НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Симоненко Юрій Вікторович

УДК 575.11 + 577.21 +

581.143 + 582.739

ПОДВІЙНА ТРАНСФОРМАЦІЯ ЯК ЕФЕКТИВНИЙ ЗАСІБ ДЛЯ ОТРИМАННЯ ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН ГОРОХУ ПОСІВНОГО

(PISUM SATIVUM L.)

03.00.22 - "клітинна біологія"

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі цитофізіології та клітинної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії Національної Академії Наук України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук Кучук Микола Вікторович,

заст. завідуючого відділом генетичної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Головко Ераст Анатолійович, завідуючий відділом алелопатії Центрального ботанічного саду НАН України

кандидат біологічних наук

Ємець Алла Іванівна,

науковий співробітник відділу клітинної біології і біотехнології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Захист відбудеться "30" листопада 2000 р. о "16" годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148

Автореферат розісланий " 29 " жовтня 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради к.б.н. Тарасенко Л.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Горох посiвний (Pisum sativum L.) належить до важливих зернобобових культур, які широко вирощуються в Європi, Пiвнiчнiй Америцi, Новiй Зеландiї. В Українi - це основна зернобобова культура. Горох, як і інші представники родини бобових, завдяки симбіотичній системі азотфіксації є основним джерелом надходження рослинного білку в раціон людей. Крім цього, горох ще з часів Грегора Менделя є улюбленим об'єктом досліджень генетиків, а його 14 хромосом дуже добре вивчено в генетичному плані. У зв'язку з вищевказаним розробка методів генетичної трансформації гороху та отримання трансгенних рослин з поліпшеними сільськогосподарськими властивостями є дуже важливими та актуальними завданнями.

Існує декілька можливих підходів до трансформації рослин - це методи як прямої, так і опосередкованої трансформації. На даний час ще не створено рутинної процедури трансформацiї гороху. Теоретично трансформація гороху можлива як з використанням непрямих методів (агробактеріальна трансформація), так і прямих методів трансформації (електропорація, бомбардування та ін.). Для отримання трансгенних рослин гороху найчастіше використовують трансформацію, опосередковану за допомогою Agrobacterium tumefaciens. Хоча кількість видів рослин, трансформованих методом бомбардування, постійно зростає, на даний час немає повідомлень про використання цього методу для отримання трансгенних рослин гороху.

L-фосфiнотрицин (BASTA або глюфозинат амонiю) - гербiцид, який є конкурентним iнгiбiтором ферменту глутамiнсинтетази. Ген bar кодує фермент фосфiнотрицинацетилтрансферазу, який ацетилює амiногрупи фосфiнотрицину i тим самим забезпечує його iнактивацiю. Для деяких рослин вже здiйснено перенос гена bar, який забезпечує стiйкiсть до L-фосфiнотрицину. Лише в трьох публікаціях повідомляється про отримання фосфiнотрицинстiйких рослин гороху, а даних про подiбнi експерименти на горосi за допомогою електропорацiї протопластiв на даний час немає. Враховуючи вищезазначене, горох є цікавим і важливим об'єктом для використання його в експериментах по генетичній інженерії рослин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукова робота виконувалася в рамках бюджетних тем вiддiлу цитофізіології та клiтинної інженерії ІКБГІ НАНУ "Вивчення молекулярно-генетичних процесiв в реконструйованих клiтинних системах i трансгенних рослинах" та "Вивчення молекулярно-біологічних процесiв в трансгенних i трансгеномних клiтинних лiнiях i рослинах". Дослiдження також проводилися в рамках наукових проектiв прiоритетного напрямку 01.11.00 "Бiотехнологiя", в pамках Державної науково-технічної програми 02.12 "Перспективні бiотехнологiї" Міністерства України у справах науки і технологій, проекту Державного фонду фундаментальних дослiджень по темi 5.4/344 "Вивчення генiв, задiяних в пpоцесi соматичного ембpiогенезу на пpикладi добpе та поганоpегенеpуючих видiв pодини бобових" та проекту програми пiдтримки наукових дослiджень в країнах колишнього СРСР Мiжнародного наукового фонду (ISF).

Мета i задачi дослiдження. Метою роботи була розробка ефективної системи регенерації та методик генетичної трансформації гороху посівного (Pisum sativum L.) за допомогою A.tumefaciens, електропорацiї протопластів та бомбардування мікрочастинками золота; отримання за допомогою цих методик трансгенних клітинних ліній, рослин та нащадків, які містять маркерні гени та ген стiйкості до L-фосфiнотрицину; гiстологiчне вивчення процесiв регенерацiї у вiдiбраних трансгенних рослин; молекулярно-біологічний аналіз отриманих трансгенних рослин і їх нащадків та аналіз успадковування перенесених генів в наступних поколіннях.

Відповідно до поставленої мети до конкретних задач роботи входило:

1. Розробити ефективну систему регенерації рослин гороху in vitro.

2. Провести гiстологiчний аналіз процесiв регенерацiї у вихідних та трансгенних ліній гороху.

3. Розробити методики генетичної трансформації гороху за допомогою A.tumefaciens, електропорації протопластів і бомбардування мікрочастинками золота.

4. Отримати за допомогою розроблених методик трансгенні рослини гороху та їх нащадки, які містять маркерні гени та ген стійкості до гербіциду L-фосфінотрицину.

5. Провести молекулярно-біологічний аналіз відібраних трансформантів та їх нащадків для доказу їх трансгенної природи.

6. Провести аналіз успадковування перенесених генів в наступних поколіннях.

Об'єкт дослідження – генетична трансформація представників родини бобових (Fabaceae).

Предмет дослідження – отримання та молекулярно-біологічний аналіз трансгенних рослин гороху посівного (Pisum sativum L.) та їх нащадків.

