Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Сидоренко Вадим Геннадійович

УДК 611.892: 612.014.46

Властивості іонних струмів, що активуються ГАМК, в соматичній мембрані ізольованих нейронів спинальних

гангліїв щурів

03.00.02 – біофізика.

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2000 р.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: Доктор біологічних наук

Веселовський Микола Сергійович

провідний науковий співробітник відділу

загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця

НАН України

Офіційні опоненти:

Академік НАН України, доктор біологічних наук, зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Кришталь Олег Олександрович

Доктор медичних наук, зав. відділом нейрофармакології Інституту фармакології і токсикології АМН України

Громов Леонід Олександрович

Провідна установа - кафедра біофізики біологічного факультету Київського Національного університету ім. Тараса Шевченка.

Захист відбудеться “_17__”__жовтня____2000 р. о _1000___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул.

Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “_15_”_вересня____2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук

З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Важливою задачею сучасної нейрофізіології є з’ясування ролі хімічних посередників в передачі сигналів від периферійних структур в центральну нервову систему. Однією з головних ланок у проведенні сенсорної інформації в ЦНС є нейрони спинальних гангліїв (СГ). Ці нейрони мають один відросток, що Т-образно поділяється на деякій відстані від тіла клітини. Одна гілка іде на периферію і закінчується рецепторним утворенням у шкірі, м’язах тощо. д. Інша гілка у складі заднього корінця йде у спинний мозок. Спочатку припускалося, що сома нейрона не бере участі у проведенні нервового імпульсу і виконує лише трофічну роль. Згодом електрофізіологічні дослідження довели, що в сомі нейронів присутні більшість з відомих видів іонних каналів, що керуються потенціалом або хімічними сполуками. Ці дані вказують на можливе втягнення соми нейронів спинальних гангліїв у регулювання процесу передачі сенсорної інформації. На сомі, центральних і периферійних терміналях нейронів СГ були виявлені рецептори, чутливі до гама-аміномасляної кислоти (ГАМК) - сполуки, що виконує функції гальмівного медіатора в багатьох ділянках центрального та периферійного відділів нервової системи. Якщо присутність ГАМК-рецепторів на центральних закінченнях сенсорних нейронів можна пояснити їхньою роллю в процесах синаптичного гальмування, то властивості соматичних рецепторів, а також їхня можлива роль у функціонуванні нейрона до нинішнього часу мало досліджувалися.

Мета роботи полягала у дослідженні біофізичних і фармакологічних властивостей ГАМКА-рецепторів на соматичній мембрані сенсорних нейронів.

Головні задачі дослідження:

1.

2. Вивчити зміни в кінетичних характеристиках іонних струмів при тривалому прикладенні ГАМК.

3. Кількісно дослідити вплив прикладання блокатора ГАМКА- рецепторів бікукулліна на іонні струми, що активуються ГАМК в мембрані нейронів СГ.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вивчені властивості іонних струмів, що активуються ГАМК, в соматичній мембрані нейронів СГ щурів в умовах швидкого прикладання медіатора. Показано, що ГАМКА-рецептори, пов’язані з іонними каналами, через які течуть ці струмі мають низьку афінність до медіатора. Встановлено, що іонні струми,

що активуються ГАМК, демонструють складну кінетику зростанняі спаду, що змінюються при збільшенні часу прикладання або концентрації ГАМК. На соматичній мембрані нейронів СГ вивчена чутливість ГАМКА-рецепторів щурів до блокатора - бікукулліна і показано, що бікукуллін у діапазоні концентрацій, що досліджувалися, впливає на амплітуду, але не впливає на кінетику іонних струмів, що активуються ГАМК. Визначена у дослідах відносно висока щільність іонних струмів, що активуються ГАМК, на сомі нейронів СГ дозволяє зробити припущення про вплив ГАМК-ергічної системи на проведення сенсорних сигналів цими нейронами.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. Отримані результати можуть бути використані як модель для опису деяких процесів, що протікають при взаємодії медіаторів з мембраною клітини в нормальних і патологичних умовах. Оцінка чутливості до бікукулліну ГАМКА-рецепторів на соматичній мембрані нейронов спинальных гангліїв щурів дозволяє порівняти їхні фармакологічні властивості з ГАМКА-рецепторами в інших ділянках нервової системи. Оскільки нейрони спинальних гангліїв здійснюють передачу сенсорної інформації в головний мозок, то практичне значення роботи полягає у визначенні можливої участі ГАМК-ергічної системи у модуляції процесу передачі аферентних сигналів.

