 нмолейЧхв-1Чг-1 для [1-14C]-L-аланіну відповідно. Таким чином, катаболізм до 14СО2 в гомогенатах головного мозку щурів [1-14C]-L-аланін поступається [1-14C]-L-глутамату, але в десятки разів перевищує [1-14C]-L-лейцин. Враховуючи це, подальші дослідження продовили з L-глутаматом та L-аланіном.

Фармакодинаміка та катаболізм до 14СО2 1-14С-L-аланіну та

1-14С-L-глутамату при ГЗП та амінокислотно-вітамінному захисті.

Для цих досліджень аліквоту вихідної міченої амінокислоти розводили в тисячу разів 0,2 М розчином відповідної неміченої амінокислоти до питомої радіоактивності в 2,16-2,18 МБк та вводили щурам підшкірно в об'ємі 1,0 мл на 100 г живої ваги за 2 хвилини перед розміщенням їх до гермокамери. Постановка експериментів приведена в методах дослідження. Результати представлені на малюнку 1 у вигляді відносної радіоактивності (ВА) тканин головного мозку, крові та печінки після ін'єкції [1-14C]-L-глутамату та [1-14C]-L-аланіну.

Результати досліджень показали (мал.1), що вміст загальної мітки в голов-ному мозку майже на порядок менший, ніж у крові після ін'єкції 1-14C-L-глута-мату. Розрахунки коефіцієнтів ВА крові : ВА головного мозку показали, що в перші 5-20 хвилин після ін'єкції міченого глутамату при ГЗП збільшується поглинання з крові загальної мітки, а через 40 хвилин - зменшується. Після ін'єкції [1-14C]-L-аланіну в еквівалентній дозі (2,0 ммоля/кг) спостерігається більш помітне накопичення мічених продуктів в крові, головному мозку та печінці щурів та збільшення надходження мічених метаболитів до мозку при ГЗП, ніж після ін'єкції 1-14C-L-глутамату. Наші дані (мал.1) свідчать, що транс-порт міченого L-аланіну майже в два рази інтенсивніше, ніж транспорт через ГЕБ L-глутамату та в більшій мірі посилюється при дії ГЗП в перші 5-20 хвилин після ін'єкції. Можна вважати, що системи транспорту L-аланіну та його метаболітів менш обмежені функціями ГЕБ у щурів. Необхідно також ураховувати можливість метаболізму ін'єцованих амінокислот в клітинах крові, печінки та

інших тканинах до інших мічених продуктів, а також вплив на їх фармакодинаміку ентерогепатичного рециклінга.

Про істотний внесок останнього до фармакодинаміки досліджуваних мічених амінокислот свідчить швидке та значне накопичення мічених продуктів в печінці та стабільний їх вміст в крові. Певно, при цьому амінокислоти частково метаболізуються та поступають до головного мозку у вигляді відповідних a-кетокислот, особливо якщо урахувати літературні дані про високу швидкість транспорту із крові до головного мозку пірувату, яка перевищує у щурів навіть максимальну швидкість транспорту до головного мозку глюкози (Розанов А.Я., 1989).

Враховуючи можливості змін швидкості метаболізму L-аланіну та L-глутамату при ГЗП, ми вивчили їх катаболізм до 14СО2 in vitro у півкулях головного мозку щурів, яким попередньо вводили немічені амінокислоти та функціонально-пов'язані вітаміни ("пентапірувіт"). При цьому враховували захисну дію ін'єкцій амінокислот, вітамінів та коферментів при ГЗП по середній тривалості життя (СТЖ) щурів. Постановка цих експериментів в цілому не відрізнялася від описаної в методичній частині і з урахуванням оптимальної концентрації мічених по a-карбоксилу L-аланіну та L-глутамату в інкубаційному середовищі (0,1 мМ), близької до вмісту L-аланіну, та субстратів ЦТК в головному мозку.