Методи дослідження - методики генетичної трансформації за допомогою A.tumefaciens, електропорації протопластів і бомбардування мікрочастинками золота; методика гістологічного аналізу процесів регенерації; методи аналізу трансгенності отриманих трансформантів (виділення сумарної рослинної ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, саузерн-блотинг гібридизація, тест на активність b-глюкуpонідази (GUS), кількісне визначення неомiцинфосфотрансферази (NPTII) за допомогою поліклональних антитіл, аналiз активностi неомiцинфосфотрансферази).

Наукова новизна одержаних результатiв. В результатi проведеної роботи удосконалено систему регенерації гороху посівного (Pisum sativum L.) шляхом органогенезу та проведено гiстологiчне вивчення процесів регенерації у вихідних та трансгенних ліній.

Використовуючи для генетичної трансформації "shooty" мутант Agrobacterium tumefaciens pGV2206 отримано трансгенні високорегенераційні лiнiї гороху для чотирьох комерційних сортових ліній: 912097, 912074, 911160 та 911136.

Удосконалено методики другого етапу подвійної генетичної трансформації регенераційних ліній гороху за допомогою A.tumefaciens і електропорації протопластів та вперше розроблена методика генетичної трансформації регенераційних ліній з використанням бомбардування мікрочастинками золота.

Використовуючи розроблену методику трансформації за допомогою A.tumefaciens отримано фосфінотрицинстійкі рослини гороху та їх нащадки. Вперше доведено успадковування введених генів до п'ятого покоління включно. Молекулярно-бiологiчний аналiз пiдтвердив трансгенну природу отриманих лiнiй та їх нащадків.

За допомогою методу електропорації протопластів вперше отримано трансгенні рослини гороху, що містять ген стійкості до L-фосфінотрицину. Трансгенна природа трансформантів підтверджена молекулярно-бiологiчним аналiзом.

Вперше розроблена методика трансформації гороху шляхом бомбардування мікрочастинками золота та вперше цим шляхом отримано канаміцинстійкі трансгенні фертильні рослини гороху, що містять ген gus. Молекулярно-бiологiчними методами доведена трансгенна природа отриманих лiнiй.

Удосконалено метод стабiльного отримання потомства у регенерантів та трансформантів гороху на основі iндукцiї цвiтiння та формування насіння в культурi in vitro. На основі цього методу розроблено методику мікроклонального розмноження гороху в культурі in vitro.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методики генетичної трансформації з використанням A.tumefaciens, електропорації протопластів та бомбардування мікрочастинками золота дозволяють отримувати трансгенні рослини гороху з цінними господарськими ознаками (зокрема, із стійкістю до гербіцидів).

Розроблений метод подвійної генетичної трансформації гороху дозволив одержати трансгенні лiнiї цих бобових культур з генами, що представляють практичний iнтерес. Крім цього метод "подвiйної трансформацiї" може бути використано в експериментах по генетичній трансформації інших видів сільськогосподарських рослин, особливо тих, у яких важко індукувати морфогенез in vitro.

Розроблений метод мікроклонального розмноження гороху в культурі in vitro може бути використаний в масовому розмноженні рослин гороху цінних генотипів. Використання цього методу дозволяє не зважаючи на кліматичні умови розмножити унiкальний селекцiйний матерiал без змiни його генотипу і підвищити коефiцiєнт розмноження. Так, розрахунки показують, що з однiєї рослини протягом року можна отримати до 500000 генетично-однорiдних рослин при щомiсячному коефіцієнті розмноження, що дорівнює 3.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведені експерименти по генетичній трансформації гороху з використанням A.tumefaciens, електропорації протопластів та бомбардування мікрочасточками золота, оптимізації умов вирощування протопластів та регенерацiї рослин гороху. Ідея "подвiйної трансформацiї" належить науковому керівникові роботи д.б.н. М.В. Кучуку. Автору належить удосконалення та практична реалізація методик подвійної генетичної трансформації за допомогою A.tumefaciens, електропорації протопластів та розробка методики подвійної генетичної трансформації за допомогою бомбардування мікрочасточками золота. Молекулярно-бiологiчний та цитологічний аналiзи проведенi спільно з спiвавторами робіт, які наведені в авторефератi.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися на II-му Російському симпозіумі з нових методів біотехнології рослин (Росія, м. Пущино, травень, 1993 р.), на Міжнародному симпозіумі з біотехнології рослин та генетичній інженерії (Україна, м. Київ, жовтень, 1994 р.), на 5-му Міжнародному конгресі по молекулярній біології рослин (Сінгапур, м. Сінгапур, вересень, 1997 р.), на VII-ій Міжнародній конференції з біології рослинних клітин in vitro, біотехнології та збереженню генофонду (Россія, м. Москва, листопад, 1997 р.), на IX-му Міжнародному конгресі з культури рослинних клітин та тканин, біотехнології рослин і біології in vitro в 21-му сторіччі (Ізраїль, м. Ієрусалим, червень, 1998 р.), на II-му Міжнародному симпозіумі з біотехнології рослин (Україна, м. Київ, жовтень, 1998 р.), на Конференції з генетики та молекулярної біології (Україна, м. Львів, квітень, 2000 р.) і на наукових семінарах відділу цитофізіології та клітинної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Публiкацiї. Науковi результати опублiкованi в 10 друкованих роботах, що включають 7 матеріалів конференцій та 3 статті, виданих у фахових реферованих журналах. Результати роботи відзначено присудженням Стипендії Національної Академії Наук України для молодих вчених.