Особистий внесок здобувача. Робота зі збору та наладки електрофізіологічної установки для експериментів, засвоєння методики виділення клітин та проведення експериментів були виконані автором особисто. Здобувач брав активну участь в обговоренні результатів і формулюванні висновків.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися і обговорювалися на міжнародній школі “Intracellular signalling”, Київ (1997 р.), на семінарах Інституту фізіології їм. О.О. Богомольця НАН України (1998-1999 р.)

Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті та тези доповіді.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел зі 196 найменувань. Робота викладена на 101 сторінці та ілюстрована 20 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали і методи дослідження.

В екпериментах використовувались щури лінії Вістар віком 12-15 днів, що утримувались на стандартній лабораторній дієті.

Метод ферментативної ізоляції нейронів СГ. Щури декапітувались, після чого робилося виділення спинальних гангліїв. Ганглії переносили у подвійне мінімальне середовіще Ігла (DMEM, Sigma, США), що містило 0,1% ферменту трипсину (Sigma, США) і витримували 15-20 хвилин при температурі 34оС в термостаті. Після ферментативної обробки ганглії переносилися в чисте середовіще Ігла для промивання. Після промивання проводилась механічна дисоціація тканини за допомогою Пастеровских піпеток з діаметром кінчика, що послідовно зменшувався. Суспензія клітин переносилася в чашку Петрі і ставилась у термостат при 34оС на 60 хвилин для того, щоб клітини осіли та прикріпилися до дна експериментальної камери. Перед початком досліду середовище в експериментальній камері замінювалося на робочий позаклітинний розчин. Всі досліди проводилися при температурі 20-22оС.

Електрофізіологічна реєстрація іонних струмів, що активуються ГАМК. Досліди проводили з використанням методу фіксації потенціалу на мембрані цілої клітини і на фрагменті мембрани. В роботі використовувався позаклітинний розчин такого складу (в мM): холіна хлорид - 140; KCl - 3; CaCl2 - 2; MgCl2 - 2; HEPES - 20; глюкоза - 10; рН доведений до 7,4 КОН. Скляні піпетки виготовлялися способом, описаним раніше (Hamill O. P. et. al., 1981) з легкоплавких капілярів діаметром 1,6 мм. Діаметр кінчика піпетки складав 1-3 мікрона, а опір заповненої піпетки 3-7 МОм. Реєструюча піпетка заповнювалася внутрішньоклітинним розчином (в мM): Cs ацетат - 100; CsCl - 50; EGTA - 10; MgCl2 - 10; HEPES - 20; рН доведений до 7,4 CsOH. Потенціал мембрани підтримувався на рівні -80 мВ. При потребі виконувалася аналогова компенсація послідовного опору (на 50-75%). Іонні струмі, що активуються ГАМК, посилювались із частотою фільтрування 5 кГц і реєструвалися системою АЦП/ЦАП з періодом оцифровки від 50 до 250 мікросекунд на персональному комп’ютері під контролем спеціалізованого програмного забезпечення. Апроксимаційні криві будувалися за допомогою програми CLAMPFIT із програмного пакету PCLAMP 6.0 (Axon Instruments Inc., США). Після цього по відібраним записам проводилася статистична обробка і побудова графіків із використанням програми ORIGIN 4.1 (Microcal Software, США). Експериментальні дані представлені як середнє значення зі стандартною похибкою.