Результати досліджень показали (мал.2), що попередні ін'єкції щурам терапевтичних доз L-аланіну та L-глутамату та їх комплексів з пентапірувітом достовірно збільшують швидкість катаболізму до 14СО2 гомогенатами з півкуль головного мозку 1-[14C]-L-аланіну та 1-[14C]-L-глутамату при дії ГЗП у першу "стресову" фазу, запобігають падіння катаболізму до 14СО2 в агональному періоді та збільшують СТЖ тварин. При цьому ефективність L-глутамату та його сполучення з пентапірувітом була більше виражена, ніж дія L-аланіну з пентапірувітом.

Ці дані частково підтверджують припущення, що захисна дія L-аланіну та L-глутамату при ГЗП може бути пов'язана з їх включенням до метаболізму шляхом переамінування та утворення пірувату та a-кетоглутарату, окислювальне декарбоксилювання яких в основному енергетичному циклі мітохондрій головного мозку посилюється ін'єкціями вітамінів, коферментних ПДК та КГДК.

Значення амінофераз мітохондрій головного мозку в реалізації захисних ефектів L-глутамату, L-аланіну та пентапірувіту при ГЗП.

Амінокислоти включаються до основного енергетичного циклу мітохонд-рій після їх переамінування, при цьому краще вивчена АСТ, що забезпечує швидке трансаміназне окислення в ЦТК (Кондрашова М.Н., 1987, 1988). Роль АЛТ при ГЗП ще предстоїть оцінити. Відомі також дані про структурно-функціональні взаємозв'язки трансаміназ та ферментів ЦТК, що утворюють надмолекулярні структури в мітохондріях (Beckmans. e.a., 1985, 1987), та про залежність активності цих амінофераз від ступеня інтегрованого стану цих структур (Розанов В.А. и др., 1991). З урахуванням цих даних ми не тільки враховували загальну активність АЛТ та АСТ, але й їх розподіл між мітохондріями та цитоплазмою, виділених з півкуль головного мозку щурів, а також при додаванні пірідоксаль-5-фосфату (ПАЛФ), враховуючи, що втрати ПАЛФ могли бути при виділенні мітохондрій. Досліди ставили в двох варіантах: стандартному, рекомендованому в методичному посібнику (Осадчая Л.М., 1982), та при додаванні ПАЛФ до кінцевої концентрації 40 мкМ (табл. 2 та 3).

Результати досліджень показали, що більша частина АСТ в півкулях го-ловного мозку щурів знаходиться у мітохондріях. При дії факторів замкненого простору навіть в агональному стані не спостерігається достовірних змін актив-ності "цитоплазматичної" АСТ, у той час коли в мітохондріях у цих же умовах виявляється зниження активності АСТ тільки при надлишку ПАЛФ в інкубаційному середовищі, що, певно, свідчить про ушкодження мітохондрій напівкуль головного мозку щурів при дії ГЗП, яке, проте, не супроводжувалось збільшенням активності цього ферменту в цитоплазматичній фракції (табл.2).

Таблиця 2.

Активності АСТ у півкулях головного мозку щурів при ГЗП та ін'єкціях L-глутамату (2,0 ммоля/кг) та "пентапірувіту", n=8-10

Умови досліду АСТ: нмолі піруватуЧмг-1білкуЧхв-1

мітохондріальна цитоплазматична

+ПАЛФ +ПАЛФ

Контроль ГЗП 35-45 хв. ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція L-глутамату ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція пентапірувіту" ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція L-глутамату та "пентапірувіту" 221±11,3 238±14,5 275±20,4** 278±17,8*** 318±17,6**** 378±22 261±18* 280±19,6 300±16,1 312±17,2 174±10,2 185±9,0 208±10,5** 224±14,5*** 231±12,7 238±12,6 215±9,3 227±7,2 244±12,3 254±14,7