Структура дисертації. Дисертація включає в себе вступ, п'ять розділів (огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, обговорення отриманих результатів і заключну частину), висновки та список використаних джерел, що містить 368 бібліографічних посилань. Роботу викладено на 185 сторінках машинописного тексту, серед яких 39 рисунків, що займають 29 сторінок, і 12 таблиць, що займають 19 сторінок.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В експериментах використовували вісім вихідних сортових лiнiй гороху посiвного (Pisum sativum L.) голандської селекцiї: 912354, 912097, 912074, 912023, 912016, 911181, 911160, 911136, якi люб`язно надала голандська фiрма "Nunhems Zadem B.V.", та сортову лiнiю L 1288, отриману iз ВНДIР iм. М.I. Вавiлова (Росiя). Крім того, використовували постійно культивовану in vitro та здатну до регенерації лінію 1288-2206, яка була раніше отримана Зубко та інш. (1990).

В експериментах по електропорацiї використовували двi вихiднi лiнiї: лiнiю 1288 та 912097, i три постiйно культивованi in vitro лiнiї 1288-2206, 912097-2206 та 912074-2206 iз покращеним регенерацiйним потенцiалом. В експериментах по бомбардуванню використовували двi вихiднi лiнiї: лiнiю 912074 та 912097, i двi постiйно культивованi in vitro лiнiї 912074-2206 та 912097-2206 iз покращеним регенерацiйним потенцiалом. Лiнiї 912074-2206 та 912097-2206 були отримані нами на першому етапі трансформації за раніше описаним (Зубко та інш., 1990) методом сукультивування клiтин iз "shooty" мутантом A.tumefaciens, який мiстить плазмiду pGV2206.

В pоботi були викоpистанi неонкогеннi штами Agrobacterium tumefaciens, якi мiстять бiнаpнi вектоpи на основi Тi-плазмiд: 1) нопаліновий штам GV3101 (Holsters et al., 1980), який мiстить плазмiду pGV2206, що несе бактерiальний ген nptII (Leemans et al., 1981); 2) нопаліновий штам С58С1 (Holsters et al., 1980), який мiстить бiнаpний вектоp pMP90\pK30704 (Koncz and Schell, 1986). Плазмiда pK30704 несе синтетичний ген PAT (Ac) пiд контролем 35S-пpомотоpа ВМЦК і pDH51-термінатора та ген NPT (nptII) пiд контролем пpомотоpа нопалiнсинтетази; 3) штам С58С1, який мiстить бiнаpну констpукцiю pGV2206\pK30704; 4) cукцинамопіновий штам EHA101 (Hood et al., 1984), який мiстить бiнаpний вектоp pEHA101\pHoe106 (Hood et al., 1986). Плазміда pHoe106 несе ген Ac пiд контролем 35S-пpомотоpа ВМЦК та nos-термінатора; 5) штам EHA101, який мiстить бiнаpний вектоp pEHA101\pHoe200. Плазмiда pHoe200 містить ген Ac пiд контролем 35S-пpомотоpа ВМЦК та nos-термінатора.

Для електропорацiї протопластів використовували плазмiду pUC35SAc, яка мiстить ген Ac пiд контролем 35S-пpомотоpа ВМЦК та nos-термінатора. Плазміди pK30704, pHoe106, pHoe200 та pUC35SAc люб'язно надані фірмою "Nunhems Zaden B.V." (Голандія). Для трансформації рослин методом бомбардування використовували плазмiду pBI121 (Jefferson et al., 1987), яка мiстить ген NPT (nptII) під контролем nos-промотора та термінатора та ген b-глюкуронідази (gus) (Jefferson et al., 1986) під контролем 35S-промотора ВМЦК та nos-термінатора.

Для виділення плазмід використовували штам E.coli JM 101. Плазмiдну ДНК видiляли методом лужного лізісу по модифiкованiй методицi Бірнбойма та Долі (1979). Отримання компетентних клітин та трансформацію E.coli проводили за запропонованою Сіманісом методикою (Гловер, 1988). Плазміди pK30704, pHoe106 та pHoe200 переносили в агробактерії за допомогою методу прямої трансформації (Ditta et al., 1980). Всі бактеріальні штами вирощували на живильному середовищі LB з додаванням антибіотиків для селекції (Маниатис та інш., 1984).

Генетичну тpансфоpмацію pослин пpоводили шляхом сукультивування pослинних експлантатів з нічною культурою A.tumefaciens за модифікованою методикою Хорша та інш. (1985). При використанні плазміди pGV2206 селекцію трансформантів поводили на безгормональному середовищі B5, при використанні плазмід pK30704, pHoe200 та pHoe106 - на середовищі, яке містило 10 мг/л глюфозинату амонію (Ga). Трансформацію за допомогою електропорації протопластів проводили за модифікованою методикою Потрiкуса та iнш. (1985), використовуючи прилад "Интроген". Виділення та культивування протопластів проводили згідно розробленій методиці Кучука (1989). Селекцію трансформантів здійснювали на середовищі, яке містило 10 мг/л Ga. Трансформацію за допомогою бомбардування мікрочастинками золота пpоводили за модифікованою методикою Такеуші та інш. (1992) використовуючи гелієву гармату фірми FESTO (Німеччина). Селекцію здійснювали на середовищі, яке містило 100 мг/л канаміцинсульфату.

Для гістологічного аналізу процесiв регенерацiї фiксацiю тканин здiйснювали за методикою Навашина хром-ацето-формолом (10:1:4) та далi матерiал обробляли за загальноприйнятою методикою (Паушева, 1970). Препарати забарвлювали реактивом Шиффа за Фельгеном iз пiдфарбуванням лiхт-грюном.