Метод швидкої локальної аплікації речовин. Під час досліду на клітину прикладався позаклітинний розчин із використанням системи швидкої суперфузії, частково описаної раніше (Veselovsky N. S. et. al., 1996). Система складалася з двох спеціально виготовлених скляних піпеток. Подача розчину з першої аплікаційної піпетки регулювалася за допомогою електромагнітного клапана, який керувався комп’ютером. Інша аплікаційна піпетка, постійно включена на відсмоктування розчину, забезпечувала певний негативний тиск для формування області аплікації. Електромагнітний клапан дозволяв обирати тривалість аплікації в межах від десятків секунд до 10 мс. Тестуваниня цієї системи аплікації показало, що час зміни розчину не перевищував 3-5 мс. Під час досліду на клітину прикладався позаклітинний розчин, що містив ГАМК у різних концентраціях (Sigma, США). Для ідентифікації типу ГАМК-рецепторів в аплікаційний розчин додавався блокатор ГАМКА рецепторів - бікукулін (Serva, Чехословакія) в концентрації 5 мкМ. В дослідах з кількісним дослідженням впливу бікукулліна на ГАМКА-рецептори нейронів СГ, антагоніст у різних концентраціях додавався у перфузійний позаклітинний розчин, що містить фіксовану концентрацію ГАМК (500 мкМ).

Результати досліджень.

Характеристики іонних струмів, що активуються ГАМК, зареєстровані від цілої клітини.

Швидка аплікація ГАМК (тривалістю 20 мс) на мембрану сенсорних нейронів щурів викликала трансмембраний іонний струм (рис.1 А), що зворотньо блокувався бікукулліном у концентрації 5 мкМ (рис.1 Б). При зміщенні потенціалу, що підтримувався, від -80 мВ до +40 мВ виникала реверсія струмів із потенціалом реверсії -14 мВ (рис.1 В). Розрахований за рівнянням Нернста рівноважний потенціал для використанних концентрацій іонів хлору в позаклітинному та внутрішньоклітинному розчинах дорівнював - 19 мВ. Ці дані показують, що іонний струм виникав при відкривані хлорних каналів, пов’язаних із ГАМКА-рецепторами.

Залежность між амплітудою струму та концентрацією ГАМК у діапазоні від 10 до 1000 мкМ описувалася нелінійною функцією Хілла з параметрами ЕС50=343 мкМ і Nh=2,79 (рис.2). У нашій роботі вимірювався такий параметр, як час від початку аплікації речовини до точки максимальної амплітуди струму (час до піку, ЧДП). На рис.3А представлені нормалізовані записи струмів при аплікації ГАМК в концентраціях 10 мкМ, 100 мкМ та 1 мМ і графік залежності ЧДП від концентрації ГАМК. Видно, що при збільшенні концентрації агоніста ЧДП зменшувався (130±2 мс для Сгамк=10 мкМ; 64±4 мс для Сгамк=1 мМ, рис3Б). Ділянка зростання іонного струму, що активується ГАМК, апроксимувалася двома експонентами зі сталими часу tзр1 (швідка експонента) і tзр2 (повільна експонента, рис. 4А). На рис. 4Б показаний графік залежності сталих часу зростання швидкої (зр1) та повільної(зр2) експонент від концентрації ГАМК. Видно, що при збільшенні концентрації ГАМК величина зр1 вірогідно не змінювалася, в той час як величина зр2 зменшувалася від 47±2 мс (10 мкМ ГАМК) до 12±4 мс (1 мМ ГАМК). Спад струму, що активується ГАМК, апроксимувався двома експонентами зі сталими часу сп1=15±3 мс і сп2=125±4 мс. При збільшенні концентрації ГАМК показано, що обидві - швидка (сп1) та повільна (сп2) - експоненти вірогідно незмінюються (сп1=12±3 мс для Сгамк=10 мкМ; сп1=14±2 мс для Сгамк=1мМ і сп2=130±2 мс для Сгамк=10мкМ; сп2=126±5мс для Сгамк=1мМ; p=0,05, рис. 4 В,Г).