*р<0,05 в порівнянні з контролем; **р<0,05 при порівнянні ГЗП та дії L-глутамату; ***р<0,05 при порівнянні ГЗП та дії "пентапірувіту"; ****р<0,05 при порівнянні дії "пентапірувіту" та сумісного застосування "пентапірувіту" та L-глутамату

В умовах захисту тварин від дії ГЗП попередньою ін'єкцією L-глутамату спостерігається збільшення активності АСТ як в мітохондріальній, так і в цито-плазматичній фракціях. Цей ефект не посилюється додаванням до інкубаційних середовищ ПАЛФ та, певно, обумовлений не індукцією біосинтезу нових моле-кул АСТ, а збільшенням їх активності в півкулях головного мозку під дією гормонів та інших біорегуляторів, вміст яких в крові та головному мозку змінюється при стресі (Меерсон Ф.З., 1986). В умовах захисту тварин при ГЗП попередньою ін'єкцією їм вітамінно-коферментного комплексу "пентапірувіт" спостерігається аналогічний ефект. При сумісному введенні L-глутамату та пентапірувіту спостерігається більш виражене збільшення (+11,4%) активності АСТ в мітохондріях, виділених з півкуль головного мозку в агональний період, у порівнянні зі щурами, що отримали тільки "пентапірувіт".

Результати досліджень показали, що активність АЛТ у півкулях головного мозку щурів на порядок менша, ніж активність АСТ, а її зміни більш виразні як при ГЗП, так і при ін'єкціях L-аланіну та "пентапірувіту" і в мітохондріях, і в цитоплазмі (таблиця 3). Так, при дії ГЗП в мітохондріях та цитоплазмі півкуль головного мозку щурів в агональному стані активність АЛТ знижується в 1,94 та в 2,62 рази відповідно, причому в присутності надлишку ПАЛФ in vitro цей ефект зберігається. Попередня ін'єкція щурам пентапірувіту в більшому ступені, ніж ін'єкція L-аланіну збільшує активність АЛТ і в мітохондріях, і в цитоплазматичній фракції півкуль головного мозку щурів при ГЗП. Ін'єкція щурам "пентапірувіту" сумісно з L-аланіном у тих самих дозах у ще більшій мірі запобігає падінню активності АЛТ, викликана ГЗП і в мітохондріях, і особливо в цитоплазмі. Фактично сумісна ін'єкція пентапірувіту та L-аланіну відновлює активність АЛТ у півкулях головного мозку при ГЗП до вихідного рівню у здорових тварин.

Таблиця 3.

Активність АЛТ в півкулях головного мозку щурів при ГЗП та ін'єкціях L-аланіну (2,0 ммоля/кг) та вітамінно-коферментного комплексу "пентапірувіт", n=12

Умови досліду АЛТ: нмолі піруватуЧмг-1білкуЧхв-1

мітохондріальна цитоплазматична

+ПАЛФ +ПАЛФ

Контроль ГЗП 35-45 хв. ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція L-аланіну ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція "пентапірувіту" ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція L-аланіну та "пентапірувіту" 19,3±0,51 9,87±0,64* 11,98±0,38** 16,05±0,51*** 17,60±0,54*** 24,27±0,60 10,56±0,53* 13,46±0,47** 18,56±0,65*** 20,42±0,94 13,51±0,45 5,13±0,30* 6,37±0,45** 9,25±0,52*** 14,16±0,42*** 14,06±0,67 7,15±0,43* 8,32±0,45** 11,32±0,57*** 16,35±0,70***

*р<0,001 в порівнянні з контролем; **р<0,05 при порівнянні ГЗП та дії L-аланіну; ***р<0,01-0,001 при порівнянні ГЗП та дії "пентапірувіту"; ****р<0,05 при порівнянні дії "пентапірувіту" та сумісного застосування "пентапірувіту" та L-аланіну