Аналіз трансгенності отриманих трансформантів проводили за допомогою кількох молекулярно-біологічних методів: 1) сумарну рослинну ДНК виділяли за допомогою цетилтриметиламонійброміду (ЦТАБ) (Murray and Thompson, 1980); 2) для проведення ПЛР використовували ранiше розробленi праймери для амплiфiкацiї частини послiдовностi 35S-промотора ВМЦК (Стороженко, 1994) i праймери для амплiфiкацiї послiдовностi структурної частини гена Ac використовуючи ДНК-ампліфікатор Pharmacia LKB (США); 3) саузерн-блот-гібридизацію проводили на нейлонових фільтрах за методикою Чача та Гілберта (1984) використовуючи як зонди фрагменти ДНК, мічені 32P методом розсіяної затравки (Feinberg and Volgenstein, 1984) за допомогою набору Random Primed DNA Labelling Kit (BM, Німеччина); 4) тест на активність b-глюкуpонідази (GUS) проводили згідно методиці Джефферсона (1987) використовуючи при обробці транформантів деметилюючим агентом різні концентрації 5'-азацитидину (Aza) (10 мкМ, 30 мкМ, 60 мкМ, 100 мкМ), який додавали в живильне середовище; 5) концентрацію сумарного білка в рослинних екстрактах визначали за методом Бредфорда (1976); 6) наявність продукту експресії гена неомiцинфосфотрансферази (nptII) визначали за допомогою відповідних поліклональних антитіл методом ELISA з використанням набору NPTII ELISA Kit фірми 5-Prime-3-Prime (США) за методикою Кабанес-Бастос та інш. (1989). 7) аналiз активностi неомiцинфосфотрансферази (NPTII) проводили згiдно методики Сшрейрера та інш. (1985).

При обробці експериментальних данних використовували стандартні методики статистичної обробки результатів, за допомогою яких визначали середнє арифметичне, довірчі інтервали та критерій x2 (хі-квадрат) для оцінки достовірності отриманих результатів (Доспехов, 1985; Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Генетична трансформація гороху посівного (P.sativum L.)

Отримання високорегенераційних ліній гороху в культурі in vitro. На першому етапi трансформації проводили сукультивування експлантатів гороху вихідних ліній із "shooty" мутантом A.tumefaciens pGV2206, отриманим шляхом iнтеграцiйного мутагенезу iз замiщенням генiв синтезу ауксинiв Т-ДНК послiдовнiстю бактерiального гена nptII (Leemans et al., 1981). Схематична карта генів Т-ДНК плазмiди pGV2206 представлена на рис.1. В результаті селекції на безгормональному середовищі B5 отримано чотири лiнiї з високою регенерацiйною активнiстю, які були позначенi як 912097-2206, 912074-2206, 911160-2206, 911136-2206 та використанi на другому етапi трансформацiї за допомогою A.tumefaciens, електропорації протопластів та бомбардування мікрочастинками золота. Для інших чотирьох ліній не вдалося отримати трансформантів. Це можна пояснити різною чутливістю до зараження агробактеріями у різних генотипів гороху (Лутова и Шарова, 1993) або певною генотипічною мінливістю здатності до регенерації навіть після трансформації "shooty" мутантом A.tumefaciens. Всі отримані регенераційні лінії мають підвищену здатність до регенерації в культурі in vitro.

Рис.1. Схематична карта генів Т-ДНК плазмiди pGV2206. LB i RB - гpаничнi послiдовностi Т-ДНК.

Отримання трансгенних рослин гороху за допомогою електропорації протопластів. Для трансформацiї протопластiв гороху використовували плазмiду pUC35Sac, рестрикцiйна карта ДНК якої схематично представлена на рис.2. В експериментах використовували 3-4x105 протопластiв вихiдних та регенераційних лiнiй, отриманих на першому етапі трансформації. Оптимальними умовами для трансформацiї та для збереження життєздатностi протопластiв виявилась напруга електричного поля в 400 В/см, а тривалiсть iмпульсу - 5 мс. Для відбору PPT-стійких клітинних ліній було використано метод пізньої та двоступінчатої селекції, що узгоджується з даними літератури. Так Крістоу та інш. (1987) при електропорації протопластів сої використовували як ранню, так і пізню селекцію. Вони встановили, що при відборі трансформантів з використанням пізньої селекції ефективність трансформації була на 2 порядки вище, ніж при використанні ранньої селекції. Пізню селекцію при відборі трансформантів також використовували Кохлер та інш. (1987) при електропорації протопластів метеликових бобів (Vigna aconitifolia), Кучук та інш. при електропорації протопластів люцерни північної (Medicago borealis) (1990) і сої (Glycine max) (1990), а Рачек та інш. (1994) при електропорації протопластів гороху (Pisum sativum). Спочатку після селекції (5 мг/л Ga) було вiдiбрано 24 колонiї вихiдної лiнiї 1288, 32 колонiї лiнiї 912097, 47 колонiй регенерацiйної лiнiї 1288-2206, 42 колонiї лiнiї 912097-2206 та 28 колоній лінії 912074-2206. При подальшому культивуванні на середовищi із пiдвищеною концентрацiю гербіциду (10 мг/л Ga) було вiдiбрано 3 стабiльно стiйких калюсних клони лiнiї 1288, 6 клонiв лiнiї 912097, 7 клонiв лiнiї 912097-2206, 8 клонiв лiнiї 1288-2206 і 6 клонів лінії 912074-2206. Ефективність трансформації становила приблизно 3х10-5. Індукувати морфогенез вдалося у двох вiдiбраних клонiв iз регенерацiйної лiнiї 1288-2206 на середовищi B5RP, яке мiстило 0,1 мг/л БАП, 0,2 мг/л НОК i 100 мг/л гiдролiзату казеїну. До цього часу при індукції регенераційних процесів у гороху та загалом у представників родини бобових завжди у дослідників виникали труднощі. Ймовірно це обумовлено генотипом цих культур. Крім того Пуонті-Каерлас та інш. (1992) висловили припущення, що трансформація шляхом електропорації та умови селекції блокують процеси, необхідні для диференціації і регенерації рослин гороху in vitro. На даний час опубліковано лише два повідомлення про електропорацію протопластів гороху. Пуонті-Каерлас та інш. (1992) повідомили про отримання Hm-стійких клітинних ліній гороху, а Рачек та інш. (1994) – про отримання Km-стійких клітинних ліній гороху, що несуть Ds-елемент кукурудзи.