Характеристики струмів , що активуються ГАМК, зареєстровані від фрагменту мембрани.

Для усунення помилок, пов’язаних з дифузійними процесами на мембрані цілої клітини, частина дослідів проводилася на фрагменті мембрани. На рис.5А показані записи іонних струмів, що виникають при аплікації ГАМК у різних концентраціях на фрагмент мембрани нейронів СГ щурів. Ділянку зростання струму можна було задовільно апроксимувати двома експонентами з різними сталими часу (рис. 5А; N=6). Стала часу першої експоненти (швидкої) не змінювалася при збільшенні концентрації ГАМК, тоді як стала часу другої експоненти (повільної) зменшувалася при збільшенні концентрації ГАМК зі значеннями, близькими до тих, що були отримані в конфігурації “ціла клітина” (рис. 5Б; N=6).

Ділянка спаду струму також апроксимувалася двома експонентами з різними сталими часу (сп1=24±3 мс і сп2=138±4 мс для концентрації 10 мкМ; сп1=22±3 мс і сп2=140±2 мс для концентрації 1 мМ; N=6; рис. 5В). Як видно з діаграми на рис. 5Г, обидві величини не змінюються при збільшенні концентрації ГАМК.

Зміни в кінетиці іонних струмів, що активуються ГАМК, при тривалій аплікації ГАМК

Для дослідження властивостей іонного струму , що активується ГАМК, при довготривалому прикладенні агоніста тривалість аплікації збільшувалася з 10 до 500 мс. На рис. 6 А представлені записи іонних струмів із різною тривалістю прикладення ГАМК в концентраціях 100 мкМ (а) і 1 мМ (б). Максимальна амплітуда струму зростала зі збільшенням часу прикладення ГАМК (рис. 6 Б), однак при більших концентраціях агоніста спостерігався процес насичення струму, після якого зростання амплітуди припинялося, незважючи на аплікацію, що тривала. Було відзначено, що такий параметр, як ЧДП, також поводився подібним чином (рис. 6 В). Ділянка зростання струму, що активується ГАМК, задовільно апроксимувалася двома експонентами зі сталими часу зр1 (швидка експонента) і зр2 (повільна експонента) (рис. 7А1). При збільшенні тривалості аплікації ГАМК, параметр зр1 не змінювався тоді як зр2 помітно збільшувався (рис 7А2). В досліді з тривалим прикладенням ГАМК на фрагмент мембрани було визначено, що сталі часу першої та другої експонент зростання іонного струму не виявляють чутливості до зміни тривалості прикладення ГАМК (рис.7Б1 та рис.7 Б2; N=6).

Ділянка спаду іонного струму, що активується ГАМК, апроксимувалася двома експонентами зі сталими часу: сп1=15±3 мс і сп2=68±2 мс на фрагменті мембрани та сп1=17±2 мс і сп2=130±3 мс на мембрані цілої клітини (рис.7 А3 та рис.7 Б3). Було виявлено, що при збільшенні тривалості прикладення ГАМК стала часу швидкої експоненти (сп1) не змінювалася в обох методах. Стала часу повільної експоненти (сп2) зростала до 158±4 мс для 500 мс аплікації ГАМК на фрагмент мембрани (рис.7 А4; Сгамк=500 мкМ, N=6) і до 178±5 мс для 500 мс аплікації ГАМК на цілу клітину (рис.7 Б4; Сгамк=500 мкМ, N=15).

Депресія іонних струмів при тривалій аплікації ГАМК.

Тривала аплікація ГАМК викликала також депресію іонного струму, що активується ГАМК. Зокрема, використання методики парного нанесення ГАМК з короткими інтервалами між аплікаціями показало, що при короткому (менш 500 мс) інтервалі спостерігається значне пригнічення струмів, (рис.8А,Б).