Виявлені нами відміни в активності АСТ та АЛТ при дії ГЗП та їх корекції слід оцінювати з супряженням їх функцій в нейроструктурах головного мозку. Відомо, що при гіпоксії відбувається зсув рівноваги в аспартаттрансаміназній реакції в бік утворення в мітохондріях головного мозку оксалоацетата, а через супряження функцій АСТ та АЛТ субстратом, що найбільш швидко утилізується, стає аспартат, а L-аланін накопичується (Conger K.A., 1981). Необхідно відмітити значення АСТ та АЛТ як ферментів, функціонуючих з дегідрогеназами ЦТК в головному мозку, в забезпеченні антигіпоксичних ефектів L-глутамату та L-аланіну, ін'єкцуємих сумісно з вітамінно-коферментним комплексом "пентапірувіт", активуючим ПДК та КГДК в мітохондріях.

Значення ферментів окислювального декарбоксилювання

a-кетоглутарату та пірувату мітохондрій головного мозку в реалізації захисних ефектів L-аланіну, L-глутамату та пентапірувіту при ГЗП.

В попередніх розділах роботи ми вже відмітили, що захисний ефект ін'єк-цій L-глутамату та L-аланіну при ГЗП у щурів значно посилюється при одночасному парентеральному введенні "пентапірувіту", який збільшує швидкість їх катаболізму до 14СО2 в головному мозку (мал. 2). Ми припускаємо, що потенціювання захисних ефектів L-аланіну та L-глутамату при їх сумісному введенні з пентапірувітом при ГЗП пов'язано ї його впливом на активність ключевих ферментів циклу Кребса в мітохондріях головного мозку.

Постановка експериментів була аналогічною попереднім, а методи виді-лення мітохондрій, обробки їх тритоном Х-100 та визначення активності ПДК та КГДК не відмінювалися від приведених в методичній частині роботи.

Результати досліджень показали (табл. 4), що активність КГДК в мітохондріях півкуль головного мозку щурів значно вища, ніж активність ПДК, а зміни цієї активності при дії ГЗП, ін'єкціях L-глутамату або пентапірувіту менш виражені. В мітохондріях в агональному стані щурів КГДК знижується на 30,0%, а відновлення її активності спостерігається тільки при сумісному парентеральному введенні L-глутамату та пентапірувіту. У тих самих щурів зміни активності ПДК в мітохондріях півкуль головного мозку при дії ГЗП були значні та чутливі до корегуючої дії "пентапірувіту" та L-глутамату. Зокрема, попередня ін'єкція L-глутамату та "пентапірувіту" відновлює цю активність при ГЗП.

Таблиця 4.

Активність ПДК та КГДК в мітохондріях півкуль головного мозку щурів при ГЗП, ін'єкціях L-глутамату (2,0 ммоля/кг) та пентапірувіту в нмолях НАДН2Чмг-1 білкаЧхв-1, n=8-12

Умови досліду ПДК КГДК

Контроль ГЗП 35-45 хв. ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція L-глутамату ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція "пентапірувіту" ГЗП 36-48 хв. + ін'єкція L-глутамату та "пентапірувіту" 35,64±3,80 11,58±1,92* 17,91±2,75** 30,82±2,58** 36,10±2,83*** 52,45±4,39 36,73±3,26* 40,21±4,12 43,73±3,76 51,97±4,15***

*р<0,01 в порівнянні з контролем; **р<0,01 при порівнянні ГЗП+глутамат; ***р<0,05 при порівнянні ін'єкції одного пентапірувіту та його поєднування з L-глутаматом при ГЗП

Дослідження також показали (табл. 5), що в першу "стресову" фазу (ГЗП 20 хвилин) в мітохондріях із півкуль головного мозку щурів активність ПДК достовірно збільшується на 64% у порівнянні з контролем, а в агональній фазі (35-45 хвилин ГЗП) активність ПДК знижується в 2,75 рази. Ін'єкції L-аланіну та "пентапірувіту" у більшому ступені коригують активність ПДК в мітохондріях пів куль головного мозку, ніж активність в них КГДК. Так, при сумісному парентеральному введенні L-аланіну та "пентапірувіту" активність ПДК та КГДК в мітохондріях півкуль головного мозку тварин при ГЗП відновлюється до норми та спостерігається максимальне збільшення тривалості їх життя.