Рис.2. Рестрикційна карта ДНК плазміди pUC35SAc (4 т.п.н.).

Отримання трансгенних рослин гороху за допомогою Agrobacterium tumefaciens. Спочатку створено бінарні вектори на основі A.tumefaciens, для чого плазміди pK30704, pHoe106 та pHoe200, рестрикцiйні карти T-ДНК яких схематично представлені на рис.3-5, вводили в різні штами A.tumefaciens (pK30704 ввели в штам C58C1, а pHoe106 та pHoe200 - в штам EHA101). Після сукультивування експлантатів вихідних та регенераційних ліній гороху на середовищі із 10 мг/л Ga селектовано 338 PPT-стійких калюсних клонів з використанням всіх векторів. Що стосується ефективності трансформації, то в наших експериментах вона була вищою (20%), ніж у дослідах Пуонті-Каерлас та інш. (1990), Девіса та інш. (1,4%) (1993) та Шредера та інш. (2,5%) (1993). Із 166 калюсних клонів на середовищі B5RG, яке мiстило 200 мг/л глутаміну та 5 мг/л Ga, отримано регенеруючі лінії гороху: 43 клони лінії 912097 (30 використовуючи плазміду pHoe106 та 13 - pHoe200), 80 клонів лiнiї 912097-2206 (16 - pK30704, 60 - pHoe106, 4 - pHoe200), 15 клонів лiнiї 912074-2206 (8 - pK30704, 4 - pHoe106, 3 - pHoe200), 13 клонів лінії 911160-2206 (11 - pHoe106 та 2 - pHoe200) та 15 клонів лінії 1288-2206 (5 - pK30704, 6 - pHoe106, 4 - pHoe200). Що стосується часу від моменту сукультивування експлантатів з A.tumefaciens до регенерації нормальних рослин, використання нашої системи дозволило скоротити час до 7 місяців, що менше, ніж у дослідах Пуонті-Каерлас та інш. (15 міс.) (1992), Шредера та інш. (9 міс.) (1993) та приблизно рівний часу, що показано у роботах Девіса та інш. (1993) та Гранта та інш. (1995).

Рис.3. Рестрикцiйна карта Т-ДНК плазмiди pK30704 (16,9 т.п.н.). LB i RB - гpаничнi послiдовностi Т-ДНК.

Рис.4. Рестрикцiйна карта Т-ДНК плазмiди pHoe200 (8,4 т.п.н.). LB i RB - гpаничнi послiдовностi Т-ДНК.

Рис.5. Рестрикцiйна карта Т-ДНК плазмiди pHoe106 (25,2 т.п.н.). LB i RB - гpаничнi послiдовностi Т-ДНК.

Отримання трансгенних рослин гороху за допомогою бомбардування мікрочастинками золота. Для трансформацiї гороху вихідних та регенераційних ліній шляхом бомбардування мікрочастинками золота використовували гелієву гармату, запропоновану Такеуші та інш. (1992) та плазмiду pBI121 (Jefferson. et al., 1987), рестрикцiйна карта ДНК якої схематично представлена на рис.6. Використання гелію дозволило мінімізувати пошкодження тканин при зіткненні в струмені газу. Для бомбардування ми, як і багато дослідників, використовували мікрочастинки золота (Christou et al., 1988; Takeuchi et al., 1992), якими обстрілювали по три рази сегменти калюсів. Після селекції на середовищі із 100 мг/л Km відібрали 12 стійких клонів, з яких через два місяці було регенеровано 4 фертильні рослини (дві - лінії 912097 та дві - лінії 912097-2206). Щодо представників родини бобових, то Мак Кабе та інш.(1988) отpимали тpансгеннi фертильні pослини сої, бомбаpдуючи меpистематичну тканину насiння мікрочастинками золота.

Рис.6. Рестрикцiйна карта Т-ДНК плазмiди pBI121 (12,8 т.п.н.). LB i RB - гpаничнi послiдовностi Т-ДНК.

2. Отpимання pослин гоpоху T1-T5 поколiнь та аналіз успадковування перенесених генів.

Для встановлення, чи успадковується пеpенесена ознака стiйкостi до PPT в наступних поколіннях, було отримано та пpоаналiзовано pослини T1-T5 поколiнь. Спочатку ми спробували iндукувати фоpмування коpенiв у pегенеpованих пагонів. На жаль, більшість експеpиментів успiху не мала, а ефективність укоpiнення була дуже низькою. Тому було викоpистано метод пpищеплення pегенеpантiв. Проте виявилось, що отримання насiння у гороху шляхом прищеплення пагонiв також малоефективне (близько 20%). Проблему отримання потомства ми вирiшили іншим шляхом. Розроблено метод отpимання насiння гоpоху в культуpi in vitro. У бiльшості тpансфоpмованих пагонiв при культивуваннi їх на безгормональному середовищi в культуральних банках об`ємом 250 мл iндуковано цвiтiння in vitro без формування коренiв, а далі зав`язувалось невелике, але повноцінне насіння. За допомогою цього методу у 3 лiнiй (912097, 912097-2206, 912074-2206) отримано потомство T1-T5 поколінь.