Довготривале прикладення високої концентрації ГАМК (1 мМ) також пригнічувало максимальну амплітуду іонного струму, що певно зумовлено десенситізацією ГАМК-чутливих рецепторів (рис.8В)

Вплив бікукулліну на кінетичні та амплітудні характеристики іонних струмів, що активуються ГАМК.

Дія бікукулліну в концентраціях від 10 нМ до 2 мкМ викликала зниження амплітуди іонного струму, індукованого швидкою аплікацією ГАМК в концентрації 500 мкМ на мембрану досліджуваних клітин, з 1,18±0,21 нА до 0,06±0,02 нА. На рівні концентрації бікукулліну 5 мкМ спостерігалося повне пригнічення струму, що активується ГАМК, яке відновлювалося при дії ГАМК після відмивання (рис. 9А). Залежність між амплітудою струму, що активується ГАМК, і концентрацією бікукулліну описувалося нелінійною функцією Хілла з параметрами ЕС50=203 нМ і Nh=1,0 (р<0,05; N=6, рис. 9Б). Ділянка спаду трансмембранного іонного струму, що викликається прикладенням ГАМК, описувалася двома експонентами зі сталими часу сп1=37±3 мс і сп2=179±14 мс (рис. 9В). При аплікації бікукулліну в діапазоні концентрацій від 10 нМ до 1мкМ не спостерігалося вірогідної зміни в сталих часу спаду сп1 і сп1 (рис.9Г).

В цих дослідах вивчався також такий параметр, як час від початку прикладення речовини до піку амплітуди іонного струму (ЧДП). При контрольній аплікації 500 мкМ ГАМК ЧДП складав 91±5 мс . Аплікація бікукулліну в концентраціях від 10 нМ до 2 мкМ також вірогідно не змінювала час до піку іонного струму, що активується ГАМК (10 нМ бікукулліну - 100±3 мс і 2 мкМ бікукулліну - 106±3 мс (рис. 9Д).

Щільність іонного струму, що активується ГАМК, в соматичній мембрані нейронів СГ щурів.

В усіх дослідах реєструвалася електрична ємність соматичної мембрани нейронів. За цими даними була розрахована щільність струму на одиницюелектричної ємності мембрани. На рис.10 показана щільність струму в одиницях пА/пФ при різних концентраціях ГАМК. За цим показником можна визначити, що середня щільність іонного струму, що активується ГАМК, на мембрані СГ щурів достатньо висока і наближається до щільності іонних струмів потенціал-керованих каналів (Fedulova S. A et. al., 1985; Safronov B.V. et. al., 1997).

Обговорення результатів досліджень.

Досліджувані в нинішній роботі іонні струми, що виникають при швидкій аплікації ГАМК на мембрану сенсорних нейронів щурів, виявляють відомі характеристики струмів, що реєструються при аплікації ГАМК на клітини інших типів (Desarminen P. et al., 1984; Konink Y. D. аnd Mody I., 1994; Maconochie D. J et al., 1994; Jones M. V. and Westbrook G. L., 1995; McClellan A. M. and Twyman R. E., 1999). Потенціал реверсії іонних струмів та їхня чутливість до бікукулліну показують, що ці струми виникають внаслідок трансмембранного переносу іонів хлору через канали, пов’язані з ГАМК-рецепторами типу А. Збільшення концентрації агоніста викликало збільшення амплітуди струму, яке вірогідно описується функцією Хілла, що говорить про нелінійну характеристику взаємодії рецепторів з молекулами ГАМК при різних рівнях концентрації. Період від початку струму до його максимальної амплітуди екпоненційно зменшувався зі збільшенням концентрації ГАМК. При цьому апроксимація ділянки зростання струму показує, що зменшення часу до піку визначається здебільшого зменшенням сталої часу другої експоненти, в той час як стала часу першої експоненти не змінюється. Це дозволяє припустити перебіг двох процесів на мембрані клітини: перша, швидка експонента, відбиває швидкий процес, що не змінюється при підвищенні концентрації ГАМК, в той час як швидкість другого процесу залежить від зміни концентрації ГАМК. При збільшенні періоду прикладення медіатора, навпаки, стала часу другої експоненти збільшується, в цьому випадку вона напевно пов’язана з дифузійними процесами, зумовленими розливом медіатора та взаємодією його з віддаленими ділянками мембрани. В той же час швидкість першого процесу практично не змінюється при зміні тривалості прикладення агоніста. Спад струму, що активується ГАМК, демонструє також двохекспоненційну кінетику, при цьому визначено, що стала часу швидкої експоненти не змінюється при підвищенні концентрації або періоду прикладення ГАМК. Стала часу другої експоненти вірогідно не змінюється при підвищенні концентрації агоніста, але зростає при збільшенні часу його прикладення. При тривалій аплікації ГАМК спостерігається також депресія іонного струму, викликана, певно, переходом рецепторів у десинситизований стан (Higashi H. and Nishi S., 1982; Wei J. Z. and Vicini S., 1996; Galarreta M. and Hestrin S., 1997; Matthew I. B. et al., 1998). Перша експонента також показує помітну потенціалочутливість при зміні підтримуваного потенціалу в бік деполяризації мембрани.