Таблиця 5.

Активність ПДК та КГДК в мітохондріях півкуль головного мозку щурів при ГЗП, ін'єкціях аланіну (2,0 ммоля/кг) та "пентапірувіту", в нмолях НАДН2Чмг-1 білкаЧхв-1, n=8-12

Умови досліду ПДК КГДК

Контроль ГЗП 20 хв. ГЗП 35-45 хв. ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція L-аланіну ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція "пентапірувіту" ГЗП 36-48 хв.+ ін'єкція L-аланіну та "пентапірувіту" 35,64±3,80 58,30±5,72* 12,96±1,73* 22,59±2,37** 31,28±2,59** 37,30±3,05*** 52,45±4,39 60,56±5,86 37,42±3,48* 39,18±3,42 44,18±4,78 52,15±5,06

*р<0,01 в порівнянні з контролем; **р<0,01 при порівнянні з ГЗП 35-45 хвилин; ***р<0,05 при порівнянні впливу ін'єкції одного пентапірувіту та його поєднування з L-аланіном

Таким чином, активність КГДК та особливо ПДК в мітохондріях півкуль голов-ного мозку вельми показова для оцінки захисних ефектів ін'єкцій L-глутамату та L-аланіну та їх сполучень з "пентапірувітом" при дії ГЗП.

Значення активності глутаматдекарбоксилази (ГДК) півкуль головного мозку в реалізації захисних ефектів L-глутамату, L-аланіну, ПАЛФ та "пентапірувіту" при ГЗП.

ГДК, каталізуюча декарбоксилювання L-глутамату до ГАМК, важливіший фермент нейроструктур головного мозку, локалізується переважно в клітинах нейроглії та в нейронах, які забезпечують процеси гальмування в центральній нервовій системі при участі ГАМК-рецепторів. ГДК генерує ГАМК в нейроструктурах, де цей нейротрансміттер збільшує провідність біомембран для йонів хлору (Хухо Ф., 1990). При екстремальних станах, що супроводжуються гіпоксією або ішемією, виникають судороги у тварин. Одним з механізмів розвитку судорожного синдрому є зменшення процесів центрального гальмування, який реалізується за участю ГАМК (Сытинский И.А., 1977). Цей же ж механізм викликає судороги при аліментарному В6-авітамінозі у тварин (Bayoumi R.A., 1972).

Експерименти на білих щурах відтворювались за вже апробованою схе-мою, амінокислоти вводили підшкірно в дозі 2,0 ммоля/кг, ПАЛФ у дозі 3,0 мг/кг, а "пентапірувіт" - як описано в методах дослідження. Визначення ГДК проводили хроматографічним методом (Сытинский И.А. и др.,1965) з модифікаціями (Розанов В.А., 1980) по прирісту ГАМК в гомогенатах півкуль головного мозку в процесі їх інкубації з надлишком L-глутамату (25 мМ) та ПАЛФ (0,4 мМ). В цих умовах виявляється максимальна активність ГДК, з якою порівнюють так звану "ендогенну" активність, що визначається при інкубації цих же гомогенатів без додавання субстрату (L-глутамату) та коферменту (ПАЛФ).

Результати досліджень показали, що активність ГДК в півкулях головного мозку щурів достатньо стабільна до дії кофактора та концентрації субстрату in vitro, та до впливу ГЗП і амінокислотно-вітамінного ін'єкційного захисту in vivo. Зокрема, "максимальна" активність ГДК в півкулях головного мозку щурів, що виявляється при надлишку ПАЛФ та субстрату (212±9,7 нмолейЧхв-1Чг-1), тільки на 22% вище, ніж активність "ендогенної" ГДК. Це свідчить про достатній вміст ПАЛФ та L-глутамату у вихідних гомогенатах та про малу чутливість ГДК до надлишку субстрату. При дії ГЗП "максимальна" активність ГДК збільшується у півкулях головного мозку щурів у перший "стресовий" період на 24% та незначно знижується в агональний період на 16%.