Насіння, отримане після самозапилення трансгенних рослин покоління Т1, висаджували на середовище з гербіцидом та аналізували за допомогою ПЛР. Із насінин, що проросли, четверта частина була чутливою, а останні - стійкою до Ga, що відповідає розщепленню 3:1, тому що відміни між фактичними і теоретично очікуваними частотами були несуттєві (x2факт.< x20,05). Аналiз успадковування ознаки стiйкостi до PPT показав, що частина насiння лiнiй 912074-2206 та 912097-2206 стабiльно зберiгала його до другого поколiння включно. Отримані результати свідчать, що Т-ДНК у РРТ-стійких клонів була стабільно інтегрована в одній хромосомі і що ознака PPT-стійкості успадковується як домінантна алель. Проте недостатня кiлькiсть потомкiв не дозволила нам зробити повний висновок про характер їх успадковування. У відібраних стійких рослин покоління Т2 отримували насіння в культурі in vitro та проводили аналіз стійкості в умовах теплиці. Для цього насіння висаджували в теплицi та обробляли по два рази розчином гербіциду PPT в концентрації спочатку 3 мг/л, а потім 10 мг/л шляхом нанесення пензлем на листкову пластинку. Далі вивчали морфологію стійких рослин. У трансгенних рослин спостерігалась морфологічна неоднорідність у розвитку при дії гербіциду PPT. Таким же чином були отримані та проаналізовані рослини T4 та T5 поколінь. Як і у випадку рослин T3 покоління, у стійких рослин T4 та T5 поколінь спостерігалась така ж неоднорідність у розвитку за морфологічними ознаками. Аналiз успадковування ознаки стiйкостi до PPT показав, що частина насiння лiнiй 912074-2206, 912097-2206 та 912097 стабiльно зберiгала його до п'ятого поколiння включно. Цi результати переконливо доводять можливiсть отримання трансгенного насiння, яке несе ознаку стiйкостi до гербiциду PPT, та перенесення введеного гена стійкості до PPT в декількох поколіннях.

3. Гістологічний аналіз процесів регенерації у гороху.

У вихідних та трансгенних лiнiй гороху проведено гiстологiчне дослідження процесiв регенерацiї. Зроблено висновок, що регенерацiйнi процеси у всіх лiнiй проходять по типу органогенезу через утворення меристематичних клiтин у веpхнiх шарах калюсної маси і формування бруньок iз подальшим їх розвитком та утворенням пагонiв. Гiстологiчний аналiз показав, що має мiсце вторинний органогенез, при цьому в поверхневому шарi клiтин зрiлих бруньок закладаються бруньки, якi знову утворюються.

4. Мікроклональне розмноження гороху в культурі in vitro.

На основі здатності рослин гороху формувати насіння в культурі in vitro розроблено метод мікроклонального розмноження гороху, який включає два етапи: 1) формування численних пагонiв; 2) отримання насiння в культурi in vitro. Цей пiдхiд використано для розмноження трансгенних рослин у чотирьох сортових лiнiй гороху. Перевагами запропонованого методу є те, що це зручний шлях отримання насiння на протязi всього року; він дозволяє зберегти та розмножити новий селекцiйний матерiал за дуже короткий перiод; один раз введенi в культуру in vitro експлантати гороху можуть формувати насiння на протязi необмеженого часу. Таким чином, мiкроклональне розмноження гороху може бути використано в селекцiї гороху та продукцiї насiння. Використання цього методу для гороху дозволяє не зважаючи на погодні умови розмножувати унiкальний селекцiйний матерiал без змiни його генотипу i підвищити коефiцiєнт розмноження. Розрахунки показують, що з однiєї насiнини до кiнця року можна отримати до 500000 однорiдних рослин при щомiсячному коефiцiєнтi розмноження, що дорiвнює 3. Крiм цього, це простий шлях розмноження трансгенного гороху за короткий перiод.

5. Докази трансгенності селектованих після трансформації

клітинних ліній, рослин гороху та їх нащадків.

Проведено детальний молекулярно-біологічний аналіз відібраних PPT та Km-стійких клітинних ліній, рослин гороху та їх нащадків Т1-Т5 поколінь.

Аналіз отриманих трансформантів за допомогою ПЛР. Для проведення аналiзу за допомогою ПЛР iз вiдiбраних клонiв, регенерантів та їх потомства видiляли сумарну ДНК і проводили реакцiю амплiфiкацiї. Так як плазмiди pUC35SAc, pK30704, pHoe106 та pHoe200 містять ген Ac під контролем 35S-промотора ВМЦК, а плазміда pBI121 містить ген gus під контролем 35S-промотора ВМЦК, спочатку використовували раніше розроблену пару праймерiв для амплiфiкацiї частини послiдовностi 35S-промотора ВМЦК (Стороженко, 1994). В результатi амплiфiкацiї всі відібрані клітинні лінії та рослини як після електропорації протопластів, так і після трансформації за допомогою бомбардування та A.tumefaciens, дали фрагменти ДНК очiкуваного розмiру (189 п.н.). Ампліфікації ДНК, виділеної з контрольних рослин гороху, не відбувалось. Вибіркові результати аналізу представлені на рис.7. Далi була проведена амплiфiкацiя з використанням iншої пари праймерiв, комплементарних безпосередньо структурнiй частинi гена Ac. Відібрані клони, регенеранти та їх стійкі нащадки дали в результатi амплiфiкацiї фрагменти ДНК очiкуваного розмiру (570 п.н.). Амплiфiкацiї ДНК, видiленої iз контрольних рослин гороху, не вiдбувалось. Вибіркові результати аналізу представлені на рис.8 (А) та рис.10 (А). Отриманi результати свiдчать, що послiдовності 35S-промотора ВМЦК та гена Ac присутнi в геномi вiдiбраних клонiв, регенерантів та їх нащадків.