В роботі проводилися кількісні оцінки впливу блокатора ГАМКА-рецепторів бікукулліну на іонні струми, що активуються ГАМК, в мембрані сенсорних нейронов СГ щурів. Залежність між концентрацією бікукулліну та його блокуючою дією на іонний струм, що активується ГАМК, вірогідно описується нелінійною функцією Хілла. Коефіцієнт Хілла, близький до одиниці, показує, що блокуюча дія бікукулліну виявляєтьсяпри зв’язуванні однієї молекули антагоніста з бікукуллін-чутливою ділянкою ГАМК-рецептора. Відсутність змін в таких параметрах, як часи зростання та спаду іонних струмів, показує, що бікукуллін не виявляє впливу на кінетичні механізми, які визначають активацію та деактивацію ГАМК-індукованого струму. Достатньо висока щільність ГАМК-рецепторів на соматичній мембрані нейронів СГ щурів дозволяє припустити можливість впливу на процес передачі сигналів з боку інших структур нервової системи через ГАМК-чутливі рецептори на сомі нейронів. Підвищення концентрації ГАМК поблизу мембрани нейронів СГ може викликати деполяризацію мембрани нейронів і зниження надійності проведення ПД в точці біфуркації відростка

ВИСНОВКИ

1. З використанням методу фіксації потенціалу в умовах швидкого прикладення ГАМК досліджені біофізичні характеристики іонних струмів, що активуються ГАМК, на соматичній мембрані нейронів спинальних гангліїв щурів.

2. Іонні струми, що активуються ГАМК, виникають внаслідок трансмембранного переносу іонів хлору через хемо-керовані іонні канали, пов’язані з бікукуллін-чутливим ГАМК-рецептором типу А. Крива залежності максимальної амплітуди струму від концентрації ГАМК вірогідно описується рівнянням Хілла з параметром напівмаксимальної концентрації рівним 343 мкМ і коефіцієнтом Хілла рівним 2,79.

3. Ділянки зростання та спаду іонних струмів, що активуються ГАМК, при короткочасному прикладенні агоніста мають складну кінетику, що описується двоекспоненційними функціями росту та спаду. При цьому збільшення концентрації ГАМК призводить до прискорення кінетики активації струму за рахунок зменшення сталої часу другої експоненти.

4. Тривале прикладення ГАМК викликає уповільнення кінетики росту та спаду іонного струму. Використання методу реєстрації струмів на фрагменті мембрани показує, що уповільнення кінетики росту струму обумовлене дифузними процесами на мембрані клітини, в той час як уповільнення кінетики спаду струму визначається фізіологічними властивостями ГАМКА-рецепторів.