Попередня ін'єкція щурам L-глутамату істотно збільшує "максимальну" активність у перший "стресовий" період та в агональний період. Ін'єкція L-глутамату сумісно з ПАЛФ або з "пентапірувітом" у порівнянні з ін'єкцією одного L-глутамату додатково збільшує "максимальну" активність ГДК у півкулях головного мозку на 15% в агональний період ГЗП. Ін'єкція L-аланіну також підвищує "максимальну" активність ГДК у півкулях головного мозку в агональний період при ГЗП. Ін'єкції L-аланіну сумісно з ПАЛФ або "пентапірувітом" додатково збільшують у півкулях головного мозку в агональний період ГЗП максимальну активність ГДК на 18% та на 19% відповідно у порівнянні з тваринами, яким вводили тільки L-аланін. Таким чином, захисна дія аланіну та його сполучень з ПАЛФ та "пентапірувітом" при ГЗП супроводжується аналогічними змінами активності ГДК у півкулях головного мозку, як і дія ін'єкцій глутамату з ПАЛФ або "пентапірувітом". У зв'язку із цим можна припустити, що ін'єкції L-аланіну, збільшуючи активність ГДК, призводять до підвищення рівню гальмовного нейромедіатора - ГАМК у головному мозку при ГЗП. Це підтверджується і спеціальними дослідженнями збільшення вмісту ГАМК в головному мозку щурів при ГЗП (табл. 1). Збільшення продукції ГАМК в головному мозку та її посилення ін'єкціями L-глутамату, L-аланіну, ПАЛФ та "пентапірувіту" є одним з механізмів захисної дії досліджуваних амінокислот, коферментів та вітамінів при ГЗП.

Вплив парентерального введення L-аланіну, L-глутамату та "пентапірувіту" на тривалість життя щурів при ГЗП.

У попередніх розділах роботи ми враховували середню тривалість життя (СТЖ) при гострій ГЗП у щурів під впливом попередніх ін'єкцій амінокислот та вітамінних препаратів. Ці данні свідчать, що L-глутамат, L-аланін, "пентапірувіт" та його сполучення з амінокислотами збільшують СТЖ щурів при ГЗП. Крім того, були поставлені додаткові експерименти щодо впливу на тривалість життя щурів при ГЗП сумісного застосування L-аланіну та L-глутамату, 0,2 М розчини яких змішували (1:1) та вводили підшкірно із розрахунку 1 мл на 100 г живої ваги. Таким чином, сумарна доза суміші L-глутамату та L-аланіну складала 2,0 ммоля/кг.

При цих експериментах ми враховували тривалість життя при ГЗП кожного окремого щура. Практично це досягалось спостереженнями наставання бокового положення та судорог, а також часу "останнього агонального подиху".