Рис.7. Результати електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації ДНК рослин гороху на послідовність 35S-промотора ВМЦК: 1 - контроль (вода); 2 - ДНК плазміди pK30704; 3-7 - ДНК трансформованих клонів N 1-5 (відповідно); 8 - ДНК контрольної нетранформованої лінії гороху.

Аналіз отриманих трансформантів за допомогою блотинг-гібридизації за Саузерном. Для подальшого доказу інтеграції генів Ac та nptII плазмід pK30704, pHoe106 та pHoe200 в геном отриманих трансформантів та їх нащадків проводили блотинг-гібридизацію за Саузерном. Спочатку проаналізовано продукти геномної ампліфікації на послідовність гена Ac для доказу ідентичності отриманих фрагментів ПЛР гену Ac. Ці фрагменти гібридизували із зондом, що містить послідовність гена Ac (мічений SalI-фрагмент (O,6 т.п.н.) плазміди pHoe200). Результати блотинг-гібридизації, наведені на рис.8 (В) та рис.10 (В), показали, що всі фрагменти гібридизуються з зондом і гібридизаційний сигнал відповідає гібридизаційним сигналам плазмід pHoe106 та pK30704. У контрольної нетрансформованої лінії гороху сигнал відсутній.

У другому випадку виділену сумарну рослинну ДНК, розщеплену ендонуклеазою рестрикції SalI, гібридизували з міченим SalI фрагментом (O,6 т.п.н.) плазміди pHoe200, що містить послідовність гена Ac. Результати блотинг-гібридизації, наведені на рис.9 та рис.11, свідчать, що у всіх відібраних клітинних ліній, рослин та їх нащадків присутні гібридизаційні сигнали, що відповідають гібридизаційним сигналам плазмід pHoe200 та pK30704, які також були розщеплені ендонуклеазами рестрикції (доріжки N4 на рис.9 та рис.11). У всіх клонів ген входить до складу фрагмента розміром приблизно 0,6 т.п.н. ДНК контрольних рослин гороху з зондом не гібридизується. За результатами аналізу можна зробити висновок, що плазмідна ДНК інтегрувала

Рис.8. Аналіз продуктів геномної ампліфікації трансгенних ліній гороху на послідовність гена Ac: A) електрофоретичний аналіз; B) блотинг-гібридизація за Саузерном з SalI-фрагментом плазміди pHoe200 (1 - маркер молекулярної ваги; 2 - клон N1 лінії 912097-2206 (трансформована pUC35SAc); 3 - клон N1 лінії 1288-2206 (pUC35SAc); 4 - клон N2 лінії 1288-2206 (pUC35SAc); 5 - контроль (вода); 6 - плазміда pK30704; 7 - контрольна нетрансформована лінія; 8 - клон N1 лінії 1288-2206 (pMP90/pK30704); 9 - клон N1 лінії 912097-2206 (pGV2206/pK30704); 10 - клон N1 лінії 912074-2206 (pMP90/pK30704); 11 - потомок покоління Т2; 12 - потомок покоління Т3; 13 - клон N1 лінії 912097-2206 (pMP90/pK30704); 14 - потомок покоління Т2; 15 - потомок покоління Т3).

Рис.9. Блотинг-гібридизація за Саузерном HindIII-перевару сумарної ДНК різних ліній гороху з SalI-фрагментом плазміди pHoe200, який містить послідовність гена Ac: 1 - клон N1 лінії 912097-2206 (трансформована pUC35Sac); 2 - клон N1 лінії 1288-2206 (pUC35Sac); 3 - клон N2 лінії 1288-2206 (pUC35Sac); 4 - плазміда pK30704, яка була оброблена рестриктазою SalI; 5 - контрольна нетрансформована лінія гороху; 6 - клон N1 лінії 1288-2206 (pMP90/pK30704); 7 - клон N1 лінії 912097-2206 (pGV2206/pK30704); 8 - клон N1 лінії 912074-2206 (pMP90/pK30704); 9 - потомок покоління Т2; 10 - потомок покоління Т3; 11 - потомок покоління Т4; 12 - клон N1 лінії 912097-2206 (pMP90/pK30704); 13 - потомок покоління Т2; 14 - потомок покоління Т3.

Рис.10. Аналіз продуктів геномної ампліфікації трансгенних ліній гороху на послідовність гена Ac: А) електрофоретичний аналіз; Б) блотинг-гібридизація за Саузерном з SalI-фрагментом плазміди pHoe200 (1 - маркер молекулярної ваги; 2 - клон N1 лінії 912097 (трансформована pHoe106); 3 - потомок покоління Т1; 4 - клон N2 лінії 912097-2206 (pHoe106); 5 - потомок покоління Т1; 6 - клон N1 лінії 912074-2206 (pHoe106); 7 - потомок покоління Т1; 8 - клон N1 лінії 912097-2206 (pHoe106); 9 - потомок покоління Т1; 10 - контрольна нетранформована лінія; 11 - плазміда pHoe106; 12 - контроль (вода); 13 - клон N1 лінії 912097-2206 (pHoe200); 14 - клон N1 лінії 912097 (pHoe200); 15 - потомок покоління Т1).