5. Отримана кількісна оцінка чутливості ГАМКА-рецепторів на соматичній мембрані нейронів СГ щурів до бікукулліну. Залежність блокуючої дії бікукулліну на іонний струм, що активується ГАМК, добре описується нелінійною функцією Хілла з напівмаксимальною концентрацією – 203 нМ і коефіцієнтом Хілла рівним 1.

6. Отримані в роботі дані про біофізичні властивості ГАМКА-рецепторів на соматичній мембрані нейронів СГ щурів показують, що ці рецептори на нейронах СГ мають більше, ніж одну ділянку зв’язування ГАМК, і, на відміну від більшості ГАМКА-рецепторів у ЦНС, характеризуються низькою чутливістю до медіатора.

7. Результати, що свідчать про відносно високу щільність ГАМКА- рецепторів на соматичній мембрані нейронів СГ, дозволяють припустити, що ГАМК-ергічна система має модулюючий вплив на нейрони, які передають сенсорну інформацію від периферичних структур до головного мозку.

Перелік праць, опублікованих за матеріалами дисертації:

Статті:

1. Исаева О. В., Сидоренко В. Г., Федулова С. А., Веселовский Н. С. Вызванные тормозящие постсинаптические токи в динамике развития культивируемых нейронов гиппокампа крыс.// Нейрофизиология.- 1999.- т.31 - № 5.- с.370 - 376.

2. Сидоренко В.Г., Веселовский Н. С. Свойства ГАМК- индуцированных трансмембранных токов в изолированных нейронах спинальных ганглиев крыс. // Нейрофизиология.- 1999.- т.31 - № 6.- с.410 - 416.

3. Сидоренко В.Г., Веселовский Н. С. Действие бикукуллина на ГАМК-активируемые ионные токи в мембране нейронов спинальных ганглиев крыс. // Нейрофизиология.- 2000.- т.32 - № 4.- с. 300-303.

Тези доповіді:

1. Sidorenko V. Comparative characteristics of GABA-activated ionic currents in somatic membrane of rat DRG neurons // Neurophisiologia. –2000. –v.32. - №3. –р.180

Анотації:

Сидоренко В.Г. Властивості іонних струмів, що активуються ГАМК, в соматичній мембрані нейронів спинальних гангліїв щурів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидату біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Київ – 2000.

Дисертація присвячена дослідженню властивостей іонних струмів, що активуються ГАМК, в соматичній мембрані нейронів спинальніх гангліїв щурів. Нами показано, що залежність максимальної амплітуди цих іонних струмів від концентрації ГАМК в діапазоні 10 мкМ - 2 мМ задовільно описується рівнянням Хілла з параметрами напівмаксимальної концентрації ЕС50 - 343 мкМ та коеффіцієнтом Хілла - 2,79. Іонні струми як при короткому, так и при тривалому прикладенні ГАМК мають складну кінетику росту та спаду, яка описується двоекспоненційною функцією. При тривалому прикладенні ГАМК уповільнення кінетики росту струму обумовлене дифузними процесами на мембрані клітини, в той час як уповільнення кінетики спаду струму визначається фізіологічними властивостями ГАМКА-рецепторів. Визначена залежність блокуючої дії бікукулліну на струм , що активується ГАМК, в соматичній мембрані СГ щурів. Вона вірогідно описується функцією Хілла з напівмаксимальною концентрацією – 203 нМ та коефіцієнтом Хілла рівним 1. Визначена у роботі порівняно висока щільність струмів, що активуються ГАМК, в соматичній мембрані нейронів СГ щурів дозволяє припустити, що ГАМК справляє модулюючий вплив на проведення сенсорних сигналів від периферичних структур у головний мозок.

Ключові слова: ГАМК; ГАМКА-рецептори; спинальні ганглії.

Сидоренко В.Г. Свойства ГАМК-активируемых ионных токов в соматической мембране нейронов спинальных ганглиев крыс. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика.- Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины. Киев – 2000.