Як видно з узагальнених результатів (мал. 3), при гострому впливі ГЗП спостерігається СТЖ у більшої частини щурів від 33-х до 40 хвилин після розміщення їх в гермокамеру (86% тварин). У частини тварин (14%) при цьому СТЖ сягає 41-44 хвилини. Такий біомодальний розподіл обумовлений різною чутливістю щурів до гіпоксії. При попередньому введенні амінокислот та "пентапірувіту" тривалість життя щурів при ГЗП збільшується та біомодальний розподіл часу агонального стану не спостерігається. Так, до 36-ї, 40-ї та 44-ї хвилини у стані клінічної смерті при ГЗП було 40%, 84,4% та 100% щурів, то при ін'єкції L-глутамату 0, 30,7% та 80,0% відповідно. При ін'єкціях амінокислот сумісно з пентапірувітом при ГЗП збільшується СТЖ щурів (від36 до 47 хвилин), так до 42-ї і 46-ї хвилини при ГЗП у стані клінічної смерті було 85% і 100%, при ін'єкції L-аланіну та пентапірувіту - 68% і 97%, а при ін'єкції L-глутамату і пентапірувіту - 43% і 95% відповідно.Таким чином, попереднє парентеральне введення L-глутамату або L-аланіну збільшує тривалість життя щурів при ГЗП, а сумісне з ними застосування комплексу функціонально-пов'язаних коферментів та вітамінів значно посилює цей ефект. Сполуки, які досліджуються, і їх комбінації впливають кількісно на ланцюг процесів (кінетику катастрофи), знижуючи сумарну константу швидкості настання летального процесу. Враховуючи вищевикладене, можна вважати доцільним застосування L-аланіну сумісно з L-глутаматом для захисту від дії факторів замкненого простору в значно менших дозах, ніж це пропонувалось раніш для L-глутамату.

ВИСНОВКИ

1.Вміст L-аланіну та катаболізм його до СО2 в головному мозку, активність аланінаміноферази та піруватдегідрогенази в мітохондріях в більшій мірі змінюються при гіпоксії замкненого простору та захисній дії амінокислотно-вітамінно-коферментних препаратів, ніж вміст L-глутамату та L-аспартату, активність аспартатаміноферази, a-кетоглутаратдегідрогенази та глутаматдекарбоксилази.

2.Доданий до гомогенатів мозку в фізіологічних концентраціях 1-[14C]-L-ала-нін катаболізується до 14СО2 з такою ж швидкістю, як і 1-[14C]-L-піруват, а 1-[14C]-L-лейцин - як і 1-[14C]-a-кетоізокапронат (останні на порядок повіль-ніше), що свідчить про аміноферазний шлях їхнього метаболізму до a-кетокис-лот з наступним їх окислювальним декарбоксилюванням. Катаболізм до 14СО2 1-[14C]-L-глутамату в гомогенатах мозку щурів істотно інтенсивніше, ніж 1-[14C]-a-кетоглутарату, що відображує внесок прямого його декарбоксилювання.

3.При екстремальній дії факторів ГЗП у початкову стресову фазу адаптації значно збільшується катаболізм до СО2 досліджених амінокислот у півкулях та в меншій мірі в стовбурі мозку та мозжечку, а в агональній фазі знижується нижче вихідного, в той час коли вміст L-глутамату та L-аспартату в головному мозку не змінюється, а L-аланіну та ГАМК збільшується.

4.Парентерально введений в терапевтичній дозі L-аланін в більшій мірі, ніж L-глутамат поступає до головного мозку щурів в нормі, так і в початковий період дії факторів гіпоксії замкнутого простору, адаптація до яких посилює поглинання мозком цих амінокислот та їх взаємоперетворення.

5.Адаптивна активація аспартатаміноферази збільшується після ін'єкції L-глутамату, а зниження активності аланінаміноферази частково відновлюється після ін'єкції L-аланіну в півкулях головного мозку щурів при ГЗП.

6.Одним з основних механізмів реалізації захисної дії ін'єкцій амінокислот при гіпоксії замкненого простору є їх стимулюючий вплив на активність a-кетоглутаратдегідрогенази та особливо піруватдегідрогенази в мітохондріях півкуль головного мозку, який проявляється навіть в агональному стані.

7.Парентеральне введення терапевтичних доз коферментних дегідрогеназам a-кетокислот вітамінів у вигляді комплексу "пентапірувіт", що містить кокарбоксилазу, ліпоат, 4-фосфопантотенат, нікотинамід та флавінмононуклеотид частково нормалізує активність піруватдегідрогенази та a-кетоглутаратдегідрогенази в мітохондріях півкуль головного мозку щурів