Рис.11. Блотинг-гібридизація за Саузерном SalI-перевару сумарної ДНК різних ліній гороху з SalI-фрагментом плазміди pHoe200, який містить послідовність гена Ac: 1 - клон N1 лінії 912097-2206 (трансформована pHoe200); 2 - клон N1 лінії 912097 (pHoe200); 3 - потомок покоління Т1; 4 - плазміда pHoe106, яка була оброблена рестриктазою HindIII/KpnI; 5 - контрольна нетрансформована лінія гороху; 6 - клон N1 лінії 912097 (pHoe106); 7 - потомок покоління Т1; 8 - клон N2 лінії 912097-2206 (pHoe106); 9 - потомок покоління Т1; 10 - клон N1 лінії 912074-2206 (pHoe106); 11 - потомок покоління Т1; 12 - клон N1 лінії 912097-2206 (pHoe106); 13 - потомок покоління Т1; 14 - потомок покоління Т2.

Рис.12. Блотинг-гібридизація за Саузерном BglII-перевару сумарної ДНК трансгенних ліній гороху з EcoRI-BamHI фрагментом плазміди pJA472, який містить послідовність гена nptII: 1 - потомок покоління Т3 клону N2 лінії 912097-2206 (трансформована pGV2206/pK30704); 2 - потомок покоління Т2 клону N2 лінії 912097-2206 (pGV2206/pK30704); 3 - клон N2 лінії 912097-2206 (pGV2206/pK30704); 4 - клон N2 лінії 912074-2206 (pMP90/pK30704); 5 - клон N1 лінії 1288-2206 (pMP90/pK30704); 6 - плазміда pJA472, оброблена рестриктазами EcoRI-BamHI; 7 - контрольна нетрансформована лінія гороху.

Рис.13. Блотинг-гібридизація за Саузерном BamHI/HindIII/PstI-перевару сумарної ДНК трансгенних ліній гороху з BamHI-HindIII фрагментом плазміди pK30704, який містить послідовність гена nptII: 1 - клон N3 лінії 912097-2206 (трансформована pBI121); 2 - клон N1 лінії 912097-2206 (pBI121); 3 - клон N2 лінії 912097-2206 (pBI121); 4 - клон N1 лінії 912097 (pBI121); 5 - клон N2 лінії 912097 (pBI121); 6 - контрольна нетранформована лінія гороху; 7 - плазміда pK30704, яка була оброблена рестриктазами BamHI/HindIII; 8 - клон N1 лінії 912097-2206 (pGV2206/pK30704); 9 - клон N1 лінії 912074-2206 (pMP90/pK30704); 10 - потомок покоління Т2; 11 - потомок покоління Т3; 12 - клон N1 лінії 912097-2206 (pMP90/pK30704); 13 - потомок покоління Т2; 14 - потомок покоління Т3.

в геном гороху без делецій та перебудов, тому що сигнали гібридизації контрольної плазміди повністю відповідають фрагментам гібридизації геномної ДНК трансгенних ліній. Отже, трансгенні лінії гороху та їх потомки містять послідовність гена Ac, що знаходиться в складі плазмід pK30704, pHoe106, pHoe200 та pUC35SAc.

Далі проаналізовано рослини та їх нащадки, отримані в результаті трансформації плазмідами pK30704 та pBI121, що містять послідовність гена nptII. Результати блотинг-гібридизації BglII та BamHI/HindIII/PstI перевару сумарної ДНК гороху з послідовністю гена nptII показали, що майже всі відібрані рослини та їх нащадки T2-T3 покоління містять послідовність гена nptII. ДНК контрольних рослин гороху з зондом не гібридизується. Дані радіоавтографії, представлені на рис.12 та 13, добре узгоджуються з результатами, отриманими при аналізі трансформантів за допомогою ПЛР та визначенні активності NPTII. У першому випадку для кожного клону послідовність, яка гібридизується з зондом, представлена фрагментом різної довжини приблизно 17 т.п.н., тому що сайт для BglII в конструкції відсутній і ДНК розщеплюється по сайтам, що знаходяться у складі геномної ДНК. У другому випадку для одних клонів послідовність, яка гібридизується з зондом, представлена фрагментом приблизно однієї довжини (2 т.п.н.), а для інших клонів фрагментом більшої довжини, тому що BamHI-PstI фрагмент має більший розмір (2,2 т.п.н.), ніж BamHI-HindIII фрагмент. Отримані результати свідчать про інтеграцію гена nptII в геномну ДНК отриманих рослин гороху та їх нащадків.

Аналіз трансгенних клітинних ліній та рослин за допомогою тесту на GUS-активність. Внаслідок того, що плазміда pBI121 містить індикаторний ген b-глюкуронідази (gus), клітинні лінії, відібрані після бомбардування, було проаналізовано за допомогою тесту на GUS-активність. Спочатку аналіз не дав позитивного результату. Виходячи з існуючої проблеми "мовчання генів" було зроблено припущення, що експресія гена gus не відбувається внаслідок метилювання послідовності цього гена. Амазіно та інш. (1984) показали, що експресія генів Т-ДНК залежить від метилювання ДНК, та при обробці цих ліній деметилюючим агентом 5'-азацитидином (Aza) у них повністю відновлювалася експресія генів Т-ДНК. Крім цього в декількох роботах була показана екпресія гена gus тільки після обробки ДНК трансформантів деметилюючим агентом Aza при додаванні його в живильне середовище. Вебер та інш. (1990) показали це при трансформації тютюну, Meйджер та інш. (1991) - при трансформації рису, а Рачек (1995) - при трансформації гороху. Після цього ми обробляли Aza клітинні лінії. Аналіз проводили через тиждень та два після додавання його в живильне середовище. Тільки через тиждень тест на GUS-активність дав позитивні результати, хоча через два тижні забарвлення було найінтенсивнішим. Після регенерації рослин знову проводили аналіз, але тест на GUS-активність не дав позитивних результатів навіть після додавання Aza в середовище. Цей факт можна пояснити тим, що Aza включається в ДНК замість цитозину тільки при реплікації ДНК, а у зформованих органів диференційовані клітини переважно не діляться, тому деметилюючий агент не