Диссертация посвящена исследованию свойств ГАМК-активируемых ионных токов в соматической мембране нейронов спинальных ганглиев крыс. Нами показано, что зависимость максимальной амплитуды этих ионных токов от концентрации ГАМК в диапазоне 10 мкМ - 2 мМ достоверно описывается уравнением Хилла с параметром полумаксимальной концентрации ЕС50 равным 343 мкМ и коэффициентом Хилла - 2,79. Ионные токи как при коротком, так и при длительном приложении ГАМК обладают сложной кинетикой роста и спада, описываемой двухэкспоненциальной функцией. При этом аппроксимация участка нарастания тока показывает, что уменьшение времени до пика определяется преимущественно уменьшением постоянной времени второй экспоненты. Это предполагает, очевидно, суперпозицию двух процессов на мембране клетки: первая, быстрая экспонента отражает быстрый процесс, не изменяющийся при увеличении концентрации ГАМК, в то время, как второй процесс зависит от изменения концентрации. Увеличение концентрации ГАМК ведет к повышению крутизны концентрационного градиента около мембраны и увеличивает вероятность открывания ГАМК-управляемых ионныхканалов. На макроскопическом уровне это проявляется в повышении скорости нарастания интегрального ионного тока при приложении более высоких концентраций ГАМК. При увеличении времени аппликации ГАМК, наоборот, постоянная времени второй экспоненты увеличивается. Можно предположить, что в этом случае ее изменение связано с относительно долговременными процессами, обусловленными разливом медиатора и взаимодействием его с удаленными участками мембраны. Спад трансмембранного ГАМК-индуцированного тока показывает также двухэкпоненциальную кинетику. При этом отмечено, что постоянная времени быстрой экспоненты не является концентрационно-зависимой и практически не изменяется при увеличении времени приложения ГАМК. Постоянная времени второй экспоненты спада не изменяется при повышении концентрации ГАМК, но показывает возрастание при увеличении времени его приложения. Незначительные отличия постоянной времени второй экспоненты спада в опытах на целой клетке и фрагменте мембраны показывают, что диффузные процессы не вносят ошибки в изменения постоянной времени второй экпоненты спада ионного тока и эти изменения определяются свойствами самих ГАМКА-рецепторов. Измерена зависимость блокирующего действия бикукуллина на ГАМК-активируемый ток в соматической мембране нейронов СГ крыс. Она достоверно описывается функцией Хилла с полумаксимальной концентрацией – 203 нМ и коэффициентом Хилла равным 1. Определенная в работе сравнительно высокая плотность ГАМК-активируемых токов в соматической мембране нейронов СГ крыс позволяет предположить, что ГАМК оказывает модулирующее влияние на проведение сенсорных сигналов от периферических структур в головной мозг.

Ключевые слова: ГАМК; ГАМКА-рецепторы; спинальные ганглии.

Sidorenko V.G. The properties of GABA-activated ion currents in somatic membrane of rat DRG neurons . – Manuscript.

Thesis for PhD degree by speciality 03.00.02 – biophysics.- Bogomoletz Institute of Physiology NAS of Ukraine. Kiev. – 2000.

The thesis is devoted to investigation properties of GABA-activated ionic currents in somatic membrane of rat DRG neurons. Obtained data indicate that dependence of maximal amplitude of currents versus concentrations of extracellular GABA in a range of 10 mkM - 2 mM is fitted by Hill’s equation with parameters: EC50 - 343 mкМ and Hill’s coefficient - 2,79. Ionic current, activated both by short and long GABA superfusion, demonstrated complicate kinetiks rise and decay, which could be fitted by two exponents. The dependence of blocking action of bicuculline on GABA-activated currents in somatic membrane of neurones could be fitted by Hill’s equation with parameters: EC50 – 203 nM and and Hill’s coefficient – 1. The density of GABA-activatedcurrents in somatic membrane of DRG neurones are relatively high that allows to assume that GABA modulate the transmission of sensory signals from peripherical structures to brain.

Key words: GABA; GABAA-receptors; DRG.